Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование лигнификации у пшеницы при грибном патогенезе

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование лигнификации у пшеницы при грибном патогенезе"

• ^ /

На правах рукописи

ЯРУЛЛИНА ЛЮБОВЬ ГЕОРГИЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИГНИФИКАЦИИ У ПШЕНИЦЫ ПРИ ГРИБНОМ ПАТОГЕНЕЗЕ

* (03.00.12 - Физиология растений)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических-наук

Уфа - 1997

Работа выполнена в лаборатории биохимии и генетики иммунитета растений Отдела биохимии и цитохимии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

А.М. ЯМАЛЕЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.Р.Ахметов доктор сельскохозяйственных наук, профессор Н.А.Галеев

Ведущая организация:

Институт биологии Казанского научного центра РАН

Защита диссертации состоится 1 июля 1997 г. на заседании диссертационного совета К 064.13.09 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Башкирском государственном университете по адресу: 450074 г.Уфа-74, ул Фрунзе, дом 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан Л мая 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Г.Г. Кузяхмстов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалыюсть проблемы. Болезни растений ежегодно наносят сельскому хозяйству большой материальный ущерб. В связи с этим повышение устойчивости продовольственных культур к патогенным микроорганизмам остается одной из важнейших проблем растениеводства. Решение этой проблемы и значительной степени зависит от раскрытия .естественных механизмов устойчивости растения-хозяина.

Известно, что физиолого-биохимические основы устойчивости к патогенам связаны с неспецифическими защитными реакциями растений против возбудителей болезней [Ильинская, 1991]. Одним из таких защитных ответов растений является образование и отложение лигнина в местах внедрения фи-гопатогена [Vance et al., 1980]. Лигнин - это высокомолекулярный трехмерный полимер фенольной природы [Запрометов, 1993]. Особенностью лигни-нов является устойчивость к ферментативному разрушению, что препятствует как внедрению патогена в растительные ткани, так и его развитию в них (Barber, Ride. 1982].

Лигнификацию считают важным фактором устойчивости растений [Acada. 1985]. Однако, неизвестно связана ли устойчивость растений с определенным уровнем накопления лигнина в тканях. Научные работы, подтверждающие защитную роль лигнина и раскрывающие механизмы его синтеза при патогенезе, не отличаются полнотой. В этом плане представляется весьма важным, наряду с изучением процессов лигнификации в тканях растений с различном устойчивостью при инфекционном процессе, исследования гормональных изменений, как центрального звена регуляции и проявления защитных реакций.

' Существенный интерес представляет также поиск путей искусственной интенсификации лигнификации. Познание механизмов воздействия на биосинтез лигнина поможет создать реальную возможность повышения устойчн- . вости растений к фитопатогенам.

Цель и задачи исследований. Настоящая работа посвящена изучению процессов и некоторых механизмов лигнификации в связи с устойчивостью пшеницы к грибным патогенам. Исходя из поставленной цели, в задачи исследований входило:

-изучение постинфекционных изменений в содержании лигнина в растениях с различной устойчивостью;

-определение активности ферментов лигнификации при патогенезе у сортов, различающихся по устойчивости;

- сравнительный анализ баланса фитогормонов в инфицированных растениях устойчивых и восприимчивых сортов;

-изучение влияния химических и биологически активных соединений на лигнификацию и содержание фитогормонов в растениях.

Научная новизна. Установлено, что устойчивость пшеницы к грибным патогенам Septoria nodorum Berk, и Helminthosporium sativum Pam. связана с накоплением лигнина. Показано, что повышение количественного уровня лигнина в устойчивых сортах пшеницы при патогенезе обусловлено высокой активностью фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) и повышенным содержанием фитогормонов цитокининовой природы.

Изучены некоторые аспекты гормональной регуляции лигнификации у устойчивых и восприимчивых сортов пшеницы. Выявлено, что подавление

X.

активности ФАЛ и снижение накопления лигнина у восприимчивых растений определяется биологической особенностью фитопатогена. При патогенезе, вызванном септорией, подавление лигнификации может быть связано с по- • вышеннем содержания индолилуксусной кислоты (ИУК), а при гельминто-спориозной корневой гнили - абсцизовой кислоты (АБК).

Получены новые данные о способности иммуностимулятора бисол-2 и системного фунгицида байтан индуцировать лигнификацию в растениях. Показано, что одним из механизмов действия данных соединений является стабилизация баланса фитогормонов ИУК и АБК в растениях пшеницы в условиях грибного патогенеза.

Практическая значимость работы. Результаты исследований расширяют знания о молекулярных механизмах защитных реакций растений. Полученные в работе данные могут быть использованы для направленного поиска и разработки новых средств защиты растений, основанных на стимулировании естественных механизмов устойчивости.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Всесоюзной научно-практической конференции "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням" (Уфа, 1988), на I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), па Всероссийском съезде по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность (Санкт-Петербург, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов. Работа изложена на 121 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков, 15 таблиц и список литературы, включающий 221 работу.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили растения рода Triticum L. на различных стадиях онтогенеза. В лабораторных опытах семена перед посевом стерилизовали 70%-ным этанолом, промывали дистиллированной водой и выращивали в эмалированных кюветах на речном песке или в смеси с почвой (1:1, г/г) на светоплощадке (фотопериод 16 ч, освещенность 16-18 тыс.лк.).

Заражение проростков септорией проводили опрыскиванием' их суспензией спор.(1 млн/мл) с 1%Твин-20 [James, 1971]. Поражение растений корневой гнилыо вызывали поливом основания стеблей суспензией конидий гриба Н.sativum [Кумачева, Попова, 1976], либо внесением спор патогена в землю вместе с семенами (полевые опыты). Поражение растений септориозом и корневой гнилью определяли по Пыжиковой, Карасевой [1985] и Чулкиной [1985]. '

В качестве индукторов защитных реакций использовали : иммуности' мулятор бисол-2 (замачивание семян в 0,002% растворе, 3 ч) и системный фунгицид байтан (предпосевное опудривание семян из расчета 2 кг/т).

Активность ФАЛ и ТАЛ определяли спектрофотометрически [Higuchi, 1966; Hyodo et al.. 1978].

Анализ содержания лигнина проводили согласно описанным в литературе методикам [Johnson et al., 1961; Alibert, Boudct, 1979].

Ферментные экстракты свободной, клеточностеночной и ионносвязан-ной форм пероксидазы получали по методике Bireska и Miller [1974].

Для определения концентрации белка в экстрактах использовали метод Бредфорда [Bradford, 1976].

Определение протеи'наз проводили по методу Эрлангера [196 ^..Активность ингибиторов трипсина определялась по методике Гофмана и Вайсблая [1975].

Содержание ИУК, АБК и цитокининов в растительном материале определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) [Кудоярова и др., 1986, 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Динамика накопления лигнина и активности ферментов его биосинтеза в . листьях пшеницы при септориозном патогепезе.

Лигнинам отводится важная роль в сопротивлении внедрению и физическом блокировании внедрившихся патогенов [Vance et al., 1980; Barber, Ride, 1982]. Для получения определенного ответа об участии лигнификации в защитных реакциях пшеницы на инфицирование S.nodorum нами изучено изменение содержания лигнина в постинфекционный период в различных по устойчивости к патогену сортах. В качестве относительно устойчивого к сеп-ториозу был выбран сорт пшеницы Диамант, а в качестве восприимчивого -Саратовская 29. На рис. 1а показана динамика накопления лигнина в листьях после заражения 10-дневных проростков.

Результаты экспериментов свидетельствуют, что инфицирование проростков пшеницы септорией индуцирует накопление лигнина в листьях обоих сортов. Однако, по содержанию лигнина у восприимчивого сорта контрольные и зараженные растения существенно не различаются, как у устойчивого сорта. На 6-е сутки после инфицирования содержание лигнина у устойчивого сорта относительно контроля возрастает в два раза, а у проростков восприимчивого сорта это увеличение составляет лишь 30%.

Представлялось вероятным, что накопление лигнина при патогепезе может происходить вследствие активации ферментов фенольиого обмена. Начальным этапом синтеза лигнина является дезаминировапие ароматических аминокислот фенилаланпна и тирозина, которое катализируется ферментами ФАЛ и ТАЛ [Gross, 1979). Исследования показали, что активность ФАЛ в интактных тканях устойчивого сорта значительно Выше, чем в тканях растений восприимчивого сорта (Рис. 16). -Инфицирование растений пшеницы возбудителем септориоза приводит к активации ФАЛ, при этом степень активирования фермента зависит от устойчивости сорта. Значительный интерес представляет ответная реакция растения в инкубационный период болезни. Так, в проростках устойчивого сорта уже через 24 ч после заражения активность ФАЛ, по сравнению с контролем, повышается в два раза. Что касается

г 2 3 4 5 6 9 заражения б

□осле заражения

0123456 '7 89

Ряс Л. Накопление лигнина(а) и активность ФАЛ(б) в

контрольных(---) и эараженных(-) септорией

листьях пшенлцк.

восприимчивого сорта, то первый пик активности ФАЛ прослеживается лишь на вторые сутки после заражения и активирование ФАЛ в этом случае оказывается значительно ниже. На следующем этапе инфекционного процесса, характеризующегося ростом патогена в растительных тканях и появления внешних симптомов болезни (6-е сутки после заражения), активность ФАЛ у проростков устойчивого сорта увеличивается относительно контроля в 3 раза. Последующее увеличение активности фермента в проростках восприимчивого сорта также прослеживается на б-е сутки после инокуляции, но уровень активности ФАЛ и в этой точке значительно ниже, чем у устойчивого сорта. Активация ФАЛ .через 24 ч после инфицирования свидетельствует о более раннем проявлении защитных реакций у устойчивого сорта па внедрение фи-топатогена [Lyons, 1993]. Повышение активности фермента на более поздних этапах патогенеза связано с интенсификацией лигнификации (Рис. 1а)." Можно предположить, что более ранняя и энергичная активация ФАЛ позволяет клегкам устойчивого растения накапливать высокий уровень лигнина, необходимый для защиты от патогена.

Существенных изменений активности ТАЛ в ходе патогенеза как в растениях устойчивого, так и восприимчивого сортов не наблюдается. Возможно. это связано с тем, что в растениях существуют разные пути синтеза лигнина, один из которых связан с индуцированием ФАЛ-лиазной активности [Gowles et al., 1989].

Лигнификация - сложный многоступенчатый процесс, на завершающем этапе которого может принимать участие пероксидаза [Mader et al, 1986]. Нами исследована активность пероксидазы различной локализации в клетке. В начале удельная активность пероксидазы в интактных растениях устойчивого сорта в 2 раза выше, чем у восприимчивого сорта. Заражение вызывает увеличение активности фермента как в проростках восприимчивого, так и устойчивого сорта. Однако, у устойчивого сорта высокая активность пероксидазы сохранялась на протяжении всего изучаемого периода патогенеза, а у восприимчивого сорта повышение активности фермента в зараженных проростках становилось менее существенным по сравнению с незаряженными.

Известно, что пероксидазная активность неравномерно распределена в органах растения и характеризуется определенной тканеспецифичностью и различной локализацией в клетке [Андреева, 1988]. В связи с этим, определенный интерес представляет изучение активности фермента, находящегося в свободном, ионносвязанном, а также локализованного в клеточной стенке. Исследования показали, что у здоровых проростков устойчивого сорта активность всех форм пероксидазы значительно выше, чем у восприимчивого сорта. На 6 сутки после инфицирования активность фермента повышается в различной степени, что зависит от устойчивости сорта. Так, у обоих сортов наблюдается повышение пероксидазной активности свободной и клеточно-стеночной фракции. Активность иониосвязаиной фракции повышается лишь у устойчивого сорта и практически не изменяется под влиянием заражения у восприимчивого сорта. Известно, что in vivo в образовании лигнина участвуют лишь изозимы, локализованные в клеточных стенках [Mader et al., 1975]. Вероятно, активность клеточносгеночной пероксидазы и незначительное повышение активности ионносвязанной фракции сопровождается замедлением синтеза лигнина у восприимчивого сорта и соответственно количество новосинтезированного лигнина оказывается недостаточным.

Таким образом, постинфекционные изменения в содержании лигнина и активности ферментов ФАЛ и пероксидазы имеют однотипный характер. Полученные данные позволяют заключить, что устойчивость пшеницы к сеп-ториозу связана с лигнификацией, которой приписывается роль фактора, создающего механический барьер на пути распространения патогенов. Эффективность защитной реакции связана со скоростью накопления лигнина, что определяется активностью ферментов его биосинтеза.

Содержание Фитогормонов в растениях гппениды при инфицировании

септориозом.

Механизмы, с помощью которых регулируется биосинтез лигнина в растениях при патогенезе еще не раскрыты. Патогены могут осуществлять свое влияние на геном растения-хозяина посредством фитогормонов, которые либо сами выделяют в ткани растения, либо индуцируют их образование в пораженном растении [Pegg, 1985]. Известно, что ответ растения на многие стрессовые воздействия, в том числе патогенез, регулируется также фитогор-монами [Муромцев и др., 1987]. В связи с этим мы исследовали динамику содержания ИУК, АБК, цитокининов в листьях и корнях у растений различающихся по устойчивости к S.nodorum. Заражение проростков восприимчивого сорта Саратовская 29 приводит к повышению содержания ауксинов в листьях (рис.2а). В инфицированных растениях устойчивого сорта содержание ИУК обнаруживается на уровне контрольного варианта.

Повышение содержания ауксинов в тканях может происходить в результате секреции ИУК патогеном [Кобыльский и др., 1990] и за счет индукции грибом синтеза растительного ауксина [Волынец, 1990]. Повышение содержания ИУК в листьях растений восприимчивого сорта свидетельствует о суммировании ИУК различного происхождения. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о содержании ИУК в корнях инфицированных растений восприимчивого и устойчивого сортов. В случае с заражением растений грибом S.nodorum в корнях не наблюдается повышение содержания ауксинов. Возможно, что высокое содержание ИУК в тканях ра£тений восприимчивого сорта подавляет активность некоторых ферментов, например, ферментов лигнификации [Hugner, 1990]. ФАЛ является ключевым ферментом первичного синтеза лигнина [Maule, Ride, 1976]. Способствуя накапливанию ИУК в тканях растений восприимчивого сорта гриб S.nodorum, вероятно, ин-гибирует накопление лигнина.

Нами изучалась также динамика содержания АБК, как возможного антагониста ИУК в регуляции физиологических процессов [Кефели, Протасова, 1988]. Оказалось, что септориозная инфекция не вызывает значительных из-

ИУК,нг/'г

'Л)

=о Л

■ю

Саратовская 29

Г.7,

у/,

_Сутки посла заражения У

нг/г

нг/г

Саратовская 29

г*Й

Диамантг

-Сутки

сосле заражения

| | - контроль". У7\ ' заражение

. Сутки

посла заражения

Рис.2.. Содержание ауксинов(а) и цитокининов(б) в листьях пшеницы при сопториозе.

менений содержания АБК в листьях как у устойчивого, так и у восприимчивого сорта. Это свидетельствует о том, что в местах внедрения и локализации гемибиотрофного патогена процессы нормального метаболизма не угнетаются [Мелехов, 1985].

Заражение пшеницы грибом S.nodorum вызывает повышение содержания цитокининов в инфицируемых тканях, более существенное у устойчивого сорта, чем у восприимчивого (рис.26). Анализ динамики накопления лигнина (рис. 1а) и содержания цитокининов выявил однозначную зависимость между уровнем этих фитогормонов в тканях растения и накопление в них лигнина. Кроме того, экспериментами в культуре изолированных клеток и тканей показано стимулирующее влияние гормонов цитокининовой природы на процессы лигнификации [Запрометов, 1993]. Сопоставляя полученные данные можно заключить, что у устойчивого сорта значительное накопление лигнина при септориозе обусловлено повышенным содержанием цитокининов, а также относительно стабильным балансом ИУК и АБК в растении.

Постинфекционные изменения активности ФАЛ и содержания лигнина в пшенице при заражении Н.sativum.

Известно, что характер защитных реакций растений определяется типом пищевой специализации патогена [Морозов, 1992]. В связи с этим мы исследовали особенности лигнификации у пшеницы при инфицировании грибом Н.sativum, который в отличие от S.nadorum может более успешно развиваться на отмерших растительных тканях, т.е. проявляет некротрофные свойства [Чулкина, 1985]. Этот патоген поражает корни и основание стебля растений.

Десятидневные проростки, различающиеся по устойчивости к патогену, заражали суспензией конидии гриба. В качестве устойчивого образца был выбран сорт Заря, а восприимчивого - Московская 35. Корни и листья фиксировали с интервалом 3, 6, 9 дней после инокуляции.

Анализируя экспериментальные данные постинфекционных изменений активности ФАЛ и содержание лигнина в корнях можно заметить, что ответная реакция растения определяется типом устойчивости сорта (Табл.1). У

устойчивой пшеницы она состоит как бы из двух этапов. На раннем этапе патогенеза (3-й сутки после заражения) активность ФАЛ возрастает в 2 раза, но при этом не происходит существенного повышения содержания лигнина. Второй этап защитной реакции начинается в период проявления внешних симптомов заболевания, когда активность ФАЛ, продолжая усиливаться, повышается более чем в 2.5 раза (9-е сутки после заражения), что приводит к накоплению лигнина в корнях (около 40%). В растениях восприимчивого сорта активация ФАЛ происходит лишь в первые дни заболевания (3-й сутки после заражения), в дальнейшем активность фермента снижается и повышения содержания лигнина не происходит.

Таблица 1

Активность ФАЛ (ед.акт. г1) и содержание лигнина (мг г1) в корнях пшеницы,

Сутки Вариант сорт Заря сорт Московская 35

после ФАЛ' лигнин ФАЛ лигнин

иноку-

ляции

3 Контрольные растения

Инфицированные растения. % к контролю 6 Контрольные растения

Инфицированные растения % к контролю 9 Контрольные растения

Инфицированные растения % к контролю

22.4±0.9 0.30±0.01

48.6±1.9 0.33±0.02

217 110

32.5±1.6 0.30±0.02

52.0±2.1 0.39±0.02

160 130

14.7±0.4 0.35±0.03

40.5±2.0 0.48±0.04

276 137

19.0±0.5 0.20±0.01

30.4±1.2 0.2110.01

160 105

19.6±0.8 0.25±0.01

23.5±1.1 0.27±0.01

120 104

10.Ш.З 0.35±0.02

10.9±0.2 0.36±0.01

108 102

Значительных изменений активности ТАЛ в корнях растений у обоих сортов пшеницы не наблюдается. Существует мнение об органоспецифи-ческом использовании тирозина в качестве предшественника фенольных сое-

динений [Lyons, 1993]. Считается, что в корнях он в основном используется для образования ароматических аминов, в листьях же может служить предшественником фенольных соединений.

Активация ФАЛ на раннем этапе патогенеза свидетельствует о схожести реакции растительных клеток обоих сортов на внедрение фитопатогена [Гютерев, 1994]. Повышение активности фермента у устойчивого сорта на более поздних этапах патогенеза связано с ускорением процессов формирования защитных механизмов, о чем свидетельствует усиление накопления лигнина в корнях.

Известно, что заражение вызывает изменение метаболизма в органах, отдаленных от места проникновения и развития патогена [Raulech, 1974]. Мы определяли активность ФАЛ и ТАЛ в листьях. Заражение вызывает увеличение активное™ ФАЛ и ТАЛ в листьях устойчивого сорта, причем, активация ФАЛ и ТАЛ. усиливается в процессе патогенеза. В листьях растений восприимчивого сорта инфицирование приводит к снижению активности ФАЛ и ТАЛ. Отсюда можно предположить, что повышение активности ФАЛ и ТАЛ в листьях устойчивого сорта связано с тем, что в них происходит синтез предшественников, либо промежуточных соединений, которые транспортируются в корни и ускоряют процесс лигнификации. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что у устойчивого сорта на ранних этапах развития болезни имеет место изменение в метаболизме растения-хозяина, направленное на усиление защитных реакций, как в местах внедренияпатоге-на, так и в органах, удаленных от них.

Н.sativum относится к патогенам, способным вырабатывать фитотокси-ны, которые дезорганизуют нормальный метаболизм клетки [Чулкина, 1985]. Выделение патогеном фитотоксинов можно рассматривать как часть общей стратегии, направленной на преодоление защитных систем растения-хозяина, возникающих в ответ на проникновение инфекции [Бреттелл и др., 1990]. Можно предположить, что в растениях восприимчивого сорта происходит, подавление процессов лигнификации в местах внедрения патогена фитоток-еннами гриба. Устойчивый сорт способен противостоять действию токсинов,

поэтому патогенный гриб не может значительно нарушить метаболизм устойчивых растений, в том числе направленный на защиту клеток от фито-патогена. Такое предположение позволяет объяснить тот факт, что в тканях восприимчивого сорта происходит подавление активности ферментов ФАЛ, ТАЛ и ингибирование накопления лигнина в ходе патогенеза.

Ингибиторы протеолитических ферментов как компоненты защитной

системы растения.

Известно, что проникновение и локализация H.sativum осуществляется в корнях и прикорневой части растений [Чулкина, 1985]. Предполагается, что внедрению и развитию гриба в растительный организм препятствуют ингибиторы протеолитических ферментов [Boisen, 1983). Представлялось вероятным, что действие фитотоксинов патогена направлено также на преодоление и подавление данной защитной системы.

Мы исследовали активность БАПА-гидролизующих ферментов, ингибиторов трипсина в листьях, корнях и корневых шейках проростков пшеницы с различной устойчивостью при инфицировании их H.sativum.

Как видно из рис.ЗА заражение растений грибом приводит к изменению протеолитической активности в тканях. Инфицирование патогеном H.sativum значительно повышает протеолитическую активность в проростках восприимчивого сорта. Различия между зараженными и незаряженными растениями обнаруживаются на 3-й сутки после инокуляции и сохраняются в течение всего срока опыта. Вероятно, повышение протеолитической активности в тканях зараженных растений может быть обусловлено и действием протеиназ развивающегося патогена. Б зараженных проростках устойчивого сорта существенных изменений активности протеиназ не обнаруживается.

Нами установлено, что проростки устойчивого сорта характеризуются более высокой активностью ингибиторов протеиназ, чем проростки восприимчивого сорта (рис.ЗБ). Однако, на 9-е сутки после инфицирования активность ингибиторов протеиназ у зараженных растений восприимчивого сорта снижается относительно незараженных растений. Причем, в растениях кон-

-контроль -»-заражение

мИЕ/мг белка

Заря

Б • Московская 35

Сутки

посла заражения

Заря

мКЬ'/мг белка 20

Московская 35

* >л

'/1 У/ л

//.

У, /

Ул

3 к 3

2

Сутка после заражения

Рис.3. Активность протеиназ в корнях(А).ингибиторов трипсина в корневых шейках(Б) и листьях(В) при заражении корневой гнилье.

I I - активность свободных \//\ - активность связанных ингибиторов ингибиторов

К - незараденные проростки 3 - зараженные проростки

(контроль)

трольного варианта активность ингибиторов за трое суток повышается примерно в 2 раза, а в зараженных растениях - не меняется. Вероятно, у растений восприимчивого сорта имеет место подавление синтеза белков-ингибиторов факторами, секретируемыми патогеном. Подтверждением этому служат также данные об активности ингибитора трипсина в листьях проростков (рис.4В). Инокуляция патогеном растений устойчивого сорта оказывает незначительное влияние на активность ингибиторов протеиназ. Активность свободных и связанных ингибиторов в листьях зараженных растений у устойчивого сорта обнаруживается на уровне незараженных проростков. Заражение растений восприимчивого сорта приводит к снижению активности свободных форм ингибиторов трипсина, т.е. способных участвовать в защитных реакциях.

Исследование баланса фитогормонов в механизмах устойчивости пшеницы к корневой гнили.

Результаты наших исследований подтверждают существующее в литературе мнение о том, что Н.sativum относится к патогенам, способным супрес-сировать защитные реакции [Метлицкий и др., 1986]. Однако механизмы подавления защитных реакций остаются до сих пор мало изученными.

Нами исследовалось содержание фитогормонов ИУК. АБК, цитокини-нов в местах внедрения патогена (корни) и листьях пшеницы. В инфицированных растениях восприимчивого сорта происходит резкое снижение количества ИУК в ходе патогенеза. В корнях устойчивой пшеницы после небольшого снижения содержания ИУК на раннем этапе заболевания (3-й сутки после инфицирования), в последующие сроки фиксации существенных различий между опытными и контрольными растениями не наблюдалось.

Исследование динамики содержания АБК выявило тенденцию к повышению количества этого фитогормона как в корнях (рис.4а), так и в листьях растений восприимчивого сорта. Существенных изменений уровня АБК в инфицированных растениях устойчивого сорта в ходе патогенеза мы не наблюдали. В корнях и листьях устойчивой пшеницы при патогенезе выявлено зна-

АБК,нг/г

40 35

¡0 5

Московская 35

яг/г

ю 16

13

й

1

I

нг/г-

Сутки послэ гасядеиыэ 9

Московская 35

Сутти

после заоалонил

Л 6

Заря

г1

1

Сутки поело эаражеимя

Рас.4. Содержание АБК(а) и цигокининов(б) в корнях •пшеницы пои за радении корневой гнилью. | | - контрольные растения .

¡/¿^ - инфицированные растения

читсльное увеличение содержания цитокининов (рис.4б). У зараженных растений восприимчивого сорта в местах внедрения патогена (корни) происходит резкое снижение уровня цитокининов в ходе развития болезни, при отсутствии существенных изменений в содержании этих гормонов в листьях.

Особенностью некротрофного патогена Н.sativum является его способность развиваться на отмерших растительных тканях, он не нуждается в притоке питательных метаболитов растения к месту своей локализации, а также для нормального продуцирования их клетками растения-хозяина [Морозов, 1992]. Этим можно объяснить тот факт, что в инфицированных корнях восприимчивого сорта происходит резкое снижение количества ИУК уже в начале патогенеза, а на более поздних этапах - и в листьях. Падение содержания ИУК является показателем замедления активности метаболических процессов [Полевой, 1986]. Одним из характерных признаков замедления метаболических процессов считается также повышение содержания АБК [Мелехов, 1985]. Дезорганизация фитотоксинами нормального метаболизма растительной клетки у восприимчивого сорта приводит к активизации развития в ней патогена. Известно, что АБК подавляет лигнификацию в культуре изолированных клеток и тканей [Запрометов, 1993]. Вероятно, накапливая АБК в растениях и одновременно ингибируя синтез цитокининов в корнях восприимчивого сорта, патоген Н.sativum подавляет в них лигнификацию.

Отсутствие существенных изменений в содержании ИУК и АБК в инфицированных. растениях устойчивого сорта свидетельствует о его способности противостоять действию токсинов патогена и сохранять на довольно стабильном уровне метаболизм целого растения, что способствует успешному протеканию защитных реакций. Доказано, что цитокинины усиливают синтез белка в клетках [Кулаева, 1977], повышают устойчивость клеток к неблагоприятным факторам, в том числе к грибной и вирусной инфекции [Муромцев, 1979]. Усиление синтеза белка под действием цитокининов приводит к тому, ■ что увеличивается новообразование структурных и ферментативных белков. Повышение содержания цитокининов, вероятно, усиливает синтез ФАЛ и

ТАЛ, и как результат - накопление лигнина в непосредственной близости от инфекционных структур и локализация патогена.

Индукция лигнифнкации в проростках пшеницы под действием бисола-2 и байтана

В защите растений от грибных инфекций используются различные индукторы защитных реакций растительных объектов: фунгициды системного действия, иммуностимуляторы, индукторы устойчивости биогенной природы [Метлицкин й др., 1978]. Перспективным направлением в защите растений от грибных патогенов является использование иммуностимуляторов - веществ, повышающих невосприимчивость растений к возбудителям болезней, но не токсичных для патогенов in vivo [Рогидин, 1975]. Предполагается, что повышение устойчивости растений к болезням под действием иммуностимуляторов связано с изменением обмена веществ растения [Taylor et al., 1990].

Для выяснения возможности вовлечения лигнификации в процессы индуцированной устойчивости мы исследовали динамику активности ФАЛ и ТАЛ, накопление лигнина под действием индукторов различной природы (системного фунгицида байтан и иммуностимулятора бисол-2).

На первом этапе исследований выявлено непосредственное воздействие указанных соединений на растительный организм, на втором - индуцирующее действие препаратов, для чего растения, выращенные из предварительно обработанных фунгицидом и иммуностимулятором семян, заражали возбудителем корневой гнили. Таким образом мы имели возможность изучать метаболические изменения, происходящие под влиянием данных препаратов на двух моделях: растение-фунгицид и растение-фунгицид (иммуност1шулятор)-патоген.

Как видно из данных, представленных на рис.5А, обработка семян би-солом-2 вызывает активацию ФАЛ и накопление лигнина в корнях здоровых растений обоих сортов на ранних этапах онтогенеза. Изучение активности ФАЛ в корнях зараженных проростков с индуцированной устойчивостью в динамике развития болезни показало, что на 3-й сутки после инокуляции

Заря

А

—»—ФАЛ (здоровые) -»-ФАЛ (зараж.) -л—лнгнин (здоров.) -х— лнгшш (зараж.)

Московская 35

Б

-ФАЛ (здоров.) -ФАЛ (зараж.) -ТАЛ (здоров.) -ТАЛ (зараж.)

Рис.5. Влияние обработки семян бисолом-2 на активность ФАЛ, ТАЛ, содержание лигнина в корнях (А) и листьях (Б) в % к контролю (100%)

ось абиисс - время (сутки) после заражение

¡.ось ординат - активность ФАЛ, ТАЛ, содержание лигнина ( % к контролю)

происходит снижение активности фермента у восприимчивого сорта, но за-к'.' растения отвечают на инфицирование более энергичной активацией ФАЛ. Активность фермента в корнях становится более высокой у растений с инду-

I.

цированной устойчивостью по сравнению со здоровыми проростками.

Активация фермента в результате обработки семян иммуностимулятором на раннем этапе онтогенеза растений свидетельствует о его влиянии на активацию защитных механизмов растительной клетки, что сказывается затем на повышении активности ФАЛ и накоплении лигнина в постинфекционный период. Предпосевная обработка бисолом-2 приводит к тому, что инфицированные растения восприимчивого сорта по степени активации ФАЛ "потягивают" до уровня растений с естественной устойчивостью, а по уровню накопления лигнина - превосходят. Обработка семян бисолом-2 вызывает активацию ФАЛ и ТАЛ в листьях инфицированных и здоровых растений обоих сортов (рис.5Б). Повышение активности ФАЛ и ТАЛ в листьях свидетельствует о том. что под влиянием данного препарата происходит изменение метаболизма в-органах, удаленных от места проникновения патогена. Сходное влияние на процессы лигнификации в растениях пшеницы оказывает фунгицид байтан.

Таким образом, под действием бисола-2 и байтана изменяется метаболизм растения, направленный на усиление защитных реакций, что проявляется в активации ФАЛ, ТАЛ и накоплении лигнина. Под действием бисола-2 и байтана прослеживается сходство постинфекционных изменений в растениях восприимчивого сорта и сорта с природной устойчивостью. Возможно, влияние указанных индукторов устойчивости на процесс лигнификации может 'ыть одним из механизмов индуцирования неспецифической устойчивости растений к болезням.

Изменение баланса ИУК и АБК в растениях после обработки семян индукторами устойчивости Известно, что направленность метаболизма растительной клетки может быть непосредственно связана с балансом фитогормонов [Кефели, Протасова, 1988; Ыеитап й а1., 1989]. В связи с этим представляет интерес изучение содержания фитогормонов в растениях, обработанных индукторами устойчивости, а также в условиях предобработки указанными веществами и заражения грибным патогеном.

Исследования проводили на яровой пшенице сорта Московская 35, которую выращивали в полевых условиях. Заражение пшеницы осуществляли внесением в почву спор патогена Н.БаНуит. Образцы листьев фиксировали в полевых условиях жидким азотом в фазе кущения и трубкования: На рис.6 представлены гистограммы, отражающие содержание ИУК и АБК в листьях в фазе кущения растений. Заражение растений корневой гнилью приводит к снижению вдвое содержания ИУК и резкому возрастанию (на два порядка) уровня АБК в листьях пшеницы. Увеличение содержания АБК и понижение уровня ИУК в неблагоприятных для растений (стрессовых) условиях можно рассматривать как проявление универсальной защитной реакции торможения метаболизма клеток [Жирмунская и др., 1987]. Наблюдаемое в случае грибной инфекции снижение содержания стимулятора биосинтетических процессов ИУК и увеличение содержания АБК, очевидно, свидетельствуют о том, что растения испытывают весьма неблагоприятное для них воздействие. В листьях неинфицированной пшеницы, предобработанной бисолом-2, содержание ИУК и АБК в 2 раза и более выше, чем в необработанных здоровых растениях. Однако результаты учета урожая пшеницы, предобработанной бисолом-2, показали, что накопление АБК не оказывает на растения отрицательного влияния.

Сравнение гормонального статуса листьев обработанных ».необработанных растений бисолом-2, зараженных корневой гнилью, выявило значительные различия в реакциях растений на инфекцию. Содержание АБК у зараженных обработанных бисолом-2 растений также увеличивалось, но не

230-

220-

о 210.

200'

со о 190-

о Ё о 180-

р 170-

40

30 20

10

Л

(+1

12 3 4

5 4

3 2

I

гЬ

гЪ

А

А

12 3 4

Рис.6. Влияние предпосевной обработки семян бисолом-2 и заражения корневой гнилью на содержание АБК (а) и ауксинов (б) в листьях пшеницы в фазу'кущения:

1 - контрольные растения,

2 - растения на инфекционном фоне,

3 - растения, прадобработаяныа бисолом-2,

4 - растеши на.• инфекционном фоне + бисол-2

больше чем в 2 раза, и оказалось гораздо ниже, чем у зараженных необработанных (32 и 200 нг/лист), а содержание ИУК оставалось на том же высоком уровне.

Таким образом, создается впечатление, что обработка бисолом-2 хотя и вызывает увеличение содержания АБК у незараженных растений, однако ин-гибирует накопление этого фитогормонд при заражении. Вероятно, такое соотношение исследованных нами фитогормонов и поддерживает синтетическую активность клеток, обработанных препаратом и инфицированных корневой гнилью, на более высоком уровне.

Аналогичная закономерность распределения ИУК и АБК в листьях инокулированной пшеницы, обработанной или необработанной бисолом-2, наблюдалась и в следующей фазе - выхода в трубку. Очевидно, это свидетельствует о довольно длительном периоде последействия бисола-2. Вероятно, метаболизм семян, замоченных в бисоле-2, вначале активизируется и далее поддерживается на этом уровне определенным балансом гормонов, в том числе ИУК и АБК.

Содержание фитогормонов исследовалось нами также в растениях, обработанных байтаном. Соотношение ИУК и АБК в листьях растений, выросших из протравленных байтаном семян, сходно с таковым в растениях, обработанных бисолом-2, как в условиях грибной инфекции, так и в ее отсутствие.

Таким образом, сравнительный анализ механизмов действия байтана и бисола-2 на растения обнаружил антистрессовый эффект этих соединений при инфицировании растений корневой гнилью. Иммуностимулятор бисол-2, как и фунгицид байтан, оказывает стимулирующее действие на метаболизм клеток и, тем самым, повышает иммунитет растений к грибным болезням. Известно,'что АБК подавляет лигнификацию растительных клеток, вероятно,' ингибируя накопление АБК при заражении, бисол-2 и байтан способствуют реализации такого механизма устойчивости растений, как лигнификация.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Болезни в природе являются скорее исключением, чем правилом. Поэтому при поражении патогеном растение включает, прежде всего, механизмы собственной защиты. Одним из признаков, указывающим на вовлечение растительных соединений в эти процессы при патогенезе, является возрастание их активности или количественного уровня [Вандерпланк, 1981].

Нами установлено, что устойчивость пшеницы к грибным патогенам S.nodorum и Н.sativum связана с накоплением лигнина. Повышение количественного уровня лигнина в растениях при патогенезе является результатом активации его синтеза, в регуляции которого участвуют фитогормоны. Исследования показали, что накопление лигнина у устойчивых сортов' пшеницы п ответ на инфицирование обусловлено высокой активностью фермента ФАЛ и повышенным содержанием цитокининов. Подавление активности ФАЛ и снижение накопления лигнина у восприимчивых растений определяется биологической особенностью фитопатогена. При септориозе подавление лигни-фикации связано с повышенным содержанием фитогормона ИУК, а при гельминтоспориозной корневой гнили - АБК.

Подтверждением наших представлений об определяющем значении баланса фитогормонов в регуляции синтеза лигнина при патогенезе являются результаты исследований по изучению влияния индукторов устойчивости растений (иммуностимулятора бисол-2 и системного фунгицида байтан) на лигнифпкацию и содержание фитогормонов. Обработка семян бисолом-2 и байтаном повышает активность ФАЛ и накопление лигнина, способствуя, тем .самым, устойчивости пшеницы к грибным болезням. Увеличение содержания АБК и резкое снижение уровня ИУК в восприимчивой пшенице и отсутствие таких изменений в инфицированных растениях при обработке бисолом-2 и байтаном свидетельствуют о том, что одним из механизмов действия данных соединений является стабилизация баланса фитогормонов ИУК и АБК в условиях грибного патогенеза.

Сопоставление полученных результатов параллельного повышения количественного уровня цитокининов и лигнина и способности соединений, обладающих цитокининподобным действием (бисол-2), индуцировать лигнифи-кацию у пшеницы с литературными данными о стимулирующем действии цитокининов на накопление лигнина в культуре изулированных клеток и тканей [Заирометов, 1993], позволяют отнести фитогормоны цитокининовой природы к основному фактору регулирования лигнификации при грибном патогенез:.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что устойчивость пшеницы к грибным патогенам S.nodorum и Н.sativum связана с накоплением лигнина при патогенезе.

2. Значительное повышение количественного уровня лигнина в устойчивых сортах пшеницы при грибном патогенезе обусловлено высокой активностью фермента ФАЛ и повышенным содержанием цитокининов.

3. Подавление активности ФАЛ и снижение накопления лигнина в восприимчивых сортах пшеницы определяется биологической особенностью фи-топатогена. При патогенезе, вызванном септорией, подавление лигнификации может быть связано с повышенным содержанием фитогормона ИУК, а при гельминтоспориозной корневой гнили - АБК.

4. Показаны различия в направленности ответных реакций растений пшеницы в зависимости от типа устойчивости сорта. Усиление активности ФАЛ, ингибиторов протеиназ у растений устойчивого сорта происходит не только в местах внедрения патогена, но и в органах, удаленных от них.

5. Выявлена способность иммуностимулятора бисол-2 и системного фунгицида байтан повышать активность ФАЛ и накопление лигнина у пшеницы. При этом прослеживается сходство постинфекционных изменений у растений с индуцированной устойчивостью и обладающих природной устойчивостью.

6. Показано, что одним из механизмов действия бисола-2 и байтана является стабилизация баланса фитогормонов ИУК и АБК растений в условиях грибного патогенеза.

7. Полученные результаты о параллельном увеличении содержания ци-токининов и накоплении лигнина,-а также данные о способности соединений, обладающих цнтокининподобным действием (бисол-2), индуцировать лигни-фикацию у пшеницы, свидетельствуют об определяющем значении фитогормонов цитокининовой природы в механизмах регуляции.процессов лигнифи-кации у растений при грибном патогенезе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Яруллина Л.Г., Шакирова Ф.М., Кудоярова Г.Р. Содержание индолилук-сусной и абсцизовой кислот в листьях пшеницы при обработке семян бай-таном и заражении их корневыми гнилями//Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням растений: Тез.докл.-Уфа, 1988.-С.124.

2. Ямалеев A.M., Яруллина Л.Г., Шакирова Ф.М., Каравайко H.H., Кудоярова Г.Р., Мустафина А.Р., Мошков И.Е. Влияние байтана на содержание индолилуксусной и абсцизовой кислот в растениях пшеницы при заражении корневыми гнилями//Физиология растений,-1989.-т.36.-вып.2.-С.399-

-!03.

3. Джемилев У.М., Ямалеев A.M., Шакирова Ф.М., Трошина Н.Б., Яруллина Л.Г., Кудоярова Г.Р., Вахитов В.А., Селимов Ф.А. О механизме действия бисола-2//Агрохимия.-1990.-№2.-С. 121-128.

4. Яруллина Л.Г. Активность ФАЛ и ТАЛ в контрастных по устойчивости к септориозу сортах пшеницы//Материалы 1-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Саратов, 20-25 декабря 1994. Тез.докл.-Генетика.-т. 3-.-Приложение.-1994.-С. 19.0.

5. Ямалеев A.M., Яруллина Л.Г. Влияние химических индукторов защитных реакций растений на процесс лигнификации у пшеницы в связи с устойчивостью к корневым гнилям//3ащита растений в условиях реформирования

агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологич-ность. Тез.докл.-Санкт-Петербург.-1995.-С.483-484.

6. Яруллина Л.Г., Ямалеев A.M., Максимов И.В. Исследование факторов лигнификацни в устойчивости пшеницы к септориозу// Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. Тез.докл.-Санкт-Петербург.-1995.-С.247-248.

7. Яруллина Л.Г., Ямалеев A.M., Ибрагимов Р.И. Содержание лигнина и активность фенилаланинаммоний-лиазы в связи с устойчивостью пшеницы к септориозу//Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского госуннвсрситета: Тез.докл.-Уфа, 1995.-С.89-90.

8. Яруллина Л.Г., Ямалеев A.M., Ямалеева A.A. Активность фенилалани-наммонпй-лиазы и тирозинаммоний-лиазы в растениях пшеницы с устойчивым и восприимчивым типом реакции к септориозу/ЛЗестник Башкирского госуниверситета.-1996.-№3(1).-С.7-9.

9. Яруллина Л.Г., Ямалеев A.M., Ибрагимов Р.И. Изучение баланса фито-гормонов в растениях пшеницы с различной устойчивостью к возбудителям корневых гннлей//Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского госуииверситета: Тез.докл.-Уфа, 1996.-С.5-6.

10. Ибрагимов Р.И., Яруллина Л.Г. Изучение протеиназ и их ингибиторов у пшеницы в связи с устойчивостью к; корневой пшли//Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского госуниверситета: Тез.докл.-Уфа, 1996.-С.4-5.

11. Яруллина Л.Г., Ибрагимов Р.И., Максимов И.В., Ямалеева A.A. Изучение лигннфнкации у пшеницы в связи с учтойчивостью к корневой гни-ли//Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского госуниверситета: Тез.дкол.-Уфа,1996.-С.10-11.

12. Яруллина Л.Г., Ямалеев A.M., Максимов И.В. Влияние байтана и бисола -2 на лигнификацию в растениях пшеницы с различной устойчивостью к корневым гнидям//Материалы конференции "Повышение качества продукции растениеводства".-Уфа, 1997.-С.20-26.

13. Яруллина Л.Г., Ямалеев A.M., Ибрагимов Р.И. Содержание фитогормо-нов в растениях пшеницы при грибном патогеиезе//Матсриалы 2-го съезда Биохимического общества, Москва, 19-23 мая 1997: Тез.докл.-С.47-48.

14. Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Ибрагимов Р.И. Цитологические и физио-лого-биохимические особенности взаимодействия гриба Tilletia caries и пшеницы//Материалы международной конференции но анатомии и морфологии растений, Санкт-Петербург, 1997: Тез.докл.-С. 104-105.

15. Яруллина Л.Г., Ямалеев A.M., Максимов И.В. Защитная роль лигпифика-ции при инфицировании пшеницы септориозом//Микология и фитопатология.-в печати.