Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование конъюгатов белков и нерастворимых соединений d-элементов в бесприборном иммунохимическом анализе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование конъюгатов белков и нерастворимых соединений d-элементов в бесприборном иммунохимическом анализе"

На правах рукописи

Орлова Ольга Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНЪЮГАТОВ БЕЛКОВ И НЕРАСТВОРИМЫХ СОЕДИНЕНИЙ а-ЭЛЕМЕНТОВ В БЕСПРИБОРНОМ ИММУНОХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Санкт - Петербург - 2005

Работа выполнена на кафедре общей химии Кировской государственной медицинской академии МЗ и СО Российской Федерации. Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор кандидат химических наук старший научный сотрудник

Мешандин Алексей Гаврилович

Шугалей Ирина Владимировна

Вербов Вячеслав Николаевич

Ведущая организация: Санкт-Петербургская Государственная Химико-фармацевтическая Академия

Защита состоится « с/» 2005 г., в « час., в ауд. на

заседании диссертационного совета Д 212.230.04 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт - Петербургском государственном Технологическом институте (Техническом Университете) по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт - Петербургского государственного Технологического института.

Замечания и отзывы по работе в одном экземпляре, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 198013, Санкт - Петербург, Московский пр., 26. Санкт - Петербургский государственный Технологический институт (ТУ), Ученый Совет.

Автореферат разослан «

/К, У-С ¿¡с 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ___

кандидат технических наук / Т.Е. Лисицкая

г^чъ 1

Актуальность проблемы. При развитии патологического состояния болезни в организме человека в его биологических жидкостях: крови, моче, слгоне появляются определенные маркеры - специфические вещества сложной, как правило, белковой природы. В распоряжении любого врача-клинициста должны быть диагностические препараты, позволяющие осуществить хотя бы качественную диагностику (по принципу «да»-«нет»)с последующим более полным исследованием в случае «да» конкретной патологии, соответствующей его специальности.

Эти препараты должны быть дешевы, экспрессны - постановка реакции и считывание результатов не более 1-2 минут, не требующих дополнительных приборов (возможность проводить реакции непосредственно на рабочем месте), возможность ставить реакции с малыми объемами препарата и биоматериала, взятого от больного (10-20 мкл). Кроме того, они должны иметь стабильные и воспроизводимые иммунохимические свойства, т.е. выявлять маркеры того или иного заболевания в самом широком спектре биологических жидкостей (в моче, слюне, сыворотке крови и т.д.) в минимальных концентрациях.

Основным предметом нашего исследования стали разработка и создание экспрессных иммунохимических препаратов, которые соответствовали бы выше перечисленным требованиям.

Цель исследования: Исследование конъюгатов белков и нерастворимых соединений (¿-элементов в бесприборном иммунохимическом анализе, который предназначен для экспрессного выявления в сыворотке крови специфических маркёров- антител различных инфекционных нозологий.

Задачи исследования.

1. Выбор оптимальных носителей для синтеза диагностикумов на основе катионов металлов побочных подгрупп.

2. Исследование различных способов хемоурбпи^ беттков на выбранные

ГОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I

твердые фазы.

ММ ПОТЕКА I

УЗ

3. Установление закономерностей между дозировкой химического модификатора и свойствами гидрозоля.

4. Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, дифтерия.

Научная новизна.

1. Проведено комплексное исследование и выбор наиболее оптимального неорганического материала для последующего изготовления конъюгатов этих веществ и специфических белков-антигенов для иммунохимического анализа.

2. На основе экспериментальных данных осуществлён синтез гидрозольных препаратов.

3. Установлены количественные соотношения между дозировками химических модификаторов на поверхности ультрадисперсных частиц и свойствами получающихся продуктов - иммунохимических гидрозолей.

Положения, выносимые на защиту.

1. Конъюгаты белков и неорганических дисперсных частиц - гидрозоли должны синтезироваться на основе гидрофобных неорганических объектов. Наиболее оптимальными из таковых могут быть названы оксид железа (III), оксид меди (II), гексацианоферрат (П) железа (П1).

2. Исследование методов постановки реакции гидрозольной агглютинации в варианте на стекле, в и-образном планшете и на пористом мембранном фильтре.

3. Оптимальными по иммунохимическим свойствам являются гидрозоли, поверхности которых перед сорбцией специфических белков-биолигандов подвергаются химической модификации для ковалентного связывания белка с твердой поверхностью. Использовались модификаторы, осуществляющие хемосорбцию либо по МН2-группе ( нитрозоамины), либо по БН-группе (катионы тяжёлых с1-элементов периодической системы :РЬ2+, Н§2+).

4. На основании этих положений осуществлен синтез гидрозолей для экспрессного бесприборного выявления определённых антител к возбудителям туберкулёзй/даф^фйй Биологических жидкостях человека.

Практическая значимость.

Получение и последующая реализация гидрозольных диагностикумов в практическом здравоохранении, предназначенных для выявления маркеров таких заболеваний, как туберкулез и дифтерия.

Реализация в практическом здравоохранении.

Результаты исследований внедрены в практику специализированной противотуберкулёзной больницы ГУИН по Кировской области.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «Применение нового метода гидрозольной агглютинации для оценки поствакцинального противодифтерийного иммунитета» (II международная конференция, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» СПб, 1998), «Гидрозоли в клинической практике» (доклад на II конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики Москва 2000г.), доклад на заседании проблемной комиссии «Морфология и морфогенез, нормальная и патологическая физиология» КГМА и на кафедре технологии микробиологического синтеза СПбГТИ(ТУ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 96 страницах машинописного текста и состоит из введения, трёх глав, выводов, списка использованной литературы,приложения. Работа иллюстрирована 10 рисунками, 7 таблицами. Библиографический указатель литературы включает 83 отечественных и 41 зарубежных источников.

Результаты и их обсуждение.

1. Выбор наиболее оптимальных твёрдофазных носителей для реакции гидрозольной агглютинации.

Носители для иммунохимических тестов должны соответствовать определённым требованиям: иметь различную окраску, способность

образовывать устойчивые коныогаты с белками-биолигандами и быть доступными.

Перспективные носители представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Пигменты, представляющие интерес в качестве основы для гидрозольных диагностикумов.

Тип пигмента, формула Плотность, г/см3 Размер частиц, нм Цвет

Желтый оксид железа Ре203Н20 3,85-3,9 200-600 Желтый

Красный оксид железа Ре203 4,80-5,0 300-1500 ... Красный

Оксид меди СиО 6,4 500-1000 Темно-коричневый

Свинцовые белила РЬО 6,40-6,80 500-12000 Белый

Титановые белила ТЮ2 3,82-3,85 200-800 Белый

Черный оксид железа (магнетит) Кс304 4,73 200-500 Черный

Технический углерод (сажа) С 2,7 (теоретически) 30-200 (в зависимости от типов) Черный

«Берлинская» лазурь Бе4Ре(СЫ)6]3 1,92 80-200 Синий

Свой выбор остановили на промышленно-производимых пигментах: оксид железа (III), оксид меди (II), золь гексациапоферрата (И) железа (III), взятого для сравнения.

2. Методы постановки реакции гидрозольной ai глютинации.

Наиболее традиционным способом фиксирования окончания реакции агглютинации является постановка в U-образных планшетах, но они малодоступны практическому здравоохранению из-за высокой стоимости,

поэтому стояла задача: изучить возможность применения других методов i аких, как постановка на стекле и на пористом мембранном фильтре.

Для того, чтобы выявить, какой метод постановки реакции более эффективен, взяли для сравнения оксид меди (II), оксид железа (III) и золь гексацианоферрата (II) железа (III). Они отличались друг от друга размером частиц, плотностью, удельной поверхностью и различной окраской. Далее получали модельные гидрозоли на основе физической (пассивной) адсорбции. Юмкг у- глобулина человека с 50мг CuO, Fe203, Fe4[Fc(CN)6]3. В качестве «положительной» и «отрицательной» сывороток использовали мышиные антисыворо 1ки против у- глобулина человека. Постановку реакций проводили в U-образном планшете, на стекле и на пористом мембранном фильтре. Быстрый результат по времени показала реакция на пористом мембранном фильтре и на стекле с гексацианоферратом (II) железа (III). С оксидами меди (II), железа (III) на стекле она протекала медленно (таб. 2), так как крупные частицы оксидов не способны быстро перемещаться в тонком слое тестируемого раствора, размазанного по стеклу. В U-образном планшете не удалось достигнуть быстрого результата с гексацианоферратом (II) железа (III) из-за малой плотности частиц. Опытные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Сравнение твердых фаз при различных способах постановки реакций в

модельной системе.

Твердая фаза Метод постановки

на стекле в U-образном планшете

CuO Fe203 Fe4[Fe(CN)6l3 CuO Fe203 Fe4[Fe(CN)6]3

Величина обратного титра 80 80 160 80 80 160

Время 10 мин. 15 мин. 25 сек. 15 мин. 15 мин. -

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод: наиболее экспрессным и дешевым способом является постановка реакции на мембранном

фильтре (5 сек.) и предметном стекле. Постановку реакции на мембранном фильтре в дальнейшем исключили, т.к. положительная реакция была только с золем гексацианоферрата (II) железа (1П), а для сравнения необходимо было несколько твердых фаз В дальнейшем использовали метод постановки на стекле в сравнении с постановкой в U-образном планшете.

3. Стабильность гидрозолей в процессе хранения.

При осуществлении хранения гидрозолей с модельным антигеном на основе оксида меди (II), оксида железа (1П) и золя гексацианоферрата (II) железа (III) отмечали быструю потерю чувствительности в течение одной недели, препарат переставал реагировать на положительные и отрицательные сыворотки. Это можно объяснить следующим образом: либо гидрофобные микроорганизмы, сорбируясь на гидрофобную поверхность, разрушали адсорбированный ранее антиген, либо происходила десорбция самого антигена с твердой поверхности. Для проверки этих предположений вводили в модельную систему противомикробный препарат азид натрия (NaN3) в концентрации до 0,1 % на общую массу гидрозоля и хранили в течение недели.

Постановка реакции показала, что иммунохимическая активность теряется. Фактор воздействия микроорганизмов можно было исключить, а рассматривать десорбцию как основной фактор нестабильности гидрозольных препаратов, синтезированных по схеме ионной адсорбции. Чтобы повысить устойчивость иммунохимических препаратов, необходима была модификация твёрдой фазы.

4. Выбор модификаторов для хемосорбции белков на твёрдые фазы.

Для ковалентного связывания белка с твёрдой фазой использовали следующие модификаторы, представленные в таблице 3.

Таблица 3

Виды модификаторов дисперсных твёрдых фаз.

№ Наименование. Формула Механизм взаимодействия

1. Нитрозо-Диметил-анилин (НДМА) Ф м(сн3)2 НООС-Рго^ЫНз + о=м-/ \=/ чсн3 I \=/ сн3

2. Хлорид ртути (II) (сулема) НёС12 /н 14 + НЁ2+ —Р1 Х8Н ^

3. Хлорид свинца (II) РЬС12 Ш Я Р1 + РЬ2+ —К РЪ2+ \ш ^

4. Глютар-альдегид очЧ р /Нсн^ н н °чх , л Р H2N-Pгot-COOII 1 ^-(сНг-)-^ — н 3 Н ' 2 -»- НООС-Рго^ =С-(СН2-)-Сч н 3 Н

Выбор этих модификаторов можно объяснить следующим образом: НДМА способен образовывать за счёт третичного азота комплексные соединения с катионами с!-элементов, к таковым относятся катионы Си2^, Ре3" Комплексные соединения с азотом и катионами Си2+, Ре3" широко известны Здесь имеет место низкая константа нестойкости (2,1'10"3) для меди, предопределяющая прочное химическое связывание модификатора с твёрдой фазой. С гексацианоферратом (И) железа (III) в качестве 1всрдой фазы можно предположить следующий вероятный механизм хемосорбции: т к. по1снциалопределяющим ионом является анион [Те(СК)б]4", поэтому гранула имеет отрицательный заряд.

in

НДМА использовался в виде гидрохлорида L

■N=4) ст

, поэтому

катион мог за счёт сил электростатического взаимодействия сжимать диффузный слой мицеллы до адсорбционного и входить в отрицательно заряженную гранулу. Дальнейшее ковалентное связывание антигена через нитрозогруппу приводило к получению целевого иммунохимического диагностикума.

Это можно представить в виде схем модификаций, показанных на рисунках 1,2.

[RO] + НДМА + NH2 - Prot - СООН [RO]N*(CH3) 2-C6II5- N=N-Prot - СООН + H20,

1Де [ROI - CuO, Fe203> Fe4[Fe(CN)6]3

Используя в качестве модификаторов соли тяжёлых металлов, механизм хемосорбции может быть объяснён следующим образом. Соль тяжёлого металла должна быть слабодиссоциирующей для того, чтобы не происходило гидролиза Наиболее вероятный механизм действия этих препаратов может быть обьяснён гем, что малорастворимыс и практически не диссоциирующие соли HgCL, РЬСЬ в виде молекулы достраивают кристаллические решётки CuO, Fe203, Fe4[Fe(CN)6]3.

В дальнейшем реакция шла по сульфгидрильной группе белка, где происходило замещение катиона водорода на катион тяжёлою металла, обеспечивая прочное ковалентное связывание белка с твёрдой фазой гидрозоля (рис. 2).

Рисунок 2.

Модификация твёрдой фазы катионами тяжелых металлов.

[RO] + РЬС12 + SH- CH-Prot - СООН -> [RO]Pb - S - СН - Prot - СООН + HCl,

Рисунок 1.

Модификация твердой фазы НДМА.

NH2

nh2

где [RO] — CuO, Fe203, Fe4[Fe(CN)6]3

5. Результаты хемосорбции в модельной системе.

Модифицировали выбранные твердые фазы: оксид железа (III), оксид меди (II), золь гексацианоферрата (И) железа (III) нитрозодимстиланилином, хлоридом ртути (II) и глютаральдегидом.

Впоследствии глготаральдегид не использовали, т.к. не получили положительных результатов по иммунохимическим свойствам синтезированных конъюгатов.

Постановку реакции проводили с модельным антигеном' противокоревым у-глобулином человека на стекле и в U-образном планшете.

НДМА исследован во всех трёх иммунохимических препаратах. Результаты влияния НДМА в модельной системе представлены на рисунке 3.

Рисунок 3.

Результаты влияния НДМА на химическую активность коньки агов в

модельной сисиеме.

AFe203 0 CuO ♦ Fe2[Fe(CN)6]3

Анализ опытных данных по влиянию концентраций НДМА на иммунохимические свойства коньюгатов белков и твёрдых фаз позволил определить некоторые общие закономерности. В частности, очень малая

концентрация НДМА практически не приводит к синтезу препаратов с нормальной чувствительностью по иммунохимическим свойствам. По мере увеличения концентрации НДМА наблюдается закономерный рост титра иммунохимической реакции, а затем он перестаёт изменяться. Это может быть объяснено насыщением поверхности твёрдой фазы и образованием, по-видимому, мономолекулярного слоя из модификаторов. Последующий рост содержания модификатора не приводит к увеличению количества связанного белка, следовательно, к усилению иммунохимических свойств. Исходя из этой серии опытных данных, можем приблизительно определить дозировку НДМА: применительно к опытам она составляет от 0,01мг/мл до 0,1мг/мл. Далее проводили постановки реакций агглютинации, где твердые фазы были модифицированы хлоридом ртути (II). Результаты этих экспериментов в модельной системе представлены на рисунке 4.

Рисунок 4.

Результаты влияния на химическую активность коиъюгатов в

модельной системе.

А Ре203 0 СиО ♦Ре2[Ре(СЫ)6]3

Анализ опытных данных показал, что с ростом концентрации увеличивается обратный титр, но выше концентрации 0,01мг\мл происходило резкое ухудшение иммунохимических свойств препарата. Это можно объяснить денатурирующим действием на белок избытка ионов Hg2+, не связанных с поверхностью в мономолекулярный слой.

Из полученных данных можно предположить, что НДМА и катионы Hg2+ образуют прочное ковалентное связывание белка с твердой фазой в модельной системе с воспроизводством иммунохимических свойств.

6 Результаты хемосорбции твёрдых фаз с дифтерийным анатоксином и туберкулёзным антигеном. \ Сначала определяли наличие антител к дифтерийному анатоксину с

использованием уже выбранных твердых фаз ( оксид железа (П1), оксид меди (II), золь в гексацианоферрата (II) железа (III)), методов постановки (на стекле и в U-образном планшете), модификаторов (НДМА, катионов тяжелых металлов).

В качестве положительного контроля использовали пул сывороток от пациентов, иммунизированных дифтерийным анатоксином и имеющих в ИФА и РПГА высокий титр противодифтерийных антител: 1/3200 - в случае ИФА и 1/1600-1/800 в случае РПГА. В качестве отрицательной сыворотки использовали сыворотки от пациентов, не имеющих в анамнезе прививки от дифтерии и, соответственно, имеющих фактически нулевой титр в ИФА и в РПГА по данной нозологии. Постановка реакций с применением этих сывороток показала нулевой титр, т. е. отрицательная реакция не определялась ® даже при использовании неразведённых сывороток.

" Проанализировав полученные результаты в оценке титра антител к

дифтерийному анатоксину с Fe2C>3 .в качестве твёрдой фазы, можно констатировать следующее: наблюдается закономерное увеличение обратного титра в отрицательной сыворотке по мере увеличения содержания НДМА и катионов РЬ2+, при этом величина обратного титра с катионом РЬ2+ оказывается существенно выше. По-видимому, антигенные детерминанты антител к

дифтерийному анатоксину более устойчивы к катионам РЬ2+. При использовании СиО в качестве твёрдофазного носителя оказалось, что величина обратного титра меньше, чем в случае с Ре203, при этом реакция с НДМА вообще не наблюдалась. При использовании в качестве модификаторов катионы тяжёлых металлов чувствительность также оказалась существенно ниже, чем в реакции, где основой был Ре20з. С коллоидным раствором Ре4[Ре(СМ)б]з в качестве твёрдой фазы получили приблизительно одинаковую чувствительность по обоим модификаторам. Исходя из представленных данных и их анализа по чувствительности, можно первоначально рекомендовать в качестве твёрдых фаз Ре203, Ре4(Те(СМ)бЬ Для получения диагностикума, определяющего антитела к дифтерийному анатоксину. Но помимо чувствительности решающим фактором в оценке качества диагностических иммунохимических препаратов являлось время постановки реакции. Было проведено сопоставление по времени протекания реакции с использованием Ьт-образных планшетов, где в качестве основы был взят Ре20з, и постановки реакции на стекле с Ре4[Ре(СЫ)6]3. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние различных видов модификаторов на время протекания

реакции гидрозольной агглютинации с дифтерийным анатоксином

Модификаторы РЬС12 НДМА

Тв. фаза Ре4[Ре(СЮ6]з На стекле Ре203 СиО Ре4[Ре(Оед3 На стекле Ре203 СиО

В 11-обр. планшете В ТГ-обр. планшете

Конц, (мг/мл) 105 10"4 ю-5 ю-4 ю-5 10"4 ю-5 ю-4 ю-5 ю-4 ю-5 104

Обр. титр 40 80 400 800 200 400 20 100 50 100 20 40

Время 25-30 сек 15-20 мин 15 мин 30 сек. 15-20 МИН. —

Исходя из данных этой таблицы, можно рекомендовать Ре4[Те(СМ)6]з, по комплексу иммунохимических характеристик в качестве твёрдой фазы для

получения диагностикуvtob в оценке наличия или отсутствия антител к дифтерийному анатоксину при постановке на стекле.

Далее был исследован туберкулёзный антиген с использованием твёрдых фаз: оксида железа (III), оксида меди (II), золя гексацианоферрата (И) железа (III) в постановке на стекле и в U-образном планшете. В качестве положительной сыворотки использовали пул сывороток от больных туберкулёзом, с поставленным диагнозом туберкулёз, который был подтверждён высеванием из выделений больных микобактерий туберкулёза В ряде случаев использовали данные постановки реакции ИФА для выявления антител к данной нозологии. В качестве отрицательного контроля использовали пул нормальных донорских сывороток, показавших в реакции ИФА с тест-системой на выявления антител к M.tuberculosis отрицательный результат.

Обобщение опытных данных позволило сделать первичные выводы. При использовании диагностикума, где твердой фазой был Ре20з, модифицированный НДМА и катионами тяжелых металлов, получили высокое значение обратного титра в обоих случаях. Обращает на себя внимание тот факт, что в этой реакции не отмечали, в отличие от модельной системы, снижения чувствительности диагностикума по мере увеличения содержания катионов тяжёлых металлов. Этот факт может быть объяснён естественным различием антигенной структуры белков в модельном у- глобулине человека и туберкулёзном антигене ТТПД. Когда в качестве твёрдой фазы использовали СиО, отмечали несколько меньшее значение обратных титров, нежели при использовании других носителей в случае применения таких модификаторов, как НДМА и HgCl2. При применении коллоидного раствора Fe4[Fe(CN)6]3 в качестве основы, поверхность которой была модифицирована Hg2+ в больших дозировках, приводило к коагуляции золя, т.к. происходила потеря агрегативной устойчивости коллоидного раствора, когда потенциалопределяющим ионом выступал анион [Fe(CN)(;]4', поэтому данные получить не удалось. Малое содержание катионов Hg2+ позволило достичь

положительных результатов. Также отметили существенную разницу во времени протекания реакции.

Результаты сопоставлений указывают на золь гексацианоферрата (II) железа (III) в качестве оптимальной твёрдой фазы для получения гидрозольных диагностикумов, предназначенных для определения туберкулёзных антител в сыворотке крови больных в постановке на стекле. Эти данные приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Влияние различных видов модификаторов на время протекания

реакции гидрозольной агглютинации с туберкулезным антигеном.

Модификаторы HgCl2 НДМА

Тв. фаза Fe4[Fe(CN)6]3 На схекле Fe2ü3 СиО Fe4[Fe(CN)6]3 На стекле Fe203 СиО

В U-обр. планшете В U-обр. планшете

Конц. (мг/мл) 10'3 1 10"3 1 ю-3 1 10"4 1 ю-3 1 ю-3 1

Обр. титр 80 5 1600 1600 800 800 20 20 1600 1600 800 900

Время — 25-30 сек 15-20 мин 30 сек. 15-20 МИН. 15 мин.

Поскольку, туберкулёз на сегодняшний день в РФ и ближнем зарубежье является распространённой инфекцией, приводящей фактически к национальной катастрофе, поэтому проводилось углублённое изучение гидрозольных конъюгатов твёрдых фаз и туберкулёзного антигена с различньми видами конкретных сывороток больных туберкулёзом и здоровых доноров. Исследования проводились в Центральном противотуберкулезном госпитале МО (Московская обл. г. Пушкин), специализированном учреждении ОР - 218 МВД РФ (г.Кирово-Чепецк Кировской обл.) и в ЦНИИ Туберкулеза РАМН. Во все указанные организации передавался готовый гидрозольный препарат для испытаний, которые проводились на базе указанных организаций с использованием определённого количества сывороток от конкретных больных с верифицированным диагнозом туберкулёз, а также от здоровых

доноров. В Центральный противотуберкулёзный госпиталь МО передавался гидрозоль на основе Ре203, модифицированный НДМА, в ОР-218 МВД-препарат на основе Ре203, модифицированный в Кировский

| противотуберкулёз-ный диспансер (часть сывороток испытывалась на нашей базе) передавали препарат Ре4[Ре(СМ)6]3, модифицированный Н§С12 (табл.6).

Таблица 6.

Результаты испытаний гидрозолей в клинических условиях.

Тип гидрозоля, »модификатор Ре203 (НДМА) Ре203 (Н8С12) Ре4[Ре(СН)6Ь (Н8С12)

База испытаний ЦТГМО РФ г. Пушкин ОР-218 г. Кирово -Чепецк ЦНИИ Туберкулеза РАМН

Количество пациентов п,=31 П2=34 п=53 п=8

чувствительность 67,7% 47% 63% 83,3%

специфичность п=4 100% п=25 80% п=4 83,3%

Время постановки 25-30 мин 25-30 мин 25-30 сек.

Где п, - число больных с внелегочной локализацией туберкулеза, п2 - с

легочной локализацией.

Эти данные позволили предварительно рекомендовать диагностикум на основе Ре4|Те(СМ)б]з в диагностике туберкулёза для последующего рассмотрения в Минздраве РФ и в Государственном институте стандартизации и контроля качества препаратов, а также в целях получения официальной фармакопейной статьи и реализации препарата в практическом здравоохранении.

ВЫВОДЫ:

1. В работе изучен синтез гидрозольных препаратов на основе d-элементов для получения экспрессных иммунохимических диагностикумов.

2. Исследованы методы постановки реакции гидрозольной агглютинации в U-образном планшете, на предметном стекле и на пористом мембранном фильтре Доказано: более перспективными методами являются постановка на предметом стекле , как более экспрессные, показательные и менее затратные.

3. Синтезированы твердофазные носители для получения гидрозольньтх препаратов: окрашенные оксиды меди (И), железа (III) в виде ультрадисперсных суспензий в воде и золь гексацианоферрата (II) железа (III). Наиболее перспективным твердофазным носителем оказался золь гексацианоферрата (И) железа (1П), который в реакции гидрозольной агглютинации показал наименьшее время постановки на стекле.

4. Проведена модификация твердых поверхностей всех трех гидрозольных препаратов: нитрозодиметиланилином и солями d-элементов (хлоридом рг/ти(11) и хлоридом свинца(ТТ)) Выявлено, что закономерности, полученные в реакциях с модельным антигеном (противокоревым у-глобулином человека), справедливы и для реальных систем с дифтерийным анатоксином, туберкулезным антигеном ППД.

Публикации

1. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Применение нового метода гидрозольной агглютинации для оценки поствакцинального противодифтерийного иммунитета// Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы II международная конф..- СПб, 1998 - С. 193.

2. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Гидрозоли - принципиально новый класс диагностических препаратов для выявления и мониторинга инфекционных и соматических патологий// Вятский медицинский вестник.- 1999,- № 1,- С. 3742.

3. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Возможность применения гидрозольных препаратов в лабораторной практике// Клиническая лабораюрная диагностика,-2000,-№ 10.-С. 5.

4. Орлова О.Ю , Мсшандин А.Г. Сопоставление различных видов твердых фаз при синтезе гидрозольных иммунохимических диагностикумов// Вятский медицинский вестник.- 2002.- № 3.- С.53-5 8.

5. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Применение коллоидных и полуколлоидных препаратов для проведения иммунохимического анализа,-Инф. Лист ЦНТИ № 24-191-02 от 31.05.2002.

6. Орлова О.Ю., Попов Д.В. Исследование различных видов твёрдых фаз в качестве исходных материалов при синтезе гидрозольных препаратов// Вятский медицинский вестник.- 2005.- № 1.- С. 71.

27.05.05г. Зак. 81-65 РТП Ж «Синтез» Московский пр., 26

»14 4 18

РНБ Русский фонд

2006-4 8943

¡i

i

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Орлова, Ольга Юрьевна

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИОННЫХ И СОМАТИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ (обзор литературы).

1.1. Виды иммунохимического анализа.

1.2. Методы генного зондирования.

1.3. Метод диагностических экспресс-тестов.

1.4. Иммуномембранный метод.

1.5. Иммунохроматографический анализ.

1.6. Иммуносорбенты для иммунохимического анализа.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.Материалы исследования.

2.2 Методы исследования.

2.3. Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выбор оптимальных твердофазных носителей.

3.2. Сопоставление различных способов проведения иммунохимического анализа с использованием гидрозольных препаратов.

3.3. Определение оптимального модификатора для твёрдой фазы.

3.4. Результаты хемосорбции в модельной системе.

3.5. Экспериментальные данные по определению антител к дифтерийному анатоксину в сыворотке крови.

3.6. Изучение гидрозольных диагностикумов для детекции антител к

М. tuberculosis.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование конъюгатов белков и нерастворимых соединений d-элементов в бесприборном иммунохимическом анализе"

Актуальность проблемы. При развитии патологического состояния болезни в организме человека в его биологических жидкостях: крови, моче, слюне появляются определенные маркеры - специфические вещества сложной, как правило, белковой природы. При обнаружении тех или иных специфических маркеров врач может судить о факте заболевания. В ряде случаев это удается тогда, когда больной не подозревает о начале и развитии болезни. Следовательно, необходимо внедрять в практическую деятельность врача новые экспрессные методы ранней диагностики. В распоряжении любого врача-клинициста должны быть диагностические препараты, позволяющие осуществить хотя бы качественную диагностику (по принципу «да»-«нет»)с последующим более полным исследованием в случае «да» конкретной патологии, соответствующей его специальности.

Эти препараты должны быть дешевы, экспрессны - постановка реакции и считывание результатов не более 1-2 минут, не требующих дополнительных приборов (возможность проводить реакции непосредственно на рабочем месте), возможность ставить реакции с малыми объемами препарата и биоматериала, взятого от больного (10-20 мкл). Кроме того, они должны иметь стабильные и воспроизводимые иммунохимические свойства, т.е. выявлять маркеры того или иного заболевания в самом широком спектре биологических жидкостей (в моче, слюне, сыворотке крови и т.д.) в минимальных концентрациях. В настоящее время иммунохимические методы далеки от сформулированных выше требований. Для большинства из них характерна не экспрессность, высокая стоимость одного анализа, требуются дорогостоящие приборы. Учитывая отсутствие приборов, простоту применения и быстроту постановки реакции, можно рекомендовать эти препараты для решения задач, стоящих перед МЧС, в практику прямого переливания крови в медицине катастроф (в условиях, приближенных к полевым), когда необходимо защитить пациента при трансфузиологических процедурах от контаминантных инфекций, а также оценки краш-синдрома.

В последнее время предложено решение данной задачи. Все иммунохимические методы базируются на известном уже почти столетие феномене взаимодействия между антигеном и антителом. Поэтому можно использовать в качестве диагностических препаратов так называемые гидрозоли: ультрадисперсные частицы оксидов металлов побочных подгрупп и комплексные соединения, на поверхность которых по определенной технологии нанесены антигены, либо антитела, ассоциированные с тем или иным заболеванием. Если в распоряжении врача имеется один из компонентов данной пары: антиген либо соответствующие антитела, то он может поставить верный диагноз и принять адекватные решения. Определенное место эти препараты могут занять в тестировании эффективности вакцинации разных групп населения против ряда инфекционных заболеваний: клещевой энцефалит, столбняк, коклюш, дифтерия, туберкулез. При помощи их можно осуществлять также диагностику соматических (острый инфаркт миокарда, злокачественные опухоли) патологий. Данный вид иммунологического анализа является полуколичественным, основан на методе гидрозольной агглютинации.[42.] Антитела оценивается по предельным титрам (концентрациям), а антигены -путём постановки параллельной реакции с референсным препаратом. Реакция происходит в лунках планшета, куда закапывают разведённый буфером гидрозоль и затем разведённый биоматериал. Результат считывается визуально. Общее время постановки 10-15 минут. Гидрозольные диагностикумы производятся в жидком виде и не требуют лиофилизации (вакуумной сушки). Сроки хранения от 9 месяцев до одного года в зависимости от исходных биолигандов.

Таким образом, основным предметом нашего исследования стали разработка и создание экспрессных иммунохимических препаратов, которые соответствовали бы выше перечисленным требованиям.

Цель исследования. Изучение особенностей синтеза гидрозольных диагностикумов на основе ультрадисперсных частиц неорганической природы: оксидов, комплексных соединений, на поверхность которых сорбированы специфические белки - антигены - маркеры определенных заболеваний. Задачи исследования:

1. Выбор оптимальных носителей для синтеза диагностикумов на основе катионов металлов побочных подгрупп.

2. Исследование различных способов хемосорбции белков на выбранные твердые фазы.

3. Установление закономерностей между дозировкой химического модификатора и свойствами гидрозоля.

4. Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, дифтерия.

Научная новизна:

1. Проведено комплексное исследование и выбор наиболее оптимального неорганического материала для последующего изготовления конъюгатов этих веществ и специфических белков-антигенов для иммунохимичес-кого анализа.

2. На основе экспериментальных данных осуществлён синтез гидрозольных препаратов.

3. Установлены количественные соотношения между дозировками химических модификаторов на поверхности ультрадисперсных частиц и свойствами получающихся продуктов - иммунохимических гидрозолей. Положения, выносимые на защиту:

1. Конъюгаты белков и неорганических дисперсных частиц - гидрозоли должны синтезироваться на основе гидрофобных неорганических объектов. Наиболее приемлемыми из таковых могут быть названы - оксид железа (III), оксид меди (И), гексацианоферрат (II) железа (III).

2. Исследование методов постановки реакции гидрозольной агглютинации в варианте на стекле, в U-образном планшете и на пористом мембранном фильтре.

3. Оптимальными по иммунохимическим свойствам являются гидрозоли, поверхности которых перед сорбцией специфических белков-биолигандов подвергаются химической модификации для ковалентного связывания белка с твердой поверхностью. Использовались модификаторы, осуществляющие хемосорбцию либо по NH2-rpynne (нитрозоамины), либо по SH-группе (катионы тяжёлых d-элементов периодической системы -Pb2+, Hg2"1).

4. На основании этих положений осуществлен синтез гидрозолей для экспрессного бесприборного выявления определённых антител к возбудителям туберкулёза, дифтерии в биологических жидкостях человека.

Практическая значимость.

Получение и последующая реализация гидрозольных диагностикумов в практическом здравоохранении, предназначенных для выявления маркеров таких заболеваний, как туберкулез и дифтерия.

Реализация в практическом здравоохранении.

Результаты исследований внедрены в практику специализированной противотуберкулёзной больницы ГУИН по Кировской области.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 90 страницах машинописного текста и состоит из введения, трёх глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками, 7 таблицами. Библиографический указатель литературы включает 83 отечественных и 41 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Орлова, Ольга Юрьевна

ВЫВОДЫ.

1. В работе изучен синтез гидрозольных препаратов на основе d-элементов для получения экспрессных иммунохимических диагностикумов.

2. Исследованы методы постановки реакции гидрозольной агглютинации в U-образном планшете, на предметном стекле и на пористом мембранном фильтре. Доказано: более перспективным методом является постановка на предметном стекле и на пористом мембранном фильтре, как более экспрессные, показательные и менее затратные.

3. Синтезированы твердофазные носители для получения гидрозольных препаратов: окрашенные оксиды меди (II), железа (III) в виде ультрадисперсных суспензий в воде и золь гексацианоферрата (II) железа (III). Наиболее перспективным твёрдофазным носителем оказался золь гексацианоферрата (И) железа (III), который в реакции гидрозольной агглютинации показал наименьшее время постановки на стекле.

4. Проведена модификация твердых поверхностей всех трех гидрозольных препаратов нитрозодиметиланилином и солями d-элементов (хлоридом ртути (II) и хлоридом свинца (И)). Выявлено, что закономерности, полученные в реакциях с модельным антигеном (противокоревым у-глобулином человека), справедливы и для конкретных систем - с дифтерийным анатоксином, туберкулезным антигеном ППД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, исходя из представленных экспериментальных и теоретических данных, можно сделать предварительные заключения. В работе доказано, что коллоидный раствор на основе гексацианоферрата (II) железа (III) можно использовать в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов, для детекции различных видов маркёров. Данные препараты могут служить основой для разработки большого количества бесприборных диагностических систем и могут использоваться там, где требуется выявить феномен взаимодействия антигена с антителом. Это может использоваться не только в медицине, в экологии (выявление аллергенов в окружающей среде), но и в ветеринарии (выявление таких патологий у животных, как собачий гепатит, энтерит). Доказано, что именно ковалентная "пришивка" белка к данной твёрдой фазе обеспечивает воспроизводство иммунохимических свойств.

Кроме этого, все исходные материалы: оксиды металлов, компоненты буферных растворов относятся к наименее опасному - IV классу опасности химических реагентов. Данные препараты безвредны для человека .

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Орлова, Ольга Юрьевна, Киров

1. Амброзиус X. Иммунология: Справочник. / под ред. Г. Бундау; пер.с нем,.- 2-е изд.-Киев.: Наукова думка, 1981.-480 с.

2. Амброзиус X., Фибих Г. Иммунологические методы /. под ред. Г.Фримеля пер. с нем. А.П. Тарасова.- М.: Медицина, 1987.- 472 с. t

3. Ахметов, А.С. Радиоиммунологический анализ в клинической практике./ Журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева ,- 1982.- Т. 27. №4. М.: Химия.- С.76-80.

4. Беленький, Е.Ф., И.Ф. Рискин. Химия и технология пигментов. / под ред. Л.Ф. Корсунского.- 4-е изд., Л.: Химия, 1974.- 656 с.

5. Березин, И.В. Иммобилизованные ферменты : Современное состояние и перспективы /В.К. Антонов, С.Д. Варфоломеев, Л.И., Воробьёва // М.: МГУ, Т.1.-1976.- 296 с.

6. Вербов, В.Н. Иммуноферментный анализ. // Труды Лен. НИИ им. Пастера-Л.,1989,-С.З-28.

7. Воюцкий, С. С. Курс коллоидной химии. / 2-е. изд.,- М.: 'Химия', 1975.512 с.

8. Гаврилова, Е. М., Гомогенный иммуноферментный анализ новое направление иммунохимии. /Журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева,-1982.- Т.27. № 4. М.: Химия,-С. 90-96.

9. Гнутова, Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. М., Наука, — 1993,-С.102-104.

10. Гурвич, А.Е., ДСузовлева О.Е. Получение белково-целлюлозных компонентов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител./ Журн. Биохимия,-1961.- Т. 26. №5. М.: изд. Академии наук СССР. С.934-942.

11. Дзантиев, Б.Б., Егоров А.Н. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа / журн. Всесоюзного хим. об-ваим. Д.И. Менделеева,- 1982.- Т.27. № 4. М.: Химия, -С.82-89.

12. Думанский, А. В., Учение о коллоидах,/ 3 -е изд., М. J1. Госхимиздат,1948.-416 с.

13. Думпес Ю. Я. Диагностические экспресс-тесты на твёрдофазных носителях для медицинских биохимических анализов. // Рига.: Медицина, 1986.-198 С.

14. Егоров A.M., Теория и практика иммуноферментного анализа. /Ф.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова,- М., "Высшая школа",1991.-271С.

15. Егоров, A.M., Диков М.М. Структура и механизм действия антител. / .Журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева,-1982.- Т.24. №4. М.: Химия . С.21-28.

16. Ефременко, В.И. Опыт применения магноиммуносорбентных диагностикумов в эпиднадзоре за холерой в Дагестане и Чеченской Респ./ В.И. Ефременко, В.И. Таран, Е.И. Афанасьев. Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996.-№3. М.: С-инфо.-С.73-75.

17. Жуков, И. И. Коллоидная химия, ч. 1. / Л., изд. ЛГУ им. А.А. Жданова,1949.-324 с.

18. Заявка №4826518/14(055046) МКЛ5 G 01 № 33/92 Способ многократного использования иммунологических твердофазных носителей на основе полимеров./ Мешандин А.Г.; заявитель НИИ им. И.И. Мечникова; заявл. 17.05.90.

19. Зильберман, Е.Н. Реакция нитрилов./М.: Химия, 1972.-447 с.

20. Иммуногенетика человека.: Основные принципы и клиническое значение. / Под ред. С. Литвина, пер. с англ.-Т.2. М.: Мир. 1994.- 366 с.

21. Иммунология. Методы исследований. / под ред. И. Лефковитса; пер. с англ. А.И. Маца.-М.: Мир, 1983.-348 с.

22. Иммунолюминесценция в медицине. // Под ред. Е.Н. Левиной, М.:1. Медицина, 1977.- 216 с.

23. Иммуноферментный анализ. / под ред. Т.Т.Нго и Г.Ленхоффа, пер. с англ. С.В. Калугера М.: Мир, 1988.-444 с.

24. Иммунохимический анализ./ Под ред. действ, чл. АМН СССР проф. JI.A. Зильбера. М.: Медицина, 1968.- 300 с.

25. Иммунохимия в клинической лабораторной практике. / под ред. А.М.Уорда, Дж.Т.Уичера. пер.с англ. A.M. Авербаха.- М.: Медицина, 1981.- С.59-69.

26. Карякин Ю.В. Ангелов И.И. Чистые химические вещества. / 4-е изд. М.: Химия, 1974.- 409 с.

27. Коллинз, У.П. Новые методы иммуноанализа. / Тертон М., Балангхем Д., под ред. У.П. Коллинза, пер. с англ. М.: Мир, 1991.- с.151-154.

28. Кройт, Г.Р. Наука о коллоидах. / Под ред. Г. Р. Кройта, пер. с англ. И.А. Плетневой. Т. 1.- М., изд. иностр. лит.,1955.- 538 с.

29. Ленский,С.В. Твердофазный РИА для диагностики клещевого энцефалита/ автореф. дисс. канд. биол. наук. -Свердловск., 1982.-20 с.

30. Мешандин, А.Г. Физико-химические аспекты сорбционных процессов при синтезе биолигандов:/ дис.док. тех. наук : 03.00.23.- М.,-1994.216.С.

31. Мешандин, А. Г, Ванеева Л. И. Проблемы потери активности сорбированных лигандов в гетерогенном иммуноферментном анализе ./Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1994.- №4.- М.: С-инфо.- С. 52-55.

32. Мешандин, А. Г. Возможность применения гидрозольных препаратов впрактике гематологии и трансфузиологии //Актуальные вопросы трансфузионной и клинической медицины. Материалы науч. конф.16-17 апреля 1997-Киров.- С.56-57.

33. Мешандин, А. Г., Матвеев А. Г. Латексные тест-системы- основа для создания бесприборных диагностикумов.//Труды раб. совещ. Состояние диагностики бактериальных инфекций. Оболенск.-1989.-С.143.

34. Мешандин, А. Г., Матвеев А. Г. О возможности бесприборной экспресс диагностики инфекционных заболеваний .//Труды VI Всерос. Съезда микробиологов, эпидемиологов, паразитологов — Н. Новгород.-1991.-Т.2.-С.226.

35. Мешандин, А.Г. Гидрозольные препараты в диагностике различных инфекционных и соматических патологий / Паллиативная медицина и реабилитация .-1997.-№1.- М.: а/я 137. фонд Паллиативная медицина и реабилитация больных.-С.21-23.

36. Мешандин, А.Г., Серологическая диагностика сальмонеллезов./ Золотарев Ю.В. Золотарева Л. В. // Клиническая лабораторная диагностика,- М.: Медицина, 2001.- № 1.- С. 52-53.

37. Михайлов А.Т., Симирский В.Н.- Методы иммунохимического анализа в биологии развития /М.: Наука.- 1991.-315 с.

38. Неизотопные методы иммуноанализа. Итоги науки и техники, серия "Биотехнология". //М., Изд.ВИНИТИ, 1987.- С. 4-7.

39. Некрасов В.В. Руководство к малому практикуму по органической химии. //М., Госхимиздат., 1954.-295 с.

40. Оловников, A.M. Методы иммунохимического анализа./Журнл. ВХОим. Д.И.Менделеева. 1968-Т. 15 .-№6.- М.: Химия.- С.48-54.

41. Орлова О.Ю. Мешандин, А.Г. Гидрозоли: принципиально новый класс диагностических препаратов для выявления и мониторинга инфекционных и соматических патологий // Вятский медицинский вестник. -1999.-№1.- Киров., КГМА.- С. 37-42.

42. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Сопоставление различных видов твердых фаз при синтезе гидрозольных иммунохимических диагностикумов./ Вятский медицинский вестник. 2000.-№ 3.- Киров.-С. 53-58.

43. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Применение нового метода гидрозольной агглютинации для оценки поствакцинального противодифтерийного иммунитета./Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Материалы II международной конференции .-СПб, 2-4 сентября 1998.-С 193.

44. Орлова, О.Ю., Мешандин А.Г. Возможность применения гидрозольных препаратов в лабораторной практике./Клиническая лабораторная диагностика. 2000,- №10,- М.: Медицина.- С.5.

45. Остерман, A. JI. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммунноэлектрофарезом и радиоизотопными методами./ М.: Наука.-1983.- 304.C.

46. Падюков, Л.Н., Харитоненков И.Г. Иммунодиагностика инфекций./ Руководство: "Иммунология инфекционного процесса", М.: Медицина, 1994.- С. 63-68.

47. Пастер, Е.У. Практикум по иммунологии./ Учебное пос. для вузов-Киев.: Выща школа,1989.-302 С.

48. Пасынский, А. Г., Коллоидная химия / под ред. акад. В.А.Каргина.З-е изд., М.: Высшая школа, 1968.-232с.

49. Пат. № 2154826 Российская Федерация, С 2 G 01 №33/53 Способ постановки агглютинационного иммунологического анализа / Мешандин А.Г.; заявитель и патентообладатель Мешандин А.Г.-№ 95114935/14; заявл. 21.08.95; опубл.20.08.00, Бюл.№ 23 (II ч.),-376 с.

50. Пат. Su №1464089 А1, ЕР № 0254117 Физико- химические аспекты сорбционных процессов при синтезе твердофазных биолигандов./ Мешандин А, Г. заявл. 27.01.88; опубл.07.03.89.

51. Пат. Su №883053 А1, ЕР 1839560 Физико- химические аспекты сорбционных процессов при синтезе твердофазных биолигандов./ Мешандин А, Г. заявл. 30.12.88; опубл.23.11.89.

52. Пат.№ 2154827 Российская Федерация, С 2 G 01 №33/53 Способ агглютинационного иммунологического анализа / Мешандин А.Г.; заявитель и патентообладатель Мешандин А.Г.-№ 95116983/14; заявл. 05.10.95; опубл.20.08.00, Бюл.№ 23 (И ч.),-376 с .

53. Пат.№ 2169924 Российская Федерация, С 2 G 01 №33/551 Способ агглютинационного иммунологического анализа / Мешандин А.Г.; заявитель и патентообладатель Мешандин А.Г.-№ 96118125/14; заявл. 12.09.96; опубл.27.06.01, Бюл.№ 18 (И ч.),-315 с.

54. Пат.№ 2170434 Российская Федерация, С 2 G 01 №33/551, 33/53 Способ агглютинационного иммунологического анализа / Мешандин А.Г.; заявитель и патентообладатель Мешандин А.Г.-№ 96118266/14; заявл. 12.09.96; опубл. 10.07.01,Бюл.№ 19 (II ч.),-311 с.

55. Песков, Н. П., Курс коллоидной химии,/ М., Л., Госхимиздат, 1940.-276с.

56. Писаренко, А. Г. Курс коллоидной химии, / Поспелова К. А., Яковлев А. Г., 3-е изд., М.: Высшая школа, 1969.- 249 с.

57. Покровский В.И. Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития./Е.П. Голубинский, Н.А. Семина, И.В. Рубцов.//Обз. инф. ВНИИ мед. и мед- тех. инф. Мед. генетика и иммунол. 1986.- М., 74с.

58. Покровский, В. И., Семенов Б.Ф. Проблемы современной медицины и иммунохимии, / Журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева, 1982.- Т. 27. № 4.- М.: Химия, С. 97-103.

59. Полетаева, О.А., Мешандин А.Г. Иммуноагглютинационный диагностикум на основе моноклональных антител для скрининга эпителиального опухолевого маркера в цельной крови онкологических больных./Журн. Биотехнология, 1995.- №3-4.- М., С. 46-47.

60. Попечителев, Е.А., Старцева О.Н. Методы иммунохимических исследований, / СПб.: СГбГЭТУ, 1993,- С. 32-35.

61. Практическая иммунология. / Под ред. П.Н. Бургасова и И.С. Безденежных, М.: Медицина, 1969.-414 с.

62. Равич-Щербо М.И., Физическая и коллоидная химия. /2-е изд., М.: Высшая школа, 1968.-С. 150-153.

63. Ребиндер, П. А., Избранные труды: Поверхностные явления в дисперсных системах. / Коллоидная химия, М.: Наука, 1968.- 239 с.

64. Реми, Г. Курс неорганической химии. / Пер. с нем. к.х.н. А.И.Григорьева, Т. 2. М.: Мир, 1974.-888 с.

65. Роберте, Д.Д., Касерио М. Основы органической химии. / Пер. с англ. Ю.Г.Бунделя. 2-е изд.,- М.: Мир, 1978.Т.2.-775 с.

66. Стендаль, С. ,Сойни Э. Новые направления в развитии неизотопных методов иммуноанализа // Перспективы биоорганической химии и молекулярной биологии .М.: Наука, 1986.-С. 305-309.

67. Стендифер, Д. К. Иммуноферментный анализ антигенов с разделениемкомпонентов // Иммуноферментный анализ М.: Мир, 1988. С. 172-192.

68. Степанов, Б.Н. Введение в химию и технологию органических красителей. /3-е изд. -М.: Химия,1984.-589 с.

69. Строев, Е.А. Биологическая химия. / М.:Высшая школа ,1986 .-500 с.

70. Сухоруков, A.M., Пономарева A.M. Изучение сорбционных свойств полистироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анализе/ Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1987. № 9.-С. 18-22.

71. Теплова, Н.Н. Рабдомиолиз у хирургических больных в клинике неотложных состояний:/ дис. . канд. мед. наук : 14.00.37.- Пермь.,2000.- 137.C. »

72. Фримель, Г., Брок И. Основы иммунологии, /пер. с нем. А.П. Тарасова; под ред. А.И. Маца.-М.: Мир, 1986.-254 с.

73. Харитоненков, И.Г., Христова M.JI. Использование иммуноферментных методов в вирусологии. / "Молекулярная генетика, микробиология, вирусология".1985.- №.6 .- С. 3-15

74. Цоллингер, Г. Химия азокрасителей. / пер. с нем О.Ф. Гинзбурга под ред. Проф. Б.А. Порай-Кошица, Л.: Госхимиздат, I960.- 363 с.

75. Чард, Т. Радиоиммунологические методы, / пер. с нем. М.С. Морозовой; под ред. Л. М. Варшавского.- М.: Мир, 1981.-246 с.

76. Шаханина, К.Л. Выбор критериев пригодности твердофазных носителей на основе полистерола для проведения иммуноферментного анализа./И.П. Павлова, Л.Ф. Евсеева, Н.С. Умнова. Журн. Микробиолог., эпидемиологии и иммунобиологии. 1987.- №9.-М,., С.8-9.

77. Шелудко, А.Д., Коллоидная химия, / пер. с болг. В.М.Муллера- М.:1. Мир, 1984.-319 с.

78. Эллин, Р.Д., Макензи Р. Иммунологические аспекты инфекционных заболеваний / под ред, Д.Дика; пер. с англ. А.С. Анта, М.: Медицина, 1982.- 574 с.

79. Adarwai А.То the question of retichal immunosozbent// Experimentia.-l 971 .-Vol.27.-P.514-515.

80. Aizawa M. Immunosensors //Philos. Trans. Royal soc. London., B. Biol. Science.-1987.-Vol.316.-P.-121-133.

81. Clark R., Engvall E. Enzyme linked immunosorbent assay// (ELISA).Teoreoretical and praktical aspects. Enzyme-Immunoassay (E.T.Maggioed.). Boca Raton, Florida.- 1981.-P.- 167-179.

82. Collins W.P.ed J.Wiley & Sons Alternative Immunoassays , //Chichester-New York-Brisbane-Toronto-Singapore, 1985.

83. Crosignani P.G., Nakamusa R.M., A method of sodium phase radioimmunoassay untilizing polypropylene dises. // J. Clin. Endocrinof and Metabol.- 1970.- Vol .-30 .- P. 153-160.

84. Edswall J.T. Methods of crosslinking. //J. Am. Chem. Soc. 1954.-Vol.-.76.-P.3131-3138.

85. Ekins R. In immunoassays for the 80s. // University Park Press, Baltimore, 1981.-P.-276.

86. Freundlich H., Kapillarchemie. / / Lpz., 1930.-B. 1 .-P.-32.

87. Gallo D. Uses of immunofluorescence in diagnostic virology. // Amer. J. Med. Technol.- 1983.-Vol.- 49.-P, 157-161.

88. Gleally John F. Monoclonal antibodies and their potential in medicine.// Irish Med. J.-1987, 80.-№6.-P.-161-162.

89. Goldring О. L. Detergent solubilised antigens in enzyme immunoassay with particular reference to enzyme-linked immunosorbent assey (ELISA) systems.//Immunoassay Technol.- Vol.- 2. Berlin; New York.- 1986.- P.189-213.

90. Guenes Z. Factors, that can influsence of reactions antigen-antibody. //J.Biochem Physiol.-1960.-Vol.38.-P.-1235-1243.

91. H. R. Kruyt Colloid science .// N. Y.-a. o., 1949.-Vol.-l-2.-P.-52.

92. Harlow E., Lane D. Antibodies. //A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. Lab., 1988.-P.254.

93. Hazen Beth W., Hazen Kevin C. Modification and application of a simple, surface hydrophobicity detection method to immune cells.// J. Immunol. Meth, 1988, 107, №2.-P.- 157-163.

94. Hemmila J. Fluoroimmunoassays and immun fluorometric assays. // Clin. Chem. 1985.- Vol. 31. - P. 359-370.

95. Ichikawa E, Imagawa M. Enzyme inking of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunologicol staining. // J. Immunoassay -1983. -Vol.- 4.-P.- 1399 -1401.

96. Jou-Chu-Ziu. //J.Immunol.Meth. 1989-.Vol.-124.-P.-159-163.

97. Kricka L. J., Whitehead T. P. Chemiluminescent and dioluminescent immunoassays.// J. Pharm. And Biomed. Anal. 1987.-№8.-P.- 829-833.

98. Lassons S.M , Ferens J.M., Radiologi.// 1985.- P.-155, P.- 489.

99. Letonen O. Antibody connection in immunoassays//J.Immunol.Meth.-1980.-Vol.-34.-P.-61-70.

100. Magnusson Karl-Eric, Bartonek Eva. // Immunol. Invest.,.- 1987.- № 3.- P.-227-240.

101. Matijevic E. Surface and colloid science. // N. Y. a. o., 1969.-Vol.-l-4.-P. 71.

102. Monroe D. Liposome immunoassay .//Immunoassay Thechnol. 1986.- Vol.2.- Berlin;New York.-P.- 167-187.

103. Nakana P.K. The synthesis conjugates peroxidaze with antidodies. //J.Histochem.Cytochem.-1968.-Vol.-16.-P.-337-502.

104. Newark N. J. Immunomedics inc receives patent on antidody-linking technology.//Appl. Genet. News.- 1987,8.-№1.P.- 8.

105. Nilsson Bertil, Larsson Ann-Charlott .An amplification technology for improving sensitivity when measuring components in biological samples.// J. Immunol. Meth., 1988, 108, № 1-2.-P.- 237-244.

106. Nossal Gustav J. V. Current concepts: immunology. The basic components of the immune system.//N. Engl. J. Med., 1987, 316 № 21.-P.- 1320-1325.

107. Olownikow A Diazocrossliking in immunology.//Immunochemistry.-1967.-Vol.-4-P.-77-80.

108. Pacry R. P., Love C., Detection of rubella antibody using an optical immunosenser.//J. Virol. Meth-1990.-Vol.27.-P.39-48.

109. Parsons G. N. Antibodi-coated plastie tubes in radioimmunoassay.// Meth Enzymol .-1981.-Vol.-73.- P.-196.

110. Pesons G. H. Antibody coated plastic tubes in radioimmunoassay. // Meth. Enzymol.- 1981.- Vol .-73.- P. 196.

111. Phillips A. P., Martin K. L. Direct and indirect immunofluorescence analysis of bacterial populations by flow cytometry. //J. Immunol. Meth., 1987, 101.-№2, P.-219-228.

112. Porstmann T. Entwicklung eines Doppel-Sandwich-Enzymim-Munoassay zum quantitativen Nachweis von HBsAg (I. Mitteilung).Dt. Gesund.// Wes.,-I980.-Vol.- 35.-P.- 598-600.

113. Sever John L. Future perspectives in virology diagnosis, treatment and immunoprophylaxix.// S. Afr. Med. J. 1986.- 70, Suppl.-P. 10-16.

114. Stewart- Tull Duncan E.S., Parant Monique. Immunopotentiators in vaccines: a drem to to a reality.//Ann. Immunol. Hung.- 1986,26.-№1.-P.- 197-223.

115. Stollar B. D., Rashtehian A. Immunochemikal approaches to gene probe assay // Annual. Biochem.-1987.-Vol.-161 .-P.- 387-394.

116. Timpl R., Furthmayr H. //Ysolation of pure anti collagen antibodies using a specific lmmunoadsorbent technigue, L.Ymmunitatsforsch, 1967.- P.-134, 391-396.

117. Werner Georges H. Synthetic immunostimulants(excluding sulur-containing compounds).//Comp. Immunol., Microbiol., and Infect. Dieseases.-1986,9.-№4 2-3.-P.-131-136.

118. Wood W. G. Luminescence immunoassays in theory and practice- the state of the art. //Immuneassey Thechnol.-1985.- Vol.- 1. Berlin, New York, P.-105 -150.