Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование физико-химических и биологических свойств конъюгатов L-лизин- α-оксидазы, пероксидазы и антител

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гогичаева, Наталья Викторовна, Москва

Москва - 2001

2

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.-------------------------------------------------------------------- 6

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ _________________________________________ 11

Часть!. Применение иммобилизованных ферментов в медицине. 12

1.1. Возможности использования ферментов в терапевтических целях_________________________________________________________________________14

1.2. Применение иммобилизованных ферментов в клинических анализах _ _____________________________________20

Часть 2. Фермент L-лизин-а-оксидаза. Физико-химические и

биологические свойства.-------------------------------------------------------

Часть 3. Химические методы иммобилизации ферментов---------------34

Часть 4. Направленный транспорт лекарственных веществ в

организме._________________________________________________________________________41

Часть 5. Влияние различных видов модификации на физико-химические и биологические свойства ферментов______________________48

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.-------------51

2.1. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.------------------------------------- 51

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.--------------------------------------------52

2.2.1. Определение ферментативной активности

оксидазы.

52

2.2.2. Определение белка по Лоури__________________________________________52

2.2.3. Определение активности антител_____________________________________52

2.2.4. Получение конъюгатов L-лизин-а-оксидазы и антител методом перйодатного окисления фермента_______________________________54

2.2.5. Получение конъюгатов L-лизин-а-оксидазы и антител с

57

использованием глутарового альдегида.________________________________

2.2.6. Конъюгация пероксидазы, окисленной по углеводному компоненту, с L-лизин-а-оксидазой и антителами.----------------------59

2.2.7. Определение молекулярной массы конъюгата,------------------- 61

2.2.8. Определение рН-оптимума ферментативной активности тройных конъюгатов L-лизин-а-оксидазы, пероксидазы и

антител.

62

2.2.9. Изучение стабильности конъюгатов L-лизин-а-оксидазы при +4 и -18С-------------------------------------------------------------------- 62

2.2.10. Исследование стабильности конъюгатов L-лизин-а-оксидазы с пероксидазой и антителами при 60°С^---------------------63

2.2.11. Определение константы Микаэлиса тройного конъюгата

L-лизин-а-оксидазы, пероксидазы и антител по отношению к L-

лизину=-----------------------------------------------------------------------------

2.2.12. Исследование цитотоксического эффекта двойных и

63

тройных конъюгатов L-лизин-а-оксидазы относительно опухолевых клеток человека в культуре._________________________________ 64

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Часть 1. Разработка лабораторной технологии получения

------------------------------------- 66

конъюгатов L-лизин-а-оксидазы.----------------------------------------

3.1.1. Исследование возможности получения конъюгатов путем окисления углеводного компонента в молекуле L-лизин-а-оксидазы. ------------------------------------------------------------------------- 67

3.1.2. Разработка метода получения конъюгатов L-лизин-а-оксидазы с антителами путем использования бифункционального сшивающего агента - глутарового альдегида. ---------------------------

3.1.3. Разработка методов получения тройных конъюгатов L-лизин-а-оксидазы, пероксидазы и антител_______________________________ 75

Часть2. Некоторые физико-химические свойства конъюгатов L-

лизин-а-оксидазы.

- 78

3.2.1 Определение молекулярной массы конъюгатов.___________________78

3.2.2. рН-оптимум ферментативной активности конъюгатов L-

7ft

лизин-а-оксидазы5 пероксидазы и антител.------------------------------- ®

3.2.3. Исследование стабильности конъюгатов L-лизин-а-оксидазы при +4°С и -18 °С. -------------------------------------------------^

6

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: ДО - L-лизин-а-оксидаза AT - антитела ПХ - пероксидаза ГА - глутаровый альдегид С - субстрат Е - фермент П - продукт

РИА - радиоиммунологический анализ ИФА - иммуноферментный анализ

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-диметилтетразолия бромид)

7

В мировой литературе накопилось очень много работ по биохимическому, фармакологическому и лечебному применению ферментов.

Уникальные свойства ферментов, в частности, высокая каталитическая активность, избирательность действия ферментных препаратов предопределили перспективность их широкого

применения в химической технологии, аналитических процессах и медицинской практике.

Практическое использование ферментов при лечении множества разнообразных заболеваний требует не только основательных знаний в области биохимии, но также опыта целенаправленного применения этих знаний в клинике, точной диагностики болезней, а также непрерывного клинического и биохимического контроля основных параметров гемодинамики и правильной интерпретации полученных результатов.

Химиотерапия - признанный метод лечения онкологических заболеваний; в этой области ведется непрерывный поиск новых противоопухолевых средств, обладающих высокой избирательностью действия в отношении пораженных опухолью органов и тканей. Интерес к энзимотерапии связан с тем, что ферменты, обладая высокой специфичностью действия, могут избирательно действовать на интенсивность основных путей обмена опухолевой клетки, не затаргивая существенно метаболизм нормальных прототипов клеток.

8

Однако следует указать на ряд существенных недостатков ферментов и других биологически активных белков, ограничевающих их широкое применение в практической медицине; в частности, их быстрое выведение из организма и разрушение под действием эндогенных протеаз, антигенность как чужеродных организму белков, токсичность и пирогенность. Кроме того, следует отметить их относительно малую доступность из природных источников и дороговизну получения чистых ферментных препаратов. Некоторые из этих недостатков можно легко устранить применив ряд биотехнологических методов (см. ниже).

Важным направлением исследований в практическом применении любых лекарственных средств является проблема направленного транспорта препарата; она решается с помощью различных методов, позволяющих прицельно локализовать действие лекарственного вещества в организме. Учитывая уникальные свойства ферментов и возможности направленного транспорта, создаются различные комплексы, включающие в себя ферменты и белки-переносчики, например, антитела, комплементарные тем клеткам-мишеням организма, на которые планируется оказать воздействие фермента.

Цель настоящей работы - выбор оптимальных методов получения конъюгатов противоопухолевого фермента L-лизин-а-оксидазы, пероксидазы и антител и изучение физико-химических и биологических свойств полученных конъюгатов.

9

Задачи исследования:

1. Разработка оптимальных условий конъюгации L-лизин-а-оксидазы с антителами путем окисления углеводного компонента в молекуле L-лизин-а-оксидазы.

2. Поиск оптимальных условий получения конъюгатов L-лизин-а-оксидазы с антителами с использованием для сшивания бифунционального реагента - глутарового альдегида.

3. Разработка метода конъюгации L-лизин-а-оксидазы и антител с использованием активированной пероксидазы в качестве «мостиковой» сшивающей молекулы.

4. Исследование некоторых физико-химических свойств полученных конъюгатов.

5. Наработка конъюгата L-лизин-а-оксидазы с моноклональными антителами и исследование его цитотоксических свойств.

Научная новизна. Разработана технология получения тройных конъюгатов L-лизин-а-оксидазы из штамма Trichoderma harzianum, пероксидазы и антител и двойных конъюгатов L-лизин-а-оксидазы и моноклональных антител. Был опробован ряд методов конъюгации L-лизин-а-оксидазы и антител:

1) метод перйодатного окисления углеводных компонентов L-лизин-а-оксидазы

10

2) связывание компонентов конъюгата с помощью глутарового альдегида

3) использование в качестве сшивающего агента окисленной перйодатом натрия пероксидазы. Выявлены оптимальные для сохранения энзиматической активности L-лизин-а-оксидазы условия конъюгации фермента с моноклональными антителами.

Определены некоторые физико-химические свойства

полученных конъюгатов: термостабильность, рН-оптимум ферментивной активности по отношению к L-лизину, определена степень сродства конъюгатов к субстрату L-лизину - Км и значения молекулярной массы. Приводятся доказательства сохранности цитотоксического действия двойного комплекса L-лизин-а-оксидазы с моноклональными антителами (ICO-80 к CD-5 рецепторам клеток) на рост клеток лимфомы линии Yurkat in vitro.

11

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Обзор литературы состоит из 5 глав. В первой главе рассмотрены пути использования иммобилизованных ферментов в медицине. Вторая глава посвящена ферменту L-лизин-а-оксидазе и содержит описание её физико-химических и биологических, в частности антиопухолевых, свойств. Третья глава содержит описание химических методов иммобилизации ферментов. В четвертой главе представлен обзор способов направленного транспорта лекарственных веществ в организме, и собраны данные о различных "носителях" (специфических лигандах, средствах направленного транспорта) лекарственных препаратов. Пятая глава посвящена анализу литературных данных о влиянии конъюгации на биологические и физико-химические свойства ферментов.

12

ЧАСТЬ 1. Применение иммобилизованных ферментов в

медицине.

В медицинской практике все большее применение находят лекарственные вещества белковой природы, оказывающие существенное влияние на метаболические процессы в целостном организме. Следует отметить, однако, что широкое применение нативных ферментов ограничивается и осложняется их аллергогенными свойствами и недостаточной стабильностью при физиологических значениях рН, учитывая эти обстаятельства, в медицинской практике используют чаще модифицированные, а не чистые ферментные препараты.

Препараты иммобилизованных ферментов находят применение в медицине, прежде всего в терапевтических целях, т.к. многие заболевания обусловлены нарушением активности или синтеза ферментов. Кроме того, ферменты используются в различных химических анализах, и позволяют быстро и достаточно точно определить качественное или количественное содержание различных соединений в пробе образца.

Иммобилизация ферментов может способствовать достижению нескольких целей:

1. Пролонгирование времени действия.

2. Использование для локальной терапии.

3. Применение иммобилизованных ферментов для наружного и экстракорпорального действия.

4. Снижение иммуногенности фермента.

13

5.Многократное использование в лабораторных анализах.

И.В. Березин ещё в 1987 году выдвинул следующую модель создания иммобилизованных лекарственных препаратов белкового происхождения:

Схема 1. Модель структуры лекарственного вещества.

^ стабильная /*

Полимерная цепь —► биодеградируемая \

Неспецифический агент

освобождение лекарства путем расщепления связи

На данной схеме лекарственное вещество соединено с полимерной цепью, солюбилизирующим агентом и транспортной системой. Легко видеть, что возможны различные вариации

14

иммобилизованного лекарственного препарата: если полимер растворим, - не требуется солюбилизирующий агент. Если же вещество заключено в полимерную оболочку (капсулу), то не требуется химическое связывание. Комбинация желаемых свойств (т.е. растворимости, специфичности, нетоксичности) может быть достигнута при связывании белка с полимерной цепью, которая, в свою очередь, модифицируется определенным способом. Так, например, известно, что высокомолекулярное вещество не проникает в клетку в силу своего размера путем диффузии, но может проникнуть путем эндоцитоза, если для этого полимер снабдить группами, специфично взаимодействующими с клеточной мембраной (Березин И.В., 1987).

1.1. Возможности использования ферментов в терапевтических

целях.

Ниже будет представлена условная классификация ферментов по группам, основанная на биологическом действии ферментов, а также указаны возможные и уже осуществленные методы иммобилизации.

К основным областям использования иммобилизованных ферментов относятся следующие:

Ферменты протеолитического действия, способствующие разрушению струпов и келоидных рубцов и применяющиеся в основном при лечении гнойно-некротических процессов. В частности, трипсин, химотрипсин, коллагеназа, могут быть иммобилизованы в перевязочные материалы, порошкообразные полимерные частицы

15

(Torchillin V.P., 1991). В настоящее время нашей промышленностью выпускается препарат профезим, содержащий иммобилизованный предшественник протеолитического фермента - протосубтилина, и обладающий пролонгированным действием (Машковский М.Д., 1994).

- Ферменты, гидролизующие молекулы РНК и ДНК: рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза (препараты, содержащие эти ферменты, способствуют разжижению гноя, слизи, вязкой и густой мокроты при туберкулезе легких и наделены, кроме того, противовоспалительными свойствами) эти ферменты могут быть связаны с растворимыми полимерами, включены в липосомы и тени эритроцитов (Torchillin V.P., 1991).

- Ферменты и препараты, улучшающие процессы пищеварения: пепсин, химотрипсин, трипсин, амилаза. Для этих ферментов возможна иммобилизация микрокапсулированием или включением в полимерный гель или частицы, имплантация в микрокапсулы, нерастворимые в желудке и растворимые в кишечнике (Torchillin V.P., 1991, Машковский М.Д., 1994).

- Ферменты, применяемые при аллергических реакциях, могут быть использованы для борьбы с аллергическими реакциями, вызванными пенициллиновыми антибиотиками: пенициллиназа (продуцируется определенными видами организмов и применяется при аллергиях, вызванных препаратами группы пенициллина), и лизоцим могут быть иммобилизованы с растворимыми полимерами, включены в микрокапсулы, тени эритроцитов, липосомы (Torchillin У.Р., 1991, Машковский М.Д., 1994).

16

- Фнбрннолитические ферменты, применяемые в тромболитической терапии: фибринолизин, стрептокиназа (фермент получают из гемолитического стрептококка группы С), урокиназа, плазмин можно иммобилизовывать с растворимыми полимерами, включать в тени эритроцитов и в биодеградируемые частицы. Стрептокиназа, например, была включена в комплекс антиколлагеновое антитело-эритроцит (Muzykantov Y.R., 1986). Иммобилизация белков на эритроците была проведена с помощью авидкн-биотинового взаимодействия, полученный конъюгат может использоваться для лизиса фибриновых сгустков в определенных участках и применяться в терапии для профилактики тромбозов. Нашими соотечественниками (Чазов Е.А. и др. 1981) был создан препарат стрептодеказа, представляющий собой фермент стрептокиназу, иммобилизованную на водорастворимом матриксе. Полученный препарат обладает пролонгированным действием и имеет меньше побочных эффектов.

Урокиназа была иммобилизована на поверхностях транспортных молекул (Ohshiro Т., 1980) в частности, на нейлоне (Sugitachi А., 1978, Sugitachi А.,1976), поливинилхлориде, силиконе, полистироле (Sugitachi А., 1978), была опробована клинически (Sugitachi А., 1978) и имела высокие антитромбообразующие свойства.

- Ферменты* обладающее антиопухолевой активностью: L-аспарагиназа, аргиназа, нуклеаза и дезоксирибонуклеаза могут быть включены в микрокапсулы, липосомы, тени эритроцитов и иммобилизованы с растворимыми полимерами (Torchillin Y.P.,

17

1991). Кроме того, иммобилизованная на гемодиализной мембране аспарагиназа, включенная в экстракорпоральный шунт, была применена для детоксикационных целей (Callegaro L., 1983). Показано, что аспарагиназа, связанная с коллагеном, в перспективе может использоваться в экстракорпоральной терапии опухолей. Модифицированный фермент, включенный в экстракорпоральный модуль, оказывал меньше побочных эффектов, чем при обычной энзимотерапии (Olanoff L.S., 1975). Токсический эффект конъюгата аспарагиназы и монометоксиполиэтиленгликоля был изучен Viau А.Т. и др. в1986, а аспарагиназы и полиэтиленгликоля Abuchowski А. в 1984. Токсикологическое действие данного конъюгата проявлялось только в больших дозах. Терапевтический эффект связанного фермента был значительно сильнее, чем у немодифицированного (Abuchowski А., 1984).

- Антимикробная эезимотерапия применяется при резистентности к антибиотикам в ветеринарии. В частности, фермент лизосубтилин применяется для лечения и профилактики желудочных инфекций новорожденных телят. Фермент был иммобилизован на высокопористой смоле BiocarbL (Biziulevicius G.A., 1999), полученный ферментный комплекс обладал рН-резитстентностью и был стабилен при хранении в отличие от нативного фермента. Препарат был аробирован в клинических условиях и рекомендован в качестве терапевтического средства.

- Иммобилизованные ферменты нашли применение также в клинике для удаления токсичных веществ из циркулирующей крови. Причем оказалось, что нет необходимости во введении

18

непосредственно в организм иммобилизованного фермента, а можно использовать метод гемоперфузии вне организма. Гемоперфузия основана на пропускании крови пациента через систему с инкапсулированным и иммобилизованным ферментом для избирательного удаления токсических веществ и широко применяется в клинике в течение многих лет (Shen Z., 1995).

Применение иммобилизованных ферментов в

экстракорпоральных системах.

- Разрабатываются способы снижения концентрации липопротеинов