Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование мутагенеза, индуцированного ..., и его модификация

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование мутагенеза, индуцированного ..., и его модификация"



гссегйакя 1ЮС/ДАРсгвЕ!аап шадщтяяш ушгзшчгяга

îîa ЩХЖЧ! рдонбгсл

yjn.í 5» $53.17): 013. 033

ДЛЖШкДДУГХ ОЗЛЧЖЙ

ЮТЛИЗЯЭЛ,' ,ЙЩ-Ц!П!СЕ'Чй?ОГО !£r:íí?AIbS3Pí!í jfQl/Sft-N,

?! кга нидеягада

.СЗ. 00. 02 - (itni-xxr.m

03. СО. 15 - го star: nía

Азгорофораз даес9!ртщ1яя »¡а созезиашэ учяша сятодя камдаяата ^дацражнзя SÖ^K

ЙООШ Í8S2

Работа выполнена в Российском государственном шдщинскоы

университете.

.Научные руководители:

доктор медицинских наук Л Г. Еораза, доктор медицинских наук А. Д. Дур¡сап

Официальные оппоненты./

доктор биологических наук, профессор & Ц. Сйетко^гский доктор медицинских наук В. О. Ядагш

Ведущая организация - Шжовскгя медицинская академия

им. И. М. Сеченова

Защита состоится .............. 1202 г. ц "----" часов

ка заседании спецк&гмэированного совета по зозуле диссертаций К. 084.14.04 при РГШ по адресу: 117531, Мэсква, уд. Островитянова, 1

С диссертацией можно ознакомиться в Оибдиотеке РГШ. Автореферат разослан "----"................. 1992 года

Ученый секрета!» - ; спецналюировшшго совета кандидат ыеджщнсюа наук

И. В. Буромскм

ОВШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАКУ? У Актуальность темы. Среди патогенных факторов внесшей среды особое место зашшают агенты, повреждающие геиетичесние структуры. Они представляют серьезную опасность, поскольку, согласно фундаментальным представлениям, вновь возникающее грации сникают приспособленность популяции в целом и имеш негативное влияние на здоровье отдельных индивидумов. Отмечено, что мутационные повреждения соматических клеток лежат в основе процессов канцерогенеза и обуславливают преждевременное старение. Мутации в зародышевых клетках приводят к невынашиванию беременности 1Ш1 рождению детей с пороками развития, а мутации в половых «летках ответственны за увеличение уровней наследственных болезней в ряду поколений. В связи с этим, остро возникает проблема предупреждения негативного влияния мутагенов различной природы на структуры наследственности человека С ¡1 П. Дубинин 1986, Н. П. Бочков, Л. Н. Чеботарев 1989, Агозб а1. 1975 ).

' Профилактика индуцированного мутагенеза основывается на' широком генетическом скрининге, направленном на выявление и устранение из среды обитания факторов, обладающих мутагенными свойствами. Однако, до сих пор отдельные категории средовых агентов не наследованы или исследованы недостаточно. В первую очередь, это - минеральные пыли, пироко распространенные в быту и на производстве ( Б. Т. Величковский и соавт. 1985, А. Д. Дурнев и соавт. 1990 ). Более того, задача изучения мутагенности пылей не имеет методического обеспечения, поскольку очевидно, что тесты на мутагенность, разработанные для оценки генетических свойств химических соединений, не могут быть прямо использованы в аналогичных исследованиях минеральных пылей из-за особых физико-химических и биологических свойств этих агентов ( А. Д. Дурнев 1991 ).

Отсутствие методов, адаптированных к задаче изучения мутаген-

ности шнеральных пылей, также не позволяет; проводить исследования, направленные на выявление модификаторов их генотоксического действия. Б го зга время, подобная работа очень актуальна, гак как, с одной стороны, наш и последние литературные данные ( Е Е Ванчу-гова 1989, к Д. Дурнев и соавт. 1990, ^гапс! е1. а1. 1986) показывают наличие у пылей хризотил-асбеста и цеолитов мутагенных свойств, а, с другой стороны, очевидно, что ни гигиенические, ни технологические мероприятия не могут полностью исключить контакт человека с минеральными полями, а от их использования невозможно отказаться по экономическим причинам ( Б. Т. Беличковский и соавт. 1986 ).

Необходимым этапом поиска средств защиты генетических структур от повреждающего действия пылей является изучение механизма их мутагенного действия ( С. Б. Середенин, А. Д. Дурнев 1990 ).• Однако, изучение этого вопроса, точно тага© как исследование мутагенности пылей, тормозится из-ва отсутствия соответствующих методичеашх подходов.

Таким образом, в рассматриваемой области корпускулярного мутагенеза существуют три взаимосвязанные актуальные' проблемы: (1) Адекватной оценки мутагенной активности пылей. С2) изучения механизма мутагенного действия пылей, (3) поиска и создания протекторов, позволяющих предупредить поврегвдаиеее действие минеральных пылей.

Работа выполнена в рамках программы заданий ГКНТ СССР N О. 74.08. "Разработать и внедрить методы и средства, обеспечивающие дальнейшее повышение безопасности и оздоровление условий труда в народном хозяйстве" и "Медико-биологическое обоснование использования природных цеолитов Сибири и Дальнего Востока в.народном

хозяйстве РСОСР", а такте по плаву Комплексной научной программы,, подготовленной в РГМУ, "Свободнорадикальные процессы ' и активные формы кислорода в норме и патологии".

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явились проверка пригодности методов учета хромосомных аберраций в клетках эукариот in vitro и in vivo для оценки мутагенности корпускулярных загрязнителей на примере яылей хризотил-асбеста и цеолита, изучение механизма мутагенных эффектов этих агентов и поиск воз>,годных протекторов их цлтогенетического действия.

Для достижения указанной цели необходимо было решггь следующие задачи:

1. Обосновать целесообразность применения культуры лимфоцитов периферической крови человека для изучения мутагенной активности корпускулярных загрязнителей и с помоп&п згой тест-системы исследовать цитогенетическую активность пылевых образцов цеолитов и хризотил-асбеста в условиях in vitro.

2. На основе изучения особенностей проявления шггогенетических эффектов хризотил-асбеста и цеолита in vivo адаптировать метод учета хромосомных аберраций у млекопитающих для оценки мутагенности' корпускулярных агентов. Оценить влияние изучаемых, пылей на мутирование в половых клетках-млекопитающих.

3. Изучить роль АФК в механизме мутагенного яеЯствил волокон хризотил-асбеста и частиц цеолита

4. Исследовать природные и синтетические соединения с антиради-1 сальной шстивностыо в качестве средств запиты генетических структур от повреждающего действия хризотил-асбеста и цеолита.

Научная новизна. В результате проведенного исследования разработана экспериментальная модель, позволяющая исследовать мута-

генные свойства корпускулярных загрязнителей в условиях in vivo. Впервые уетаповлеш 1яутагенные свойства частиц цеолита и подтверждена мутагенность волокон хризотил-асбеста в экспериментах на животных, охарактеризовали особенности проявления цитогенетического действия этих корпускулярных -мутагенов; выявлен дистанционный эффект в ыутагенпом действии хризотил-асбеста и цеолита; показана зависимость выраженности мутагенного эффекта этих агентов от времени их экспозиции в организма, установлено, что временные зависимости цитогенетического действия хризотил-асбеста и цеолита различны; зарегистрирована индукция мутаций в половых клетках под действием цеолита.

Исследован механизм повреждающего действии промышленных минеральных вшей: мутагенность хризотил-асбеста опосредована образованием в ходе свободнорадикальных реакций гидроксилподобных радикалов, свяаанных с ионами железа, и гидропероксида водорода, в то время как цитогенетическое действие цеолита связано с индукцией только гидропероксида водорода.

Сформулирована гипотеза о том, что дистанционный'' мутагенный эффект корпускулярный загрязнителей может быть обусловлен влиянием продуктов перекисного окисления липидов на половые и соматические клетки, удаленные от адста контакта с пшими.

В;.с установлена принципиальная возможность уменьшения л полного устранения мутагенных эффектов хризотил-асбеста и цеолитов с помощью фармакологических производных 2-меркаптобензимидазола, обладающих антирадикальцой активностью, и охарактеризованы закономерности протекторного действия природных антиоксидаятов - витаминов и флавоноидов. .

[Графическая значимость. Впервые охарактеризованы мутагенные свойства образцов цеолита различны:: месторождений, показана адекватность цитогенетических методов ■ in vitro и in vivo для оценки Мутагенной активности корпускулярных загрязнителей, установлены данные, открывающие перспективу фармакологической коррекции клас-тогенных эффектов цеолитов.

Материалы работы положены в основу Методических рекомендаций "Использование краткосрочных тестов для оценки мутагенных свойств минеральных пылей".Ш СССР и "Экспериментальное обоснование предельно-допустимых концентраций ( ПДК ) в воздухе рабочей зоны пыли природных и синтетических цеолитов" IS PCSCP.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ" ( Ленинград, 1989 ), на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" ( Нзрггаягз, • 1990 ), а такта на семинарах НИЛ пневмокониозов РГ5.{У, НИЛ Оар?.'аиологической генетики НИИ фармакологии РАМН и НИЛ оценки отдаленных эффектов НИИ обшей и коммунальной гигиены ил. А. Е Сысииа.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ( глава 1 ), описания материалов и методов 'исследования ( глава 2 ), результатов экспериментов ( глава 3 ), их обсуждения ( глава 4 ), выводов и списка литературы. Работа 'излетана на 173 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу ч Я рисунков, Библиографический указатель включает 108 отечественных и 128 иностранных источников.

- б. -

МАТЕРИАЛЫ ft ЖГОДЫ' ИССЛЕДОВАНИЯ

3 paSoie яееледозали пшезыз образцы хризотил-асбеста ( Бгжэ-вззскээ к Тузиксков кесторзйдааия ) и цеолитов ( Хонгуруу, Пегасс-л ар. десгорояаеюя >, а -также часткии латекса ( Sigma, USA ), зря s?osj *шна волокон хризотил-асбеста кэ зареваваяа 10 мкц, раз-scsp-.-i дзолнтоз К8 вшодидм за предел* 5 мкм, а величина час-

тиц хагек-са составляла 5 ¡уж.

В качэствз модификаторов з.!у?агенкых эффектов карпускужрньз агэхзта ксг.сгьесвадЕ фермент суперэксиддхемутазу { СОД ) }з ката-&гщ: i Signs., ISA* Sarva, Sersvany )» юшичегкке соединения отечес-теэгаого зрээзводсгвг: аскорбиновую кксдоту, ругиа, байкает-Ban-L-a»35B, Зайкадака?-Ь-гко?вдка, в тага© фармаяогогичвокие ар©-аграгьг. йгмзкмк ( 2-эгкагиобензкыидазола гидроброыид ) и- томервог i 5-ето5аа-2-эгйП'иоб8а8шадазола гйдроххорзд ).

^Ьсоказдактау© активность ааяевък образцов в аитирадикаяьньэ своЗсяза хюжчегюж соедзденкй ксегедозаги методой клеточной хеми-аямяквоа«з5!Яй ( XS ) о доводом, ©агоципфушие клетки звдежсда иг »зтоад&хияго экссудата белы» беспородных крыс иассой 12G -160 7. МГСЗЯОМ К. Я. У*ЖГМЯ ( 1S78 ) С МОЯИфШШОДШ ( В. ВЭЛИЧ-товзхкб в ссавт. 1931 ). Хй измеряли s сраде, состоящей ка 110 Ш Иг€1, 10 Ш ярке, б гоМ гдоксаы, О. 65 тМ люкинола пря рН - 7.4 ка ■гишжшгре JS51 LKB ( Швеция ) при 37°С, при этом пылевые образцы храворкл-зобеота и цеолета добавлялись кз расчета 0. б ur/ыл, а ш-дкфилатора - s диапазоне концентраций от 10\-7 до 10\-3 Ш.

Мугагеаныа эффекты корпускулярных агентов и их модификацию, а sera® Црйогенвтическое действие аскорбиновой кислоты и рутина оценивали с помощь» модифицированных методов учета хромосомных абер-

раций в культуре лимфоцитов периферической кровь т уи^о ( М И Бочков 1974, ИапгегГогй 1665 ), з ю;зт;сах кос"»--'': аэ& ( Гсгй, На!пегг.оп 1956 ) и в клетках перятонеальногс внсздегзд ( оригинальная методика ), а гаю© учета доминантных ле-галья^т ;,<;у-тащй в половых клетках самцов ( Д. Н. Магашзкко и ссавт. 19">7 с ое-ксмекдациямк ЕШпз э1 а!. 1976 ).

Бри исследовании мутагенных эдфектоз уИго была зспояаао-вака экспериментальная схема Р. II Арутзшна ( 1885 ), прэдуенгтр:*-вавсзя добавление изучаемых образцов з культуру дайфоцдаоь за 4 часа до фиксации. Хризотил-асбест, цеолит и .натеке вкссйлх б туралькую смесь в концентрациях 0.01 и О. 05 ка*/ш, е асг-сэрбикогую зелоту и рутин - в диапазоне концентраций от 10\-7 до 104-3 У; при коррекции цитогекэтическиз эффектов модификаторы йзсдклк непосредственно перед добавлением корпускулярных агентов г диапазоне концентраций от 10\-7 до 10\-3 Я

Для дагогенетичеекого анализа соматических кле'.ок \пча использовали мышей-самцов ликки С57Ы/б массой а8 -"20 г, яра зтоы минеральные пали вводились внугрйбршиню ( однократно ), на срок 1-28 суток в дозе 50 .V!г/кг, а модификаторы - дарорашге, в дозах: аскорбат - 1.8 и 18 мг/кг„ рутик - 5.3 и 83 мг/кг,, Сежгаа - 1.8 и 18 мг/кг и гомерзол - 40- и 80 мг/кг перед введением ыутагэа».

Общий объем цитогекегкческих исследований т и т "'П'о .

составил" 48' 700 мэтафаз.

Метенные эффекты хризотил-асбеста й цеолита ( 50 иг/кг ) за зародышевых клетках изучали не мышах-гибридах Рг- СЗА х С57ЕУ6 массой 18 - 22 г.

Данные обработаны статистически с помощью программы '^а^гаГ' на 1ВМ РС. .

- 8 -

•РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. 5;1Спзрза1Э1ггсШМЕ1Л шдоль j; гаучшшо г.дггагенных свойств »иэрпус;суляр:ил агкггоп.

Сегодня очевидна способность пылевых частиц индуцировать образование АФК в суспензиях фагоцитирующих клеток ( Л Г. Коргаша 1083 ). С другой стороны, известно, что АФК способны повреждать генетические структуры ( С. Б. Середенин, А. Д. Дурнев 1990, Ercerit et al. 1985, Phillips et al. 1987 ). Два этих факта позволили предполагать, что мутагенные эффекты частиц цеолита и волокон хризотил-асбеста могут быть обусловлены АФК, которые образуются фагоцитами в присутствии этих агентов. Б таком случае, адекватно оценить генетические эффекты корпускулярных загрязнителей возможно только при использовании эукариотическлх тест-систем, в которых моделируется контакт пьшевых частиц о фагоцитирующими клетками, в частное-, ти, в культуре цельной крови человека.

Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что в культуре лимфоцитов периферической крови человека пылевые образцы хризотил-асбеста Вагановского месторождения и цеолита месторождения Хонгуруу в концентрациях 0.01 и 0.05 мг/мл вызывали статистически достоверное, по сравнении с контрольным уровнем, увеличение числа метафаз с хромосомными аберрациями ( при исследовании цеолитов других месторождений - Гедзами, Шивыртуйского, Мухор-Талянско-го, Алтын-Эмельского, а также филлипсита также были получены результаты, свидетельствующие об их мутагенной активности ).

Для изучения генотоксического действия корпускулярных агентов

N

в условиях живого организма изначально были выбраны клетки перито-к^аяьного зкссулчта ммш<.-й. которые.при внутрибршинном введении

Таблица 1. '

Мутагенные эффекты промышленных минеральных пылей.

Штод Срок Количество аномальных метафаз (Ж)

Способ введения экспозиции -

Концентрация/Доза (сутки) хризотил-асбест цеолит

Учет хромосомных контроль 2.0 10.7 1.Б ± 0.7

аберраций in vitro

0.01 мг/мл 6.0 ± 1.5 * 13. 0 ± 2. 4 ***

0.05 \tx/m 7.0 ± 1.3 *** 9. 2 ± 1.2 *г*гк

Учет хромосошых контроль 8.3 ± 1.1

аберраций в перито- 1 2. б ± 1.1 ** 1.8 t 0.7 ***

неальных клетках, 2 19. 0 ± 2. 8 *** 12.0 ± 2. 3

в/б введение, 7 22. 0 ± 2. 9 *** 16. б t 2. б **

50 мг/кг 28 19.0 ±2.8 *** 36. 5 ± 3. 4 ***

Учет хромосомных . контроль . 1.2 t 0.5

аберраций в клетках 1 4.4 ± 0. 9 ** 2.2 ± 0.7

костного мозга, • 2 4. 0 ± 0. 9 •** 2. 8 ± 0.7

в/б введение. 7 3. 6 ± 0. 8 * 2.4 ± 0.7

50 мг/кг 28 3. 2 ± 0.8 * 3. 7 ± 0. 7 ■А*

контроль

Учет доминантных 1-7 3.8 6.6 ± 1.5 '•6.5 ± 1.?

летальных мутаций, 8-14 3.7 3. 7 ± 1. 2 9.9 i 2.7

60 да/кг 15-21 5.7 4.2 ± 1.1 8.9 ± 1.8

22-28 2.9 ' 3.1 ± 1.0 9.3 ± 1.5 ***

Примечание: статистически достоверные отличия от контрольного уровня: * ~ р< 0.05. ** - Р < 0.01, *** - Р < 0.001.

пылевых образцов ьступаиг в непосредственный контакт с пылевыми частицами.

При однократном внутрибршшшом введении мышам пылевых волокон хризотил-асбеста в дозе 50 мг/кг,. моделирующем условия хронического аапыления, аналогичные производственным, в первые сутки наблюдалось статистически значимое снижение уровня аберрантных клеток относительно спонтанного значения, а начиная со 2 суток экспозиции пылевых волокон в организме животных было зарегистрировано достоверное увеличение количества метафаз с хромосомными аберрациями, сохраняющееся практически на постоянном уровне ( 19 -22 X ) в течение 4-х недельного срока.

При аналогичном исследовании цитогенетических эффектов частиц цеолита после суточной экспозиции в перитонеальном экссудате было зарегистрировано значимое уменьшение количества поврежденных метафаз, в дальнейшем наблюдалась тенденция к росту уровня хромосомных аберраций и к 4-х недельному сроку число аберрантных клеток в перитонеальном экссудате достигало 36. 5 ± 3. 4 X.

В параллельном наблюдении, выполненном на клетках костного мозга шгвй, боло показано, что хризотил-асбест вызывал повышение Уровня поврежденных метафаз уж с первых суток после введения пылевого образца и, в дальнейшем, в течение месячного срока'поддер-киваяся на практически постоянном уровне. Цеолит же проявлял, достоверную мутагенную активность только к юнцу 4-х недельного срока.

Исследование влияния 'пылевых образцов-, в клетках иеритонеаль-пого экссудата и клетках костного мозга, в целом, выявило сходные по относительной величине цитогеиетические эффекты и общи« закономерности их динамики, что позволило использовать в качестве обгек-

та для дальнейших исследований в условиях in vivo более простые в техническом отношении ¡метки костного мозга.

В целом, совокупность результатов вышеописанных экспериментов in vivo демонстрирует наличие мутагенной активности промышленных минеральных пылей как в ¡слетках, имэкядах непосредственный контакт с пылевыми частицами, так и в отдаленных органах. Выявленный дистанционный эффект шкет бить предположительно объяснен через индукцию пылями перекисного окисления липидов, в результате которого образуются и накапливаются эндогенные мутагены: малоновый диальде-гид и гидроперекиси липидов ( К1 А. Владимиров, А. И. Арчаков 1972, Yaca ot al. 1988 ).

Выявление генерализованного характера мутагенного действия пылей на соматических клетках сделало актуальным.оценку их эффектов в половых клетках. Данное исследование проводилось с помоасью метода учета доминантных летальных мутаций на кыиах. При этом было выявлено достоверное увеличение частоты мутаций под действием цеолита при использовании самцов с.4-х недельной экспозицией, пыли; при внутрибршинном введении мышам волокон хризотил-асбеста повреждающего действия на половые клетки зарегистрировано не было.

.Таким образом, полученные результаты указывают на наличие мутагенного действия у исследуемых образцов хризотил-асбеста и цеолита в условиях in vitro и in vivo, а выявленные эффекты позволяют обоснованно, утверждать, что использованные тест-системы, а такта выбранные дозы и сроки экспозиции пылевых образцов - адекватны для изучения мутагенности корпускулярных загрязнителей.

При изучении особенностей генетических эффектов хризотил-асбеста ,и цеолита выявлены существенные различия в повревдащем действии данных агентов: цитогенетическое влияние цеолита в условиях

in vitro превалировало над эффектами, индуцированными асбестом; в клетках перитонеального экссудата и костного мозга при внутрибрю-шинном введении цеолита наблюдалась тенденция к нарастанию мутагенных эффэктов, в отличие от хризотил-асбеста,' для которого характерным явилось сохранение постоянного уровня поврежденных мета-фаз; мутации в половых клетках зарегистрированы лишь при исследовании цеолита.

Выявленные специфические особенности проявления генотоксичес-ких эффектов пылевых образцов возможно обусловлены различным механизмом реализации их.мутагенного действия.

2. Изучение мэхашша мутагенного действия хризотил-асбеста и

!

цеолита.

Для проверки гипотезы об участии кШ в мутагенном действии исследуемых промышленных минералов было, проведено две группы экспериментов. В первую очередь, изучали возможность образования АФК фагоцитами под действием пылевых образцов.

На рис. 1 представлены наиболее типичные кривые ХЛ, полученные при исследовании пылевых образцов хризотил-асбеста и цеолита, которые подтверждают наличие прооксидантной активности у изучаемых минералов.

Последующие эксперименты были направлены на анализ влияния антирадикальных ферментов на мутагенную активность хризотил-асбеста и цеолита { Табл. Z ). Пэлное устранение цитогенетических эффектов хризотил-асбеста под действием СОД и цеолита - под действием каталазы," а также достоверное снижение каталазой асбест-индуцированного уровня хромосомных аберраций позволило установить непосредственное влияние АФК на- мутационные изменения генетических структур клеток.

IS -

Рис. 1. Влияние пылевых образцов на ХЛ леритонеальных макрофагов.-1 - хризотил-асбеста, 2 - цеолита, to оси ординат - интенсивность ХЛ- ответа.

Таблица 2.

Влияние антирадикальных ферментов на щтогенеттескуп активность корпускулярных агентов в условиях in vitro.

Количество клеток с хромосомными аберрациями (7.)

Хризотил-асбест Пеолит Латекс

0. 05 мг/мл 0.05 мг/мл 0. 01 мг/мл

Контроль . 2.0 + 0.7 2.0 + 1.0 1. 5 ± 0.6

Корпускулярный агент 7.0 ± 1.3 8.5 ±2.0 6.0J 1.1

* каталаэа 20 мкг/мл а 2 ± D. 8 * 2.3 t 0.9 * 7.2 ± 1.6

* СОД 50 «КГ/МЛ 1. 7 t 0.7 ** 8. 0 ± 1. б 2.0 ± 1.0 **

Примечание: статистически значимая модификация мутагенных эффектов: * - Р < 0.01. ** - Р < 0.001.

Однако, в литературе существует предположение, что мутагенные свойства хризотил-асбеста обусловлены химическим мутагеном, бенз(а)пиреном, адсорбированным на его волокнах ( Л. Н Пылев 1980, В. А. Кюнг и еоавг. 1988' ), а в механизме действия бензСа)пирена также имеется свободнорадикальлый компонент ( У/е1 е1 а1. 1985 ), что не позволяет однозначно трактовать результаты, полученные в опытах с ангирадикальныш! ферментами. Поэтому в дополнение к проведенным экспериментам в культуре цельной крови человека были исследованы частицы химически инертного латекса. Оказалось, что латекс, подобно цеолиту и хризотил-асбесту, индуцировал хромосомные аберрации. Уровень клеток с повреждениями, в этом случае, повышался до 6 %. Бри этом, мутагенный эффект латекса полностью устранялся СОД.

В целом, вышеописанные эксперименты позволили сделать заключение, что мутагенное действие корпускулярных агентов обусловлено образованием АФК, а установленный дистанционный эффект, показанный на половых клетках и клетках костного мозга, позволяет предполагать, что мутационные изменения в отдаленных органах могут быть связаны с образованием в ходе свободнорадикальных реакций продуктов перекисного окисления липидов,

Выявленные закономерности в изучении свободнорадикального механизма корпускулярного мутагенеза, а также специальные исследования особенностей лшинол- и лвдегинин-зависимой ХЯ в присутствии пылевых образцов, не вошедшие в настоящую работу ( Дурнев А. Д. 1991, I. В.'АГапаз'еу еЬ 1991 ). позволили предложить схему генерации АФК под действием корпускулярных агентов, представленную на рис. 2.

Изначально, во всех случаях в суспензии фагоцитов происходит

латекс

* с о;з

Фагоцит

цеолит'

♦ í о2]

хризотил-асбест—[0^3

•f FeO? + Н202

Рис.2. Пути генерации АФК под влиянием корпускулярных агентов.

образование супероксидного анион-радикала, который, очевидно обуславливает повреждающее действие латекса, тогда 1сак в случае хризотил-асбеста и цеолита в результате каталитических реакций супероксидного анион-радикала с металлами на поверхности частиц образуется гидропероксид водорода, а в случае хризотил-асбеста - еше и гндрокеилподобние радикалы, связанные с иоиаш .телеза, являющиеся сильны*!,га окислителями. Вероятно, к,вино эти агенты играют ведуиую роль в реализации мутагенных зффэктов минеральных образцов. ■

3. Коррекция }гутагешгш »$фегегез хорпускулзрия загрззшпчэ-гса

Установление свободнорадикаяьяого механизма повреждающего действия минеральных пшей на генетические структуры» в .частности, за счет генерации. Нг02 ц Feo" , позволило производить целенаправленный noíícK протектороз мутагенных эффектов хризотил-асбеста и цеолита среди соединений с антарадиКальиымя и хелзтирухшки свойствами.

Первоначальный скрининг выбранных соединений производили с помощью ХЛ-иетода, диализ данных, приведенных а таблице 3, показал, что аскорбиновая кислота в концентрациях 10\-4 и 10V3 . L!, а .такта рутин, байкалииат-L-лизин. байкалинат-Ь-гистидин и бемитил в

Таблица 3.

Влияние соединений с антирадикаяьными свойствами на хешлшинесцентную активность пылевых образцов.

Кон-ция Аскорби- Рутин Байкали- Байкали- Еемитил Томер-модиф-ра новая нат-Ь- нат-Ь- • зол

(М) кислота лизин гистидин

104-7 103 79 - - 124 -

104-6 103 " 68 01 70 118 105

.104-5 72 32 44 37 65 9 7

104-4 46 4 26 14 6 47

104-3 18 - ■ - - -

104-7 91 ' 99 - - 82

10\-5 99 88 78 87 90' 9?

104-5 71 55 60 60 73 ' -100

104-4 45 И 29 27 ' 9 80

104-3 26 - - - - . -

Примечание: результаты представлены в виде отношения интенсивности свечения фагоцитирующее клеток иод действием пылевых образцов ■ с применением модификаторов к аналогичному показателю без модификаторов ( » процентах-').

концентрациях 10\-5 и 104-4. Ы ингибировали прооксидантное действие хризотил-асбеста и цеолита. Исключение составил томерзол, который практически не влиял на ХЛ-активносгь цеолита, а снижение аналогичного эффекта хризотил-асбеста наблюдалось только после применения препарата в концентрации 104-4 М. . .

^Установление антирадикальных свойств у данных соединений по

отношению ic промышленным минералам определило перспективность их исследования в качестве протекторов мутагенных эффектов корпускулярных загрязнителей.

Из природных.модифшеаторов были выбраны аскорбиновая кислота н флавоноиды - рутин и комплексы байкалшгатов с аминокислотам;! лизином и гистидшюм, а из синтетических - с|армзкологические производные 2-меркаптобензимидазола бемитил и томерзол. При этом, первоначально исследовалась собственная мутагенная активность аскорбиновой кислоты и рутина ( генетическая безопасность остальных соединений была показана в НИЛ фармакогепетики НК1 фармакологии РАМ! ).

В экспериментах, проводимых в условиях in vitro, было получено, что аскорбиновая кислота в концентрации 10V4 М и рутин в диапазоне концентраций от 10Y-7 до 10\-4 М вызывают увеличение уровня аберрантных клеток в культуре цельной крови человека ( Таблица 4 ).

Кроме того, в условиях in vivo была показана мутагенная активность рутина в дозах 6.3 иг/кг и 63 мг/кг при внутркбргаинном введении препарата ( аналогичный эксперимент с использование).! пе~ рорального способа введения рутина не выявил его цктогенеткческого действия ).

В целом, полученные данные согласуются со сведениями, демонстрирующими возможность инверсии ангиоксидантных свойств в проокси-дантные, выявленными- для аскорбиновой кислоты ( И. Б. Афанасьев 1985, Vayner et al. 1984, Shamberger 1990 ) и рутина ( Л М. Вайнер и соавт. '1988. Bors 1987 ).

Результаты экспериментов по изучению модифицирующего влияния природных и синтетических соединений с антирадикальными свойствами на цитогенетическое действие пылевых частиц в условиях in vitro

Таблица 4,

амгггей&гачгоии© аффекты аскэрЭижизой кконозн к руткна £ >у*;ъаура .»¡¿щитов аёр$«&з£ШческоЯ крозк человека.

Ко-гичеггзэ клеток с зфоьйоокгыш абэрэгцжюз (.%) пос-сэ добавления соединений а' концентрациях (М):

Препарат - 10ч-7 104-6 1СЧ-5 104-4 104-3

Аскоэбат 1. 0^0. 7 2, ОН. О 3,341.3 1.540. 9 4.541.5* 0.540.5 ?У*2Я 1.010.7 6.0±1.8* 6.0±1.8* 8.542.0** 3.0+1.2

Ярлмечачие^ статистически достоверное превышение контрольного уровня: л - ? < О. 05. л* - Р < 0.01.

представлены в таблице 5,

В куям'урэ люгфсюяоз периферической крсвк человека природные ан?иоксйдангы; аскообиноз&й кислота в концентрации 104-5 И, рутин б диапазоне концентраций от 104-6 ас 104-3 Ы и байкалинат-Ь-жзия е концентрации 104-5 У сникали мутагенный эффект хризотил-асбеста, аскорбиновая кислота и рутин в диапазоне концентраций от 104-6 до 104-4 II, а Зайкадинат-и-лизин б концентрации 104-6 М умень-

шали цитогекетическую активность цеолита. Байкаяинат-Ь-гистиднн в даакая экспериментах не обладал ингибирующим действием по отношению к шнеральным аыляи.

Прй изучении ангимутагенкых свойств синтеткческих актиокси-дачтов бемитил не оказьшал модифицирующего влияния на мутагенну» активность хризотил-асбеста, но уменьшал онтогенетическое действие

Влияние соединений с антирадикалыгомм свойствами на гугагечное действие минеральных пылей з культуре .шмфоцигоэ периферической

крови человека.

Модификатор кодкф-ра (М) Хризотил-асбест Цеолит

Количество клеток е повреждениями 1 (%)

Контроль 5.5 * 1.7 9.0 ± 2.0

Аскорбиновая • кислота 104-6 ' 104-5 104-4 Ю4-3 4.0 1.3 3. 3 5. 5 + 1.0 4 0. 7 ** ±1.0 ±.1.4 ■ 4.0 * 4.0 ± 2.5 ± 6.5 ± «* 4 1с л 1. 4 А. * *

Рутек' 10\-7 10\-б 104-5 104-4 104-3 2.5 2.0 2.0 0.6 ± 1.1 * ± 0.9 л 4 1.0 * £ 0. 6 4. 5 * 4. 0 ± 3.5 г 3.0,± 1.5 1.4 1.3 1„ £ Я Л

Контроль 6.3 ; 1.3 8.5 ± л.'?

Еайкаликат--Ь-лизан 104-3 104-5 104-4 4. 0 1. '5 3. 5 ± 1. 4 ± 0. 7 Й* а 1.3 2. 5 + 4 5 + 5. 0 ± 1. 1 1. 5 Г 5 л

Вайкалина?--Ь-гйстмкйн 104-8 104-5 104-4 3.5 ?.о 5.0 ±1.3 ± 1.а ± 1.5 с + 5. 5 ± 6.0 ± 1.8 1.5 И?

Контроль 7.3 ± 1. е 9. 2 + 1 2.

Наметил 1С4-? 104-6 104-5 104-4 7. 0 + 1. 8 6. ? ± 1. 4 4.7 А 1.2 б. 7 ± 1.3 4,0: 6.3 + 5. 3 А 7 ± 1.4 1. 4 Л «•> л. О 1.2 м л

Контроль б. 3 £ 1.3 9.2 ± 1.2

Тоиерзол 104-7 104-6 104-6 104-4 5.0 4 1.5 3.3 1 0.9 Й 3.0 ± 1.0 А 4.5 1 1.5 Я. 5 ± 9.0 + 4.7 + - 7. 0 ± 2.1 2.0 1. г 1.3 А

Примечание: статистически значимая модификация мутагенных аффекто® пьшей: а - Р < 0.05, ** - Р < 0.01, л** - ? < 0.001,

- во -

цеолита и концентрациях Ю\-7, 10Ч-Б и 1ÜV4 tí, а тошрзол снюкал мутагенные зЦ4екти хризотил-асбеста в концентрациях tOY-B, 104-5 }J и цеолита в концентрации 10\-Ь í¿

В ю к время, изучение модифицирующих способностей соедине кий с антирадикальныыи свойствами в условиях in vivo на примере хризотил-асбеста выявило существенные расхождения с результатами,

полученными а условиях in vitro ( Рис. 3 ).

% ■

псе е. •

м a TfiTfii

4 ■ Ъ-

г-

I ■

So <Я <$ 6. J 63 1.8 <£ 40 So (ИГДГ)

Рис. 3. Модифицирутазе влияние природных и синтетических соединений ка мутагенные эффекты хризотил-асбеста в клетках коотиогс мозга кашей.

Ни аскорбиновая кислота, ни рутин, ни томерзол достоверно не еншали цитогелетичеекке эффекты хризотил-асбеста. И лишь фармакологический препарат бемитил полностью устранял мутагенное воздействие пылевых волокон как в клетках костного молга. так и в клеткаа перитонеаяьиого экссудата шкап.

Очевидно, различия в' антимутагешгон действии исследовании^ соединений в условиях in vitro и in vivo miujio достоверно объяс-

нить только на основе специальных исследований. Тогда как в рамках напей работы валю отметить, что различия в действиях модификаторов in vitro и in vivo позволяют подчеркнуть целесообразность научения модификаторов мутагенной активности пылей именно в условиях

in vivo с помощью выше охарактеризованной модели.

* * *

Совокупность результатов представленной работы позволяет указать на пригодность использованных модифицированных цитогенетичес-ких методов для оценки мутагенной активности корпускулярных загрязнителей и отметить более высокую кластогенную активность цеолита по сравнении с хризотил-асбестом.

Различия в проявлении «.мутагенных эффектов частиц этих минералов очевидно обусловлены неодинаковым механизмом реализации их повреддагаего действия, связанного с генерацией свободных радикалов кислорода и образованием стабильных окисляющих агентов: под влиянием цеолита происходит генерация гидропероксида водорода, а под влиянием хризотил-асбеста -.гидропероксида водорода и гидрок-силподобных радикалов, связанных с ионами келеза (см. раздел 2).

Ваяно, что следствием выявления свободнорадикального механизма повреждающего действия исследованных агентов гютт явиться изучение роли генотипа в проявления их зф^езшзз, т.к. соврегетные сведения о регуляции окислителъио-восстаповительиого баланса клэ-ток. организации их антиоксядаяташ систем í II '1 Абрамова, Г. И. 0к~ сенгендлер 1985. Hall)well. Gutteridge 3984 ) позволяют обоснованно предполагать, что популяция человека генетически гетерогенна по чувствительности к действию прооксидантов. Доказательство этого

положения позволило бы объективно прогнозировать риск контакта человека с повреждающими пылевыми агентами. В практическом плане это означает раннюю профилактику отдаленных генетически обусловленных последствий контакта человека с минеральными загрязнителями.

Другим возможным направлением профилактики негативного ■ влияния мутагенных пылей на здоровье человека является разработка средств зашиты генома от повреждающего действия пылей ( А. Д. Дурнзв 1991 ). •

В рамках настоящей работы с этой целью были исследованы аскорбиновая кислота, рутин, байкалинаты, а также фармакологические соединения бештил н томераол, взаимосвязь между антирацикальнымн и антимутагенными свойствами которых была показана ранее ( Э. А. Ни-гарова 1989, А. Д. Дурнев 1991).

, В целом, полученные данные указывают на то, что разработка корректоров мутагенной активности конкретных ксенобиотиков не мо-дат решаться с позиции предполагаемого в литературе ( У. К. Алекперов 1934 ) универсального механизма защитного действия и в каждом отдельном случае должна рассматриваться как отдельная самостоятельная задача

Завершая обсуждение полученных результатов, следует отметить, что дальнейшее внедрение в практику исследования пылевых патологий генетических подходов и методов можг углубить фундаментальные представления о патогенезе пневмокониозов, усовершенствовать регламентирование содержания пылей в разных средах, предложить новые методы профилактики и разработать фармакологические средства для лечения легочных заболеваний пылевой этиологии.

В целом, полученные результаты позволяют сделать следующие

РКГ-'ЛМ:

- 23 -ВЫВОДЫ.

1. Доказана пригодность цитогенетических методов in vitro и in vivo для оценки мутагенной активности корпускулярных загрязнителей. Методами учета хромосомных аберраций установлены мутагенные эффекты волокон хризотил-асбеста и частиц цеолита ( 0.01 и О.05 мг/мл ) в культуре цельной крови человека и у мышей линии C57BL/6 при внутрибрюшинном введении этих пылей (50 мг/кг).

2. Мутагенное действие волокон хризотил-асбеста и частиц цеолита in vivo имеет генерализованный характер и регистрируется в клетках перитонеального экссудата и костного мозга мышей, кроме того цеолит вызывает доминантные летальные мутации в половых «слетках этих животных.

3. Онтогенетический эффект пылей хризотил-асбеста и цеолита зависит от длительности их экспозиции в организме тавотных. В 4-х недельном эксперименте установлено, что цеолит ( 50 мг/кг ) вызывает прогрессирующее увеличение выхода аномальных метафаз на протяжении всего срока, максимальный эффект хризотил-асбеста ( 50 мг/кг ) отмечается на 24 - 48 часу и далее сохраняется на постоянном уровне.

4. С помо1дыо метода хемшшыинесценции й модификации цитогенетичес-. ких эффектов антирадикальньии ферментами ( супероксиддисмутаза и каталаза ) показало, . что мутагенное действие пылей хризотил-асбеста и цеолита опосредовано активными формами кислорода.

5. Аскорбиновая кислота, рутин, байкалинат-L-лизин, байкали-нат-Ь-гистидин, бемитил и гомерзол в концентрациях 10\-5 -104-3 М иигибируот образование активных форм кислорода, индуцированное в суспензии- фагоцитов пылями хризотил-асбестом и цеолитом.

5. Аскорбиновая кислота, рутин, байкалинат-L-лизин и томерзол, в зависимости от концентрации ( 104-6 - 10V3 М ), снижают и устраняют цитогенетическое действие волокон хризотил-асбеста и частиц цеолита в культуре цельной крови человека.

7. Бемитил ( 1.8 и 18 мг/кг ) при пероральном введении предотвращает повреждающее действие волокон хризотил-асбеста на клетки костного мозга и перитонеального экссудата мышей.

- 24 -

акоои (шашшавшх рлшг по тше ишгртацщ

1. Дурнев а. Д , Даугель-Дауге я о. , Корина Л. г., Середенин с. б. // Модификация мутагенного эффекта хризотил-асбеста аскорбиновой кислотой / Всесоюзный симпозиум "Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ". Ленинград, 1989 год. - Л. - 1989. - С. 36

2. Дурнев А. Д. , Даугель-Дауге Е 0., Коркина Л. г. // Особенности тестирования на мутагенность промышленных пылей хризотил-асбеста и цеолита / "Экологический мониторинг состояния окружающей среды". Материалы секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера". Караганда, 1990 г. - Караганда. - 1990. - С. 44

3. Дурнев А. Д., Даугель-Дауге IL 0. , Коркина Л. Г. , Середенин С. Б., Величковский Б. Т. // Особенности проявления мутагенных свойств промышленных пылей хризотил-асбеста" и цеолита / 1Аэтодические и методологические вопросы генетики. - Томск, из-во Томского шд. ин-та. - 1990. - С. 73-81

4. Снигирева Т. В., Лурье Б. Л. , Даугель-Дауге Н. О. , Коркина JL Г. , Величковский Б. Т. // Особенности цитотоксического действия цеолит-содержащего туфа Шивыртуйского месторождения / "Перспективы применения цеолитсодержащих туфов Забайкалья". - Чита. - 1990.

. С. 131-136

•5. Снигирева Т. В., Коркина Л. Г. , Величковский Б. Т., Соодаева С. к. , Даугедь-Дауге Н. О. // Исследование физико-химических,, цито-токсичзских и мутагенных свойств природных цеолитов / "Использование природных цеолитов в народном хозяйстве". Материалы Всесоюзного совеветия (Кемерово-Новостройка), апрель 1990 г. - Новосибирск. - 1991. - С. 122-129

6. Korkina l. q., Durnev A. D., Sus.lova T.B. , Cheremisína Z. p. , Daugel-Dauge N. 0. , 1, В. ATanas'ev // 0>:v№ii radical-mediated nütagemc effect of asbestos on human Ivnvt.oovtes: suppression bv oxygen radical scavengers f Mutat. Res. • ,\m. : V. 265. - P. 245-253