Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование стабильности и РНК-связывающих свойств белка HFQ из Pseudomonas aeruginosa

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование стабильности и РНК-связывающих свойств белка HFQ из Pseudomonas aeruginosa"

На правах рукописи

Мурина Виктория Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ И РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ СВОЙСТВ БЕЛКА HFQ ИЗ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 АВГ 2014

Пущино - 2014

005551829

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка Российской академии наук.

кандидат химических наук Никулин Алексей Донатович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук, старший научный сотрудник группы структурных исследований рибосомных белков

доктор физико-математических наук, профессор Кутышеико Виктор Павлович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, заведующий лабораторией ЯМР-исследований биосистем

кандидат биологических наук Казаков Алексей Сергеевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологического приборостроения с опытным производством Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории новых методов в биологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт кристаллографии им. A.B. Шубникова Российской академии наук, лаборатория биоорганических структур

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Защита состоится 13 ноября в 14 час. 00 мин.

на заседании диссертационного совета Д.002.038.01

при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки

Институте биофизики клетки Российской академии наук

по адресу: 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН и в библиотеке Института биофизики клетки РАН.

Автореферат разослан " " августа 2014.

Ученый секретарь диссертационного совета к. б. н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Регуляция экспрессии генов (процесса преобразования наследственной информации от гена в белок или нетранслируемую РНК) определяет состояние и функцию каждой живой системы (клетки или организма). Важную роль в регуляции экспрессии генов играют взаимодействия белков с ДНК и РНК, которые определяют скорость и направление происходящих процессов. Структурно-функциональные исследования белков-регуляторов транскрипции и трансляции, а также детализация их взаимодействий со специфически узнаваемыми участками ДНК и РНК, имеет большую значимость для понимания регуляции экспрессии генов во всех живых организмах.

В качестве объекта исследования выбран белок Hfq, который в бактериальных клетках играет роль глобального регулятора экспрессии генов. Он выполняет свои функции, изменяя трансляционную активность и время жизни матричных РНК, кодирующих более 40 белков Е.соН.

Цель и задачи исследования.

Основными целями работы были: определение структурной единицы белка Hfq, ответственной за его термостабильность, и поиск нового способа локализации РНК-связывающих участков на поверхности белка. Для достижения целей были поставлены следующие задачи: 1) Выделить мутантные формы белка Hfq с заменами Q8A, N28A, D40A и Y55A. 2) Определить степень олигомеризации полученных белков. Оценить стабильность белков. 3) Получить кристаллы мутантных форм белка Hfq. Проанализировать влияние произведенных замен на структуру и стабильность белка Hfq. 4) Получить и закристаллизовать комплексы белка Hfq с изолированными рибонуклеотидтрифосфатами (ATP, СТР, GTP, UTP). 5) Определить структуры полученных комплексов. Провести анализ обнаруженных сайтов связывания рибонуклеотидтрифосфатов. 6) Сравнить положение рибонуклеотидтрифостфатов в полученных нами структурах с положением соответствующих нуклеотидных остатков в известных структурах комплексов Hfq с олигоРНК.

Научная новизна и практическая ценность исследования.

Исследован вклад недоступных растворителю водородных связей, образованных консервативными аминокислотными остатками, в термостабильность белка Hfq из

мезофильной бактерии P. aeruginosa. Впервые была измерена термостабильность белка Hfq (ТПЛ.=120°С при рН=7) и предложена модель плавления белка Hfq, в которой единицей, определяющей термостабильность белка, является его мономер. Полученные результаты могут использоваться для повышения термостабильности белков, содержащих Sm фолд или близкие ему по структуре ОВ и SH3 фолды.

Разработан и успешно использован новый подход к локализации участков связывания одноцепочечных участков РНК (оцРНК) на поверхности белка при помощи рентгеноструктурного анализа. Впервые показано, что ЦТФ, УТФ и АТФ взаимодействуют с Hfq в сайтах связывания одноцепочечных участков РНК, причем ориентация оснований и рибозы в нуклеотид-белковых и в РНК-белковых комплексах совпадают. Показано, что белок Hfq не связывает гуаниновые основания. На основании полученных нами данных детализована модель связывания матричных и регуляторных РНК с белком Hfq. Предложенная методика поиска мест связывания РНК на поверхности белка Hfq может быть использована для локализации сайтов связывания одноцепочечных РНК (ДНК) на поверхности других белков, связывающих нуклеиновые кислоты.

Апробация работы и публикации. Результаты работы неоднократно представлялись на российских и международных конференциях. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и 12 тезисов. Полученные структуры депонированы в банк данных PDB (3QUI, 4ММК, 4MML, 4J5Y, 4J6W, 4J6X, 4J6Y).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы (166 наименований). Диссертация содержит 68 рисунков и 6 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование тер.мостабилыгости белка Hfq из Pseudomonas aeruginosa

Белок Hfq был открыт в 1968 г. как клеточный белок E.coli HF-I (Host factor I), участвующий в репликативном цикле бактериофага QJi. Молекулярный вес белка - около 12,5 кДа, активной формой белка является гексамер. При выделении белка использовалась методика прогрева до 85°С для очистки белка HF-I от мезофильных клеточных белков, что показало высокую термостабильность белка. Однако термостабильность белков Hfq детально не изучалась. Впервые в нашей группе, совместно с В. В. Филимоновым, было показано, что белок Hfq обладает экстремальной термостабильностью и начинает плавиться при температурах выше 120°С при нейтральных рН.

Было решено определить какая структурная единица белка ответственна за его термостабильность, это могли быть, например, гексамер, мономер или фибриллярные структуры. Так как белок в растворе находится в виде гексамеров, в которых реализуется сквозной [3-лист через все 6 мономеров, то закономерно было бы предположить, что это и есть самая стабильная единица белка. Тогда замена любого из консервативных остатков, формирующих недоступные водородные связи между соседними мономерами на аланин, должна была привести к значительному понижению стабильности белка. Для замен на аланин были выбраны следующие консервативные аминокислотные остатки: Q8, N28, D40, Y55, Н57. Были получены и выделены мутантные формы белка Hfq с заменами указанных консервативных аминокислотных остатков на аланин и определена их стабильность. Для проверки возможных изменений в структуре белка все полученные формы были закристаллизованы и их структура определена с помощью рентгеноструктурного анализа.

Было показано, что температуры плавления мутантных белков НГц С>8А, Б40А, N28 А снизились по сравнению с белком дикого типа на 15 градусов, Шц Н57А - на 30 градусов, У55А - на 54 градусов (рис. 1). Таким образом, удаление одной водородной связи привело к снижению температуры плавления белка на 15 градусов. Замены Н57А и У55А, при которых произошла замена больших ароматических остатков на аланин, привели к увеличению доступности гидрофобного ядра гексамера белка и, следовательно, к значительному уменьшению термостабильности Шц.

1

40

35

30

"о £ 25

3 20

15

10

№яУ55А

120 100 80 60 -40 20 -о

10 30 50 70 90 110 Температура, °С

^ # ^ ^ сг ^ -X5

Рис. 1. Дифференциальная сканирующая калориметрия образцов белка РаеШя дикого типа и с заменами проводилась при рН=3,0 для сдвига пиков плавления белков в низкотемпературную сторону. (1) Кривые плавления мутантных белков РаеШц. При рН=3,0 высота пиков теплоемкости для мутантных белков У55А и Н57А РаеНГя находилась в пределах шума прибора, поэтому энтальпия плавления для этих белков не может быть рассчитана. Высота пика теплоемкости для этих мутантных форм мала, так как, по всей видимости, при значениях рН<3,0 они находятся в частично расплавленном состоянии. (2) Гистограмма измеренных температур плавления мутантных белков.

Плавление всех мутантных белков является обратимым и пик теплоемкости не смещается с изменением концентрации белка (рис. 2-1), что говорит в пользу плавления мономера, а не гексамера. Полученные кривые зависимости теплоемкости от температуры были аппроксимированы двумя моделями (В.В. Филимонов, персональное сообщение). Первая модель была без учета процесса диссоциации - плавление мономера, вторая модель -плавление димера, с учетом диссоциации до мономеров (рис. 2-2). Как видно из рисунка, вторая модель лучше соответствует экспериментальным данным.

30 50 70 90 110 Температура, °С

30 50 70 90 110 Температура, °С

Рис. 2. (1) Кривые плавления белка Шя дикого типа при рН=4,0 с разной концентрацией белка. Видно, что при уменьшении концентрации белка в два раза положение пика плавления белка не смещается в более низкотемпературную область. (2) Аппроксимация зависимости теплоемкости белка РаеН1с[ дикого типа (рН=2,0) двумя разными моделями плавления белка. Первая модель (закрашенные кружки) соответствует равновесному плавлению мономера белка. Вторая модель (незакрашенные кружки) соответствует модели плавления димера белка с учетом диссоциации димера до мономеров.

Для уточнения полученных результатов был проведен эксперимент по определению влияния произведенных замен на олигомеризацию белка (рис. 3). Электрофорезом в "полунативных" условиях было показано

7

динамическое равновесие олигомерных состояний для белка РаеЖц "мономер <-> гексамер <-> мультимер". Таким образом, гексамер белка способен диссоциировать в растворе до мономеров с концентрационной зависимостью - чем ниже концентрация белка, тем легче он диссоциирует.

Несмотря на разницу в температурах плавления мутантных белков и разное олигомерное состояние белков в условиях "полунативного" электрофореза в кристаллах все мутантные белки формировали гексамеры.

wt N28A D40A Н57А Q8A Y55A М

Мультимер —

Гексамер —

- ИОкДа

- ббкДа

w - 35 «Да

- 25 кДа

Мономер____^_в Ж~ 18 "Да

10 «Да

Рис. 3. Электрофорез в "полунативных" условиях мутантных форм белка Hfq из P. aeruginosa. Замена N28A не повлияла на степень диссоциации белка. Замена D40A привела к блокированию образования мультимеров. Остальные замены привели к диссоциации гексамеров и мультимеров до димерного/мономерного состояния.

Удельная теплоемкость, рассчитанная из кривой плавления для мономера белка с молекулярной массой 9 кДа, составляла около 35 Дж/г. Для хорошо свернутых белков размера порядка 10 кДа удельная теплоемкость должна быть равна 50 Дж/г. Такая разница между теоретическим и измеренным значениями удельной теплоемкости обычно говорит о частично неупорядоченном состоянии белка. Белок Hfq из P. aeruginosa имеет длинную неупорядоченную С-концевую часть, которая составляет около 15 аминокислот или 20% от всех аминокислотных остатков белка. Кроме того, из структуры гексамера видно, что N-концевая а-спираль одного мономера формирует гидрофобные контакты с поверхностью соседнего мономера белка. Поэтому мы предполагаем, что N-концевая а-спираль принимает

развернутое состояние при диссоциации гексамера до мономеров, что также вносит вклад в снижение удельной теплоемкости основного пика плавления белка.

Рис. 4. Предполагаемая модель плавления белка РаеНГц. N6 - нативное гексамерное состояние белка, 61 - переходное состояние, в котором гексамеры диссоциировали до мономеров, би - расплавленный белок.

Основываясь на данных ДСК, а также на данных по влиянию произведенных замен на олигомерное состояние белков, можно заключить, что именно мономер является структурной единицей белка, ответственной за экстремальную термостабильность белка. Была предложена модель плавления белка, в которой первая стадия соответствовала обратимому низкоэнтальпийному процессу диссоциации гексамеров до мономеров, а вторая - обратимому плавлению мономеров (рис. 4). Так как структура мономера нами так и не была получена, в качестве примера мономерной организации белка на схеме приведена структура ортолога белка ВДц ЬвглИ, который формирует мономеры как в растворе, так и в кристаллах (РБВ ГО

2. Локализация специфических РНК-связывающих сайтов на поверхности белка

Вторая часть моей работы была посвящена изучению РНК-связывающих свойств белка Шц способен связывать РНК на двух

поверхностях - проксимальной (для У-богатых последовательностей) и

61

би

2РВ7).

дистальной (для А-богатых последовательностей). Предполагается, что проксимальной стороне связываются матричные и регуляторные РНК, а на дистальной стороне - полиА участки матричных РНК. Имеются структуры комплексов Hfq с олигоУ и олигоА РНК. Однако не имеется структур белка с природными РНК, такие комплексы быстро диссоциируют.

Следует отметить, что Hfq связывается с одноцепочеными участками РНК. Анализ имеющихся структур комплексов белка Hfq с олигоРНК показал, что связывание происходит за счет образования стекинг-взаимодействий между основанием нуклеотида и ароматическими аминокислотами, стекинг при этом дополняется водородными связями. Нами было предположено, что изолированные рибонуклеотиды также могут связываться в специфических сайтах связывания РНК на поверхности белка аналогично основаниям нуклеотидов в составе РНК.

Для получения комплексов Hfq с рибонуклеотидами использовалось два подхода: вымачивание кристаллов в растворе, содержащем 50 мМ соответствующего рибонуклеотида; и кристаллизация в присутствии соответствующего нуклеотида с молярным соотношением белок:нуклеотид = 1:2.

Как вымачиванием, так и сокристаллизацией были получены комплексы белка Hfq с АТФ, ЦТФ и УТФ. При анализе структуры комплекса белка Hfq с УТФ, полученным при вымачивании кристалла белка, УТФ был обнаружен в новом латеральном сайте связывания РНК (рис. 5-4). Существование этого сайта связывания РНК было показано с помощью мутагенеза данных другими исследователями в то же самое время, когда велась данная работа (Panja et al., 2013; Sauer et al., 2012).

В нашей работы впервые были показаны структурные детали взаимодействия уридина с белком в латеральном сайте. Анализ структуры комплекса белка с УТФ, полученного сокристаллизацией, показал наличие уридина только в каноническом сайте связывания олигоУ РНК. Положение рибонуклеотидов АТФ и ЦТФ не зависело от способа получения комплексов.

ю

АТФ был найден в К-сайте связывания олигоА РНК (рис. 5-1), ЦТФ - в сайтах сязывания олигоА и олигоУ РНК (рис. 5-2, 5-3).

Рис. 5. (1) Наложение структур комплексов PaeHfq с АТФ и EcoHfq-A7 РНК. Связывание АТФ происходило в R-сайте. (2) Наложение структур комплексов PaeHfq-ЦТФ и EcoHfq-AU6A РНК. Положение рибозы и а-фосфата в ЦТФ не создает стерических препятствий для связывания цитозинов в данном сайте. (3) Наложение структур комплексов PaeHfq-ЦТФ и EcoHfq-A7 РНК Адениновое и цитозиновое основания в структурах располагаются в одной плоскости. Положение рибозы и а-фосфата в ЦТФ не создает стерических препятствий для связывания цитозина в данном сайте. Наложение всех структур комплексов выполнено в программе "Superpose"

11

,Gln52

Адениновое

Gly29

Gln52

„ /

Адениновое

комплекса программ ССР4. (4) Положение урацила в новом латеральном сайте связывания.

Ни вымачиванием, ни кристаллизацией в присутствии нуклеотида не было получено комплексов Hfq с ГТФ. Это хорошо соответствует полученным ранее биохимическим данным о низкой константе связывания РНК с гуанин-содержащими последовательностями (Link et al., 2009).

На основании полученных нами данных по локализации рибонуклеотидов на поверхности белка исходная модель связывания РНК с белком была дополнена (рис. 6). Нами в модель были добавлены латеральные сайты связывания РНК, а также дополнена возможность связывания цитозиновых оснований в проксимальном и дистальном сайтах.

1 2

Проксимальные сайты связывания —

А/Ц

Дистальные сайты связывания -на противоположной стороне гексамера

Рис. 6. Сравнение исходной модели связывания РНК на поверхности Шц (1) и модели, дополненной новыми данными (2). Нами было обнаружено, что в Л-сайте связывания адениновых оснований могут связываться цитозиновые основания, также как и в проксимальных сайтах связывания на месте урациловых оснований. Кроме того, был добавлен латеральный сайт связывания уридинов.

1

2

О

О

Комплекс

Hfq/мрРИК

Проксимальная сторона

Детализация модели с использованием данных по связыванию нуклеотидов

Рис. 7. Предполагаемая модель положения малых регуляторных РНК на поверхности белка Hfq. (1) Исходная модель на основании данных по мутагенезу (Sauer et al., 2012). (2) Детализированная на основе полученных нами структурных данных по локализации нуклеотидов на поверхности белка Hfq модель связывания мрРНК. Для связывания с белком мрРНК должна иметь на 3' конце 4-5 последовательно расположенных уридина, часть из которых может быть замещена на цитидины, а на 5' конце через каждые 3-4 нуклеотида должен быть расположен строго уридин.

Известно, что многие регуляторные РНК, с которыми взаимодействует Hfq, имеют в составе олигоУ последовательности как на У, так и на 5' конце. Исходя из особенностей связывающихся с белком РНК и анализа мутантных форм белка EcoHfq, была предложена следующая модель взаимодействия малых регуляторных мрРНК на проксимальной стороне тороида (Sauer et al., 2012) (рис. 7-1). Сначала с белком связывается У-богатая последовательность 3' конца мрРНК в проксимальном сайте Hfq, затем происходит

формирование связей между У-богатой последовательностью 5'конца мрРНК с латеральным сайтом связывания на белке. Именно урацилы, формирующие контакты с латеральным сайтом связывания, могут быть ответственны за спаривание с A-последовательностями матричных РНК (Sauer et al., 2012). Используя результаты нашей работы удалось детализировать исходную модель. На 3' конце мрРНК, связывающихся с Hfq, должны располагаться последовательно не менее 4-5 уридиновых остатков, часть из которых может быть заменена на цитозины, а на 5' конце мрРНК должна быть последовательность, содержащие уридины в каждом 4-5 положении для взаимодействия с латеральными сайтамиШс] (рис. 7-2).

Предложенная нами методика локализации нуклеотидов на поверхности белка оказалась более информативной по сравнению с другими подходами по локализации РНК-связывающих сайтов на поверхности белка Hfq. Наш подход позволяет определить не только расположение сайта взаимодействия белка с одноцепочечной РНК, но и структуру сайта, положение в нем основания нуклеотида, проанализировать специфичность сайта связывания к различным основаниям. Данный подход позволил показать, что Hfq не является АТФазой, как было предположено после работ, выполненных методами мутагенеза и молекулярного докинга (Arluison et al., 2007; Lazar et al., 2010) и определить структурные детали взаимодействия РНК в новом сайте связывания. Этот метод проще, чем SELEX (Someya et al., 2012), позволяющий целенаправленно искать высокоспецифичную к белку последовательность РНК, и не требует получения большого количества мутантных форм белка с заменами для локализации участка связывания на белке (Hämmerle et al., 2012).

выводы.

1. Определена температура плавления белка Hfq из Pseudomonas aeruginosa и ряда его мутантных форм с заменами консервативных аминокислотных остатков: N28A, Н57А, D40A, Y55A и Q8A.

2. Показано, что процесс плавления белка Hfq лучше всего описывается моделью "гексамер <-> промежуточное мономерное состояние <-> развернутое состояние". Структурной единицей, ответственной за высокую термостабильность белка Hfq, является его мономер.

3. Получены кристаллы и определены с высоким разрешением структуры комплексов белка Hfq с рибонуклеотидами ЦТФ, УТФ, АТФ и его нерасщепляемым аналогом ADPNP. Показано, что ГТФ не образует комплекс с Hfq.

4. Показано, что ЦТФ, УТФ и АТФ взаимодействуют с Hfq в сайтах связывания одноцепочечных участков РНК, причем ориентация оснований и рибозы в нуклеотид-белковых и в РНК-белковых комплексах совпадают.

5. На основании полученных нами данных уточнена существующая модель взаимодействия РНК с белком Hfq: впервые показана способность белка Hfq связывать цитозины; определены структурные детали взаимодействия уридина в новом, латеральном, сайте связывания РНК на поверхности белка.

6. Предложен новый кристаллографический подход к локализации положения одноцепочечных участков РНК на поверхности белка Hfq.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи:

1. Murina V.N. and Nikulin A.D. RNA-binding Sm-like proteins of bacteria and archaea, similarity and difference in structure and function. Biochemistry (Mosc). 2011 Dec; 76(13):1434-49.

(Мурина B.H., Никулин А.Д. РНК-связывающие Sm-подобные белки бактерий и архей: сходства и различия структур и функций. Успехи биологической химии, 2011, 51, 133-64).

2. Murina V.N., Lekontseva N.V., Nikulin A.D. Hfq binds ribonucleotides in three different RNA-binding sites. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013 Aug; 69 (Pt8): 1504-13.

3. Murina V.N., Melnik B.S., Filimonov V.V., Uhlein M., Weiss M.S., Muller U. and Nikulin A.D. Effect of conserved intersubunit amino acid substitutions on Hfq protein structure and stability. Biochemistry (Mosc)., 2014 May; 79(5):469-77.

(Мурина B.H., Мельник B.C., Филимонов В.В., Улайн М., Вейсс М.С., Мюллер У., Никулин А.Д. Влияние замен консервативных аминокислотных остатков на структуру и стабильность белка Hfq. Биохимия, 2014, 79(5):595-604).

Тезисы:

1. Москалева О.В., Мурина В.Н.. Мельник Б.С, Никонов С.В., Никулин А.Д. Исследование стабильности белка Hfq из Pseudomonas aeruginosa: вклад консервативных водородных связей в стабилизацию пространственной структуры белка. XIV Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 2010. Тезисы, с. 160.

2. Мурина В.Н., Никулин А.Д. Локализация места связывания нерасщепляемого аналога АТФ на поверхности белка Hfq Pseudomonas aeruginosa. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и

16

биотехнологии». Москва, Институт биоорганической химии им академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2011. Тезисы, с. 54.

3. Мурина В.Н.. Селиванова О.М., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Никулин А.Д. Способен ли белок Hfq из Pseudomonas aeruginosa образовывать фибриллярные структуры? XV Международная Путинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 2011. Тезисы, с. 62.

4. Мурина В.Н., Селиванова О.М., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Никулин А.Д. Влияние первичной структуры белка Hfq на его структурную организацию. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, Россия, 2011. Тезисы, с. 307.

5. Никулин А.Д., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Мурина В.Н. Структурный анализ участка связывания аденозинтрифосфата белком Hfq Pseudomonas aeruginosa. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, Россия, 2011. Тезисы, с. 202.

6. Мурина В.Н., Вейс М.С., Мюллер У., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Никулин А.Д. Термофлуоресцентный анализ (Thermofluor assay) как новый метод поиска и оптимизации условий кристаллизации белков на примере мутантных форм белка Hfq. XVI Международная Путинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 2012. Тезисы, с. 132-133.

7. Никулин А. Д., Мурина В.Н. Взаимодействие белка Hfq с рибонуклеотидами - гипотеза и эксперимент. Ежегодная научная конференция, Институт белка, Пущино, Россия, 2012. Тезисы, с. 11.

8. Леконцева Н.В., Мурина В.Н.. Гарбер М.Б., Никонов С.В., Никулин А.Д. Исследование нуклеотид- и РНК-связывающих свойств белков-регуляторов транскрипции. XVII Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 2013. Тезисы, с. 220.

9. Мурина В.Н.. Леконцева Н.В., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Никулин А.Д. Кристаллографический пробинг — новый метод локализации РНК-связывающих участков на поверхности белка. XXV Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-

17

химической биологии и биотехнологии». Москва, Институт биоорганической химии им академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2013. Тезисы, с. 7.

10. Мурина В.Н., Леконцева Н.В., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Никулин А.Д. Исследование РНК-связывающих свойств РНК-шаперона Hfq. XXVI Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, Институт биоорганической химии им академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2014. Тезисы, с. 31.

11. Мурина В.Н.. Леконцева Н.В., Мельник Б.С., Филимонов В.В., Мюллер У., Уляйн М., Вейс М.С., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Никулин А.Д. Исследование экстремальной термостабильности белка Hfq. XVIII Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 2014. Тезисы, с. 266.

12. Murina V.. Filimonov V., Melnik В., Nikonov S., Garber M., Nikulin A. Study of protein Hfq extreme thermostability. ProtStab2014, 10th International Conference on Protein Stabilization, Stresa, 2014. Abstract, p. 61.

Подписано в печать 23.07.2014 г. Печать лазерная

Заказ № 4793 Тираж: 75 экз.

Типография «РгхРпгЦ» ИНН503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 18а (4967)759784 www.fix-print.ru