Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование динамики накопления флуоресцирующего метаболизма при культивировании Escherichia coli M-17 (эксперимент, моделирование, аппаратура)

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Воронин, Александр Иванович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РОСТА И СИНТЕЗА МЕТАБОЛИТОВ МИКРОБНОЙ .ШПУЛЯЦИЕЙ

§1 Образование экзопродуктов микробными популяциями.

§2 Флуоресцирующие соединения в клеточном обмене веществ

§3 Математическое описание взаимосвязи процессов накопления биомассы и образования продукта метаболизма микробной популяцией ».••.••*••••«.•.••••■.••«*.**

ГЛАВА II. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ РОСТОВЫХ 'А- БШСШТЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК МЖРОЕНЫХ

ПОПУЛЯЦИЙ.

§1 Анализ взаимосвязи удельных скоростей роста и синтеза целевого продукта при выращивании популяции на питательной среде лимитированной по одному элементу.

§2 Анализ взаимосвязи удельных скоростей роста и синтеза целевого продукта при выращивании популяции на питательной среде лимитированной по двум элементам.

§3 ММ-системы и их применение для анализа взаимосвязи ростовых и биосинтетических характеристик микробных популяций.

ГЛАВА III. ПРИБОРЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. МАТЕРИАЛЫ И

ПРЕПАРАТЫ.

§1 Аппаратура иметодьт культивирования. Измерение концентрации биомассы.

§2 Измерение спектральных характеристик клеточных суспензий и супернатанта.

ГЛАВА 1У. ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ НАКОПЛЕНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО МЕТАБОЖТА КУЛЬТУРОЙ E.COLI M-I7 В УСЛОВИЯХ

ГЛУБИННОГО КУЛЬТЛВЯРОВАНИЯ. IOI

§1 Спектральные характеристики супернатанта.

§2 Исследование кинетики накопления флуоресцирующего метаболита при культивировании E.coliIvl-17 на питательных средах с односубстратным лимитированием.

§3 /Исследование кинетики накопления флуоресцирующего метаболита при культивировании E.coli M-I7 на питательных средах, лимитированных по двум элементам питания.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ й ВЫВОДЫ РАБОТЫ.

Ci'MCOK ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование динамики накопления флуоресцирующего метаболизма при культивировании Escherichia coli M-17 (эксперимент, моделирование, аппаратура)"

стоящих перед современной микробиологией особенно в настоящее время, в связи с широким внедрением методов управления на основе вычислительной техники[82,831.

Цель работы. I.Разработка математического описания и качественное исследование взаимосвязи ростовых и биосинтетических характеристик микробных популяций на примере E.coli M-I7 и синтезируемых ею метаболитов /веществ пиридиннуклеотидной природы и пиридоксина/ при одно- и двухфакторном влиянии состава питательной среды на рост и биосинтез.

2. Создание инструментальной базы для исследования кинетики накопления биомассы и флуоресцирующих метаболитов.

3. Исследование динамики накопления флуоресцирующих метаболитов при культивировании E.coli M-I7 на питательных средах определенного состава в лимитируемых по ряду элементов /Mg,P, Ы,£/ и их комбинациям /P,Mg ; Р,Ы; М^ ,Ы/ условиях.

4. Проверка адекватности математического описания наблюдаемым в эксперименте зависимостям между ростовыми и синтетическими характеристиками.

Основные задачи исследования. В задачу настоящего исследования входит:

1. Построение и качественное исследование математического описания взаимосвязи ростовых и биосинтетических характеристик микробных популяций при одно- и двухфакторном влиянии II 0JL

2. Создание технического обеспечения эксперимента для получения кинетических кривых накопления биомассы и Флуоресцирующего метаболитаt14,32,33,52] в процессе культивирования.

3. Экспериментальное исследование процесса накопления флуоресцирующих метаболитов в стрессовых ситуациях /при одно- и двухфакторных лимитированиях/[1] .

Общая характеристика работы

Математическое описание, построенное на базе ММ-систем [Ю] определяет взаимосвязь таких физиологических характеристик микробной популяции как удельной скорости роста биомассы и удельной скорости синтеза продукта. Качественное исследование системы уравнений, описывающей эти характеристики, позволило построить трехмерный параметрический портрет системы и внявить области с качественно различным характером фазовых траекторий. Разработанный применительно к данному случаю аппарат М-представ-ления [10,53] позволяет получить аналитическое решение исследуемой системы уравнений, что может представлять определенный интерес при адаптивном управлении процессом культивирования.

Техническое обеспечение данной работы реализовано в виде специально разработанной проточной системы измерения оптической плотности бактериальной суспензии с широким динамическим диапазоном измеряемых оптических плотностей /0 * 20 Д/, а также в виде двухволнового проточного флуориметра, принцип действия которого основан на измерении отношения интенсивностей флуоресценции на двух длинах волн, что позволяет в ходе эксперимента фиксировать не только интенсивность флуоресценции, но и изменение положения максимума спектра флуоресценции. Применение данных приборов в исследовании значительно повысило точность получаемых результатов, сократило затраты ручного труда при проведении анализов, уменьшило вклад неконтролирумых погрешностей в процессе измерения.

Полученные с помощью технических средств данные при культивировании E.coIL M-I7 в условиях лимитирования рядом неорганических элементов питания позволили выявить различный характер поведения зависимостей ^(fO для случаев одно- и двухфактор-ных лимитирований, а также сверхсинтез веществ пиридоксалевой природы при двухсубстратном лимитировании, когда одним из лимитирующих элементов был фосфор.

Сопоставление экспериментально полученных зависимостей как для метаболитов пиридиннуклеотидной, так и пиридоксалевой природы показывает, что математическое описание, предложенной в данной работе, качественно верно описывает взаимосвязь ростовых и синтетических характеристик популяции, что подтверждает правильность основных положений данного описания.

Научная новизна и основные результаты работы

Для исследования ростовых и синтетических характеристик популяции создана инструментальная база, позволяющая получить в реальном масштабе времени /в темпе эксперимента/ полную и точную информацию о накоплении биомассы и флуоресцирующего метаболита. Два из разработанных в составе комплекса аппаратуры устройства - пробоотборное и измеритель оптической плотности защищены авторскими свидетельствами и положительным решением / A.c. W 9I3I2I, заявка № 2955128 от 14.07.80 ; A.c. № 991,230, заявка W 3303671 от 03.04.81. Положительное решение ВНШГГО от 28.06. 83 по заявке № 3476198/25 от 11.06.82/.

Предложенное математическое описание взаимосвязи удельных скоростей роста биомассы и синтеза продукта, построенное на основании MM-систем, позволяет качественно верно описать характер взаимосвязи физиологических характеристик популяции-продуцента, таких как удельная скорость роста биомассы и удельная скорость синтеза целевого продукта. Данная модель удовлетворительно описывает взаимосвязь С^ и J4 как в случае выделения популяцией продукта в тропофазе, так и при синтезе вторичных метаболитов. Характерным отличием данного математического описания от существующих является его универсальный характер, а наличие структурного портрета системы позволяет из получающихся экспериментальных данных оценить соотношение кинетических постояннных, определяющих характер протекающего процесса. ММ-представление, предложенное в рамках данной модели, позволяет расширить область применения данного описания на широкий класс биологических объектов, а также использовать его при решении задач управления /в т.ч. и адаптивного/.

Исследование динамики накопления метаболита пиридиннуклео-тидной природы в культуральной суспензии при выруливании Е.соЗд M-I7 в периодических условиях выявило зависимость синтеза этих соединений от условий культивирования.

Имеющаяся корреляционная связь между ростом биомассы и интенсивностью флуоресценции позволяет использовать флуоресценцию суспензии для оценки концентрации биомассы кулктуры в широком диапазоне оптических плотностей /0 * 5 Д/. При культивировании E.coli M-I7 на питательных средах, лимитированных по двум элементам питания - Р, N и Р,М<^ , обнаружен сверхсинтез культурой веществ пиридоксалевой природы /концентрация пиридоксина достигает 20 от/л/. До настоящего времени в научной литературе информация по данному вопросу отсутстует.

Практическое внедрение. На базе Научно-исследовательского Центра автоматизации /НИЦ биоавтоматика/ налажено производство составных элементов устройства для кинетического измерения характеристик роста, которые включены в состав серийно выпускаемых систем для культивирования микроорганизмов: "Шермус-З" /про-боотборное устройство/ и "Фермус-4" /проточный измеритель оптической плотности/ с объемом выпуска 15 единиц в год.

Математическое описание используется в автоматизированной биотехнологической системе "Автоферм-2". Результаты исследования, а также аппаратура используется в научно-исследовательской работе сотрудников НИЦ биоавтоматика.

Связь работы с целевыми комплексными программами Работа выполнена в связи с целевой комплексной научно-технической программой 0.Ц.027 /тема-задание 06.19/, утвержденной ГКНТ СМ СССР, Госпланом СССР и АН СССР /постановление № 474/250/132 от 12 декабря 1980 г./. Автор защищает следующие положения:

1. Математическое описание взаимосвязи ростовых и синтетических характеристик микробной популяции-продуцента.

2. Аппаратурное оформление метода исследования кинетических характеристик популяции-продуцента.

3. Результаты экспериментальных исследований кинетики накопления биомассы Ё.соК М-17 и флуоресцирующих метаболитов в процессе периодического культивирования.