Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование физико-химических свойств и биологической активности регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование физико-химических свойств и биологической активности регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка"

На правах рукописи

Маргасюк Дмитрий Викторович

ООЗОВЗОТ2

Исследование физико-химических свойств и биологической активности регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка

03 00 02 биофизика 03 00 25 цитология, гистология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Москва 2007 г

Работа выполнена в Институте элементорганических соединений им Л И Несмеянова РАН и в Институте биологин развития им Н К. Кольцова РАН

Научные руководители

доктор биологических наук, Элеонора Норайровна Григорян и

доктор биологических наук Виктория Петровна Ямскова Официальные оппоненты

доктор химических наук Кеменова Вера Александровна и

доктор биологических наук Шарова Наталья Петровна Ведущая организация Институт биохимии им А Н Баха РАН

Защита диссертации состоится 29 мая 2007 г в_часов на заседании Диссертационного

совета Д 002 238 01 при Институте химической физики им Н Н Семенова РАН по адресу 119991, Москва, ул Косыгина д 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им Н Н Семенова РАН

Автореферат разослан^^>^2007г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

Л А Радкевич

Введение

Актуальность работы Изучение механизмов, лежащих в основе процессов передачи регуляторного сигнала в тканях, является актуальной проблемой современной биофизики В данном аспекте одним из главных направлений научных исследований остается поиск новых эндогенных биорегуляторов, обеспечивающих поддержание органно-тканевого гомеостаза у высших животных К таким веществам относятся регуляторные белки (РБ), которые в сверхмалых дозах (СМД) оказывают влияние на такие важнейшие биологические процессы как клеточная адгезия, миграция, пролиферация, дифференцировка Такие РБ были обнаружены в различных тканях животных и растений (Ямскова и др, 1977, Ямскова, Резникова, 1991, Ямсков и др, 1999, Краснов и др, 20036), в том числе, в тканях глаза млекопитающих - нейральной сетчатке и пигментном эпителии (Краснов и др, 2003а) Было установлено, что РБ стимулируют восстановительные и репаративные процессы в патологически измененных тканях На основе РБ, выделенных из сыворотки крови крупного рогатого скота, были разработаны новые фармакологические препараты, применяемые настоящее время в медицине -офтальмологии и ортопедии, в качестве, соответственно, ранозаживляющего и восстанавливающего функцию хрящевой ткани лекарственных средств Такой характер биологического действия РБ предполагает возможность их влияния на клеточные источники регенерации в тканях Однако, до сих пор этот вопрос не изучался В настоящей работе предпринята попытка определить влияние РБ на клетки - источники воссановления ткани взрослых особей позвоночных животных В качестве объекта исследования была выбрана роговица глаза млекопитающих, в которой клеточными источниками регенерации являются зона лимба и базальный слой эпителия (у млекопитающих, кроме того, эпителий конъюктивы) Поскольку, как было показано, биологическая активность РБ характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности, исследование РБ роговицы было проведено на тканях млекопитающих и хвостатых амфибий

Целью настоящей работы явилась идентификация в роговице глаза позвоночных животных РБ, биологически активного в СМД, а также исследование его физико-химических свойств и биологической активности в отношении восстановления роговицы позвоночных

В отдельные задачи исследования входили

• идентификация в роговице глаза быка РБ, биологически активного в СМД,

• изучение физико-химических свойств РБ роговицы,

• изучение локализации РБ роговицы в тканях глаза позвоночных животных с помощью методов иммуногистохимии

• изучение влияния РБ роговицы на клеточную пролиферацию на модели механической травмы роговицы глаза тритона т vivo,

• разработка новых экспериментальных моделей in vitro для изучения специфической биологической активности РБ роговицы,

• изучение влияния РБ роговицы на состояние ткани роговицы глаза позвоночных животных условиях in vitro

Новизна работы Впервые в роговице глаза млекопитающих обнаружен новый кислый белок, проявляющий биологическую активность в дозах, соответствующих 10 10 - 10"'2 мг белка/мл Было установлено, что данный белок локализован в эпителии и эндотелии роговицы позвоночных животных РБ, выделенный из роговицы быка, охарактеризован как кислый низкомолекулярный белок, образующий в водных растворах наноразмерные частицы На модели экспериментальной травмы роговицы тритона in vivo, было показано, что выделенный из роговицы глаза быка РБ в СМД стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток Для изучения специфической активности РБ роговицы разработаны новые экспериментальные модели т vitro, представляющие собой роллерные и стационарные культуры целых роговиц глаз позвоночных животных Впервые показано, что при роллерном культивировании роговицы глаза амфибий происходит активация резерва клеточного отдела этой ткани, отражающаяся в стимуляции эпителизации роговицы Установлено, что РБ роговицы в СМД стимулирует процессы пролиферации и миграции клеток эпителия роговицы, способствуют поддержанию структуры ткани роговицы и оказывают воздействие на ее клеточные источники регенерации Практическая значимость Полученные в работе результаты, во-первых, способствуют пониманию механизмов, лежащих в основе восстановительных и репаративных процессов, идущих в травмированных или патологически измененных тканях, а потому могут быть включены в специальные курсы лекций, касающихся механизмов регуляторной трансдукции, проблемы регенерации тканей позвоночных, в частности, ранозаживления роговицы глаза В ходе исследования впервые разработана модель роллерного культивирования целых роговиц глаза тритона и крысы Данная экспериментальная модель является перспективной для идентификации эффекта биологически активных веществ, влияющих на заживление и регенерацию тканей глаза Учитывая полученные в данной работе результаты, свидетельствующие о ранозаживляющем свойстве РБ роговицы, а также данные, полученные при исследовании локализации данного белка в ткани, на его основе предполагается разработать новый

офтальмологический препарат, который будет эффективен при лечении кератопатий различной этиологии

Апробация результатов исследования Материалы диссертации были доложены на III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз», Москва, 3-6 декабря, 2002, на Конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН, 8 декабря 2004 г Москва, на V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина», Уфа, 5-8 сентября 2005 г, на V ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 14-16 декабря, 2005, на IV Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006 г, на III Международной научной конференции "Факторы экспериментальной эволюции организмов", Алушта (Автономная Республика Крым, Украина), 25-28 сентября, 2006

По результатам данного исследования опубликовано 4 статьи в периодически издаваемых журнала и 7 тезисов докладов в сборниках и материалах Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на'-^'страницах машинописного текста, состоит из следующих глав

Введение, где рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы, Обзор литературы, в котором представлены основные данные по строению и функциям и регенерации роговицы, а также факторах, регулирующих регенераци,

Экспериментальная часть, в которой описаны материалы и основные методы, с помощью которых было проведено исследование,

Результаты и их обсуждение - глава, в которой представлены результаты, полученные при идентификации РБ в роговице глаза, а также исследования его физико-химических свойств и изучения мембранотропной и специфической активности, проявляемой в СМД

Общее обсуждение результатов - раздел, в котором изложены предположения о возможном механизме биологического действия изучаемого РБ Выводы Результаты и обсуждение

1. Выделение и очистка регуляторного белка роговицы глаза быка Регуляторный белок роговицы (РБР) выделяли из ткани согласно ранее разработанной методике (Ямскова и др, 1977, Ямсков и др, 1999) В процессе очистки фракции, содержащие РБР, идентифицировали с помощью адгезиометрического метода, специально

разработанного ранее для определения биологически активных в СМД РВ (Ямскова. Резникова, 199 1). Основные характеристики фракций, содержащих РБР, приведены в табл. ].

Габлина I. Свойства фракций, содержащих регуляторные белки роговицьг глаза быка

Название изучаемого раст вора Объем, мл Концентрация белка, мг/мл Интервал разбавления фракции, в котором проявляется биологическая активность

Тканевый экстракт роговицы 100 0.3-0.4 io-J- Ш*

Сунсрпатапт тканевого экстракта 20 0.08-0.1 LOT3 - 10"

Фракция кислых белков после ИЭФ тканевого экстракта 8 0,95-1,0 10""- I0'J

Фракция кислых бел коп после ИЭФ супернатанта т каневог о экстракта 2 0.35-0,4 10'*-10""

Низкомолекулярный белок после электрофоре за в ПААГ {РБР-фракция) 2 0.01 -0,015 lff*-10-|J

РБР-фракция после ВЭЖХ 1 -- Ю'1- 10"'

Тканевой экстракт Получали, экстрагируя целые роговицы свежеэнуклеированиых

глаз быков (материал бойни Таганского мясокомбината г. Москвы) в физиологическом

растворе при 4"С в течение 2-3 час. I>Ь выделяли из тканевого экстракта по ранее

разработанной методике, включающей высаливание белков в насыщенном растворе

сульфата аммония, изоэлектро фокусирование и электрофорез в ЛААГ. В данном

исследовании изучена фракция кислых белков, собранная при значениях рН<3,5 после

проведения итоэлектрофокусировани«, Методом биотестпроваипя (Ямскова, Резникова,

1991) было покатано, что данная фракция проявляет биологическую активность в

сверхмалых дозах, соответствующих 10 '' - 1ЙГ мг белка/мл раствора. Затем фракцию

исследовали методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПАДГ) в присутствии

ДОдеци л сульфата натрия. Было установлено, что основным ее компонентом был

низкомолекулярщй белок (КГ 0.95 ± 0.05) (рис. 1).

Рис. 1. Разделение фракции кислых белков, полученной после изоэ л ектрофоку сиропамня супернатанта

экстракта роговицы, в 15% 11ААС с добавлением додецилсульфата

натрия.

Окраска Кум ас с и С250, Па рисунках слева - маркеры, справа - фракция РБР.

77 кДа 67 кДа 45 кДа

30 кДа

20.1 кДа~ ¡4.4 кДа"~

РБР"

Выделение биологически активного белка осуществляли с помощью электрофореза в ПААГ без добавления додецилсульфата натрия Низкомолекулярная фракция, значение ЯГ которой соответствовало 0,95 + 0,05, была элюирована из геля и методом биотестирования показано, что она проявляет биологическую активность в СМД, то есть содержит РБР

Приведенная электрофореграмма свидетельствует о том, что во фракции кислых (рН<3,5) белков, выделенных из супернатанта тканевого экстракта, роговицы присутствует один белок с кажущимся значением молекулярной массы значительно ниже 14,4 кДа С другой стороны, при проведении диализа молекулы регуляторного белка не проходили через поры, пропускающие частицы с молекулярной массой менее 8 кДа Таким образом, кажущееся значение молекулярной массы находится в интервале 8 — 14,4 кДа

Рис 2 Разделение фракции РБР методом "Ч

обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте > j

вода/ацетонитрил j По оси абсцисс - время удержания, мин, по

оси ординат - интенсивность поглощения, " , , .

мАВ ч____"= " ' !_____

Фракцию РБР разделяли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте вода -ацетонитрил Было установлено, что биологическая активность соответствовала одной мажорной фракции, время удерживания которой составило 3,2 мин (рис 2) Эти данные свидетельствуют о высокой степени очистки регуляторного белка роговицы, а также о его выраженных гидрофильных свойствах Таким образом, в этой серии экспериментов было установлено, что в роговице глаза быка содержится биологически активный в СМД РБ, который переходит в экстракт и представляет собой низкомолекулярньгй белок, фокусирующийся в интервале рН<3,5

2 Исследование вторичной структуры регуляторного белка роговицы методом кругового дихроизма Вторичная структура РБР была изучена с помощью метода кругового дихроизма с использованием программы k2d для рассчета полученных результатов (Venyaminov, Yang, 1996) Было показано, что во вторичной структуре белка данной фракции преобладают ß-структуры - 57,34%, а-спираль представлена 18,12%, а статистический клубок составляет около 25,78% Эти данные указывают на значительное сходство вторичной структурой РБР и РБ, выделенных из других тканей позвоночных животных (Ямскова и др, 2004,

Рыбакова, 2005) Следует отметить, что согласно литературным данным, преобпадание р-структур во вторичной структуре белков указывает на их способность к образованию в водных растворах высокомолекулярных ассоциатов (Ross, Poirier, 2004) Такое свойство было отмечено у белков фракции РБР и у РБ, выделенных из других тканей (Ямскова, Резникова, 1991, Ямсков и др , 1999, Ямскова и др , 2003)

3 Исследование размеров и формы частиц, присутствующих в водном растворе регуляторного белка роговицы, методами динамического светорассеяния и атомно-

силовой микроскопии Данные, полученные при измерении гидродинамического радиуса (Rt,) частиц, присутствующих в водном растворе РБР с использованием метода динамического светорассеяния приведены в табл 2

Таблица 2 Гидродинамический радиус частиц, обнаруженных в водном растворе РБР фракции при разных углах рассеяния

Угол рассеяния (G), градусы Интенсивность светорассеяния, 1овщ, Гц Избыточная интенсивность светорассеяния, La, Гц Квадрат волнового вектора, q2 Кажущаяся величина гидродинамичес кого радиуса (Rh), нм

60 81164,7 69888,4 1,74*1014 94,3

75 46022,2 44057,45 2,58* 1014 86,7

90 30180,9 29780,5 3,49* 1014 97,0

105 21791,4 19650,49 4,39* 1014 101,0

120 18240,9 15396,62 5,23* 1014 112,0

В этом исследовании установлено, что в водном растворе РБР присутствуют частицы, по размерам близкие к 100 нм Полученные данные далее были приняты в качестве основы для оценки размера частиц РБР в водном растворе при величине угла рассеяния 0° (РгоуепсЬег, 1985) Линейное экстраполирование кажущихся величин К и к 0° позволило вычислить истинную величину Яи, составившую 130,55±6,67 нм Полученная величина гидродинамического радиуса частиц в водном растворе РБР значительно превышает значения данной величины, измеренной для других, более крупных, белков Так гидродинамический радиус геликазы RecQI человека, имеющей молекулярную массу 158 кДа составляет 5,4±0,6 нм (Сш е1 а1, 2004) Для низкомолекулярных белков и пептидов описано также образование в водных растворах значительно более крупных частиц Например, ГвГ-2, имеющий молекулярную массу 15 кДа, образует в растворах с концентрациями растворенного вещества 0,1 - 1 мг/мл димеры или тримеры с

гидродинамическим радиусом 90 им. а при концентрациях Г01--2 менее 0,1 мг/мл -ассоциаты с гидродинамическим радиусом КО - 100 им (Опита е! а!.. 2004).

Дм оценки формы образовавшихся и растворе РБР частиц было проведено вычисление радиуса инерции на основании данных, полученных при измерении интенсивности светорассеяния при различных значениях угла рассеяния. '>га величина составила 153 им. Величина фактора формы, определяемою как соотношение Кк/К.ь. составила 1,275. что позволило оценить форму ассоциатор как эллипсоид. Эти данные нашли частичное подтверждение при исследовании белков РБР-фракции с помощью атомно-силовой микроскопии (рис.З).

^оо НЙ лт

Рис. 3, Размеры частиц фракции кислых (рН<3.5) белков супернатанта экстракта ткани роговицы глаза быка (РБР) после электрофореза в ПААГ согласно данным атомно-

С НЛО ЕЮ и микроскопии.

Л. Частицы РБР на поверхности скола слюды (сканирование в контактной моде). Б. Профиль поверхности выделенного участка. По осям — линейные размерь? частиц, ям.

Полученные данные свидетельствуют, что в растворе РБР обнаруживаются частицы, радиусом, близким к 140 нм. Эти данные, в целом, соответствует размеру частиц, полученных методом динамического светорассеяния Некоторые отличия от данных, полученных методом динамического светорассеяния, возможно, связаны с тем. что при высыхании раствора может протекать дополнительная агрегация частиц РБР, а также их взаимодействие с поверхностью субстрата. Полученные данные свидетельствуют о существовании в водном растворе РБР высокомолекулярных ассоциатов, размеры которых соответствуют гак называемым наночастицам. Известно, что вещества, находящиеся в состоянии наночастиц, проявляют уникальные свойства, значительно отличные от свойств этого же вещества в частицах других размеров. Возможно, что биологическая активность РБР, как и иных РБ, проявляющих биологическую активность в СМД, связана именно с его способностью образовывать в водном растворе частицы этого размерного класса.

4. Исследование локализации PHP

Нами была получена кроличья поликлональная шгШсыворотка к РБР по методу ГоСяинга (Gosling, 2000). Для получения анти сыворотки был использован самец кролика возрастом 2 месяца к Массой ! кг . Раствор исследуемого антигена объемом 0,5 мл и концентрацией 1 мг/мл вводили пятикратно через 1 дней подкожно в область спины и внутримышечно в бедро; для первой инъекции раствор РБР смешивали с полным адъювантом Фрейида и соотношений Iii, а для последующих инъекций использовали раствор РБР в смеси с неполным адъювантом фрейида. Забор проб крови производили путем надреза ушных сосудов, после отделения сыворотки проводили определение содержания в ней антител методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (lingvail. Perlmал. 1971).

Рис. 4. А. Локализация фракции кислых (рП<3.5) белков супернатаита экстракта ткани роговицы глаза быка (РБР) в интактной роговице глаза тритона Pleurodetes -wähl (иммуногкстохим!¡ческая реакции с использованием вторичных FITC-lipнъюгироваиных антител (ув. ок. хЮ: об. х40). Стрелками показаны зоны специфической флуоресценции. Ь. Слои роговицы глаза тритона (фазо во контрастная микроскопия, ув. ок. \ 10: об. х40) 1 -эпителий, 2 - строма, 3 - эндотелий.

Рис. 5. Локализация фракции кислых (рН<3,5) белков супернага!на экстракта ткани роговицы глаза быка (РЬР) и шпактной роговице крысы. А. Локализация фракции кислых (рП<3,5) белков суперпзтапта экстракта ткани роговицы глаза быка (РБР) в роговице крысы (ув. ок. хЮ, об. хЮ; зона локализации показана стрелкой), Б. Слои роговицы глаза крысы (фазовокбнтрастнаЯ микроскопия, ув. ок, х(0; об. х40). I - эпителий, 2 ■■ строма, 3 -эндотелий.

А

Ъ

С помощью иммуногистохимической реакции с использованием вторичных F1TC-конъюгированных антител была изучена локализация данного белка в роговице глаза тритона и крысы Было обнаружено что в интактной роговице тритона РБР локализован в межклеточном пространстве эпителия и эндотелия (рис 4) В интактной роговице глаза крысы он имел аналогичную локализацию (рис 5) Эпителий роговицы выполняет ряд важных функций, среди которых защита и синтез биологически активных соединений (Копаева, 2002, Li, Tseng, 1995), важнейшей функцией эндотелия, наряду с синтезом цитокинов (Wilson et al, 1991) и компонентов десцеметовой мембраны (Joyce et al, 1998) является поддержание уровня гидратации стромы (Bonanno, 2003) и, вследствие этого, поддержание ее толщины и прозрачности Поэтому локализация РБР именно в этих частях роговицы и данные о том, что РБ, выделенные из других тканей, стимулируют процессы пролиферации и миграции клеток, а также способствуют нормализации состояния тканей при протекании патологических процессов (Гундорова и др , 1997), позволили выдвинуть гипотезу о том, что и РБР способен оказывать такое воздействие Это позволило бы использовать РБР в качестве лекарственного препарата при различных повреждениях роговицы

5 Исследование влияния регуляторного белка роговицы глаза быка на состояние роговицы глаза позвоночных в условиях культивирования in vitro

Задачей данного исследования явилось изучения влияния РБР на состояние роговицы глаза позвоночных животных в условиях длительного культивирования in vitro Было проведено несколько серий экспериментов, позволивших иследовать ряд проблем

1 Изучение состояния тканей с разной способностью к регенерации — культивирование роговиц тритона Pleurodeles wait! и крысы линии Wistar Кроме более высокой способности к регенерации, у амфибий менее выражены воспалительные реакции, которые также оказывают влияние на результаты эксперимента Также нуждались в подтверждении предположения об отсутствии видоспецифического характера биологической активности РБР

2 Изучение роли адгезионных взаимодействий в сохранении тканевой структуры роговицы - роллерное культивирование роговиц в сравнении с культивированием на подложке

Работы по роллерному культивированию клеток ведутся с 60-х годов XX века (Moscona, 1961, Moscona, 1963), органное культивирование было впервые использовано в 2001 г Викторовым (Victorov et al, 2001) и показало влияние адгезионного сигнала на

состояние культуры Работ по органному культивированию роговиц ранее не проводилось

3 Исследование роли основного клеточного источника регенерации роговицы

в поддержании ткани в культуре — культивирование роговиц с областью лимба в сравнении с роговицами без лимба Роль лимба —области, расположенной на границе роговицы и склеры — как источника клеток, участвующих в возобновлении и регенерации слоев роговицы была показана в начале 1970-х годов (Davanger, Evensen, 1971, Cotsarelis et al, 1989) Исследование веществ, оказывающих влияние на прогениторные клетки области лимба является актуальным направлением современных биологических исследований При постановке эксперимента по органному культивированию роговиц в опытные флаконы добавляли фракцию РБР в разбавлении, соответствующему концентрации 10 12 мг/мл В качестве контроля в каждой экспериментальной серии исследовали роговицы, выделенные указанными выше способами и культивированные в среде без добавления регуляторного белка

Для оценки состояния роговицы морфометрически оцеенены относительная толщина эпителия и стромы, то есть отношение измеренной с помощью микрометрической линейки толщины соответствующего слоя к общей толщине роговицы, а также количество слоев эпителиальных клеток При культивировании происходит частичная деградация эндотелия, что приводит к увеличению степени гидратации стромы и, вследствие этого, к увеличению ее относительной толщины и уменьшению относительной толщины эпителия Поэтому сходство культуры по этим параметрам с интактной роговицей является признаком протекания процессов поддержания гистоструктуры роговицы Оценка количества эпителиальных клеточных слоев позволила оценить вклад пролиферации клеток этой части роговицы в поддержании относительной толщины эпителия Поскольку эндотелий является однослойным и состоит из уплощенных гексагональных клеток, количественная оценка его состояния не представлась информативной и потому не проводилась

5 1 Роплерное культивирование роговицы глаза тритона без сохранения области лимбав течение 7 сут

После извлечения из культуральной среды образцы роговицы представляли собой практически плоские фрагменты Роговицы глаза тритона экспериментальной серии и контроля на гистологических срезах представляли собой двуслойную структуру, состоящую из эпителия и стромы Эндотелиальный слой деградировал и не замещался мигрирующими клетками эпителия Эпителиальный пласт состоял из 2 - 3-х слоев клеток,

адгезия базальиого слоя эпителия к строме была нарушена, причем на некоторых гистологических препаратах контрольной серии эпителий вообще отсутствовал Строма сохраняла волокнистую структуру, однако порядок расположения волокон стромы был нарушен, а количество живых фибробластов было невелико как в опыте, так и в контроле Результаты измерений, представленные в таблице 3, показывают, что в опытных культурах (при воздействии РБР) относительная толщина эпителиального слоя была приблизительно в 4 раза больше, а количество клеточных слоев - более чем в 2,5 раза больше, чем в контроле (без воздействия РБР) В то же время, толщина стромы в опыте была приблизительно в 1,4 раза меньше, чем в контроле Все измеренные количественные показатели в опыте практически совпадают с таковыми в интактной роговице, в отличие от контрольных Достоверные отличия (р<0,05) между опытной и контрольной группами наблюдались по всем измеренным показателям, свидетельствующим, главным образом, о деградации эпителиального слоя в контроле и его сохранением в опыте

Таким образом, данные позволяют сделать вывод о том, что изучаемые РБР в СМД оказывают выраженный протекторный эффект на состояние роговицы глаза тритона без сохранения области лимба при длительном органоспецифическом роллерном культивировании

5 2 Роччерное культивирование роговгщы гчаза тритона с сохраненной областью

лимба в течение 7 сут

Извлеченные из культуральной среды после 7 сут культивирования роговицы представляли собой сфероиды, образованные за счет сближения края роговицы Роговицы как в экспериментальной серии (культивированные с добавлением РБР), так и в контроле (без добавления РБР) состояли из трех слоев В роговицах контрольной серии можно было выделить эпителий, строму и эндотелий, однако, по краю роговицы происходила миграция эпителиальных клеток на внутреннюю поверхность роговицы и их увеличение их числа (рис 7) Эти клетки постепенно замещали эндотелиальный слой на периферии роговицы так, что внутренняя поверхность роговицы после 7 сут культивирования оказывалась покрытой двумя типами клеток эндотелиальными в центральной части и эпителиальными на периферии Среднее число клеточных слоев эпителия здесь составило 2,36±0,43

В роговице тритона опытной серии процесс замещения эндотелия эпителиальными клетками к окончанию срока культивирования был полностью завершен В роговицах удавалось выделить три сформированных слоя - наружный (исходный) эпителиальный, строму и внутренний эпителиальный (вновь образованный) Относительная толщина слоев роговицы и количество слоев эпителиальных клеток приведены в таблице 3

Полученные данные показывают, что число слоев эпителиальных клеток наружного слоя В опыте к к контроле достоверно не различаются (р>0.05), но оно выше, чем н интактной роговице. В то же время, относительная толщина наружного эпителиального слоя в опыте достоверно выше, чем к контроле. Эти данные, с одной стороны, указывают на увеличение количества эпителиальных клеток н роговицах тритонов Ш vitro с (¡»храненной областью лимба, а с другой стороны, на стимуляцию РБР пролиферации эпителиальных клеток. Эти данные подтверждаю гея результатами, подученными при культивировании роговиц тритонов без сохранения области лимба (см, раздел 54 и таблицу 3). Были обнаружены достоверные отличия в относительной толщине стромы роговиц опытной н контрольной серий - к опыте средняя толщина стромы была приблизительно в 1,2 раза меньше, чем в контроле. Следует отметить, что культивирование роговиц глаза тритонов без сохранения области лимба приводило к достоверному увеличению относительной толщины стромы по сравнению с интакпой рогоннцей н роговицами, культивированными с сохранением области лимба (данные контроля, таблица 3). Полученные данные указывают и на то. что условия роллерного культивирования роговицы чритона с сохранением лимба способствуют поддержанию структуры ткани. В опытных сериях, как при сохранении области лимба, гак и без данной области относительная толщина стромы была достоверно меньше (р<0.05). чем в соответствую вшх контрольных сериях и не отличались ог интактной роговицы (р>0,05) Эти результаты можно объяснить тем, что в условиях роллерного культивирования при сохранении области лимба в роговице тритона поддерживается ее тканевая структура, а РБР дополнительно способствует этому;

По наиболее значительным результатом, демонстрирующим качественные различия между роговицами опытной и контрольной серий, является появление внутреннего эпителиального слоя в

Рис. 7. Роговица тритона, область лимба сохранена. 7 суток роллерного органного культивирования при 18"С (ув. ок. х4, об. х 10. окр, гематоксилин, эозин). А - кон троль, Б - опыт (РБР в концентрации 10-12 мг белка/мл раствора) (/ - наружный (естественный) слой эпителия, 2 - строма, 3 эндотелии, 4 - внутренний (дополнительный) слой эпителии).

1

роговицах, подвергавшихся воздействию РБР На наш взгляд, различия в толщине стромы могут быть связаны с образованием дополнительного внутреннего эпителиального слоя, который снижает степень гидратации стромы за счет изолирования ее от культуральной жидкости

Таблица 3 Состояние роговицы тритона после 7 сут роллерного органного культивирования

Измеряемая структура роговицы Интактная роговица Роговицы, культивированные при сохранением области лимба Роговицы, культивированные в отсутствие области лимба

опыт контроль опыт контроль

Относительная толщина наружного эпителиального слоя, % 32,13±1,08 36,19+3,13 29,94+ 4,91 35,89+ 5,41 8,49+2,46

р<0,05 р<0,05

Относительная толщина стромы, % 66,88±2,14 58,98+3,47 70,06±4,48 63,10± 2,35 91,08+2,83

р<0,05 р<0,05

Относительная толщина внутреннего эпителиального слоя (в центре), % 4,83±1,71

Количество слоев клеток эпителия 3,72±0,41 5,15+0,72 4,78+1,71 3,46± 0,50 1,34±0,48

р>0,05 р<0,05

Полученные в этой серии опытов данные свидетельствуют о том, что РБР стимулирует процессы миграции клеток из области лимба и их последующую пролиферацию Ни в одной экспериментальной серии, кроме той, где роговицы, выделенные с областью лимба, подвергались воздействию РБР, цельный, полностью сформированный внутренний дополнительный слой клеток эпителия не образовывался

Источником образования этого дополнительного слоя с большой степенью вероятности являются клетки лимба, испытавшие воздействие РБР

Таким образом, результаты этой серии свидетельствуют о том, что РБР в СМД способен стимулировать миграцию клеток эпителия области лимба и, возможно, более центрально расположенных клеток эпителия роговицы При этом общее количество эпителиальных клеток на обеих поверхностях роговицы в опытных сериях значительно превышало эту величину для контрольных культур Показателем этого является достоверно (р<0,05) отличающееся количество слоев клеток в обоих эпителиальных слоях роговицы в опыте и контроле В данной серии экспериментов мы не оценивали клеточную пролиферацию, однако можно предположить, что только за счет миграции эпителиальных клеток такие различия не могли быть достигнуты

5 3 Виияние РБР на состояние роговицы тритона при органном культивировании

т vitro на подложке

Было показано, что в условиях роллерного органного культивирования наблюдается сохранение гистоструктуры роговицы и стимуляция миграции клеток эпителия лимба Мы предположили, что адгезионный сигнал со стороны подложки на культивируемую ткань является принципиальным фактором регуляции хода и направленности основных биологических процессов Поэтому следующим этапом данной работы явилось исследование состояния роговицы глаза тритона в условиях культивирования на подложке и влияния РБР на ее состояние Культивирование проводили при t = 22°С в течение 7 сут, после чего культуры извлекали и исследовали с использованием методов микрометрии При таком способе культивирования in vitro роговицы не образовывали замкнутые структуры, состояли из трех исходных слоев - эпителия, стромы и эндотелия, причем целостность последнего была частично нарушена Следует отметить, что в контрольных сериях роговиц, включавших область лимба, отмечено нарушение адгезии между эпителием и стромой, вероятно, за счет нарушения целостности базальной мембраны эпителия В опытной серии (при воздействии РБР) адгезионные взаимодействия между стромой и эпителием в основном сохранялись строма и эпителий прилежали друг к другу Миграция эпителиальных клеток на внутреннюю поверхность роговицы практически не была выражена и обнаруживалась только у края роговицы, а образование целостного внутреннего эпителиального слоя не было отмечено Полученные данные приведены в таблице 4

Таблица 4 Состояние роговицы тритона после 7 сут стационарного культивирования на подложке

Слои Интактная Роговицы, Роговицы,

роговицы роговица культивированные с сохранением области лимба культивированные без сохранения области лимба

опыт контроль опыт контроль

Относительная 32,13±1,08 14,28±1,81 14,98±1,93 31,86±2, 27,3913,46

толщина 55

эпителия, % р>0,05 р<0,05

Относительная 66,88±2,14 85,73±3,45 85,02±3,98 68,14±2, 72,44+2,85

толщина стромы, 54

% р>0,05 р<0,05

Количество слоев 3,72±0,41 4,62±0,60 4,37±0,65 4,23± 3,43±0,51

клеток эпителия 0,58

р>0,05 р<0,05

При оценке относительной толщины эпителия и стромы наблюдались достоверные различия (р<0,05) между данными, полученными в контрольных сериях при культивировании роговиц как с сохраненной областью лимба, так и без нее, а также интактной роговицы (табл 4), однако различия в количестве слоев эпителиальных клеток не были достоверными (р>0,05) Полученные данные можно объяснять увеличением толщины стромы роговицы, в результате ее гидратации При изучении роговиц, культивированных без области лимба, были обнаружены достоверные различия (р<0,05) между данными опытных ( с добавлением РБР) и контрольных (без добавления РБР) культур Количество слоев эпителиальных клеток и относительная толщина эпителия была выше в опыте, а относительная толщина стромы — в контроле Обращает на себя внимание тот факт, что величины параметров роговиц, культивированных без области лимба, в опытной серии практически соответствуют данным, измеренным для интакной роговицы (р>0,05) Это свидетельствует, на наш взгляд, о стабилизирующем действии РБР па структуру ткани роговицы в контроле за время культивирования начинается развитие деструктивных процессов, а РБР оказывает на ткань выраженное протекторное действие

Совершенно иная картина наблюдается в случае стационарного культивирования роговиц с сохраненной областью лимба Различий в величинах всех трех параметров мы

не выявил» Это связано с тем, что адгезия области лимба с подложкой, вероятно, сама по себе является определяющим сигналом, поддерживающим структуру ткани роговицы Предположитечыю, резервные клетки области лимба в данных условиях находятся в «латентном», «молчащем» состоянии, а воздействия РБР недостаточно для их активации

Итак, по результатам нескольких серий экспериментов, исследующих влияние РБР на состояние роговиц глаза тритона при их культивировании в различных условиях, можно отметить следующее

Во-первых, в сериях экспериментов на роговицах тритона была продемонстрирована принципиальная роль клеточной адгезии как фактора регуляции пролиферации и миграции клеток Рассматривая данные контрольных серий эксперимента, можно отметить, что при роллерном культивировании роговиц глаза тритона с сохраненной области лимба наблюдается стимуляция клеточного резервного отдела, что проявляется поддержании структуры ткани роговицы по сравнению с культурой на подложке (табл 3 и 4) При культивировании роговиц с сохраненной областью лимба на подложке наблюдается развитие деструктивных процессов (увеличение относительной толщины стромы и, в то же время, уменьшение относительной толщины эпителия) по сравнению с интактной роговицей Данные, полученные при роллерном культивировании роговиц с сохраненной областью лимба, близки к данным, измеренным в интактной роговице При роллерном культивировании роговиц тритона без сохранения области лимба происходит быстрая деградация ткани роговицы (табл 3, контроль), а РБР оказывает в этих условиях выраженное протекторное действие, предположительно, влияя на клетки базального слоя эпителия, который также относятся к клеточному резервному отделу данной ткани Причем значения трех изучаемых параметров, полученных в опытной серии (воздействие РБР), в данном случае приближаются к таковым, измеренных для интактной роговицы Следует отметить, что при культивировании роговиц без области лимба на подложке процессы деструкции ткани протекают не столь интенсивно, как при роллерном способе культивирования (контрольные серии, таблицы 3 и 4) Поскольку во всех приведенных примерах были рассмотрены данные контроля (без воздействия РБР), то можно заключить, что адгезия к подложке является фактором, удерживающим в неактивном состоянии клетки резервного отдела, локализованные в области

Можно также предположить, что адгезия между роговицей и соседними тканями, имеющая место условиях in vivo, является фактором, регулирующим уровень активности клеток резервного отдела в ткани В условиях роллерного культивирования, то есть в отсутствие адгезионного сигнала со стороны подложки, возможно, происходит активация клеточных источников восстановления и репарации в роговице (таблица 3) Таким

образом, роллерное органное культивирование роговицы глаза тритона является принципиально новой моделью, позволяющей изучать клеточный резервный отдел регенерации роговицы, а также влияние на него различных факторов, в том числе, биологически активных веществ

Во-вторых, в данном исследовании было показано, что регуляторный белок, выделенный из роговицы глаза быка, в СМД способен поддерживать тканевую структуру роговицы глаза тритона в системах in vitro Данный протекторный эффект РБР особенно ярко проявляется при роллерном способе культивирования как при сохранении области лимба, так и в его отсутствие Полученные данные показывают, что в этих условиях происходит активация клеточных источников регенерации роговицы (данные контрольной серии), а РБР дополнительно стимулирует этот процесс

В условиях отсутствия активации или ингибирования клеток резервного отдела, локализованных в области лимба, которое, по нашему мнению, происходит при стационарном способе культивирования, РБР не способен проявить свое биологическое действие Однако в этих условиях РБР оказывает влияние на клетки базального слоя эпителия, которые также являются клеточными источниками регенерации в роговице амфибий и относятся к прогениторным клеткам (Dua, Azuaro-Blanco, 2000) Таким образом, основным результатом данной серии экспериментов является выявление стимулирующего воздействия РБР в СМД на клеточный резерв базальных клеток эпителия

5 3 Влияние РБР на состояние роговш{ы крысы при роллерном органном кулыпивированиив течение 7 сут в условиях in vitro В следующей серии экспериментов проведено исследование РБР па роговицу крысы в условиях органотипического роллерного культивирования Основной задачей данной экспериментальной серии было выяснение вопроса, является ли стимулирующее воздействие РБР на миграцию и пролиферативную активность клеток общим для эпителия роговицы далеких классов животных, обладающих разными регенерационными возможностями

Также, как и при изучении влияния РБР на состояние роговицы тритона, мы исследовали роговицы крысы, включающие область лимба, и выделенные без нее Срок культивирования также составил 7 сут

По окончании срока ротационного культивирования роговицы крысы во всех сериях представляли собой сфероиды, состоящие из двух слоев — эпителия и стромы Клетки эндотелия частично гибли и через 7 сут на некоторых участках внутренней поверхности стромы отсутствовали Ни в опыте, ни в контроле не было отмечено образования

внутреннего дополнительного слоя за счет клеток наружного слоя эпителия, как это происходило у тритонов Не было обнаружено нарушение адгезии между эпителием и стромой Морфологическое состояние роговиц опытной и контрольной группы было сходно Некоторые количественные характеристики состояния роговицы крысы после 7 сут культивирования приведены в таблице 5 Статистические различия в величинах относительной толщины слоев и количества слоев клеток эпителия роговиц, культивированных вместе с областью лимба, между опытной (с добавлением РБР) и контрольной (без добавления РБР) групп не обнаружены (р>0,1)

Таблица 5 Морфологическое состояние роговицы крысы после 7 сут роллерного органного культивирования

Интактная роговица Роговицы, культивированные с областью лимба Роговицы, культивированные без области лимба

опыт контроль опыт контроль

Относительная толщина наружного эпителиального слоя, % 20,03+3,90 9,17± 1,75 9,61±2,49 11,41± 2,49 15,97±3 02

р>0,05 р>0,05

Относительная толщина стромы, % 77,28+3,75 90,83±1, 74 90,39±2,93 88,59± 2,38 84,03±3,24

р>0,05 р>0,05

Количество слоев клеток эпителия 4,69±0,13 4,10± 1,24 3,92±0,73 5,65± 1,31 3,52±0,64

р>0,05 р<0,05

В роговицах, выделенных без сохранения лимба, напротив, отмечены достоверные отличия в количестве слоев эпителиальных клеток (р<0,05), причем обнаружена стимуляция эпителизации роговицы со стороны РБР, выражающаяся в увеличении количества слоев эпителиальных клеток Данные указывают на протекторное действие РБР на эпителий роговицы в этих условиях Мы допускаем также стимуляцию РБР пролиферации предшественников клеток базалыюго слоя, поскольку число слоев данных клеток в роговицах, культивируемых в присутствии РБР, оказалось достоверно выше, чем в интактной роговице (р<0,05) В то же время, можно констатировать, что РБР не оказывает протекторного действия на морфологическое состояние роговицы, и наблюдаемое воздействие прослеживается лишь в отношении эпителиальных клеток

Различия в действии РБР на роговицы крысы при роллерном культивировании были обнаружены только в случае роговиц без области лимба

5 4 Влияние РБР на состояние роговицы крысы в условиях кушпивирования на подложке in vitro Результаты, полученные при исследовании влияния РБР на состояние роговицы крысы после культивирования на подложке в течение 7 сут, представлены в таблице 6 При культивировании роговиц, выделенных как с областью лимба, так и без нее, отличий между опытными и контрольными сериями не выявлено

Таблица 6 Морфологическое состояние роговицы крысы после 7 сут стационарного культивирования на подложке in vitro

Слои роговицы Интактная Роговицы, Роговицы,

роговица культивированные с областью лимба культивированные без области лимба

опыт контроль опыт контроль

Относительная 20,03±3,90 17,62± 16,59±1,68 10,77± 10,24 ±2,52

толщина 3,63 1,57

эпителиального слоя, % р>0,05 р>0,05

Относительная 77,28±3,75 82,33± 83,49±1,85 89,76± 89,23 ±1,57

толщина стромы, % 3,61 2,51

р>0,05 р>0,05

Количество слоев 4,69±0,13 4,89± 5,14±1,07 4,20± 4,31 ±0,64

клеток эпителия 2,05 0,89

р>0,05 р>0,05

Сравнение оцениваемых показателей для интактной роговицы и роговиц экспериментальных серий показывает, что при стационарном культивировании развиваются процессы деградации ткани, проявляющиеся в увеличении относительной толщины стромы и уменьшении относительной толщины эпителия Наиболее вероятной причиной таких изменений является увеличение степени гидратации стромы, имеющей место при нарушении целостности эндотелия роговицы (Вопаппо, 2000)

Сравнение результатов, полученных при культивировании роговицы крысы и тритона позволяет отметить, а также предположить следующее

1 рочлерный тип культивирования роговицы способствует активизации клеток резервного отдела амфибий, но не имеет того же эффекта при действии на роговицу млекопитающих,

2 у амфибий влияние РБР выражается в стимуляции как недифференцированных клеточных источников регенерации (клеток лимба), так и более дифференцированных тканевых прогениторных клеток (клетки базального слоя),

3 у млекопитающих в условиях роллерного культивирования роговиц РБР не оказывает влияние на клеточные источники регенерации ткани (клетки лимба), но, вероятно, оказывает действие на клетки базального слоя роговицы, интенсифицируя их переход в дифференцированные эпителиальные клетки

6 Исследование влияния РБР на клеточную пролиферацию эпителия роговицы тритона после нанесения экспериментального разреза в условиях т vivo Результаты проведенных нами экспериментов по роллерному и стационарному культивированию роговиц тритона и крысы позволили сформулировать предположение о том, что РБР стимулирует пролиферацию клеток эпителия роговицы глаза тритона и не оказыает такого действия на клетки эпителия роговицы крысы Таким образом, клетки эпителия роговицы хвостатых амфибий сохраняют способность к пролиферации в большей мере, чем таковые клетки млекопитающих, в частности, крысы Исследование влияние фракции РБР на клеточную пролиферацию в роговице поэтому было проведено на глазах тритона с помощью метода авторадиографии в условиях т vivo

Тритонам наносили стандартный поперечный разрез роговицы, рану ежедневно обрабатывали раствором РБР в СМД, соответствующей 10 12 мг белка/мл раствора В качестве контроля исследовали оперированных животных, которые не подвергались воздействию РБР Индекс меченых ядер (ИМЯ) в роговицах оценивали на сроках 7, 14 и 28 сут после проведения операции В качестве дополнительного контроля был использован РБ, выделенный из сыворотки крови быка, который, как было установлено ранее, обладает значительными ранозаживляющими свойствами в отношении роговицы млекопитающих (Гундорова и др , 1997)

Было показано, что РБР в СМД стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток роговицы тритона in vivo Результаты данного эксперимента представлены на рис 8 Наибольшие различия в величине ИМЯ между группой животных, глаза которых обрабатывали РБР, и контрольной группой, наблюдали на сроке 7 дней после нанесения разреза роговицы (р<0,05) На 14-й день после операции эти различия уменьшались, но

оставались достоверными (р<0.05). На 28-й день после операции различий между контрольной и опытными группами выявлено не было (р>0.05).

Следует отметить, что на 7 и 14 сутки после операции пел мчи..... ИМЯ. как в

экспериментальных так в и контрольной группах, достоверно превышали значение ИМЯ, определенное для иитактиых неопрерйрованных роговиц тритонов, не подвергавшихся операции (в данной группе ИМЯ составил 2.37 ± 1.12%).

Рис, 8 Йпиямие фракции кислых (рН<3.5) белков супериатанта экстракта ткани роговицы глаза быка (PSP). на клеточную пролиферацию эпителия йогов и цы тритона /V. wähl. По оси абсцисс: РБ 1 - роговицы тритонов, подвергавшихся воздействию Р1>Р; РБ 2 - роговицы, подвергшиеся воздействию РБ, выделенные из сыворотки крови быка, К -роговицы тритонов, подвергавшихся воздействию воды (контроль); но оси ординат: величина ИМЯ. %.

2 3 12 3

контроль РБР

Рис. 9. Величина ИМЯ в разных секторах роговицы тритона

Л. Схема расположения иследованнпых секторов роговицы (линия разреза показана сплошной чертой). (1 - латеральный, 2 -дорсальным. 3 - медиальный, 4 -вентральный).

I) ИМЯ в эпителии разных секторов роговицы.

1+3 2+4 1+3 2+4

РБ сыворотки крови также стимулировал клеточную пролиферацию в роговице глаза тритона in vivo (р<0.05). но достоверных различий между двумя группами тритонов, которых в ходе эксперимента подвергали воздействию РБР и РБ сыворотки крови, обнаружено не было (р>0,05). Наблюдаемое за время проведения опыта постепенное уменьшение значений ИМЯ во всех экспериментальных Группах животных, в том числе и контрольной, очевидно, отражает уменьшение всего пула пролиферирувдцих клеток в ткани роговицы в связи с завершением ее регенерации.

При оценке значений ИМЯ отдельно подсчитывали ядра в четырех секторах роговицы, условно выделенных на каждом гистологическом срезе. При этом не обнаружено

достоверных отличий в величинах ИМЯ между секторами, через которые проходил разрез (медиальный и латеральный), и секторами, которые разрез не затрагивал (дорсальный и вентральный) (рис 9) По-видимому, процессы заживления поврежденной роговицы происходят в ткани достаточно широко, формируя поле репарации вне области прямого повреждения Такое предположение согласуется с концепцией морфогенетических полей (Гилберт и др, 1997, Beloussov, 2001) и связанных с ними полей регенерации (Chiang et al, 1992, Robinson, Messerli, 2003)

Полученные в этом разделе работы данные свидетельствует о том, что РБР в СМД увеличивает клеточную пролиферацию в этой ткани в такой же степени, как и сывороточный РБ Ранее было установлено, что сывороточный РБ стимулирует восстановление поврежденной роговицы после ее разреза у кролика in vivo (Гундорова и др, 1997) Сопоставление этих данных позволяет заключить, что оба РБ являются стимуляторами пролиферативной активности клеток роговицы глаза как низших, так и высших позвоночных животных

ВЫВОДЫ

1 В роговице глаза быка идентифицирован регуляторный белок, биологически активный в сверхмалых дозах, соответствующих 10"'° — 1012 мг белка/ мл раствора

2 Изучены некоторые физико-химические свойства регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка Выяснено, что он представляет собой кислый, низкомолекулярный белок со значением «кажущейся» молекулярной массы в интервале 8 — 14,4 кДа, который проявляет резистентность к воздействию ряда физико-химических факторов, имеет способность образовывать в водных растворах межмолекулярные ассоциаты размером около 130 нм По совокупности проявляемых физико-химических свойств изучаемый регуляторный белок роговицы является новым, но относящимся к известной группе биологически активных в сверхмапых дозах белков, идентифицированных в других тканях позвоночных животных

3 С помощью иммуногистохимических методов показано, что регуляторный белок локализован в эндотелии и эпителии роговицы глаза амфибий и млекопитающих

4 Для оценки биологической активности регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка, была разработана модель роллерного культивирования т vitro роговицы глаза позвоночных животных

5 С помощью тимидиновой радиавтографии установлено, что регуляторный белок стимулирует пролиферацию клеток эпителия роговицы тритона в ходе ранозаживления после нанесения экспериментальной травмы in vivo

6 Показана роль адгезионного сигнала со стороны подложки в активации клеточных источников регенерации роговицы у хвостатых амфибий, в отличие от млекопитающих, роллерный тип культивирования (отсутствие адгезионного сигнала) приводит к их активации

7 При роллерном культивировании роговицы глаза тритона регуляторный белок, выделенный из роговицы глаза быка, стимулирует миграцию, адгезию и пролиферацию эпителиальных клеток, а также способствует поддержанию структуры стромы роговицы У крыс данный регуляторный белок способствует увеличению количества эпителиальных клеток в роговице без области лимба в условиях роллерного культивирования по сравнению с контролем

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Маргасюк Д В, Григорян Э Н, Ямскова В П Исследование влияния на клеточную пролиферацию в роговице глаза тритона адгезивного белка, выделенного из роговицы глаза быка // Изв РАН Сер Биол 2005а № 6 С 738 -743

2 Маргасюк Д В , Краснов М С , Ямскова В П, Григорян Э Н, Ямсков И А Исследование регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка выделение, очистка, локализация в ткани и биологическая активность // Офтальмология 2005 Т 2 №3 С 81-87

3 Краснов М С , Беляева А В , Маргасюк Д В , Качалина А В , Ямскова В П Изучение влияния регуляторных белков, выделенных из подорожника большого на заживление кожных ран у мышей in vivo // Онтогенез 2005 Т 36 № 5 С 379-380

4 Григорян Э Н , Новикова Ю П , Маргасюк Д В , Краснов М С , Алейникова К С , Поплинская В А , Миташов В И Меланоциты васкулярной сети лимба участвуют в заживлении роговицы глаза взрослого тритона Pleurodeles waltl // ДАН 2007 Т 412 № 6 (в печати)

5 Маргасюк Д В, Краснов М С , Ямскова В П , Ямсков И А Биологически активный в сверхмалых дозах регуляторный белок, выделенный из роговицы глаза быка влияние на состояние роговицы крысы в условиях культивирования т vitro U Труды V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 14-16 декабря, 2005, С 197-207

6 D V Margasyuk, M S Krasnov, IV Blagodatskikh, E N Grigoryan, V P Yamskova, IA Yamskov "Regulatory Protein from Bovine Cornea Localization and Biological Activity", pp 49-56 // In the book «Biochemical Physics Frontal Research», Ed by S D Varfolomeev, E В Burlakova, A A Popov and G E Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc 2006 P 160

7 Ямскова В П , Краснов M С , Маргасюк Д В , Ямскова О В , Ямсков И А Действие новых регуляторных белков растений в сверхмалых дозах // Тезисы докладов III Международного симпозиума «"Механизмы действия сверхмалых доз", Москва, 3-6 декабря, 2002 с 41

8 Маргасюк Д В , Краснов M С Влияние регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка, на процессы ранозаживления роговицы глаза тритона // Тезисы докладов V Всероссийского научного семинара и Молодежной научной школы «Химия и медицина» в «Новые лекарственные средства успехи и перспективы», Уфа Гилем, 2005 С 117

9 Д В Маргасюк Изучение адгезивного белка, выделенного из роговицы глаза быка//Онтогенез 2005 т 36 №3 с 234 Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им H К Кольцова РАН 8 декабря 2004 г Москва

10 Краснов M С , Ямскова В П , Григорян Э H , Гурмизов Е П , Маргасюк Д В , Скрипникова В С, Ямсков И А Воздействие сверхнизких концентраций регуляторных пептидов, выделенных из тканей глаза позвоночных, на состояние этих тканей // Материалы IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006а С 74

11 Краснов M С , Ямскова В П, Гурмизов Е П , Григорян Э H , Маргасюк Д В Модели органотипического культивирования тканей глаза in vitro для тестирования регуляторных молекул // Сборник научных трудов Ш Международной научной конференции "Факторы экспериментальной эволюции организмов", Алушта (Автономная Республика Крым, Украина), 2528 сентября, 2006, ред M В Роик, К Логос, Т 3, С 590-595

Заказ № 187/04/07 Подписано в печать 19 04 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

, ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 < М www efr ru, e-mail info@cfr rn

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маргасюк, Дмитрий Викторович

Список используемых в тексте англоязычных сокращений.

Список используемых в тексте русскооязычных сокращений.

Введение.

1 Литературный обзор.

1.1. Строение и основные функции роговицы.

1.1.1 .Строение и функции эпителия роговицы.

1.1.2.Строение и функции етромы роговицы.

1.1.3.Строение и функции эндотелия роговицы.

1.2. Взаимодействия между слоями роговицы.

1.2.1. Эндотелиалыю-стромальные взаимодействия

1.2.2. Взаимодействия между стромой и эпителием роговицы.

1.3. Процессы ранозаживлепия в роговице.

1.3.1 Общая последовательность процессов, протекающих в ходе раиозаживления.

1.3.2. Клеточные источники регенерации роговицы.

1.3.3. Раиозаживление в эпителии роговицы.

1.3.4. Процессы раиозаживления в строме роговицы.

1.3.5. Процессы раиозаживления в эндотелии роговицы.

1.4. Регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах.

Глава 2 Материалы и методы.

2.1. Приготовление экстракта ткани роговицы.

2.2. Приготовление супернатанта экстракта ткани роговицы.

2.3. Получение фракций экстракта ткапи роговицы и супернатанта методом изоэлектрофокусирования.

2.4. Определение концентрации белка.

2.5. Электрофорез белков в полиакриламидиом геле.

2.6. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

2.7. Определение вторичной структуры с помощью метода кругового дихроизма.

2.8. Исследование частиц в водном растворе РБР методом динамического светорассеяния.

2.9. Определение радиуса частиц, присутствующих в растворе РБР, методом атомпо-силовой микроскопии.

2.10. Определение влияния растворов, содержащих РБР, на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мышипри кратковременном органном культивировании in vitro.

2.11. Получение кроличьей поликлоналыюй антисыворотки.

2.12. Иммупоферментный анализ антител (ELISA).

2.13. Иммуногистохимическое исследование локализации белка с использованием FITC -копъюгированных антител.

2.14. Культивирование роговицы.

2.15. Приготовление гистологических срезов.

2.16. Нанесение разреза роговицы.

2.17. Исследование клеточной пролиферации методом радиоавтографии.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Выделение и очисткарегуляторных белков, выделенных из роговицы глаза быка.

3.2. Биотестирование фракций РБРв процессе очистки.

3.3. Исследование РБР- фракции методом кругового дихроизма.

3.4. Исследование методами динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии размеров и формы частиц, присутствующих в водном растворе регуляторного белка роговицы.

3.5. Исследование локализации регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка.

3.6. Исследование влияния регуляторных белков, выделенных из роговицы глаза быка, на состояние роговицы тритона в условиях роллерпого культивирования in vitro.

3.7. Влияние С-РБР на состояние роговицы тритона при органном культивировании на подложке в условиях in vitro.

3.8. Влияние С-РБР на состояние роговицы крысы при роллерном органном культивировании в условиях in vitro.

3.9. Влияние С-РБР на состояние роговицы крысы в условиях культивирования на подложке in vitro.

3.10. Исследование влияния С-РБР на клеточную пролиферацию эпителия роговицы тритона после нанесесения экспериментального разреза в условиях in vivo.

Глава IV. Общее обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование физико-химических свойств и биологической активности регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка"

Актуальность работы. Важнейшей функцией роговицы глаза является проведение и преломление светового потока, для чего необходимо поддержание ее определенных оптических свойств - прозрачности и коэффициента преломления. В то же время роговица участвует в формировании передней стенки глаза, непосредственно контактирует с окружающей средой и испытывает влияние различных физико-химических факторов, действие которых часто является неблагоприятным и приводит к ее повреждению. В связи с этим травмы и сопутствующие им заболевания роговицы являются одними из самых распространенных патологий глаза человека.

В силу данных обстоятельств изучение процессов восстановления и репарации, лежащих в основе ранозаживления роговицы, представляет собой актуальную проблему современной биологии и офтальмологии. Одним из важнейших путей разрешения данной проблемы является поиск новых соединений, участвующих и регулирующих такие биологические процессы, как адгезия, миграция, дифферепцировка и пролиферация клеток. Среди этих веществ вызывают интерес регуляторпые белки (РБ), проявляющие биологическую активность в сверхмалых дозах (СМД). Белки данной группы были обнаружены в различных тканях животных и растений (Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 1999; Краснов и др., 20036), в том числе в таких тканях глаза, как нейральная сетчатка и пигментный эпителий (Краснов и др., 2003а). Установлено, что РБ в СМД оказывают влияние на ход и направленность важнейших биологических процессов: РБ влияют па адгезию, диффереицировку клеток сетчатки и пигментного эпителия и увеличивают их жизнеспособность. Биологическая активность РБ тканей глаза характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности. При исследовании РБ данной группы был разработан новый экспериментальный подход, применение которого позволяет идентифицировать РБ в различных тканях.

Целыо настоящей работы явилась идентификация в роговице глаза позвоночных животных РБ, биологически активного в СМД, а также исследование его физико-химических свойств и биологической активности.

В отдельные задачи исследования входили:

• идентификация в роговице глаза быка РБ, биологически активного в ОМД;

• изучение физико-химических свойств РБ роговицы;

• изучение локализации РБ роговицы в тканях глаза позвоночных животных с помощью методов иммуногистохимии:

• изучение влияния РБ роговицы на клеточную пролиферацию на модели механической травмы роговицы глаза тритона in vivo;

• разработка новых экспериментальных моделей in vitro для изучения специфической биологической активиости РБ роговицы;

• изучение влияния РБ роговицы на состояние ткани роговицы глаза позвоночных животных условиях in vitro.

Новизна работы. Впервые в роговице глаза млекопитающих обнаружен новый кислый белок, проявляющий биологическую активность в дозах, соответствующих Ю"10 - 10"12 мг белка/мл. Были изучены некоторые физико-химические свойства данного белка. Показано, что данный белок имеет небольшую молекулярную массу - менее 10 кДа, характеризуется высокой резистентностью к воздействию ряда физико-химических факторов (изменению в широком диапазоне значений температуры, рН, ионной силы растворов, воздействию хелатирующих ионы металлов агентов, органических растворителей, действию различных иротеаз и др.). На модели экспериментально нанесенной травмы роговицы глаза тритона in vivo, было показано, что РБ, выделенный из роговицы глаза быка, в СМД стимулировал пролиферацию эпителиальных клеток. Для изучения специфической активности РБ роговицы были разработаны новые экспериментальные модели in vitro, представляющие собой роллерные и стационарные культуры целых роговиц глаз позвоночных животных. Впервые было показано, что при роллерном культивировании роговицы глаза амфибий происходит активация резервного клеточного отдела этой ткани, которая отражается в стимуляции эпителизации роговицы. По сравнению с контролем изучаемый РБ роговицы в СМД стимулирует данные процессы. Таким образом, впервые показано стимулирующее влияние эндогенного биорегулятора в СМД на клеточный резервный отдел ткани взрослых особей позвоночных животных.

Практическая значимость. Полученные в работе результаты, во-первых, способствуют пониманию механизмов, лежащих в основе восстановительных и репаративных процессов, идущих в травмированных или патологически измененных тканях, а потому могут быть включены в специальные курсы лекций, касающихся проблемы раиозаживления, в частности, в роговице глаза позвоночных животных и человека. В ходе исследования было впервые применено роллерное культивирование роговиц тритона и крысы; данная модель может быть использована для изучеиия воздействия различных физико-химических факторов на ткань роговицы.

Учитывая результаты исследования, показавшие стимулирующее действие изучаемого РБ на процесс эпителизации роговицы, а также данные, полученные при исследовании локализации данного белка в ткани, на его основе предполагается разработать новый офтальмологический препарат, который будет эффективен при лечении кератопатий различной этиологии.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Маргасюк, Дмитрий Викторович

Выводы

1. В роговице глаза быка идентифицирован регуляторный белок, биологически активный в сверхмалых дозах, соответствующих Ю"10 - 10~12 мг белка/ мл раствора.

2. Изучены некоторые физико-химические свойства регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка. Выяснено, что он представляет собой кислый, низкомолекулярный белок со значением «кажущейся» молекулярной массы в интервале 8 - 14,4 кДа, который проявляет резистентность к воздействию ряда физико-химических факторов, имеет способность образовывать в водных растворах межмолекулярные ассоциаты размером около 130 нм. По совокупности проявляемых физико-химических свойств изучаемый регуляторный белок роговицы является новым, но относящимся к известной группе биологически активных в сверхмалых дозах белков, идентифицированных в других тканях позвоночных животных.

3. С помощью иммуногистохимических методов показано, что регуляторный белок локализован в эндотелии и эпителии роговицы глаза амфибий и млекопитающих.

4. Для оценки биологической активности регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка, была разработана модель роллерного культивирования in vitro роговицы глаза позвоночных животных.

5. С помощью тимидиповой радиавтографии установлено, что регуляторный белок стимулирует пролиферацию клеток эпителия роговицы тритона в ходе ранозаживления после наиесепия экспериментальной травмы in vivo.

6. Показана роль адгезионного сигнала со стороны подложки в активации клеточных источников регенерации роговицы: у хвостатых амфибий, в отличие от млекопитающих, роллерпый тип культивирования (отсутствие адгезионного сигнала) приводит к их активации.

7. При роллерном культивировании роговицы глаза тритона регуляторный белок, выделенный из роговицы глаза быка, стимулирует миграцию, адгезию и пролиферацию эпителиальных клеток, а также способствует поддержанию структуры стромы роговицы. У крыс данный регуляторный белок способствует увеличению количества эпителиальных клеток в роговице без области лимба в условиях роллерного культивирования по сравнению с контролем.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маргасюк, Дмитрий Викторович, Москва

1. Бурлакова Е.Б. // Вести РАН. 1994, Т. 64. № 5. С.425.

2. Вечеркии В.В. Некоторые аспекты определения молекулярной структуры и механизма биологического действия регуляторных белков // Онтогенез. 2005. Т. 36, № 3. С. 230-231

3. Гилберт С.Ф., Опиц Д.М., Рэф Р.А. Новый синтез эволюционной биологии и биологии развития // Онтогенез. 1997. Т. 28. № 5. С. 325 343.

4. Григорян Э.Н., Краснов М.С., Алейникова К.С., Поплипская В.А., Миташов В.И. Ротационное культивирование изолированной сетчатки тритона как способ получения малодифференцированных, пролиферирующих клеток in vitro II ДАН. 2005. Т. 405. № 4. С. 566 570.

5. Гуидорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Чснцова Е.В., Платовская Л.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение адгслона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // Вопросы офтальмологии. 1997. Т. 113. С. 12-15.

6. Зайцев С.В., Ефанов A.M., Сазанов Л.А. // Рос. Хим. Журнал. 1999. т. XLIII. № С. 28.

7. Зиангирова Г.Г., Олиневич В.Б. Использование S100b белка для оптимизации послеоперационной регенерации роговицы // Изв. Акад. Наук Сер. Биол. 2000. Т. 61. С. 27-32.

8. Краснов М.С., Григорян Э.Н, Ямскова В.П. Модель органотипического культивирования сетчатки вместе с тканями заднего сектора глаза тритона для изучения действия адгезивных гликопротеинов // Изв. Акад. наук . серия биологическая. 2003. № 1. С. 22 36.

9. Краснов М.С., Гурмизов Е.П., Ямскова В.П., Гундорова Р.А., Ямсков И.А. Исследование влияния регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез у крыс in vitro // Вестник офтальмологии. 2005. т. 121. №1. с. 37-39.

10. Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Ямсков И.А., Ямскова В.П. Действие новых регуляторных белков из растений в сверхмалых дозах // Радициопная биология и радиоэкология. 2003. № 3. С. 269 272

11. Рамис Е. К проблеме нуклеации (образования клеток) при самоорганизации наноструктур белка in vitro и in vivo II Ж. техн. физики. 2005. Т. 75. С. 107 113.

12. Рамис Е. Неравновесное состояние наноструктур белка при его самоорганизации //Ж. техн. физики. 2006. Т. 76. С. 121 127.

13. Рыбакова ЕЛО. О возможном механизме, лежащем в основе метода биотестирования in vitro регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах // Онтогенез. 2005. Т. 36. № 3. С. 238-239.

14. Симирский В.Н., Григорян Э.Н., Миташов В.И., Михайлов А.Т. Синтез кристаллиноподобных антигенов в эпителии роговицы, радужке и сетчатке взрослых амфибий // Онтогенез. 1984. Т. 15. N 4. С. 439 440.

15. Туманова Н.Б., Попова Н.В., Ямскова В.П. Влияние макромолекулярных адгезионных факторов на пролиферацию гепатоцитов в органных культурах эмбриональной печени мышей // Известия Акад. наук, серия биол. 1996. №.6. С/ 653-657.

16. Филонов А.С., Гаврилко Д.Ю., Яминский И.В. Программное обеспечение для обработки трехмерных изображений «ФемтоСкан Онлайн». М.: Центр перспективных технологий, 2005. 89 с. (http://www.nanoscopy.net).

17. Хэм А., Кормак Д. Гистология: пер. с англ. М. Мир. 1983. Т. 5., 296 с

18. Энгельгардт Н.В. // Иммунохимический аиализ. 1968. М.: Медицина, С. 165-188.

19. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на основе ранее неизвестных биорегуляторов-гликопротеипов клеточного микроокружения // Рос. хим. ж. (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). 1998. Т. 42. С. 85 -90.

20. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионные факторы печени и легкого // Молекулярная биология. 1977. Т. 11. № 5. С. 1147-1154.

21. Ямскова В.П., Резникова М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию // Журнал общей биологии. 1991. Т. 52, № 2, С. 181-191.

22. Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Вечеркин В.В, Ямсков И.А. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № 4. С.407 -413.

23. Ямскова В.П., Туманова Н.Б., Логинов А.С. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СВА на адгезию гепатоцитов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. № 3. С.303-306).

24. Ямскова В.П., Ямсков И.А. Механизм биологического действия физико-химических факторов в сверхмалых дозах // Российский химический журнал ЖРХО им. Д.И. Менделеева. 1999. Т.43. № 2. С. 74-79.

25. Anderson Н. Adhesion molecules and animal development // Experientia. 1990. V. 46. P. 2-10.

26. Andresen J.L., Ledet Т., Ehlers N. Keratocyte migration and peptide growth factors: the effect of PDGF, bFGF, EGF, IGF-I, aFGF and TGF-beta on human keratocyte migration in a collagcn gel // Curr. Eye Res. 1997. V. 16. P. 605. 613.

27. Ang L.P.K., Tan D.T.H. Ocular surface stem cells and deseases: current concepts and clinical amplications //Ann. Acad. Med. Singapore. 2004. V. 33., P. 576 580.

28. Araki-Sasaki K., Danjo S., Kawaguchi S., Ilosohata J., Tano Y. Human hepatocyte growth factor (HGF) in the aqueous humor // Jpn. J. Ophthalmol. 1997. V. 41. P. 409-413.

29. Armstrong J.K., Wenby R.B.,Meiselman H.J. Fisher T.C. The Hydrodynamic Radii of Macromolecules and Their Effect on Red Blood Cell Aggregation // Biophysical Journal. 2004. V. 87. P. 4259-4270

30. Auerbach R, Lewis R,, Shinners В., Kubai L., Akhtar N. Angiogenesis Assays: A Critical Overview // Clinical Chemistry. 2003. V. 49. P. 32 40.

31. Bahn CF., Falls H.F., Varley G.A., Meyer R.F., Edelhauser H.F. Bourne W.M. Classification of corneal endothelial disorders based on neural crest origin // Ophthalmology. 1984. V. 91. P.558 563.

32. Baldwin H.C., Marshall J. Growth factors in corneal wound healing following refractive surgery: A review // Acta Ophthalmologics Scandinavica. 2002. V. 80. P. 238.

33. Balestrazzi E., De Molfetta V., Spadea L., et al. Histological, immunohistochemical and ultrastructural findings in human corneas after photorefractive keratectomy//J. Refract. Surg. 1995. V. 11. P. 181 187.

34. Bazan H.E., Tao Y., Bazan N.G. Platelet-activating factor induces collagenase expression in corneal epithelial cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. V. 90 P. 8678 -8682.

35. Bazan H.E.P. Cellular and molecular events in corneal wound healing:significance of lipid signaling // Exp. Eye Res. 2005. V. 80. P. 453-463.

36. Beloussov L.V. Morphogenetic fields: outlining the alternatives and enlarging the context // Dev. Biol. 2001. V. 94. № 2. P.219 235.

37. Berman M., Leary R. & Gage J. Evidence for a role of the plasminogen activator-plasmin system in corneal ulceration // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1980. V. 19. P. 1204 -1221.

38. Binetruy-Tournaire R., Demangel C., Malavaud B. et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF) -mediated angiogenesis. EMBO J. 2000. V. 19. P. 1525 1533.

39. Birkedal-Hansen H. Proteolytic remodeling of extracellular matrix // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V. 7. P. 728 735.

40. Bissell M., Barcellos-IIoff M. Influence of ECM on gene expression // J. Cell Sci. Suppl. 1987. V. 8. P. 327-343.

41. Bissell M., Hall II., Parry G. How does extracellular matrix direct gene expression? // J. Theor. Biol. 1982. V. 99. P. 31-68.

42. Bonanno J.A. Identity and regulation of ion transport mechanisms in the corneal endothelium // Prog, in Ret.and Eye Res. 2003. V. 22. P. 69 94.

43. Bonanno J.A., Giasson С. Intracellular рН regulation in fresh and cultured bovine corneal endothelium, II. Na+: HCO3" cotransport and СГ/НСО3" exchange // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1992b. V. 33. P. 3068-3079.

44. Bonanno J.A., Giasson C. Intracellular pH regulation in fresh and cultured bovine corneal endothelium, I. Na/H exchange in the absence and presence of HCO3"// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1992. V. 33. P. 3058 3067.

45. Bosco L., Filoni S., Cannata S. Relationship between eye factors and lens-forming transformation in the cornea and pericorneal apidermis of larval Xenopus laevis И J. Exp. Zool. 1979. V. 209. P. 261 282.

46. Bottaro D.P., Rubin J.S., Faletto D.L., Chan A.M., Kmiecik Т.Е., Vande Woude G.F., Aaronson S.A. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product//Science. 1991. V. 251. P. 802-804.

47. Boulton M., Albon J. Stem cells in the eye // The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2004. V. 36. P. 643-657

48. Bringmann A., Reichenbach A. Role of Muller cells in retinal degeneration // Front. Biosci. 2001. V. 6. P. 372 392.

49. Brissette-Storkus C.S., Reynolds S.M. Lepisto A.J., Hendricks R.L. Identification of a Novel Macrophage Population in the Normal Mouse Corneal Stroma // Invest. Ohthalmol.Vis.Sci. 2002. V. 43. P. 2264-2271.

50. Buck R. C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse // Inv. Ophthalmol. Vis. Sci. 1985. V. 26. P. 1296 1299.

51. Buck R.C. Ultrastructure of conjunctival epithelium replacing corneal epithelium //Curr. Eye Res. 1986. V.5. P. 149 159.

52. Burgeson R.E., Christiano A.M. The dermal-epidermal junction // Curr. Opin. Cell Biol. 1997. V. 9. P. 651 -658.

53. Carpenter G., Wahl M.I. The epidermal growth factor family. In Handbook Exptl. Pharmacol, 95 part I. P. 159-171.

54. Chandrasekher G., Ma X., LallierT.E., Bazan H.E.P. Delay of Corneal Epithelial Wound Healing and Induction of Keratocyte Apoptosis by Platelet-Activating Factor // Inv. Ophthalmol and Vis. Sci. 2002. V. 43. P. 1422 1428.

55. Chiang M., Robinson K.R., Vanable J.W. Elcctrical fields in the vicinity of epithelial wounds in the isolated bovine eye // Exp. Eye Res. 1992. V. 54. № 6. P. 999 1003.

56. Cintron C., Schneider II., Kublin C.L. Corneal scar formation // Exp. Eye Res. 1973. V. 17. P. 251 -259.

57. Comoglio P.M., Graziani A. Hepatocyte growth factor. In Guidebook to Cytokines and Their Receptors. Edited by N.A.Nicolas; A Sambrook and Tooze Publication. 1994. P. 182- 185.

58. Connon С J, Meek K.M. Scar Tissue in Penetrating Full-Thickness Wounds // Cornea. 2004. V. 23. P. 165 171.

59. Cotsarelis G., Cheng G., Dong G., Sun T.T., Lavker R.M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells can be preferential stimulated to proliferate: implication on epithelial stem cells // Cell. 1989. V. 57. P. 201 209.

60. Cui S., Arosio D., Doherty K.M., Brosh R.M., Falaschi A., Vindigni A. Analysis of the unwinding activity of the dimeric RecQl helicase in the presence of human replication protein A //Nucleic Acids Researches. 2004. V. 32. P. 2158-2170.

61. Daniels J.T., Dart J.K.G., Tuft S.G., Khau P.T. Corneal stem cells in review // Wound Rep. Reg. 2001. V. 9. P. 483-494.

62. Davanger M., Evenson A. Role of the pericorneal structures in renewal of corneal epithelium // Nature. 1971. V. 229. P. 560 561.

63. Davies Y., Lewis D., Fullwood N .J., Nieduszynski I.A., Marcyniuk В., Albon J., Tullo A. Proteoglycans on normal and migrating corneal endothelium // Exp. Eye Res. 1999. V. 68. P. 303-311.

64. Dawson D.G., Edelhauser H.F., Grossinklaus H.E. Long-term Histopathologic Findings in Human Corneal Wounds After Refractive Surgical Procedures // Am. J. Ophthalmol. 2005. V. 139. P.168 178.

65. Del Pero R.A., Gigstad J.E., Roberts A.D., et al. A refractive and histopathologic study of excimer laser keratectomy in primates // Am. J. Ophthalmol. 1990. V. 109. P. 419-429.

66. Dikstein S., Maurice D.M. The active control of corneal hydration // Isr. J. Med. Sci. 1972a. V. 8. P. 1523-1528.

67. Dikstein S., Maurice D.M. The metabolic basis to the fluid pump in the cornea // J.Physiol. 1972b. V. 221. P. 29^11.

68. Dower S.K., Slims J.E. Interleukin-la, interleukin-lp, and interleukin-1 receptor antagonist (11-la, 11-lp, and 11-lra). In Guidebook to Cytokines and Their Receptors. Edited by N.A.Nicolas; A Sambrook and Tooze Publication, 1994. P. 17.-23.

69. Dua H.S. Conjuctiva in the corneal wound healing // Br. J. Ophtalmol., 1998. V. 82. P. 1407-1411.

70. Dua H.S., Azuaro-Blanco A. Limbal stem cells of the corneal epithelium // Survey of Ophthalmology. 2000. V. 44. P. 415-425.

71. Edelman J.L., Castro M.R., Wen Y. Correlation of VEGF expression by leukocytes with the growth and regression of blood vessels in the rat cornea // Invest. Ophthalmol. Visual. Sci. 1999. V. 40. P. 1112 1123.

72. Egan C.A., Savre-Train I., Shay J.W., Wilson S.E., Bourne W.M. Analysis of telomere lengths in human corneal endothelial cells from donors of different ages // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P. 648 653.

73. Engelmann K., Friedl P. Optimization of culture conditions for human corneal endothelial cells // In Vitro Cell Dev. Biol. 1989. V. 25. P. 106. -1072.

74. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin GII Immunochemistry. 1971. V.8. P. 871 874.

75. Er II., Uzmez E. Effects of transforming growth factor-beta 2, interleukin 6 and fibronectin on corneal epithelial wound healing // Eur. J. Ophthalmol. 1998. V. 8. P. 224 -229.

76. Fabre E. J., Bureau J., Pouliquen Y., Lorans G. Binding sites for human interleukin-1 alpha, gamma-interferon and tumor necrosis factor on cultured fibroblasts of normal cornea and keratoconus // Curr. Eye Res. 1991. V.10. P. 585 592.

77. Finch P. W., Rubin J. S., Miki Т., Ron D. and Aaronson S. A. Human FGF-related with properties of paracrine effector of epithelial cell growth // Science. 1989. V. 245. P. 752 755.

78. Fini M.E. Keratocytes and fibroblasts phenotypes in repairing cornea // Prog. In Ret. And Eye Res. 1999. V. 18. P. 529 -551.

79. Fini M.E., Girard M.T., Matsubara M. Collagenolytic/ gelatinolytic enzymes in corneal wound healing // Acta Ophthalmol. Suppl. 1992. V. 202. P. 26 33.

80. Fitch J.M., Birk D.E., Mentzer A., Hasty K.A., Mainardi C., Linsenmayer T.S. Corneal collagen fibrils: dissection with specific collagenases and monoclonals antibodies // Inv. Ophtalmol. Vis. Sci. 1988. V. 29. P. 1126 1135.

81. Freeman G. Lens regeneration from cornea in Xenopus laevis II J. Exp. Zool. 1963. V. 154. P. 39-65.

82. Friling R., Yassur Y., Levy R., Kost J., Schwartz В., Mikhailowsky R., Lamprecht S.A. A role of transforming growth factor-beta 1 in the control of corneal neovascularization. In Vivo II 1996. V. 10. P. 59 64.

83. Gao J., Gelber-Schwalb T.A., Addeo J.V., Stern M.E. Apoptosis in rabbit cornea after photorefractive keratotomy // Cornea. 1997. V. 16. P. 200 208.

84. Garana R.M., Petroll W.M., Chen W.T., Herma, I.M., Barry P., Andrews P., Cavanagh H.D., Jester J.V. Radial keratotomy. II. Role of the myofibroblast in corneal wound contraction // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1992. V. 33. P.3271 3282.

85. Giasson C., Bonanno J.A. Facilitated transport of lactate by rabbit corneal endothelium // Exp. Eye. Res. 1994. V. 59. P. 73 81.

86. Gillette Т.Е., Chandler J.W., Greiner J.V. Langerhans cells of the ocular surface // Ophthalmology. 1982. V. 89. P.700 711.

87. Girard M.T., Matsubara M., Fini M.E. Transforming growth factor-beta and interleukin-1 modulate metalloproteinase expression by corneal stromal cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1991. V. 32. P. 2441 -2454.

88. Gitelman S.E., Derynck R. Transforming Growth Factor p (TGFp). In Guidebook to Cytokines and Their Receptors. Edited by N.A.Nicolas; A Sambrook and Tooze Publication, 1994. P. 223 - 227.

89. Goldberg M.F., Bron A.J. Limbal palisades of Vogt // Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 1982. V. 80. P. 155-171.

90. Goodman G.L., Trokel S.L., Stark W.J., et al. Corneal healing following laser refractive keratectomy // Arch. Ophthalmol. 1989. V. 107. P. 1799 1803.

91. Gordon S.R. Changes in distribution of extracellular matrix proteins during wound repair in corneal endothelium // J. Histochem. Cytochem. 1988. V. 36. P. 409 -416.

92. Grierson I., Heathcote,L., Hiscott P., Hogg P., Briggs M., Hagan S. Hepatocyte growth factor/scatter factor in the eye. Prog. Retin.Eye Res. 2000. V. 19. P. 779 802.

93. Grueterich M., Espana E.M., Scheffer C.G. Tseng M.D. Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cells: amniotic membrane serving as a stem cell niche // Surv. of Ophtalmol. 2003. V. 48. P. 631 646.

94. Hamanaka Т., Thornell L.E., Bill A. Cytoskeleton and tissue origin in the anterior cynomolgus monkey eye // Jpn. J. Ophthalmol. 1997. V.41. P. 138 149.

95. Hames B.D. One-dimensional gel electrophoresis of proteins// In Gel Electrophoresis of Proteins.A Practical Approach ( B.D. Hames and D. Rickwood, eds.) Oxford University Press, New York. 1990. 106P.

96. Hamrah P., Ying Liu, Qiang Zhang, Dana M.R.The Corneal Stroma Is Endowed with a Significant Number of Resident Dendritic Cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. V.44. P. 581 -589.

97. Hayashi S., Osawa Т., Tohyama K. Comparative observations on corneas, with special reference to Bowman's layer and Descemet's membrane in mammals and amphibians // J. Morphol. 2002. V.254. P. 247 58.

98. He J., Bazan H.E.P. Corneal myofibroblasts and keratocytes differ in PAF-induced apoptosis // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. V.45. E-Abstract 1417.

99. Heldin C.-H., Claesson-Welsh L. Receptors for platelet-derived growth factor (PDGF). In Guidebook to Cytokines and Their Receptors. Edited by N.A.Nicolas; A Sambrook and Tooze Publication, 1994. P. 205 208.

100. Heldin C.-H., Westermark B. Platelet-derived growth factor (PDGF). In Guidebook to Cytokines and Their Receptors. Edited by N.A. Nicolas; A Sambrook and Tooze Publication. 1994. P. 202 205.

101. Heldin C.-H., Westermark B. Platelet-derived growth factor: mechanism of action and possible in vivo functions // Cell Regul. 1990. V. LP. 555 566.

102. Henry J.J., Elkins M.B. Cornea-lens transdifferentiation in the anuran, Xenopus tropicalis II Dev. Genes Evol. 2001. P. 377 387.

103. Hongo M., Itoi M., Yamamura Y., Yamaguchi N., Imanishi J. Distribution of epidermal growth factor receptors in rabbit lens epithelial cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. P. 401 -404.

104. Hoppenreijs V.P., Pels E., Vrensen G.F., Treffers W.F. Corneal endothelium and growth factors // Survey Ophthalmol. 1996. V. 41. V. 155 164.

105. Iguchi I., Kamiyama K., Wang X. G., Kita M., Imanishi J., Yamaguchi N., Sotozono C. and Kinoshita S. Enhancing effect of platelet-derived growth factors on migration of corneal endothelial cells. Cornea. 1995. V. 14. P. 365 371.

106. Imanishi J., Kamiyama K., Iguchi I., Kita M., Sotozono C., Kinoshita S. Growth factors: importance in wound healing and maintenance of transparency of the cornea // Prog. Retin Eye. Res. 2000. V.19. P. 113-129.

107. Inkeniene A.M., Klimas R. Hormonal anti-inflammatory and anti-allergic ocular drugs and their use // Medicina (Kaunas). 2002. V. 38. P. 779 84

108. Iwamoto Т., Smelser G.K. Electron microscopy of the human corneal endothelium with reference to transport mechanisms // Invest. Ophthalmol. 1965. V. 4. P. 270-279.

109. Jager M.J. Corneal Langerhans cells and ocular immunology // Reg. Immunol. 1992. V. 4. P. 186-195.

110. Jain S., Azar D.T. Extracellular matrix and growth factors in corneal wound healing // Curr. Opin. Ophthalmol. 1994. V. 5. P. 3 12.

111. Jester J.V., Moller-Pedersen Т., Huang J., Sax C., Kays W.T., Cavanagh H.D., Petroll W.M., Piatigorsky J. The cellular basis of corneal transparency: evidence for "corneal crystallins" // J.Cell.Sci. 1999a. V. 112. P. 613 622.

112. Jester J.V., Petroll W.M., Cavanagh H.D. Corneal stromal wound healing in refractive surgery: the role of myofibroblasts //Prog. Retin. Eye Res. 1999b. V. 18. P. 311-356.

113. Johnston M.C., Noden D.M., Hazelton R.D., Coulombre J.L., Coulombre A.J. Origins of avian ocular and periocular tissues // Exp. Eye Res. 1979. V. 29. P. 27- 43.

114. Jones S.M., Kazlauskas A. Connecting signaling and cell cycle progression in growth factor-stimulated cells // Oncogene. 2000. V. 19. P. 5558 5567.

115. Jones S.M., Kazlauskas A. Growth Factor-Dependent Signaling and Cell Cycle Progression // Chem. Rev. 2001, V. 101. P. 2413 2423.

116. Jorissen R.N., Walker F., Pouliot N., Garrett T.P.J., Ward C.W., Burgess A.W. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signaling. Exp. Cell Res. 2003. V. 284. P. 31 -53.

117. Joseph A., Hossain P.,Jham S. et al. Expression of CD34 and L -selectin on human corneal keratocytes // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. V. 44. P. 4689 4692.

118. Joyce N.C., Harris D.L., Zieske J.D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P. 2572 2583.

119. Kamiyama K., Iguchi I., Wang X., Kita M., Imanishi J., Yamaguchi N., Hongo M., Sotozono C. and Kinoshita S. Enhancement of growth of rabbit corneal endothelial cells by PDGF // Cornea. 1995. V. 14. P. 187 195.

120. Kaye G. I. Studies on the cornea. 111. The fine structure of the frog cornea and the uptake and transport of colloidal particles by the cornea in vivo //J. Cell Biol. 1962. V. 15, P. 241 -258.

121. Kitano S., Goldman J.N. Cytological and hystochemical changes in corneal wound repair// Arch. Ophtalmol. 1966. V. 76. P. 345 -354.

122. Kitazawa Т., Kinoshita S., Fujita K., Araki K., Watanabe H., Ohashi Y. and Manabe R. The mechanism of accelerated corneal epithelial healing by human epidermal growth factor// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1990. V. 31. P. 1773 1778.

123. Klenker В., Sheardown H. Growth factors in the anterior segment: role in tissue maintaince, wound healing and ocular pathology // Exp.Eye Res. 2004. V.79. P. 677 -688.

124. Ко M.H.K, Kay E.D.P. Differential interaction of molecular chaperones with procollagen I and type IV collagen in corneal endothelial cells // Mol. Vis. 2002. V.8. P.l-9.

125. Kreutziger G.O. Lateral membrane morphology and gap junction structure in rabbit corneal endothelium. Exp. Eye Res. 1976. V. 23. P. 285-293.

126. Kvanta A., Sharma S., Fagerholm P. et al. Expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in inflammation-associated corneal neovascularization. Exp. Eye Res. 2000. V. 70. P. 419 -428.

127. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

128. Latvala Т., Tervo K., Mustonen R., Tervo T. Expression of cellular fibronectin and tenascin in the rabbit cornea after eximer laser photorefractive keratektomy: a twelwe month study // Br. J. Ophtalmol. 1995. V. 79. P. 65 69.

129. Layer P.G., Robitzki A., Rothermel A., Willbold E. // Trends in Neurosci. 2002. V.25, P.131-134

130. Lemp M. A., Mathers W. D. Corneal epithelial cell movement in humans // Eye. 1989. V. 3. P. 438 -445.

131. Leuenberger P.M. Functional morphology of the cornea // Adv.Ophtalmol. 1978. V. 35. P. 94-166.

132. Li D. Q., Tseng S. C. Differential regulation of keratinocyte growth factor and hepatocyte growth factor/scatter factor by different cytokines in human corneal and limbal fibroblasts. J. Cell Physiol. 1997. V. 172. P. 361 372.

133. Li D.Q., Tseng S.C. Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial fibroblast interactions of human ocular surface // J. Cell Physiol. 1995. V. 163. P. 61-79.

134. Li J.H., Kau S.T. Amphibian cornea as a model for studying intrinsic activities of loop diuretics // J. Pharmacol. Methods. 1987. V. 18. P. 283 294.

135. Lightner V.A., Erickson H.P. Binding of hexabrachion (tenascin) to the extracellular matrix and substratum and its effect on cell adhesion. J. Cell Sci. 1990. V. 95, P. 263-277.

136. Lin H.Y., Lodish H.F. Receptors for TGF0 superfamily: multiple polypeptides and serine/threonine kinases // Trends Cell Biol. 1993. V. 3. P. 14-19.

137. Lohmann C.P., Guell J.L. Regression after LASIK for the treatment of myopia: the role of the corneal epithelium // Semin. Ophtalmol. 1998. V. 13. P. 79 82.

138. Ludens J.H. Nature of the inhibition transport by furosemide: evidence for competitive inhibition of active transport in toad cornea // J. Pharmacol. Exp.Ther. 1982. V. 223. P.25-29.

139. Ma X., Bazan H.E. Increased platelet-activating factor receptor gene expression by corneal epithelial wound healing // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000. V. 41. P. 1696 1702.

140. Malecaze F., Simorre V., Chollet P. et al. Interleukin-6 in tear fluid after photorefractive keratectomy and its effects on keratocytes in culture // Cornea. 1997. V.16. P. 580-587.

141. Mann I., Pullinger B. D. Proc. R. Soc. Med. 1942. V. 35. P. 229.

142. Margaritis L.H., Politof Т.К., Koliopoulos J.X. Qualitative and comparative ultrastructure of the vertebrate cornea. I. Urodele Amphibia // Tissue Cell. 1976. V. 8. P. 591 602.

143. Marshall G.E., Konstas A.G., Lee W.R. Immunogold fine structural localization of extracellular matrix components in aged human cornea. I. Types I-IV collagen and laminin // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1991. V. 229. P. 157 163.

144. Matsubara M., Zieske J.D., Fini M.E. Mechanism of basement membrane dissolution preceding corneal ulceration // Invest Ophthalmol Vis Sci.1991. V. 32. P. 3221-3237.

145. Maurice D. The Cornea and Sclera // Academic Press, New York. 1981.

146. McBain V.A., Forrester J.V., McCaig C.D. HGF, МАРК, and a small physiological electric field interact during corneal epithelial cell migration // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. V. 44. P. 540 547.

147. Michelacci Y.M. Collagens and proteoglycans of the corneal extracellular matrix// Brazilian Journal of Medical and Biological Researches. 2003, V. 36. P. 1037 1046.

148. Miki Т., Fleming T.P., Bottaro D.P., Rubin J.S., Ron D., Aaronson S.A/ Expression cDNA cloning of the KGF receptor by creation of a transforming autocrine loop // Sciense. 1991. V. 251. P. 72 -75.

149. Mizukawa Т., Otori Т., Нага J., Fujita, N., Okahara S., The movement of the epithelial cells after lamellar homokeratoplasty studied by autoradiography // Jpn. J. Ophthalmol. 1963. V. 7. P. 196 202.

150. Mohan R. R., Liang Q., Kim W.-J., Helena M. C., Baerveldt F., Wilson S. E. Apoptosis in the cornea: further characterization of Fas/Fas ligand system // Exp. Eye Res. 1997. V. 65. P. 575 -589.

151. Mohan R.R., Wilson S.E. Discoidin domain receptor (DDR) 1 and 2: collagen-activated tyrosine kinase receptors in the cornea // Exp. Eye Res. 2001. V. 72. P. 87 92.

152. Moller-Pedersen Т., Cavanagh H.D., Petroll W.M., et al. Neutralizing antibody to TGFp modulates stromal fibrosis but not regression of photoablative effect following PRK // Curr. Eye Res. 1998. V. 17. P. 736 747.

153. Montcourrier P., Hirsch, M. Intercellular junctions in the developing rat corneal endothelium//Ophthalmic Res. 1985. V. 17 P. 207-215.

154. Moolenaar W.H. Lisophosphatidic acid signaling // Curr. Opin. Cell. Biol. 1995. V. 7. P. 103-110.

155. Morimoto К., Mishima H., Nishida Т., Otori Т. Role of urokinase type plasminogen activator (u-PA) in corneal epithelial migration. Thromb. Haemostas. 1993. V. 69. P. 387-391.

156. Moscona A. Studies of cell aggregation: demonstration of material with selective cell-binding activity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1963. V. 49. P. 743 748.

157. Moscona A. A. Cell agregation: properties of specific cell-ligands and their role in the formation of multicellular systems // Develop. Biol. 1968. V. 18. C. 250 277.

158. Moscona A. Rotation mediatrd histogenetic aggregation of dissociated cells // Exp. Cell Res. 1961. V. 22. C. 455 - 458.

159. Murakami J., Morimoto K., Nishida Т., Otori T. Movement of corneal epithelium of rats in situ observed by time-lapse cinematography // Curr. Aspects Ophthalmol. 1992. V. 1. P. 315-319.

160. Murphy-Ullrich J.E. The de-adhesive activity of matricellular proteins: Is intermediate cell adhesion an adaptive state?// J. Clin. Invest. 2001. V. 107. P. 785 790.

161. Murphy-Ullrich J.E., Hook M. Thrombospondin modulates focal adhesions in endothelial cells//J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 1309- 1319.

162. Murphy-Ullrich J.E., Lane T.F., Pallero M.A., Sage E.H. SPARC mediates focal adhesion disassembly in endothelial cells through a follistatin-like region Ca2+-binding EF-hand // J. Cell. Biochem. 1995. V. 57. P. 341 350.

163. Murphy-Ullrich J.E., Lightner V.A., Aukhil I., Yan Y.Z., Erickson H.P., Hook M. Focal adhesion integrity is downregulated by the alternatively spliced domain of human tenascin// J. Cell Biol. 1991. V. 115. P. 1127 1136.

164. Muthukkaruppan V.R., Auerbach R. Angiogenesis in the mouse cornea // Science. 1979.V. 205. P. 1416-1418.

165. Nakamura K. Interaction between injured corneal epithelial cells and stromal cells // Cornea. 2003. V.22 (7 Suppl.). S. 35 47.

166. Nakamura K., Kurosaka D., Yoshino M., et al. Injured corneal epithelial cells promote myodifferentiation of corneal fibroblasts // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. V. 43. P. 2603-2608.

167. Nakamura Y., Sotozono C., Kinoshita S. The epidermal growth factor receptor (EGFR); role in corneal wound healing and homeostasis // Exp. Eye Res. 2001. V. 72. P. 511-517.

168. Nicola N.A. Guidebook to Cytokines and their receptors I I Oxford University Press, 1994 pp. 261.

169. Nishida K., Sotozono C., Adachi W., Yamamoto S., Yokoi N. and Kinoshita S. Transforming growth factor-bl, -b2 and -b3 mRNA expression in human cornea // Curr. Eye Res. 1995. V. 14. P. 235 241.

170. Nishida Т., Nakamura M., Mishima H., et al. Hyaluronan stimulates corneal epithelial migration. Exp. Eye Res. 1991. V.53. P. 753-758.

171. O'Brien Т., Li Q, Ashraf M.F., Matteson D.M., Stark W.J., Chan C.C. Inflammatory response in the early stages of wound healing after excimer laser keratectomy // Arch. Ophthalmol. 1998. V. 116. P. 1470 1474.

172. Olivier J.- C. Drug Transport to Brain with Targeted Nanoparticles // The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2005. V. 2. P. 108-119).

173. Olsen E.G., Davanger M., Moen T. The role of microfilaments in the healing of the corneal endothelium // Acta Ophthalmol. 1985. V. 63. P. 104 108.

174. Onuma K., Kanzaki N., Kobayashi N. Association of calcium phosphate and fibroblast growth factor-2: a dynamic light scattering study // Macromol Biosci. 2004. V. 4. P. 39-46.

175. O'Reilly M.S., Wiedcrschain D., Stetler-Stevenson W.G., Folkman J., Moses M.A. Regulation of angiostatin production by matrix metalloproteinase-2 in a model of concomitant resistance // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 29568 29571.

176. Ottino P., He J., Axelrad T.W., Bazan H.E.P. PAF-induced furin and MT1-MMP expression is independent of MMP-2 activation in corneal myofibroblasts // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005. V. 46. P. 487 496.

177. Ottino P., Taheri F., Bazan H.E. Growth factor-induced proliferation in corneal epithelial cells is mediated by 12(S)-HETE // Exp. Eye Res. 2003. V. 76. P. 613 622.

178. Pancholi S., Tullo A., Khaliq A., Foreman D. & Boulton M. The effects of growth factors and conditioned media on the proliferation of human corneal epithelial cells and keratocytes // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1998. V. 236. P.l 8.

179. Parelman J.J., Nicolson M., Pepose J.S. Epidermal growth factor in human aqueous humor// Am. J. Ophthalmol. 1990. V.109. P. 603 604.

180. Pasquale L.R., Dorman-Pease M.E., Lutty G.A., Quigley H.A., Jampel H.D. Immunolocalization of TGF-beta 1, TGF-beta 2, and TGF-beta 3 in the anterior segment of the human eye // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. P. 23 30.

181. Prockop D.J., Kivirikko K.I. Collagens: molecular biology, diseases, and potentials for therapy // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 403 34.

182. Provencher S.W.//Makromol. Chem. 1985. B.82. №15 P. 632.

183. Puangsricharern V., Tseng S.C. Cytologic evidence of corneal deseases with limbal cells deficience // Ophthalmology. 1995. V. 102. P. 1476 1485.

184. Raines E.W., Bowen-Pope D.F., Ross R. Platelet-derived growth factor. In Handbook of experimental pharmacology. Peptide growth factors and their receptors. (Ed. M.B. Sporn and A.B. Roberts). 1990. P.173 262. Springer, Heidelberg.

185. Raines E.W., Ross R. Compartmentalization of PDGF on extracellular binding sites dependent on exon-6-encoded sequences // J. Cell Biol. 1992. V. 116. P. 533 543.

186. Ramchandran R., Dhanabal M., Volk R., et al. Antiangiogenic activity of restin, NC10 domain of human collagen XV: comparison to endostatin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 255. P. 735-739.

187. Raphael В., Kerr N.C., Shimizu R.W. et al. Enhanced healing of cat corneal endothelial wounds by epidermal growth factor // Invest Ophthalmol Vis. Sci. 1993. V. 34. P. 2305 -2312.

188. Rawe I.M., Meek K.M., Leonard D.W., et al. Structure of corneal scar tissue: An x-ray diffraction study // Biophys. J. 1994. V. 67. P. 1743 1748.

189. Rayner S.A., Gallo, J.L., George A.J., Larkin D.F. Distribution of integrins alpha v beta 5, alpha v beta 3 and alpha v in normal human cornea: possible implications in clinical and therapeutic adenoviral infection // Eye. 1998. V. 12. P. 273 277.

190. Reeve J.G., Wild A.E. Lens regeneration from cornea of larval Xenopus laevis in the presence of the lens // J. Embryol. Exp. Morph. 1978. V. 48. P. 205 214.

191. Riley M., Winkler В., Czajkowski C., Peters M. The roles of bicarbonate and C02 in transendothelial fluid movement and control of corneal thickness // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. V. 36. P. 103 112.

192. Robinson K.R., Messerli M.A. Left/right, up/down: the role of endogenous electrical fields as directional signals in development, repair and invasion // Bioassays. 2003. V. 25. № 8. P. 759 766.

193. Ronnov-Jessen L., Petersen O.W. A function for filamentous alpha-smooth muscle actin: retardation of motility of fibroblasts // J. Biol. Chem. 1996. V. 134. P. 67 -80.

194. Ross C.A., Poirier M.A. Protein aggregation and neurodegenerative disease // Nat. Med. 2004, 10 Suppl. S 10 17.

195. Rubin J. S., Osada H., Finch P. W., Taylor W. G., Rudikoff S. and Aaronson S. A. Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cell // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 802 806.

196. Rugged A, Pajaro S. Automatic recognition of cell layers in corneal confocal microscopy images // Computer Methods and Programs in Biomedicine. 2002. V.68. P. 25 -35.

197. Saika S., Kawashima Y., Okada Y., et al. Immunohistochemical and ultrastructural analysis of dysplastic epithelium of human ocular surface:basement membrane and intermediate filament // Cornea. 1999. V. 18. P. 343 52.

198. Saika S., Kawashima Y., Okada Y., et al. Recombinant TIMP-1 and -2 enhance the proliferation of rabbit corneal epithelial cells in vitro and the spreading of rabbit corneal epithelium in situ // Curr. Eye Res. 1998. V. 17. P. 47 52.

199. Saika S., Ohnishi Y., Ooshima A, Liu C.Y., Kao W.W. Epithelial repair: roles of extracellular matrix // Cornea. 2002. V. 21 (Suppl. 1). S. 23 9.

200. Saika S., Shiraishi A., Saika S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 2607 703.

201. Sakamoto Т., Nakashima Y., Sueishi K. The effect of thrombin on actin filament and vinculin of corneal endothelial cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. P. 438-446.

202. Sangwan V.S. Limbal Stem Cells in Health and Disease // Bios. Rep., 2002. V. 21. P. 385-405.

203. Sasaki Т., Larsson H., Tisi D., et al. Endostatins derived from collagens XV and XVIII differ in structural and binding properties, tissue distribution and anti-angiogenic activity. J. Mol. Biol. 2000. V. 301. P. 1179 1190.

204. Schilling-Schon A., Pleyer U., Hartmann C., Rieck P.W. The role of endogenous growth factors to support corneal endothelial migration after wounding in vitro // Exp. Eye Res. 2000. V. 71. P. 583 589.

205. Schlessinger J. How receptor tyrosine kinases activate Ras // TIBS. 1993. V. 18. P. 273-275.

206. Schlessinger J. The epidermal growth factor receptor as a multifunctional allosteric protein // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 3119 3123.

207. Schulz M.W., Chamberlain C.G., De Iongh R.U., McAvoy J.W. Acidic and basic FGF in ocular media and lens: implications for lens polarity and growth patterns // Development. 1993. V. 118. P. 117 126.

208. Shashoua V.E., Hesse G.W., Moore B.W. Proteins of the Brain Extracellular Fluid: Evidence for Release of S-100 Protein // J. of Neurochemistry. 1984. V. 42. P. 1536- 1541.

209. Sherrard E.S., Ng Y.L. The other side of the corneal endothelium // Cornea. 1990. V. 9. P. 48-54.

210. Sivak J.M., Fini M.E. MMPs in the eye: emerging roles for matrix metalloproteinases in ocular physiology // Prog. Retin. Eye Res. 2002. V. 21. P. 1-14.

211. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid // Anal. Biochem. 1985. V. 150. P. 76 85.

212. Smith R.S., Hawes N.L., Kuhlmann S.D., et al. Cornh mouse model for corneal surface disease and neovascularization // Invest. Ophthalmol. Vis.Sci. 1996. V. 37. P. 397-404.

213. Soler C., Carpenter G. The Epidermal growth factor (EGF) family. In Guidebook to Cytokines and Their Receptors. Edited by N.A.Nicolas; A Sambrook and Tooze Publication, 1994. P.194 198.

214. Song Q.H., Klepeis V.E., Nugent M.A., Trinkaus-Randall V. TGF-bl regulates TGF-bl and FGF-2 mRNA expression during fibroblast wound healing // Mol. Pathol. 2002. V. 55. P. 164- 176.

215. Sosnova M., Bradl M., Forrester J.V. CD34+ corneal stromal cells are bone marrow-derived and express hemopoetic stem cell markers // Stem Cells. 2005. V. 2. P. 507-515.

216. Sotozono C., Kinoshita S., Kita M. and Imanishi J. Paracrine role of keratinocyte growth factor in rabbit corneal epithelial cell growth // Exp. Eye Res. 1994. V. 59. P. 385 -392.

217. Stepanek P. Dynamic Light Scattering. The method and some applications // Ed. By Brown W. Oxford: Clarendron Press, 1993. P. 177.

218. Stevens A., Lowe J. S. Histology // Mosby Year Book Europe Ltd, London, 1993, pp. 378.

219. Stramer B.M., Zieske J. D., Jung J.-C., Austin J.S., Fini M.E. Molecular Mechanisms Controlling the Fibrotic Repair Phenotype in Cornea: Implications for Surgical Outcomes // Invest. Ophthalmol. Vis. Science. 2003. V. 44. P. 4237 4246.

220. Streuli C., Schmidhauser C., Bailey N., Yurchenco P., Skubitz A., Roskelley C., Bissell M. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia // J. Cell Biol. 1995. V.129. P.591-603.

221. Sudesh S., Laibson P.R. The impact of the Herpetic Eye Disease Studies on the management of herpes simplex virus ocular infections // Curr. Opin. Ophthalmol. 1999. V.10. P.230 233.

222. Suzuki K., Saito J., Yanai R., Yamada N., Chikama Т., Seki K., Nishida T. Cell-matrix and cell-cell interaction during corneal epithelium wound healing // Prog, in Ret. and eye Res. 2003. V. 22. P. 113 133.

223. Tao Y., Bazan H.E., Bazan .G. Platelet-activating factor induces the expression of metalloproteinases-1 and -9, but not -2 or -3, in the corneal epithelium // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. V.36. P. 345 354.

224. Tao Y., Bazan H.E., Bazan N.G. Platelet-activating factor enhances urokinase-type plasminogen activator gene expression in corneal epithelium // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996. V. 37. P. 2037 2046.

225. Thalmann-Goetsch A., Engelmann K., Bednarz J. Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing// Acta Ophthalmol. Scand. 1997. V. 75. P. 490 -495.

226. Toti P., Tosi G.M., Traversi C. et al. CD-34 stromal expression pattern in nor-mal and altered human corneas // Ophthalmology. 2002. V. 109. P. 1167 1171.

227. Tuori A., Uusitalo H., Burgeson R.E., et al. The immunohistochemical composition of the human corneal basement membrane // Cornea. 1996. V. 15. P. 286 -294.

228. Turner M.L. Cell adhesion molecules: a unifying approach to topographic biology // Biol. Rev. 1992. V. 67. P. 359 377.

229. Vainikka S., Mustonen Т., Alitalo K. Fibroblast growth factors (FGFs). In Guidebook to Cytokines and Their Receptors. Edited by N.A.Nicolas; A Sambrook and Tooze Publication, 1994. P. 214 218.

230. Vantrappen L. Geboes K., Missotten L., Maudgal P.C., Desmet V. Lymphocytes and Langerhans cells in the normal human cornea // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1985.V. 26. P. 220-225.

231. Venyaminov S. Yu, Yang J.T. "Determination of protein secondary structure" In "Circular Dichroism and the conformational analysis of Biomolecules", Edited by G.D.Fasman, New York, Plenum Press, pp. 69-107, 1996.

232. Victorov I.V., Lyjin A.A., Aleksandrova O.P. // Brain Res. Prot. 2001. V. 7. P. 30 -37.

233. Volpert О.V., Fong Т., Koch A.E., Peterson J.D., Waltenbaugh C., Tepper R.I. & Bouck N.P. Inhibition of angiogenesis by interleukin 4 // J. Exp. Med. 1998. V. 188. P. 1039 1046.

234. Wang I.-J., Kao C.W.-C., Liu C.-Y., et al. Characterization of Corn I mice: alteration of epithelial and stromal cell gene expression I I Mol. Vis. 2001. V. 7. P. 20 -26.

235. Waring 3rd G.O., Bourne W.M., Edelhauser H.F., Kenyon K.R. The corneal endothelium: normal and pathologic structure and function // Ophthalmology. 1982. V. 89. P. 531 -590.

236. Watt F.M., Hogan B.L. Out of Eden: stem cells and their niches // Science. 2000. V. 287. P. 1427- 1430.

237. Welge-Luben U., May C.A., Neubauer A.S., Priglinger S. Role of tissue growth factors in aqueous humor homeostasis // Curr. Opin. Ophthalmol. 2001. V. 12. P. 94 99.

238. West-Mays J.A., Sadow P.M., Tobin T.W., Strissel K.J., Cintron C., Fini M.E. Repair phenotype in corneal fibroblasts is controlled by an interleukin-1 alpha autocrine feedback loop//Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1997. V. 38. P. 1367 1379.

239. Williams K.A., Mann T.S., Lewis M., Coster D.J. The role of resident accessory cells in corneal allograft rejection in the rabbit // Transplant. 1986. V. 42. P. 667 671.

240. Wilson C.M. Staining of proteins on gel: comparision of dyes and procedures // Methods in Enzymol. 1983. V. 91. P. 236 247.

241. Wilson S. E., He Y.-G., Weng J., Li, Q., Vital M., Chwang E. L. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization // Exp. Eye. Res. 1996. V. 62. P. 325 338.

242. Wilson S. E., Walker J. W., Chwang E. L., He Y.-G. Hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor (KGF), their receptors, FGF receptor-2, and the cells of the cornea. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. P. 2544 2561.

243. Wilson S.E., Liu J.J., Mohan R.R . Stromal-epithelial interactions in the cornea // Prog. Ret. Eye Res. 1999. V. 18. P. 293-309.

244. Wilson S.E., Mohan R.R., Ambrosio Jr R., Hong J.W., Lee J.S. The corneal wound healing reponse: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma and inflammatory cells // Prog, in Ret and Eye Res. 2001. V. 5. P. 625 637.

245. Wolburg H., Willbold E., Layer P.G. Muller glia endfeet, a basal lamina and the polarity of retinal layers from properly in vitro only in the presence of marginal pigmented epithelium //Cell Tissue Res. 1991. V. 264. P. 437 -451.

246. Wolosin J.M., Budak M.T., Akinci M.M.A. Ocular surface epithelial and stem cell development//Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 981 -991.

247. Wolosin J.M., Xiong X., Schutte M., Stcgman Z., Tieng A. Stern cells and differentiation stages in the limbo-corneal epithelium // Prog. Ret. Eye Res. 2000. V. 19. P. 223-255.

248. Woost P. G., Jumblatt M. M., Eiferman R. A. and Schultz G. S. Growth factors and corneal endothelial cells: I. Stimulation of bovine corneal endothelial cell DNA synthesis by defined growth factor // Cornea. 1992. V. 11. P. 1 10.

249. Ye H.Q., Azar D.T. Expression of gelatinases A and B, and TIMPs 1 and 2 during corneal wound healing//Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 1998. V. 39. P. 913-21.

250. Yu F.X., Guo Y., Zhang Q. Expression and differentiation of adhesion molecule CD44 in healing corneal epithelia // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P.710-717.

251. Zieske J.D., Guimaraes S.R., Hutcheon A.E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement // Exp. Eye Res. 2001. V. 72. P. 33 39.

252. Zimmerman G.A., Mclntyre T.M., Prescott S.M., Stafforini D.M. The platelet-activating factor signaling system and its regulators in syndromes of inflammation and thrombosis // Crit. Care Med. 2002. V. 30. P. 294 301.