Поиск и изучение генов, участвующих в транспортировке пуриновых производных из клеток Escherichia coli

Гронский, Сергей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск и изучение генов, участвующих в транспортировке пуриновых производных из клеток Escherichia coli
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Поиск и изучение генов, участвующих в транспортировке пуриновых производных из клеток Escherichia coli"

На правах рукописи

Гронский Сергей Викторович

Поиск и изучение генов, участвующих в транспорте пуриновых производных из клеток Escherichia coli

Специальность: 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории №2 Закрытого Акционерного общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.П. Закатаева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.C. Миронов кандидат биологических наук Л.И. Патрушев

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится «7 I » марта 2006 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу 117545, г Москва, 1-й Дорожный проезд, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан «_» января 2006 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук

В И Щербакова

¿00*А*

Введение

Актуальность проблемы. В последние годы появилось много работ, посвященных изучению транспорта различных веществ из клетки бактерий Системы экскреции позволяют клеткам поддерживать более высокий уровень устойчивости к различным токсичным соединениям, таким как антибиотики, детергенты, красители и др. Охарактеризованы также системы транспорта из клетки нормальных метаболитов. Установлено, например, что белок LysE отвечает за транспорт лизина у Corynebacterium glutamicum (Vrljic et al, 1996), белок PbuE (YdhL) из Bacillus subtilis экскретирует пуриновые основания (Jobansen et al., 2003). У Escherichia coli идентифицировано несколько транспортеров, участвующих в выведении из клеток различных метаболитов: белок YdeA экскретирует сахар арабинозу (Bost et al, 1999), белок YdeD транспортирует цистеин, его метаболические предшественники и производные (Dassler et al, 2000), белки RhtA, RhtB и RhtC способны экскретировать аминокислоты треонин и гомосерин (Zakataeva et al, 1999; Livshits et al, 2003). Физиологическая роль этих систем до конца не ясна, однако, они могут иметь большое значение при создании продуцентов различных биологически активных соединений. У эффективных продуцентов концентрация целевого продукта в среде может достигать очень больших значений, при этом увеличивается и содержание продукта в клетке. Увеличение внутриклеточной концентрации конечного продукта биосинтеза способно ингибировать активность ферментов пути биосинтеза, а также репрессировать гены и опероны, кодирующие эти ферменты. Более того, увеличение внутриклеточного пула целевого продукта может воздействовать на глобальные регуляторные системы, осуществляющие общую перестройку метаболизма клетки, что может отрицательно сказываться на способности культуры накапливать целевой продукт. Также, может наблюдаться подавление роста клеточной культуры, связанное с тем, что сверхпродукция одного метаболита вызывает репрессию оперонов и/или ингибирование ферментов, участвующих в биосинтезе других необходимых клетке соединений. В связи с этим способность клетки активно выводить синтезируемый продукт в культуральную среду имеет большое значение. Поиск и изучение генов, кодирующих транспортные системы, осуществляющие выброс различных метаболитов из клетки, является важной задачей, имеющей как научное, так и практическое значение. Гены, кодирующие такие системы, могут быть использованы для увеличения накопления конечного продукта штаммами-продуцентами.

Цель и задачи работы. Диссертационная работа посвящена поиску и изучению генов Е. coli, участвующих в экскреции пуриновых производных из клетки, а также изучению возможности применения этих генов для повышения продукции нуклеозидов штаммами-

продуцентами.

В процессе работы решались следующие задачи:

• найти и идентифицировать гены, амплификация которых повышает устойчивость штаммов Е. coli к аналогам пуриновых оснований, а также к пуриновым нуклеозидам инозину и гуанозину;

• определить точки начала транскрипции и трансляции обнаруженных генов, а также провести компьютерный анализ кодируемых ими белков;

• исследовать влияние сверхэкспрессии и инактивации найденных генов на фенотип клетки, на экскрецию пуриновых производных из клетки и на продукцию пуриновых оснований и нуклеозидов соответствующими штаммами-продуцентами;

• экспериментально исследовать регуляцию обнаруженных генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе обнаружено, что сверхэкспрессия генов ydeD, yijE, rhtA и yicM обеспечивает устойчивость штаммов Е. coli к ингибирующим концентрациям аналогов пуриновых оснований. Амплификация каждого из генов ydeD, yijE и rhtA улучшает продукцию инозина штаммом-продуцентом.

Сверхэкспрессия гена yicM обеспечивает устойчивость к пуриновым нуклеозидам чувствительного к этим соединениям штамма Е coli. Определены точки начала транскрипции и трансляции гена yicM. Получены различные данные, указывающие на участие белка YicM в экскреции пуриновых нуклеозидов из клетки, а также на зависимость этой экскреции от протон-движущей силы. Показано, что сверхэкспрессия yicM повышает накопление инозина штаммом-продуцентом. Исследовано влияние различных условий культивирования, возможных субстратов YicM, а также аллельного состояния гена rpoS на уровень экспрессии yicM.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Смотрах-конкурсах работ сотрудников ЗАО "АГРИ" в июне 2004 года и июне 2005 года. Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре ЗАО "АГРИ" и Секции Учёного Совета "Генетики" ФГУП ГосНИИГенетика 15 декабря 2005 года.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 137 листах машинописного текста, включая 17 рисунков и 17 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 232 источника, в том числе 5 на русском языке.

Результаты и обсуждение

1. Поиск в идентификация генов, амплификация которых обеспечивает устойчивость Е. coli к аналогам пуриновых оспований

1.1. Идентификация генов ydeD и yijE, обеспечивающих устойчивость к 8-азааденину

Целью дапной работы был поиск транспортных белков, участвующих в экскреции пуриновых производных из клетки. Известно, что амплификация генов, которые кодируют компоненты транспортных систем, выводящих вещества из клетки, повышает устойчивость бактерий к различным антимикробным агентам (Li and Nikaido, 2004). Аналоги пуриновых оснований и нуклеозидов, поступая внутрь клетки, способны тггибировать рост Е. coli Мы предположили, что амплификация генов, кодирующих транспортные белки, участвующие в экскреции пуриновых производных, может повысить уровень устойчивости клеток R coli к аналогам пуриновых оснований. Ранее в нашей лаборатории при клонировании in vivo с использованием фазмиды mini-Mu d5005 (Groisman and Casadaban, 1986) была получена коллекция фазмид, которые содержали различные участки хромосомы Е coli и обеспечивали устойчивость штамма Е coli TGI к различным аналогам пуриновых оснований: 8-азааденину, 6-меркаптопурину, пурину, 6-тиогуанину и т.д. Библиотека генов была получена на штамме Е. coli MG1655Mu, лизогенным по фагу Mu ets62.

Нами была определена нукпеотидная последовательность концевых участков отобранных вставок. Полученные данные сравнивали с информацией из базы данных GenBank, и таким образом идентифицировали клонированные фрагменты. Среди идентифицированных вставок нас в первую очередь интересовали участки хромосомы, которые содержали гены, кодирующие мембранные белки с вероятной транспортной функцией. Две такие вставки, aza9 и azalO, обеспечивали устойчивость к 200 мкг/мл 8-азааденина (см. Рисунок 1). Для того чтобы идентифицировать гены, обеспечивающие устойчивость к 8-азааденину, различные фрагменты вставок aza9 и azalO клонировали в многокопийный вектор pUC21 и проверяли их способность придавать устойчивость к указанному пуриновому аналогу. Оказалось, что за фенотип устойчивости отвечают фрагменты, несущие гены yijE (вставка aza9) и ydeD (вставка azalO).

Ген yijE кодирует гипотетический мембранный белок, состоящий из 301 аминокислотного остатка с рассчитанной молекулярной массой 34.1 кДа и имеющий 10 трансмембранных сегментов. Функция данного белка неизвестна. Напротив, ген ydeD кодирует белок с известной функцией - экскреция метаболитов пути биосинтеза цистеина (Dassler et al, 1999). Можно предположить, что ген ydeD обладает более широкой специфичностью и также вовлечен в процесс экскреции пуриновых производных. Также следует отмстить, что белки YdeD и YijE входят в одно семейство (ТС 2.А.7.З. The 10 TMS

Drug/Metabolite Exporter (DME) Family) с белком RhtA. Ранее в нашей лаборатории было показано, что белок RhtA участвует в экскреции аминокислот и их аналогов и обладает очень широкой субстратной специфичностью (Livshits et al, 2003).

8«рНЙ 1 г Paul

' ftopea .Hhd! : rBw)5l

aza9

2.0 kb

PVIlll - Vtpf

(Vilieee) , PVU», > PvuH , *

Рисунок 1. Физическая карта хромосомных генов, входящих в состав вставок aza9 и azalO, обеспечивающих устойчивость 8-азааденину.

1.2. Влияние амплификации генов ydeD, yijE и rhtA на устойчивость клеток Е. coli к 8-азааденину

Клетки Е. coli с клонированными на многокопийных векторах генами yijE и ydeD плохо росли на минимальной среде. Поэтому эти гены были переклонированы на вектор средней копийности pAYCTER3. Ген rhtA также был клонирован в этот вектор. Полученные плазмиды трансформировали в штамм Е. coli TGI. Кроме того, с помощью трансдукции был получен штамм Е coli TGlrhtA23. Мутация rhtA23, как было показано в нашей лаборатории ранее, значительно повышает экспрессию гена rhtA. Затем определяли устойчивость этих штаммов к 8-азааденину.

Таблица 1. Влияние амплификации генов yijE, ydeD и rhtA, а также мутации rhtA23 на

Штамм Рост на минимальной среде, содержащей 8-азааденин

- 100мкг/мл 300 м кг/мл 500 мкг/мл 1000 мкг/мл

TG1 + - - - -

TGI (pAYCTER3) + - - - -

TGI (pYIJE2) + + + + -

TGI (pYDED3) + + + + +

TGI (pRHTA3) + + + + -

TGlrthA23 + + + + +

Пояснения. + : хороший рост; ±: плохой рост; -: отсутствие роста.

Как видно ич Таблицы 1, амплификация генов yijE, ydeD и rhtA в значительной степени увеличивала устойчивость клеток к 8-азааденину. Как отмечалось ранее, гены yijE, ydeD й rhtA кодируют транспортные белки. Тот факт, что их повышенная экспрессия придает клеткам устойчивость к 8-азааденину, указывает на то, что возможными субстратами соответствующих транспортеров могут являться производные пуринов.

1.3. Влияние амплификации генов ydeD, yijE и rhtA на продукцию инозина штаммом-продуцентом.Е'. coli

Исходя из полученных выше данных, мы проверили влияние амплификации генов yijE, ydeD и rhtA, а также мутации rhtA23 на продукцию инозина соответствующим штаммом-продуцентом. Ферментации проводили в пробирках. Полученные результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Влияние амплификации генов yijE, ydeD и rhtA, а также мутации rhtA23 на накопление инозина штаммом-продуцентом Е coli AJ13732 в условиях ферментаций в

Штамм OD540 Инозин, г/л

AJ13732 (pMWKQ) 5.4 6.3+0.4

AJ13732 (pMWKQ, pAYCTER3) 5.4 6.0±0.3

AJ13732 (pMWKQ, pYIJE2) 5.3 6.5+0.4

AJ13732 (pMWKQ, pYDED3) 5.3 6.7+0.4

AJ13732 (pMWKQ, pRHTA3) 5.1 8.2+0.5

М\Ъ1У1гЫА23 (pMWKQ) 4.7 8.8+0.5

* По результатам, как минимум, трех опытов

Как видно из Таблицы 2, сверхэкспрессия гена rhtA заметно повышала накопление инозина в культуральной жидкости, в то время как амплификация генов yijE и ydeD увеличивала накопление инозина незначительно.

2. Идентификация гена yicM и компьютерный анализ кодируемого им белка

2.1. Поиск генов Е. coli, амплификация которых обеспечивает устойчивость к инозину

и/или гуянозину штамма GS72

Как показано выше, амплификация генов yijE и ydeD лишь незначительно увеличивала накопление инозина штаммом-продуцентом. Более того, введение плазмид pYIJE2 и pYDED3 в специально сконструированный штамм GS72 (см ниже), не повышало устойчивость этого штамма к инозину или гуанозину. Вероятно инозин, а также другие

пуриновые производные, не являются основными субстратами этих транспортных белков В связи с этим мы решили провести дополнительный поиск генов, участвующих в экспорте пуриновых производных из клеток Е coli, при помощи специально сконструированного штамма, чувствительного к пуриновым нуклеозидам

Pvull (6873)

Ncol (8288)

Eco47lll (1757)

Pstl (4928) Xhol (4070)

»/Uli (9308) Pvull (9550) Sali (9554) (11587) Ndel (9740)

pMP1

12 0 kb

Рисунок 2. Схема хромосомной вставки, содержащейся в фазмиде рМР1

Штамм GS72 несет мутацию gsk-3 (Petersen, 1999). Ген gsk кодирует фермент гуанозинкиназу, осуществляющий превращение гуанозина и инозина в ГМФ и ИМФ, соответственно Мутация gsk-3 делает этот фермент нечувствительным к ретроингибированию пуриновыми нуклеотидами. В результате при добавлении экзогенных нуклеозидов сильно увеличивается внутриклеточный пул адениновых и гуаниновых нуклеотидов, что приводит к ингибированию фермента фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (ФРПФ-синтетазы). Так как ФРПФ необходим для синтеза пиричидиновых нуклеотидов и некоторых аминокислот (гистидина и триптофана), то при росте на минимальных средах с инозином и гуанозином клетки испытывают голодание по этим соединениям, следствием чего является подавление роста мутанта gsk-3 в этих условиях Фазмиды из описанной выше коллекции, содержащие вставки различных участков хромосомы Е coli, трансформировали в штамм GS72, предварительно лизогенизированный по Mu cts Отобранные трансформанты проверяли на способность к росту на минимальной среде в присутствии ингибирующих концентраций инозина или гуанозина Так было отобрано несколько фазмид, обеспечивающих клеткам устойчивость к различным концентрациям инозина и/или гуанозина. Концевые участки вставок секвенировали. Полученные данные о нуклеотидной последовательности сравнивались с информацией из GenBank, и таким образом идентифицировали клонированные фрагменты. Большинство фрагментов содержало гены метаболизма пуриновых производных (amn, deoD, ехо). Но одна фазмида - рМР1, обеспечивающая устойчивость к 6-меркаптопурину штамма TGI Ми as и к инозину штамма GS72Mu, несла фрагмент хромосомы £ coli из района öj мин длиной -12 г.п.н., на коюром не было охарактеризованных генов, продукты которых мо1ли бы отвечать за указанный фенотип (см. Рисунок 2) Однако на этом участке хромосомы находится несколько генов,

которые кодируют белки, вероятно являющиеся мембранными. Путем субклонирования различных фрагментов этой вставки в многокопийный вектор рОК12 бьио установлено, что минимальный Pstl-Pvull фрагмент размером ~2 т.п.н., обеспечивающий фенотип устойчивости к инозину, содержит открытую рамку считывания (ORF) yicM и 342 п.н. перед ее предполагаемым стартовым кодоном (GenBank accession number U00096). Таким образом, был идентифицирован ген yicM, амплификация которого придает штамму GS72 устойчивость к инозину.

2.2. Определение сайтов инициации транскрипции и трансляции гена yicM

Анализ нуклеотидной последовательности перед предполагаемой точкой начала трансляции ORF yicM (Genbank, U00096) не выявил потенциального рибосом-связывающего сайта Более того, изучение доступных баз данных обнаружило различие в определении точки начала трансляции гена yicM и, следовательно, в размере кодируемого белка. В соответствии с данными GenBank, белок (NP 418118) состоит из 451 аминокислотного остатка. В соответствии с данными SWISS-PROT (http://au.expasy.org/sprot/) белок (Р31438) состоит из 412 аминокислотных остатков. В соответствии с данными EcoGene (http://bmb.med.miami.edu/) белок (EG11689) состоит из 396 аминокислотных остатков. Соответствующие стартовые кодоны отмечены на Рисунке 3 (А). Для определения истинной точки инициации трансляции yicM каждый из потенциальных стартовых кодонов гена, содержащегося на плазмиде pYICMl, был изменен при помощи сайт-направленного мутагенеза. Так, первый потенциальный стартовый кодон (GTG) был изменен в CTG, второй и третий стартовые кодоны (ATG1 и ATG2) были изменены в АТС. Полученные плазмиды трансформировали в штамм GS72. Далее изучалось влияние указанных плазмид на устойчивость к инозину штамма GS72. Оказалось, что введение мутаций в кодоны GTG или ATG1 не изменяет устойчивости к 500 мг/л инозина штамма GS72 с амшгафшщрованным yicM. В тоже время введение мутации в кодон ATG2 нарушало способность штамма GS72 расти в присутствии инозина. Исходя из этого, мы сделали вывод, что трансляция YicM начинается с кодона ATG2 (см. Рисунок 3). Это заключение также подтверждается тем, что только перед указанным кодоном есть последовательность, напоминающая сайт связывания рибосом - RBS (см. Рисунок 3 (А)).

Сайт инициации трапскрипции yicM был определен при помощи primer-extension анализа. Как показано на Рисунке 3 (В), инициация транскрипции yicM происходит с СТР, в 32 п.н. перед точкой начала трансляции YicM. Более слабый сигнал, соответствующий началу транскрипции с GTP, был обнаружен в 1 п.н. перед сильным сигналом. В шести нуклеотидных парах перед сильным сигналом расположен сайт TAaAgT, который напоминает консенсусную последовательность -10 области (ТАТААТ) возможного

промотора (см. Рисунок 3 (А)). Более того, в 19 п.н. перед этим -10 регионом расположен сайт ТТаАа1, имеющий некоторое сходство с консенсусной последовательностью -35 промоторной области (ТГОАСА). Совпадение обнаруженных -10 и -35 областей промотора гена укМ с консенсусными последовательностями не очень велико. По-видимому, экспрессия гена у/с А/не высока.

Genbank (QTG)

5'-cgcctgacctgtcgggtggataagacgttc acgccgcatccggtaatctttgccctgttccgt ttcgatcttaactccagctcaagcaacaccgta -35

aaagttgcaaaaacgttaaatgcgtcacacatt SWISS-PROT (ATG1)

-10 гу*

tcaatgttaaagtggtcg6cttttcccctgaaa

RBS EcoGene (ATG2) catgccacfgggtlaacaccatgagtgaattt-3 ' m s e f

Рисунок 3. (А) Нуклеотидная последовательность промоторной области гена yicM. Возможные кодоны инициации трансляции, в соответствии с различными базами данных, выделены жирным шрифтом. Наиболее вероятный сайт связывания рибосом (RBS) обведен в рамку. Возможные точки начала транскрипции показаны стрелками, -10 и -35 области возможного промотора подчеркнуты. (В) Определение точки начала транскрипции yicM при помощи primer-extension анализа. кДНК транскрипты РНК, выделенной из штаммов TG1 (рОК12) и TGI (pYICMl) анализировались в 6% полиакриламидном геле (дорожки 1 и 2, соответственно). Возможные точки начала транскрипции yicM (соседние нуклеотиды С и G) и направление транскрипции указаны стрелками.

2.3. YicM - мембранный белок, относящийся к MFS транспортерам

Таким образом, нами было установлено, что ген yicM кодирует белок, состоящий из 396 аминокислотных остатков и имеющий расчетную молекулярную массу 41.85 кДа. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности YicM показал, что он является гидрофобным белком, вероятно, локализованным в цитоплазматической мембране. Поиск гидрофобных доменов при помощи программы ProtScale

(http://au.expasy.org/tools/protscale.html) показал, что белок YicM может иметь 12 трансмембранных сегментов (см. Рисунок 4).

В соответствии с ТС системой классификации транспортных белков (http://www.tcdb.org), YicM принадлежит к семейству 2.А.1.2. DHA1 (Drug:!!4' Antiporter-1), в которое входят белки с 12 трансмембранными сегментами, использующими для транспорта субстрата протон-движущую силу. В свою очередь это семейство входит в состав

надсемейства 2.А.1 MFS (Major Facilitator Superfamily). Различные MFS-транспортеры обладают специфичностью к ядам, сахарам, метаболитам цикла Кребса, аминокислотам, пептидам, нуклеозидам и т.п. В соответствии с ТС системой MFS входил в состав подкласса:

2.А. Переносчики (унипортеры, симпортеры, антипортеры), класса: 2. Транспортеры, использующие электрохимический потенциал.

3 2 1 О -1 -2 -3

О 100 200 300 400

Номер аминокислотного остатка

Рисунок 4. Гидрофобно-гидрофильный профиль YicM, построенный по методу Кайта и Дулитгла (Kyte and Doolittle, 1982).

Также, белок YicM относится к COG 2814, т е. кластеру ортологичных групп белков (Tatusov et al., 2001), в который входят пермеазы, осуществляющих экспорт арабинозы К этому COG также относятся белки YdeA из Е coli, осуществляющий экскрецию арабинозы, и YdhL (PbuE) из Bacillus subtilis, участвующий в экскреции пуриновых оснований.

Исходя из вышесказанного, мы предположили, что ген yicM кодирует белок, участвующий в экскреции пуриновых производных. По-видимому, YicM, как и большинство членов MFS, использует энергию трансмембранного потенциала для транспорта субстрата.

3. Исследование участия YicM в экскреции пуриновых иуклеозидов из клеток Е. coli 3.1. Влияние инактивации и сверхэкспрессии гена yicM на устойчивость клеток Е. coli к шуриновым нуклеозидам

Для изучения роли yicM в клеточпой физиологии мы инактивировали этот ген на хромосоме Е coli. Инактивация гена yicM не влияла на скорость роста штаммов Е coli на богатых и минимальных средах при различных температурах. Возможно, yicM экспрессируется на очень низком уровне и/или его функция проявляется только в особых условиях.

Для изучения влияния сверхэкспрессии гена yicM на устойчивость клеток Е. coli к

различным агентам мы клонировали кодирующую часть укМ в вектор pMIV-Р^д под

контроль сильного промотора гена Е coli nlpD. Вектор pMIV-P„^D был предоставлен нам Зиятдиновым М.Х. (ЗАО "АГРИ"). Плазмида pMlV-?„iPD-yicM содержит сайты интеграции фага Mu, между которыми находятся ген устойчивости к хлорамфениколу (cal), терминатор гена гтВ и ген yícM под контролем сильного промотора Р„¡ро Эта конструкция была интегрирована в хромосому Е. coli.

Исходя из ранее высказанного предположения об участие белка YícM в экспорте шуриновых производных из клетки, мы предположили, что его сверхпродукция должна повышать устойчивость штамма E.coli GS72 к пуриновым нуклеозидам. Для проверки этого предположения мы определяли влияние сверхэкспрессии и инактивации гена yicM на уровень устойчивости штамма GS72 к пуриновым нуклеозидам.

Таблица 3. Влияние инактивации и сверхэкспрессии гена yicM на устойчивость клеток Е coli к пуриновым нуклеозидам.__

Штамм Минимальная ингибирующая концентрация (МИК)а, мкг/мл

Инозин Аденозин Гуанозин

GS72 300 500 10

GS72 AyicM 100 100 7.5

GS72V „¡pD-yicM >30000 >6000 100

' По результатам, как минимум, трех опытов

Данные, представленные в Таблице 3, показывают, что сверхэкспрессия гена yicM значительно повышает уровень устойчивости штамма GS72 к пуриновым нуклеозидам. Стоит отметить, что устойчивость к инозину возрастает более чем в 100 раз. В то же время инактивация yicM снижает уровень устойчивости к нуклеозидам. Это может свидетельствовать о том, что YicM является основным транспортером, осуществляющим экскрецию пуриновых нуклеозидов у К coli.

3.2. Сверхэкспрессия гена yicM снижает скорость pocia Е. coli на минимальных средах, содержащих пуриновые рибонуклеозиды в качестве единственных источников углерода и энергии

Е. coli может утилизировать нуклеозиды, как единственные источники углерода. Также известно, что при сверхэкспрессии генов, кодирующих транспортные помпы для различных соединений, накопление этих соединений в клетке снижается. Как мы показали выше, сверхэкспрессия гена yicM придает устойчивое гь штамму GS72 к инозину, гуанозину и аденозину. Мы предположили, что если повышенная устойчивость связана с экскрецией этих пуриновых нуклеозидов из клетки, то сверхэкспрессия гена yicM будет снижать

накопление этих соединений в клетке, что, в свою очередь, должно влиять на рост штаммов Е. coli на минимальной среде, в которой единственными источниками углерода являются пуриновые нуклеозиды. Для проверки этого предположения мы изучали влияние инактивации и сверхэкспрессии гена yicM на рост штамма MG1655 в минимальной среде М9 с различными источниками углерода. Для этого в штамм MG1655 трансдуцировали инактивированный аллель гена yicM - byicMwcctt и ген yicM, экспрессирующийся под контролем промотора РфВ.

Глюкоза

Рибом

Цкгидин

О 20 40 00 10 О 20 40 00 80 0 20 40 00 00 Время, ч

Двзокоиинозин Дезоксигуанозин Деэоксиаденозин

Рисунок 5. Влияние сверхэкспрессии и инактивации гена yicM на рост штамма Е. coli MGI 655 на минимальной среде с различными источниками углерода. Концентрация каждого источника углерода составляла 2 мМ. Темные кружки - штамм MG1655, светлые кружки -штамм MG1655AyicM, треугольники - штамм MG\655P„lpiryicM.

Родительский штамм М01655 и ts.yicMv.cat мутант одинаково росли на минимальной среде, содержащей 2 мМ глюкозы, рибозы, цитидина, инозина, гуанозина или аденозина, в качестве единственных источников углерода и энергии. Скорость роста штамма, в котором ген укМ экспрессировался под контролем сильного промотора Р„¡ро, не отличалась от скорости роста контрольного штамма при использовании в качестве источников углерода глюкозы, рибозы или цитидина. Однако, когда в качестве источников углерода

использовались пуриновые рибонуклеозиды, это приводило к сильному замедлению роста штамма MG1655P niPB-yicM. Полученные результаты свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия гена yicM, очевидно, снижает накопление пуриновых рибонуклеозидов в клетках Е coli. В то же время сверхэкспрессия yicM не оказывала никакого влияния на рост на средах с дезокснрибонуклеозидамн.

3.3. Сверхэкспрессия гена yicM приводит к накоплению инозина в культуральной среде штаммом Е. coli с инактивированной пурин нуклеозидфосфорилазой

Для получения прямых доказательств участия YicM в экскреции нуклеозидов мы изучали накопление пуриновых производных штаммом Е coli TGldeoD, не способным эффективно катаболизировать пуриновые нуклеозиды. С этой целью с помощью ВЭЖХ определяли содержание различных веществ в культуральной среде после культивирования этого штамма и его производного со сверхэкспрессией гена yicM.

(V &

о С

л! Иж u, 1 TGldeoD >ЗИН л 1

jioi Ин 1 LJI оин TG1 deoDP.po-yicM Л (I

о 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время удержания, мин

Рисунок 6. Элюционный профиль супернатанта культуральной жидкости штаммов ТОИеоО (вверху) и ТОЫеоОРп1Ро-у1сМ (внизу). Штаммы выращивались 24 часа на минимальной среде Е1 с глюкозой, после чего клетки осаждались центрифугированием, а супернатант анализировался с помощью ВЭЖХ. Стрелками показано место выхода инозина.

Элюционный профиль супернатанта культуральной жидкости штамма Т01с1еоОРП|ри-

уюМ показал наличие около 8 мг/л инозина, в отличие от контрольного штамма,

культуральная жидкость которого содержала только следы пуриновых производных (см.

Рисупок 6). Таким образом, сверхэкспрессия гена yicM значительно повышала накопление инозина. Ранее полученные данные указывают на специфичность YicM по отношению как к инозину, так и к другим пуриновым рибонуклеозидам, аденозину и гуанозину. Отсутствие в культуральной жидкости заметных количеств этих соединений можно объяснить тем, что инозин является биосинтетическим предшественником аденозина и гуанозина, и повышенная экскреция инозина снижает их внутриклеточную концентрацию.

3.4. Сверхпродукция YicM снижает индукцию внутреннего промотора deoP3 оперона deoCABD пуриновыми нуклеозидами

Если сверхпродукция YicM ведет к повышенной экскреции пуриновых нуклеозидов, •го это должно влиять на индукцию нуклеозид-зависимых промоторов. Известно, что экспрессия с внутреннего промотора deoP3 оперона deoCABD у Е coli индуцируется экзогенным инозином и гуанозином (Valentin-Hansen et al., 1984). Сверхпродукция транспортера, экспортирующего эти нуклеозиды, должна снижать их внутриклеточную концентрацию и степень индукции промотора deoP3 этими соединениями.

Для проверки этого предположения мы сконструировали трансляционное слияние (фьюз) структурной части гена lacZ и deoP3 промотора. Плазмида рМС1871 (Shapira et al., 1983) содержит ген lacZ без промотора, сайта связывания рибосом и нескольких N-концевых аминокислот. Этот ген был переклонирован в вектор pMW-att-Km, ранее полученный в нашей лаборатории на основе малокопийной плазмиды pMW118. Сконструированная плазмида получила название pMWF. Путем клонирования фрагмента ДНК, содержащего deoP3 промотор, сайт инициации трансляции и 48 нуклеотидов кодирующей области гена deoB в рамку с lacZ был получен вектор pMWF-deoP3. В данной конструкции ген lacZ, кодирующий ß-галактозидазу, экспрессируется под контролем deoP3 промотора и его экспрессия зависит от присутствия в ростовой среде пуриновых нуклеозидов. Вектор pMWF-deoP3 трансформировали в штамм GS224, у которого гены lacZ и deoD инактивированы, и по активности ß-галактозидазы определяли зависимость экспрессии с промотора deoP3 от присутствия в среде пуриновых рибонуклеозидов.

Как видно из Таблицы 4, активность ß-галактозидазы в штамме GS224 (pMWF-deoP3) увеличивается в 3.3 раза при добавлении гуанозина и в 2.2 раза при добавлении инозина или аденозина. В тоже время сверхэкспрессия гена yicM значительно снижала степень индукции пуриновыми нуклеозидами. Так, в штамме со сверхпродукцией YicM активность ß-галактозидазы при добавлении гуанозина или инозина повышалась незначительно, а при добавлении аденозина повышения уровня активности обнаружено не было. Эти данные свидетельствуют о том, что сверхпродукция YicM снижает внутриклеточную концентрацию пуриновых рибонуклеозидов.

Таблица 4. Индукция deoP3 промотора пуриновыми нуклеозидами и влияние на индукцию сверхэкспрессии гена yicM.__

Штамм Генотип Активность ß-галактозидазы, нмоль/(мин мг)

без добавления пуринов 100 мкг/мл инозина 100 мкг/мл гуанозина 100 мкг/мл аденозина

GS224 deoD 928+52 3078+86 2047+147 2053+61

GS258 deoD ?„ipD-yicM 896+38 1272+103 1187+24 927+52

3.5. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на скорость экскреции инозина из клеток Е. coli и зависимость этой экскреции от присутствия протонофора карбонилцианида-/я-хлорфенилгндразона (СССР)

Как мы показали ранее, YicM участвует в экскреции пуриновых рибонуклеозидов из клетки Е. coli. Для изучения скорости опосредованной YicM экскреции инозина из клеток, в хромосому штамма FADRaddedd (Matsui et al, 2001), содержащего ряд мутаций, полезных для продукции инозина, интегрировали ген yicM под контролем конститутивного промотора гена Е coli nlpD. Так был получен штамм GS 144. ГТлазмида pMWKQ содержит ген purF с мутацией K326Q, снижающей ингибирование этого фермента пуриновыми нуклеотидами, что необходимо для продукции инозина (Matsui et al, 2001). Мы трансформировали эту плазмиду в штаммы FADRaddedd и GS 144 и получили штаммы FADRaddedd (pMWKQ) и GS144P„iPD-yicM (pMWKQ).

Скорость экскреции измерялась в минимальной среде El, неспособной поддерживать рост штаммов FADRaddedd (pMWKQ) и GS 144 (pMWKQ), так как эти штаммы несут мутацию риг А и нуждаются в экзогенном аденине. Таким образом, в ходе эксперимента рост культур не происходил, и оптическая плотность была постоянной и одинаковой для тестируемых штаммов. Как видно из Рисунка 7, при сверхэкспрессии гена yicM повышалась скорость накопления инозина в среде. Через 6 часов концентрация инозина была примерно в 3 раза выше в случае штамма GS144PniPD-yicM (pMWKQ), чем в случае штамма FADRaddedd (pMWKQ). Таким образом, YicM обеспечивает экскрецию инозина, и сверхпродукция этого белка увеличивает скорость выброса инозина клетками Е. coli.

Транспортер YicM относится к надсемейству MFS транспортных белков. Большинство членов MFS используют протон-движущую силу для транспортировки субстрата, и поэтому мы проверили влияние протонофора СССР на экскрецию инозина. Снижение трансмембранпого электрохимического потенциала при добавления 20 мкМ СССР (эта концентрация не влияет на рост клеток), вело к полному прекращению экскреции инозина штаммом GS144P„ipD-yicM (pMWKQ). Это свидетельствует о том, что экспорт

инозина из клеток очевидно осуществляется при использовании протон-движущей силы по механизму вторичного транспорта.

Время, ч

Рисунок 7. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на скорость накопления инозина в среде, штаммами FADRaddedd (pMWKQ) (темные треугольники), GS144P„iPD-yicM (pMWKQ) (темные кружки) и штаммом GS144P„iPD-yicM (pMWKQ) после добавления 20 мкМ протонофора СССР (светлые кружки), момент добавления СССР указан стрелкой.

3.6. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на продукцию пуриновых производных штаммами-продуцентами Е. coli

Как мы показали ранее, сверхэкспрессия гена yicM повышает скорость экскреции инозина из клеток Е coli. Следовательно, сверхэкспрессия гена yicM в клетках штамма-продуцента инозина должна повысить их продуктивность, т.е. должно увеличиться накопление инозина в культуральной среде. Для проверки этого предположения мы определяли влияние сверхэкспрессии гена yicM под контролем промотора ?niPD на накопление инозина штаммом-продуцентом GS144P„]pD-yicM (pMWKQ) по сравнению с контрольным штаммом FADRaddedd (pMWKQ). Кроме того, в штамм FADRaddedd (pMWKQ) трансдуцировали мутацию AyicM::cat и получили штамм GS168AyicM (pMWKQ). Штаммы GS144P„iPD-yicM (pMWKQ), FADRaddedd (pMWKQ) и GS168AyicM (pMWKQ) культивировали в одинаковых условиях, обеспечивающих максимальную продукцию инозина. После культивирования определяли количество пуринов в среде. Как мы и ожидали, в условиях ферментаций в пробирках штамм GS144P„iPD-yicM (pMWKQ) накапливал примерно в 1.7 раза больше инозина, чем штамм FADRaddedd (pMWKQ) (см Таблицу 5). Таким образом, сверхэкспрессия гена yicM заметно повышает продукцию инозина соответствующим штаммом-продуцентом.

Также нами было отмечено, что штамм GS144P„iPD-yicM (pMWKQ) накапливает в культуральной среде примерно в два раза меньше гипоксантина, продута деградации

инозина, чем штамм FADRaddedd (pMWKQ). Известно, что за деградацию пуриновых нуклеозидов у Е coli отвечает фермент пуриннуклеозидфосфорилаза, кодируемый геном deoD. Штаммы-продуценты инозина FADRaddedd (pMWKQ) и GS144Pn!pD-yicM (pMWKQ) не способны деградировать пуриновые нуклеозиды вследствие мутации в гене deoD (Matsui et al, 2001). Однако присутствие среди продуктов ферментации довольно больших количеств гипоксантина, по-видимому, свидетельствует о наличии у Е. coli альтернативного механизма деградации пуриновых нуклеозидов (Petersen and Moller, 2001). Снижение накопления гипоксантина в ферментационной среде при сверхэкспрессии гена yicM, может бьпъ связано с повышенной скоростью экскреции инозина из клеток, что, в свою очередь, снижает количество инозина, деградирующего в клетке до гипоксантина и рибозы.

Таблица 5. Влияние сверхэкспрессии и инактивации гена укМ на накопление инозина и гипоксантина штаммом-продуцентом FADRaddedd (pMWKQ) и его производными._

Штамм ODsoo Накопление пуринов, г/л

Инозин Гипоксантин

FADRaddedd (pMWKQ) 20.0 1.6+0.3 0.35+0.1

GS168AyicM (pMWKQ) 20.0 1.5+0.4 0.35+0.1

GS144P„ip0-yicM (pMWKQ) 17.2 2.7+0.2 0.16+0.07

Для выяснения специфичности YicM в отношении других пуриновых производных, мы 1акже проверяли влияние сверхэкспрессии yicM на накопление гипоксантина и ксантозина в культуральной среде, соответствующими штаммами-продуцентами Превышения накопления этих продуктов по сравнению с контрольным штаммом отмечено не было, что может свидетельствовать об отсутствии или низкой специфичности YicM по отношению к этим субстратам.

3.7. Сверхэкспрессия yicM в клетках Bacillus amyloliquefaciens увеличивает накопление пуриновых нуклеозидов штаммом-продуцентом

Как уже отмечалось, анализ аминокислотной последовательности белка YicM

показывает, что он является мембранным белком. Гомологами YicM являются белки,

выполняющие транспортные функции, например, YdeA является экспортером арабинозы у

Е coli (Bost et al, 1999), a PbuE (YdhL) является экспортером пуринов у Bacillus subtilis

(Johansen et al., 2003) Эти данные позволяют предположить, что и YicM является

транспортным белком, непосредственно участвующим в экскреции пуриновых производных

из клетки. Однако, получение прямых доказательств транспортной функции YicM

затруднено сложностями выделения мембранных белков и воспроизведением условий их

функционирования В настоящее время заключения о транспортной функции того или иного

белка основываются на косвенных доказательствах, а также на анализе его аминокислотной последовательности. В связи с отсутствием прямых экспериментальных данных о мембранной локализации и транспортной функции YicM допустимо предположение о том, что YicM может являться регуляторным белком-индуктором, активирующим продукцию неизвестного транспортного белка, который и осуществляет экскрецию пуриновых рибонуклеозидов. Для проверки этого предположения мы изучали влияние сверхэкспрессии гена yicM на накопление пуриновых нукпеозидов штаммом-продуцентом Bacillus amyloliquefaciens AJ1991. Если YicM является регуляторным белком, то его сверхпродукция не должна влиять на накопление пуриновых производных штаммом AJ1991, поскольку Е coli и Bacillus amyloliquefaciens являются неродственными микроорганизмами и, очевидно, имеют различные регуляторные механизмы.

Для экспрессии гена yicM в клетках Bacillus amyloliquefaciens мы клонировали его кодирующую область в вектор pLF22 (Тараканов и др., 2004), поддерживающийся как в Е. coli, так и в Bacillus amyloliquefaciens. Клонирование было проведено таким образом, чтобы ген yicM экспрессировался под контролем промотора герАВ генов (Р^д-промотор) и имел сайт связывания рибосом, характерный для бацилл. Полученная плазмида pLF-yicM была введена в штамм Bacillus amyloliquefaciens AJ1991 - продуцент инозина и гуанозина. Далее изучалось влияние сверхэкспрессии гена yicM на накопление пуриновых нукпеозидов. В качестве контрольного штамма мы использовали штамм AJ1991, в который была введена исходная плазмида pLF22. Полученные штаммы культивировали в одинаковых условиях, обеспечивающих максимальную продукцию пуриновых нуклеозидов. После культивирования определяли количество пуринов в среде. Как видно из Таблицы 6, штамм, содержащий плазмиду pLF-yicM, накапливал больше инозина и гуанозина в среде, по сравнению с контрольным штаммом. Таким образом, мы показали, что YicM не является регуляторным белком, и, следовательно, YicM - это транспортный белок, осуществляющий экспорт пуриновых рибонуклеозидов из клеток.

Таблица 6. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на накопление инозина и гуанозина штаммом Bacillus amyloliquefaciens AJ1991.__

Штамм OD600 Накопление инозина, г/л Накопление гуанозина, г/л

AJ1991 (pLF22) 26.1 2.7+0.4 2.1+0.1

AJ1991 (pLF-yicM) 28.3 4.7+0.4 2.6+0.2

4. Исследование регуляции экспрессии теияукМ

Для изучения регуляции экспрессии гена yicM мы сконструировали трансляционное слияпие (фьюз) регуляторной области этого гена с геном lacZ, кодирующим (5-галактозидазу. Регуляторная область гена yicM, содержащая 400 п.н. перед стартовым ATG кодоном и первые 36 п.н. кодирующей части гепа клонировали в вектор pMWF. Клонирование было проведено без нарушения рамки считывания lacZ Таким образом, была получена плазмида pMWF-PyiCM, в которой экспрессия гена lacZ контролируется регуляторной областью гена yicM. Этой конструкцией трансформировали штамм МС4100, который в дальнейшем использовался для исследования регуляции гена yicM.

4.1. Влияние состава питательной среды на экспрессию пнлукМ

Состав ростовой среды влияет на экспрессию многих генов. Различные питательные вещее гва (сахара, аминокислоты, пурины, пиримидины и т.д.), содержащиеся в богатой среде, могут активировать или подавлять экспрессию многих генов. При росте на минимальной среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода и энергии клетки испытывают определенный недостаток питательных веществ, что является стрессовой ситуацией. В результате, при росте на минимальной среде повышена экспрессия многих генов, индуцирующихся в стрессовых условиях (голодание, температурный, осмотический, тепловой шок и т.д).

Рисунок 8. Влияние состава питательной среды на экспрессию гена укМ. Ночные культуры штамма МС4100 (рМ\УР-Рукм), выращенные богатой среде ЬВ и минимальной среде М9, разводили в 50 раз в такой же среде и культивировали с аэрацией при 37°С в течении 6 часов, после чего измеряли активность Р-галактозидазы.

Как видно из Рисунка 8, экспрессии гена уюМ при росте на минимальной среде значительно выше, чем на богатой. Возможно, экспрессия гена укМ активируется в условиях недостатка каких-то питательных веществ. Возможно и другое объяснение эюго явления: повышенная экспрессия гена укМ в минимальной среде связана с тем, что в богатой среде

1В мог>г содержаться вещества, подавляющие его экспрессию Стоит отмениь. аналогичный результат был получен ранее для аминокислотных экспортеров, прод>ктов генов гЫВ и гЫС (Трошин, 2002). Известно, чго накопление ряда клеточных метаболитов, экскретируемых в окружающую среду, служит сигналом при межклеточных взаимодействиях Возможно, активация экспрессии систем экскреции нормальных метаболитов в условиях роста на минимальных средах необходима для взаимодействия клеток в популяции.

4.2. Изучение влияния фазы роста на экспрессию гена yicM

Экспрессия многих генов Е coli зависит от фазы роста культуры В процессе роста бактерии изменяют состав питательной среды, выделяют в среду продукты своего метаболизма и специальные сигнальные молекулы Все это может сказываться на экспрессии генов, кодирующих транспортные системы, которые участвуют в усвоении питательных веществ и экскреции метаболитов и вредных соединений.

- Активность ß-галактозидазы Оптическая плотность культуры

Рисунок 9. Влияние фазы роста культуры на экспрессию гена укМ. Культуру штамма МС4100 (рМ^-РулМ), выращенную в течение ночи в минимальной среде М9, разводили в 50 раз в такой же среде и культивировали с аэрацией при 37°С В процессе роста отбирались пробы для определения оптической плотности культуры и активности ¡3-галактозидазы

Как видно из Рисунка 9, экспрессия гена yicM увеличивается в конце

логарифмической и начале стационарной фазы роста. Известно, что при переходе клеток в

стационарную фазу роста замедляется экспрессия большинства генов, важных для быстрого

роста (гены трансляционного аппарата), и активируются гены, подготавливающие бактерии

к выживанию в неблагоприятных условиях Также, вступление клеток Е coli в стационарную

фазу роста сопровождается деградацией рибосомальной РНК и экскрецией производных

нуклеиновых кислот (Riñas el al, 1995). По-видимому, для этого процесса необходима

повышенная экспрессия тт&укМ, так как он кодирует транспортный белок, участвующий в экскреции пуриновых производных из клетки

4.3. Изучение влияния аллельного состояния гена гроЯ на экспрессию гена укМ

Увеличение экспрессии в стационарной фазе роста характерно для генов, регулируемых ст8-субъединицей РНК-полимеразы, продуктом гена гроЯ. Поэтому мы изучали влияние аллельного состояния гена гроБ на экспрессию укМ. С этой целью измеряли активпость Р-галактозидазы в стационарной фазе роста для пары изогенных штаммов: МС4100 (рМ^-Р^м) и МС4100гро5::Ьи (pMWF-Py,cм).

3 70

<п

1 60

5 ¥ 40

и 3«

а 20

МС4100

МС4100/ро& '.кап

Рисунок 10. Влияние аллельного состояния гена гроБ на экспрессию гена угсМ. Ночные культуры штаммов МС4100 (рМ^-Ру,см) и МС4 ЮОгроЯг¿ал (рМ\УР-Ру„;м), выращенные богатой среде ЬВ, разводили в 50 раз в такой же среде и культивировали с аэрацией при 37°С в течении 8 часов, после чего измеряли активность Р-галактозидазы.

Как видно из Рисунка 10, инактивация гена гроБ лишь незначительно снижает активность Р-галактозидазы в стационарной фазе роста. Возможно, продукт гена гро$ лишь косвенно регулирует экспрессию гена угсМ посредством неизвестного механизма Однако снижение экспрессии гена укМ в ЫС4\00гро5::кап штамме согласуется с ранее полученными данными об увеличении экспрессии укМ при переходе к стационарной фазе роста. Вероятно, повышение экспрессии гена укМ при переходе к стационарной фазе роста как-то связано с подготовкой клетки к выживанию в стрессовых условиях голодания и остановки роста.

4.4. Изучение влияния различных веществ па уровень экспрессии тенлукМ

Известно, что экспрессия генов, кодирующих транспортные системы, часто индуцируется добавлением в среду транспортируемых соединений. Поэтому мы проверили влияние возможных субстратов на уровень экспрессии гена угсМ. С этой целью с помощью

трансдукции фагом PI vir в штамм МС4100 был перенесен инахтивированный аллель 1ена yicM- byicMwcat, после чего полученный нггамм трансформировали плазмидой pMWF-Py,cM. Затем определяли активность ß-галактозидазы в культурах сконструированного штамма МС4100Ду/сА/ (pMWF-P угем), выращенных в минимальной среде М9 с добавлением и без добавления исследуемого соединения (Рисунок 11).

Рисунок 11. Влияние различных веществ на уровень экспрессии гена yicM. Для определения активности (3-галактозидазы ночную культуру штамма МС41 OOAyicM (pMWF-PylcM), выращенную в минимальной среде со 100 мкг/мл ампициллина, разводили в 50 раз в свежей среде и подращивали в течение трех генераций при 37°С с аэрацией. После этого подращенную культуру разводили в 5 раз подогретой минимальной средой М9 с добавлением и без добавления исследуемого соединения. Далее культуры выращивали до стационарной фазы роста и измеряли активность р -галактозидазы.

Так как YicM участвует в экскреции пуриновых производных, мы проверили влияние экзогенных пуриновых нуклеозидов и оснований на уровень индукции г ена yicM. Как видно из Рисунка 11 добавление этих соединений не влияло на активность р-галактозидазы. Следует отметить, что аналогичный результат был ранее получен для аминокислотных экспортеров Е coli RhtB и RhtC, экспрессия которых не индуцировалась известными транспортируемыми субстратами (Трошин, 2002). Следовательно, тог факт, что пуриновые рибонуклеозиды не являются индукторами гена yicM, не противоречит нашему заключению о функции YicM как транспортера этих соединений из клетки. Вероятно, экспрессия этого

гена регулируется с помощью иного механизма.

Также мы проверили влияние и других соединений (Сахаров, аналогов пуриновых оснований и нуклеозидов) на индукцию гена yicM. Ни в одном случае значительного изменения активности ß-галактозидазы отмечено не было (см. Рисунок 11).

Совокупность наших результатов по изучению экспрессии гена yicM позволяет предположить, что его экспрессия главным образом зависит от физиологического состояния клетки и изменяется при различных условиях роста

Заключение

В последние годы были описаны системы, осуществляющие активный транспорт аминокислот и Сахаров из клеток Е. coli. В настоящей работе мы впервые идентифицировали и охарактеризовали ген, участвующий в экскреции нуклеозидов.

Основываясь на представленных выше данных, которые показывают, что ген yicM кодирует мембранный белок YicM, который участвует в экскреции пуриновых рибонукпеозидов, в первую очередь инозина, мы предлагаем переименовать ген yicM в nepl ("nucleoside efflux permease - inosine").

Выводы

1. Идентифицированы гены yijE и ydeD, которые при амплификациии повышают устойчивость клеток Е. coli к аналогу аденина 8-азааденипу. Показано, что сверхэкспрессия гена rhtA также повышает устойчивость клеток к этому соединению. Кроме того, сверхэкспрессия генов yijE, ydeD и rhtA увеличивает продукцию инозина соответствующим штаммом-продуцентом Е. coli.

2. Идентифицирован ген yicM (nepl), принадлежащий к над семейству транспортных белков MFS, сверхэкспрессия которого повышает, а инактивация - понижает устойчивость клеток Е. coli к пуриновым рибонуклеозидам. Определены точки начала транскрипции и трансляции этого гена.

3. Сверхэкспрессия гена yicM (nepl) снижает скорость роста клеток Е. coli на минимальной среде, содержащей пуриновые рибонуклеозиды в качестве единственного источника углерода и энергии, а также ведет к накоплению инозина в культуральной среде штаммом TGldeoD, дефектным по пурин нуклеозидфосфорилазе. Кроме того, сверхэкспрессия гена yicM (nepl) снижает индукцию промотора deoP3 пуриновыми рибонуклеозидами.

4. Показано, что сверхэкспрессия гена yicM (nepl) повышает скорость накопления инозина клетками штамма-продуцента Е. coli, причем это накопление зависит от трансмембранного потенциала. Также показано, что сверхэкспрессия гена yicM (nepl) повышает продуктивность штамма-продуцента инозина £. coli.

5. Экспрессия гена yicM (nepl) под контролем соответсвующих регуляторных элементов в клетках Bacillus amyloliquefaciens повышает накопление инозина и гуаиозина штаммом-продуцентом Bacillus amyloliquefaciens AJ1991.

6. Исследование регуляции гена yicM (nepl) показало, что его экспрессия:

• возрастает при переходе клеток в стационарную фазу роста;

• слабо зависит от аллельного состояния гена rpoS, кодирующего as-субъединицу РНК-иояимеразы;

• выше на минимальной среде М9, чем на богатой среде LB;

• репрессируется в условиях теплового шока и индуцируется при осмотическом шоке;

• не индуцируется пуриновыми рибонуклеозидами и основаниями.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Gronskiy S.V., Zakataeva N.P., Vitushkina M.V., Ptitsyn L.R., Altmaii I.B., Novikova A.E., Livshits V.A. 2005. "The yicM (nepl) gene of Escherichia coli encodes a major facilitator superfamily protein involved in efflux of purine ribonucleosides". FEMS Microbiol Lett. V. 250. P.39-47.

2. Лившиц B.A., Закатаева Н.П., Алешин B.B., Гронский С.В., Кугукова Е.А. 2004. "Транспорт метаболитов из клеток бактерий: гены и белки, их свойства и применение в биотехнологии". Тезисы доклада III конференции ВОГИС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития", Москва, стр. 341.

3 Закатаева Н П, Лившиц В.А, Гронский С.В. "Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм Escherichia coli - продуцент инозина". Патент РФ №2244003 от 10.01.2005, дата приоритета 21.02.2002.

4. Гронский С.В., Закатаева Н.П., Лившиц В.А. "Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм Escherichia coli - продуцент инозина". Патент РФ №2244004 от 10.01.2005, дата приоритета 21.02.2002.

5. Лившиц В.А., Закатаева Н.П., Гронский С.В., Витупгкина М.В., Новикова А.Е. "Способ получения пуриновых нуклеозидов и нуклеотидов, штамм - продуцент пуриновых нуклеозидов (варианты)". Патент РФ №2239656 от 10.11.2004, дата приоритета 24.01.2002.

6. Закатаева Н.П, Гронский С.В., Витушкина М.В., Лившиц В.А. "Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты методом ферментации с использованием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia". Патентная заявка РФ №2003126890, дата публикации 03.10.2005, дата приоритета 03 09.2003.

к исполнению 18/01/2006 Исполнено 19/01/2006

Заказ № 30 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095)747-64-70 www autoreferat.ru

2435

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гронский, Сергей Викторович

Введение

Актуальность проблемы

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая ценность работы

Структура и объем работы

Апробация работы

Обзор литературы

1. Синтез иурпновых иуклеотидов у Escherichia coli

1.1. Синтез пурииовых нуклеотидов de novo

1.2. Взаимопревращения пуриновых нуклеотидов

1.3. salvage путь биосинтеза пуриновых иуклеотидов

2. Бактериальная цитоплазматичеекая мембрана и мембранные белки

2.1. Строение и функции цитоплазматической мембраны

2.2. Мембранные белки

2.2.1. Пространственная структура мембранных белков

2.2.2. Функции мембранных белков

2.3. Перенос различных веществ через цитоплазматическую мембрану и транспортные белки

2.3.1. Виды транспорта

2.3.1.1.Простая и облегченная диффузия

2.3.1.2.Первичные активные транспортеры

2.3.1.3.Вторичные активные транспортеры

2.3.1.4.Трапспортные системы с транслокацией группы

2.3.2. Классификация транспортных белков

3. Транспорт предшественников нуклеиновых кислот в клетку Escherichia

3.1. Транспорт через внешнюю мембрану

3.2. Транспорт нуклеозидов через цитоплазматическую мембрану

3.2.1. Системы транспорта нуклеозидов в клетку

3.2.2. Регуляция транспорта нуклеозидов

3.2.3. Источники энергии для транспорта нуклеозидов

3.3. Транспорт оснований

4. Экскреция различных веществ из клеток бактерий

4.1. Системы множественной лекарственной устойчивости - MDR транспортеры у Escherichia coli

4.1.1. Классификация MDR транспортеров 4.1.2. Системы экспорта антимикробных агентов

• 4.1.3. Регуляция экспрессии MDR транспортеров

4.1.3.1. Локальные регуляторы

4.1.3.2. Двухкомпонептные регуляториые системы 49 4.1.3.2. Глобальные регуляторы

4.2. Экскреция аминокислот из клеток бактерий

4.2.1. Экскреция аминокислот у Corynebacterium glutamicum

4.2.2. Экскреция аминокислот у Escherichia coli

4.3. Экскреция углеводов у Escherichia coli

4.4. Экскреция производных пуринов и пиримидинов 66 ® 4.4.1. Экскреция пуриновых производных у Bacillus subtilis

4.4.2. Накопление клетками Escherichia coli продуктов деградации нуклеиновых кислот

Материалы и методы

1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды, олигонуклеотиды и среды

2. Методы работы с ДНК

3. Проведение полимеразпой цепных реакций (ПЦР)

4. Определение точки начала транскрипции

5. Трансформация, транедукция, электротрансформация и интеграция в хромосому Е. coli

6. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) 78 ^ 7. Трансформация штамма Bacillus subtilis 168 и транедукция фагом Е

8. Определение скорости экскреции инозина

9. Проведение ферментации в пробирках со штаммами-продуцентами Е. coli

10. Проведение ферментации в пробирках со штаммом-продуцентом Bacillus amyloliquefaciens AJ

11. Определение активности р-галактозидазы 82 Результаты и обсуждение 83 1. Поиск и идентификации генов, амплификация которых обеспечивает устойчивость Е. coli к аналогам пуриновых оснований

1.1. Идентификация генов ydeD и yijE, обеспечивающих устойчивость к 8-азааденину

1.2. Влияние амплификации генов ydeD, yijE и rhtA на устойчивость клеток

Е. coli к 8-азааденину и продукцию инозина соответствующим штаммом- 85 продуцентом

1.3. Влияние амплификации генов ydeD, yijE и rhtA на продукцию инозина штаммом-продуцентом Е. coli

2. Идентификация гена yicM и компьютерный анализ кодируемого им белка

2.1. Поиск генов Е. coli, амплификация которых обеспечивает устойчивость к инозину и/или гуанозину штамма GS

2.2. Определение сайтов инициации транскрипции и трансляции гена yicM

2.3. YicM - мембранный белок, относящийся к MFS транспортерам

3. Исследование участия YicM в экскреции нурнповых пуклеозндов из клеток Е. coli

3.1. Влияние инактивации и сверхэкспрессии гена yicM па устойчивость клеток Е. coli к пуриновым нуклеозидам и аналогам

3.2. Сверхэкспрессия гена yicM снижает скорость роста Е. coli на минимальных средах, содержащих пуриповые рибонуклеозиды в качестве единственных источников углерода и энергии

3.3. Сверхэкспрессия гена yicM приводит к накоплению инозина в культуралыюй среде штаммом Е. coli с инактивированной пурин нуклеозидфосфорилазой

3.4. Сверхпродукция YicM снижает индукцию внутреннего промотора deoP3 оиерона deoCABD пуриновыми нуклеозидами

3.5. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на скорость экскреции инозина из клеток Е. coli и зависимость этой экскреции от присутствия протопофора карбонилцианида-т-хлорфенилгидразона (СССР)

3.6. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на продукцию пуриповых производных штаммами-продуцентами Е. coli

3.7. Свсрхэкспрсссия yicM в клетках Bacillus amyloliquefaciens увеличивает накопление пуриновых пуклеозидов штаммом-продуцентом

4. Исследование регуляции экспрессии гена yicM

4.1. Влияние состава питательной среды на экспрессию гена yicM

4.2. Изучение влияния фазы роста на экспрессию гена yicM

4.3. Изучение влияния аллелыюго состояния гена rpoS на экспрессию гена

4.4. Изучение экспрессии гена yicM в условиях теплового и осмотического

4.5. Изучение влияния различных веществ на уровень экспрессии гена yicM 114 Заключение 116 Выводы 119 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и изучение генов, участвующих в транспортировке пуриновых производных из клеток Escherichia coli"

Актуальность проблемы. В последние годы появилось много работ по изучению транспорта различных веществ из клетки бактерий. Системы экскреции (эффлюкса) сообщают клеткам более высокий уровень устойчивости к различным токсичным веществам, таким как, например, антибиотики, детергенты, красители и др. (Li and Nikaido, 2004.). Также существует несколько работ, в которых охарактеризованы системы экспорта нормальных метаболитов, например, белок LysE отвечает за транспорт лизина из клеток Corynebacterium glutamicum (Vrljic et al., 1996), белок PbuE (YdhL) из Bacillus subtilis, вероятно, способен экскретировать пуриновые основания (Johansen et al., 2003). У Escherichia coli охарактеризовано несколько систем экскреции различных метаболитов: белок YdeA экскретирует сахар арабипозу (Bost et al., 1999), белок YdeD транспортирует различные метаболиты пути биосинтеза цистеииа (Dassler et al., 2000), белки RhtA, RhtB и RhtC способны экскретировать аминокислоты треонин и гомосерии (Zakataeva et al., 1999; Livshits et al., 2003). Физиологическая роль этих систем до конца не ясна, однако, они могут иметь большое значение при создании высокоактивных продуцентов различных биологически активных соединений. У эффективных продуцентов концентрация целевого продукта в среде может достигать очень больших значений, при этом увеличивается и концентрация продукта в клетке. В связи с этим, способность клетки экскретировать синтезируемый продукт в культуральную среду имеет большое значение. Увеличение внутриклеточной концентрации конечного продукта биосинтеза способно напрямую ингибировать активность ферментов пути биосинтеза, а также репрессировать гены и опероны, кодирующие эти ферменты. Более того, увеличение внутриклеточного пула целевого продукта может воздействовать па глобальные регуляторпые системы, осуществляющие общую перестройку метаболизма клетки под влиянием различных факторов, что может отрицательно сказываться на способности культуры продуцировать целевой продукт. Также повышение концентрации продукта в клетке способно активировать системы его деградации, что является нежелательным при конструировании высокоактивных штаммов-продуцентов. Кроме того, может наблюдаться ингибирование роста клеточной культуры связанное с тем, что сверхпродукция одного метаболита вызывает репрессию оперонов и/или ингибирование ферментов, участвующих в биосинтезе других соединений, необходимых клетке. В связи с вышесказанным, большое значение приобретают системы экскреции, способные снижать внутриклеточную концентрацию продукта сверхсинтеза, что в свою очередь способно увеличить конечный выход целевого продукта. Поиск и изучение генов, кодирующих транспортные системы, способные экскретировать различные метаболиты из клетки, является важной задачей, имеющей как научное, так и практическое значение. Гены, кодирующие эффлкжсные системы, могут быть использованы для увеличения накопления конечного продукта штаммами-продуцентами.

Известно, что при переходе в стационарную фазу роста Escherichia coli накапливает в среде продукты деградации нуклеиновых кислот (Rinas et al., 1995). По-видимому, должны существовать транспортные системы, способные экскретировать пуклеозиды и/или основания из клетки.

Цель н задачи работы. Диссертационная работа посвящена поиску и изучению генов Е. coli, участвующих в транспорте пуриповых производных из клетки, а также изучению возможности применения этих генов для повышения продукции нуклеозидов штаммами-продуцентами.

В процессе работы решались следующие задачи:

• найти и идентифицировать гены, амплификация которых повышает устойчивость штаммов Е. coli к аналогам пуриповых оснований, а также к пуриновым нуклеозидам инозину и гуанозину;

• определить точки начала транскрипции и трансляции обнаруженных генов, а также провести компьютерный анализ белков;

• исследовать влияние сверхэкспрессии и инактивации найденных генов на фенотип клетки, на экскрецию пуриповых производных из клетки и на продукцию пуриповых оснований и нуклеозидов соответствующими штаммами-продуцентами;

• экспериментально исследовать регуляцию обнаруженных генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе обнаружено, что сверхэкспрессия генов ydeD, yijE, rhtA и yicM обеспечивает устойчивость штаммов Е. coli к иигибирующим концентрациям аналогов пуриповых оснований. Амплификация генов ydeD, yijE и rhtA улучшает продукцию инозина штаммом-продуцентом.

Сверхэкспрессия гена yicM обеспечивает устойчивость к пуриновым нуклеозидам чувствительного к этим соединениям штамма Е. coli. Определены точки начала транскрипции и трансляции гена yicM. Получены различные данные, указывающие па участие белка YicM в экскреции пуриповых нуклеозидов из клетки, а также на зависимость этой экскреции от протон-движущей силы. Показано, что сверхэкспрессия yicM повышает накопление инозина штаммом-продуцентом. Исследовано влияние различных условий культивирования, возможных субстратов YicM, а также аллельного состояния гена rpoS на уровень экспрессии yicM.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Гронский, Сергей Викторович

Заключение

В последние годы были описаны системы, осуществляющие активный транспорт аминокислот и Сахаров из клетки Е. coli. В настоящей работе мы впервые идентифицировали и охарактеризовали гены, участвующие в экскреции производных нуклеиновых кислот.

Клонированы фрагменты хромосомы Е. coli, амплификация которых на фазмиде mini-Mud5005 придает клеткам устойчивость к аналогам пуриновых оснований. На этих фрагментах идентифицированы гены ydeD, yijE и yicM, отвечающие за фенотип устойчивости к аналогам пуринов. Эти гены кодируют мембранные белки, которые, очевидно, выводят токсичные соединения из клетки. Показано, что амплификация гена yicM придает устойчивость к инозину клеткам специально сконструированного штамма GS72, исходно чувствительного к этим соединениям.

Экспериментально установлены точки начала транскрипции и трансляции гена yicM. Определено, что белок YicM состоит из 396 аминокислотных остатков и имеет расчетную молекулярную массу 41.85 кДа. Поиск гомологов и компьютерный анализ гидрофобных свойств белка YicM показал, что он является трансмембраппым белком, относящимся к падсемейству MFS трапепортпых белков. Более того, охарактеризованные гомологи YicM осуществляют эффлюкс различных соединений (сахаров и пуриновых оснований) из клеток Е. coli и Bacillus subtilis.

Сверхэкспрессия гепа yicM значительно повышала устойчивость штамма GS72 к пуриновым нуклеозидам, особенно к ипозипу - более чем в 100 раз. В то же время инактивация yicM повышала чувствительность к этим соединениям. Это может свидетельствовать о том, что YicM является основной экспортной системой для пуриновых нуклеозидов. Кроме этого, сверхпродукция YicM незначительно повышала устойчивость Е. coli к аналогам пуриновых оснований, возможно, за счет эффлюкса соответствующих нуклеозидов, в которые эти аналоги превращаются внутри клетки. Также сверхэкспрессия yicM значительно замедляла рост штаммов Е. coli па минимальной среде, содержащей пуриновые рибонуклеозиды в качестве единственных источников углерода и энергии. Этот эффект также можно объяснить повышенной экскрецией этих соединений из клетки. Удивительным оказалось то, что штаммы со сверхэкспрессией yicM росли с нормальной скоростью на минимальной среде с пуриновыми дезоксирибопуклеозидами в качестве единственных источников углерода и энергии. Вероятно, пуриновые дезоксирибопуклеозиды не являются субстратами YicM транспортера, хотя структурно они очень похожи на рибонуклеозиды. Также мы показали, что опосредованная YicM повышенная экскреция, ведет к накоплению заметного количества инозина в культуральной среде клетками штамма Е. coli, дефектного по пурин нуклеозидфосфорилазе (deoD). При этом накопления других продуктов нам обнаружить не удалось. Возможно, именно инозин является основным субстратом транспортера YicM.

Сверхпродукция YicM снижает внутриклеточную концентрацию пуриновых рибопуклеозидов, о чем свидетельствуют опыты с индукцией промотора deoP3 этими соединениями. Экзогенные пуриновые рибонуклеозиды индуцируют экспрессию с этого промотора, при этом сверхэкспрессия yicM значительно снижает индукцию, что, очевидно, связано с уменьшением накопления нуклеозидов в клетке.

При исследовании кинетики накопления инозина в среде клетками штамма-продуцента было установлено, что амплификация yicM гена заметно повышает скорость накопления этого соединения. Добавление к продуцирующим клеткам протонного иопофора в концентрации, не влияющей па рост культуры, приводит к полному прекращению выброса инозина в среду. Очевидно, YicM осуществляет экскрецию пуриновых нуклеозидов по механизму вторичного транспорта и зависит от энергии электрохимического градиента.

Сверхэкспрессия yicM в клетках штамма-продуцента инозина заметно повышает его продуктивность. Таким образом, повышение уровня экспрессии гена yicM может иметь важное практическое значение. В то же время, сверхпродукция YicM не увеличивала продукцию гипоксантина и ксантозина. Вероятно, эти соединения не транспортируются белком YicM.

Также мы показали, что экспрессия гена yicM под контролем соответствующих регуляторных элементов в клетках Bacillus amyloliquefaciens повышает накопление инозина и гуанозина штаммом-продуцентом Bacillus amyloliquefaciens AJ1991. Это является важным доказательством того, что YicM непосредственно участвует в транспорте, а не выполняет регуляторпую функцию.

Хотя гомолог белка YicM у Bacillus subtilis, транспортер PbuE, осуществляет экскрецию пуриновых оснований, YicM, по-видимому, не способен транспортировать эти соединения. Его сверхпродукция лишь незначительно увеличивает устойчивость к аналогам пуриновых оснований. Также, сверхэкспрессия yicM не влияет на продукцию гипоксантина соответствующим штаммом-продуцентом и, более того, ведет к двукратному снижению накоплению гипоксантина, как побочного продукта, штаммом-продуцентом инозина.

Экспериментальное изучение регуляции гена yicM показало, что его экспрессия в первую очередь зависит от физиологического состояния клетки. Экспрессия yicM повышалась при переходе клетки в стационарную фазу роста и снижалась при инактивации гена rpoS, кодирующего с5-субъединицу РНК-полимеразы. Мы показали, что экспрессия гена yicM выше при росте на минимальной среде, чем при росте на богатой среде. Также было показано, что экспрессия yicM изменяется при тепловом и осмотическом шоках. Важно отметить и то, что экспрессия гена yicM не индуцируется транспортируемыми соединениями - пуриновыми рибопуклеозидами.

Основываясь па представленных выше данных, которые показывают, что геп yicM кодирует мембранный белок YicM, участвующий в экскреции пуриновых рибонуклеозидов, в первую очередь инозина, мы предлагаем переименовать геи yicM в nepl ("nucleoside efflux permease - inosine").

Идентифицированы гены yijE и ydeD, которые при амплификациии повышают устойчивость клеток Е. coli к аналогу аденина 8-азааденину. Показано, что сверхэкспрессия гена rhtA также повышает устойчивость клеток к этому соединению. Кроме того, сверхэкспрессия генов yijE, ydeD и rhtA увеличивает продукцию инозина штаммом-продуцентом Е. coli.

Идентифицирован геи yicM (nepl), принадлежащий к надсемейству транспортных белков MFS, сверхэкспрессия которого повышает, а инактивация - понижает устойчивость клеток Е. coli к пуриновым рибонуклеозидам. Определены точки начала транскрипции и трансляции этого гена.

Сверхэкспрессия гена yicM (пер Г) снижает скорость роста клеток Е. coli на минимальной среде, содержащей пуриновые рибонуклеозиды в качестве единственного источника углерода и энергии, а также ведет к накоплению инозина в культуральиой среде штаммом TGIdeoD, дефектным по пурин нуклеозидфосфорилазе. Кроме того, сверхэкспрессия гена yicM (nepl) снижает индукцию промотора deoP3 пуриновыми рибонуклеозидами.

Показано, что сверхэкспрессия гена yicM (nepl) повышает скорость накопления инозина клетками штамма-продуцента Е. coli, причем это накопление зависит от трансмембранного потенциала. Также показано, что сверхэкспрессия гена yicM {nepl) повышает продуктивность штамма-продуцента инозина Е. coli. Экспрессия гена yicM {nepl) под контролем соответсвующих регуляторных элементов в клетках Bacillus amyloliquefacie ns повышает накопление инозина и гуанозина штаммом-продуцентом Bacillus amyloliquefaciens AJ1991. Исследование регуляции генаyicM(nepl) показало, что его экспрессия:

• возрастает при переходе клеток в стационарную фазу роста;

• слабо зависит от аллельного состояния гена rpoS, кодирующего as-субъедииицу РНК-полимеразы;

• выше на минимальной среде М9, чем на богатой среде LB;

• репрессируется в условиях теплового шока и индуцируется при осмотическом шоке;

• не индуцируется пуриновыми рибонуклеозидами и основаниями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гронский, Сергей Викторович, Москва

1. Закатаева Н.П. 1997. Исследование плейотроппой мутации устойчивости к гомосерииу и треонину у Escherichia coli К-12. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. Мир.

3. Миллер Д. 1976. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва. Мир.

4. Тараканов Б.В., Яковлева А.А., Николичева Т.А., Комкова Н.М., Маиухииа А.И., Алешин В.В. 2004. Экспрессионный вектор pLF22 для молочнокислых бактерий. Микробиология. N. 73, с.211-217.

5. Трошип П.В. 2002. Идентификация и изучение генов Escherichia coli, участвующих в экскреции гомосерипа и треонина. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

6. Alekshun M.N., Levy S.B. 1997. Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance: the mar regulon. Antimicrob. Agents Chemother. V. 41, p.2067-2075.

7. Alekshun M.N., Levy S.B. 1999. Alteration of the repressor activity of MarR, the negative regulator of the Escherichia coli marRAB locus, by multiple chemicals in vitro. J. Bacteriol. V. 181, p.4669-4672.

8. Aleshin V.V., Zakataeva N.P., Livshits V.A. 1999. A new family of amino-acid-efflux proteins. Trends Biochem. Sci. V. 24, p. 133-135.

9. Andersen P.S., Frees D., Fast., Mygind B. 1995. Uracil uptake in Escherichia coli K-12: isolation of uraA mutants and cloning of the gene. J. Bacteriol. V. 177, p.2008-2013.

10. Aono R., Tsukagoshi N., Yamamoto M. 1998. Involvement of outer membrane protein TolC, a possible member of the mar-sox regulon, in maintenance and improvement of organic solvent tolerance of Escherichia coli К12. J. Bacteriol. V. 180, p.938-944.

11. Baldwin S.A., Henderson P.J.F. 1989. Homologies between sugar transporters from eukaryotes and prokaryotes. Annu. Rev. Physiol. V. 51, p.459-471.

12. Barbosa T.M., Levy S.B. 2002. Activation of the Escherichia coli nfnB gene by MarA through a highly divergent marbox in a class II promoter. Mol. Microbiol. V. 45, p. 191-202.

13. Bassilana M., Damiano-Forano E., Leblanc G. 1985. Effect of membrane potential on the kinetic parameters of the Na+ or H+ melibiose symporter in Escherichia coli membrane vesicles. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 129, p.626-631.

14. Bellmann A., Vrljic M., Patek M., Sahm H., Kramer R., Eggeling L. 2001. Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum. Microbiol. V. 147, p.1765-1774.

15. Benz R., Schmid A., Maier C., Bremer E. 1988. Characterization of the nucleoside-binding site inside the Tsx channel of Escherichia coli outer membrane. Reconstitution experiments with lipid bilayer membranes. Eur. J. Biochem. V. 176, p.699-705.

16. Blake R., Hager L.P., Gennis R.B. 1978. Activation of pyruvate oxidase by monomeric and micellar amphiphilcs. 1978. J. Biol. Chem. V. 253, p.1963-1971.

17. Bohn C., Bouloc P. 1998. The Escherichia coli cmlA gene encodes the multidrug efflux pump Cmr/MdfA and is responsible for isopropyl-P-D-thiogalactopyranoside exclusion and spectinomycin sensitivity. J. Bacteriol. V. 180, p.6072-6075.

18. Bradbeer C. 1993. The proton motive force drives the outer membrane transport of cobalamin in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 175, p.3146-3150.

19. Bremer E., Middendorf A., Martinussen J., Valentin-Hansen P. 1990. Analysis of the tsx gene, which encodcs a nucleoside-speeific channel-forming protein (Tsx) in the outer membrane of Escherichia coli. Gene. V. 96, p.59-65.

20. Brown M.H., Paulsen I.Т., Skurray R.A. 1999. The multidrug afflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters. Mol. Microbiol. V. 31, p.394-395.

21. Buchel D.B., Erni B. 1980. Sequence of the lactose permease gene. Nature. V. 283, p.541-545.

22. Buhr A., Erni B. 1993. Membrane topology of glucosc transporter of Escherichia coli. J. Biol. Chem. V. 268, p.l 1599-11603.

23. Burton К. 1983. Transport of nucleic acid bases into Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. V. 129, p.3505-35I3.

24. Burton K. 1994. Adenine transport in Escherichia coli. Proc. R. Soc. Lond. Ser. B. Biol. Sci. V. 255, p.153-157.

25. Busch W., Saier M.H. Jr. 2002. The Transporter classification (TC) system, 2002. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. V. 37. p.287-337.

26. Busch W., Saier M.H. Jr.; International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). 2004. The IUBMB-endorsed transporter classification system. Mol. Biotechnol. V. 27, p.253-262.

27. Carole S., Pichoff S., Bouche J.P. 1999. Escherichia coli gene ydeA encodes a Major Facilitator Pump which export L-arabinose and isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside. J. Bacteriol. V. 181, p.5123-5125.

28. Casadaban M.J., Cohen S.N. 1979. Lactose genes fused to exogenous promoters in one step using a Mu-lac bacteriphage: in vivo probe for transcriptional control sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 76, p.4530-4533.

29. Christoserdov A .Y., Tsygankov Y .D. 1986. Broad host range vectors derived from an RSF1010::Tnl plasmid. Plasmid. V. 16, p.161-167.

30. Chopra I. 1986. Genetic and biochemical basis of tetracycline resistance. J. Antimicrob. Chemother. 18 Suppl. C:51-56.

31. Chung Y.J., Saier M.I I. Jr. 2001. SMR-type multidrug resistance pumps. Curr. Opin. Drug. Discov. Devel. V. 4, p.237-245.

32. Chung Y.J., Saier M.H. Jr. 2002. Overexpression of the Escherichia coli sugE gene confers resistance to a narrow range of quaternary ammonium compounds. J. Bacteriol. V. 184, p.2543-2545.

33. Cohen L., Kaplan R. 1977. Accumulation of nucleosides by starved Escherichia coli cells as a probe for the involvement of ribonucleases in ribonucleic acid degradation. J. Bacteriol. V. 129, p.651-657.

34. Craig J.E., Zhang Y., Gallagher M.P. 1994. Cloning of the nupC gene of Escherichia coli encoding a nucleoside transport system, and identification of an adjacent insertion element, IS 186. Mol. Microbiol. V. 11, p.l 159-1168.

35. Cruz-Ramos H., Cook G.M., Wu G., Cleeter M.W., Poole R.K. 2004. Membrane topology and mutational analysis of Escherichia coli CydDC, an ABC-type cysteine exporter required for cytochrome assembly. Microbiol. V. 150, p.3415-3427.

36. Danielsen S., Boyd D., Neuhard J. 1995. Membrane topology analysis of the Escherichia coli cytosine permease. Microbiol. V. 141, p.2905-2913.

37. Danielsen S., Kilstrup M., Barilla K., Jochimsen В., Neuhard J. 1992. Characterization of the Escherichia coli codBA operon encoding cytosine permease and cytosine deaminase. Mol. Microbiol. V. 6, p. 1335-1344.

38. Dassler Т., Maier Т., Winterhalter C., Bock A. 2000. Identification of a major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cysteine pathway. Mol. Microbiol. V. 36, p.l 101-1112.

39. Datsenko K.A., Wanner B.L. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 97, p.6640-6645.

40. Delihas N., Forst S. 2001. MicF\ an antisense RNA gene involved in response of Escherichia coli to global stress factors. J. Mol. Biol. V. 313, p.1-12.

41. Deo S.S., Tseng W.C., Saini R., Coles R.S., Athvval R.S. 1985. purification and characterization of Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase produced by plasmid pSV2gpt. Biochim. Biophys. Acta. V. 839, p.233-239.

42. Doskocil J. 1974. Inducible nucleoside permease in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 56, p.997-1003.

43. Eckert В., Beck C.F. 1989. Overproduction of transposon Tn/0-encoded tetracycline resistance protein results in cell death and loss of membrane potential. J. Bacterid. V. 171, p.3557-3559.

44. Edgar R., Bibi E. 1997. MdfA, an Escherichia coli multidrug resistance protein with an extraordinarily broad spectrum of drug recognition. J. Bacteriol. V. 179, p.2274-2280.

45. Eisele J.-L., Rosenbusch J.P. 1989. Crystallization of porin using short chain phospholipids. J. Molec. Biol. V. 206, p. 209-212.

46. Elkins C.A., Nikaido H. 2002. Substrate specificity of the RND-type multidrug efflux pumps AcrB and AcrD of Escherichia coli is determined predominantly by two large periplasmic loops. J. Bacteriol. V. 184, p.6490-6498.

47. Fath M.J., Kolter R. 1993. ABC transporters: bacterial exporters. Microbiol. Rev. V. 57, p.995-1017.

48. Fralick J.A. 1996. Evidence that tolC is required for functioning of the mar/acrAB efflux pump of Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 178, p.5803-5805.

49. Franke I., Resch A., Dassler Т., Maier Т., Bock A. 2003. YfiK from Escherichia coli promotes export of O-acetylserine and cysteine. J. Bacteriol. V. 185, p.l 161-1166.

50. Froshauer S., Green G.N., Boyd D., McGovern K., Beckwith J. 1988. Genetic analysis of the membrane insertion and topology of MalF, a cytoplasmic membrane protein of Escherichia coli. J. Mol. Biol. V. 200, p.501-511.

51. Furukawa H., Tsay J.T., Jackowski S., Takamura Y., Rock C.O. 1993. Thiolactomycin resistance in Escherichia coli is associated with the multidrug resistance efflux pump encoded by emrAB. J. Bacteriol. V. 175, p.3723-3729.

52. Gilbert H.J., Lowe C.R., Drabble W.T. 1979. Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase of Escherichia coli. Purification by affinity chromatography, subunit structure and inhibition by guanosine 5'-monophosphate. Biochem. J. V. 183, p.481-489.

53. Gillette W.K., Martin R.G., Rosner J.L. 2000. Probing the Escherichia coli transcriptional activator MarA with alanine-scanning mutagenesis: residues important for DNA binding and activation. J. Mol. Biol. V. 299, p.1245-1255.

54. Girons I.S., Gilles A.M., Margarita D., Michelson S., Monnot M., Fermandjian S., Danchin A., Barzu O. 1987. Structural and catalytic characteristic of Escherichia coli adenylate kinase. J. Biol. Chem. V. 262, p.622-629.

55. Goldrick D., Yu G.-Q., Jiang S.-Q., hong J.-S. 1988. Nucleotide sequence and transcriptional start point of the phosphoglycerate transporter of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. V. 170, p.3421-3426.

56. Gorter E., Grendel F. 1925. On biomolecular layers of lipid on the chromacytes of the blood. J. Exp. Med. V. 41, p.439-443.

57. Gott P., Boos W. 1988. The transmembrane topology of the 577-glycerol-3-phosphate permease of Escherichia coli analysed by phoA and lacZ protein fusions. Mol. Microbiol. V. 2, p.655-663.

58. Grkovic S., Brown M.IL, Skurray R.A. 2002. Regulation of bacterial drug export systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. V. 66, p.671-701.

59. Groisman E.A., Casadaban M.J. 1986. Mini-mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing. J. Bacteriol. V. 168, p.357-364.

60. Grosse C., Grass G., Anton A., Franke S., Santos A.N., Lawley В., Brown N.L., Nies D.H. 1999. Transcriptional organization of the czc heavy-metal homeostasis determinant from Alcaligenes eutrophus. J. Bacteriol. V. 181, p.2385-2393.

61. Guyer M.S., Reed R.E., Steitz Т., Low, K.B. 1981. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. V. 45, p.135-140.

62. He В., Choi K.Y., Zalkin H. 1993. Regulation of Escherichia coli glnB, prsA and speA by the purine repressor. J. Bacteriol. V. 175, p.3598-3606.

63. He В., Zalkin H. 1993. Regulation of Escherichia coli pur A by purine repressor, one component of a dual control mechanism. J. Bacteriol. V. 176, p.1009-1013.

64. Heller K.B., Lin E.C., Wilson Т.Н. 1980. Substrate specificity and transport properties of the glycerol facilitator of Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 144, p.274-278.

65. Hershey H.V., Taylor M.W. 1986. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Escherichia coli adenine phosphoribosyltransferase and comparison with other analogous enzymes. Gene. V. 43, p.287-293.

66. Higgins C.F. 2001. ABC transporters: physiology, structure and mechanism: an overview. Res. Microbiol. V. 152, p.205-210.

67. Higgins C.F., Ames G.E. 1981. Two periplasmic transport proteins which interact with a common membrane receptor show extensive homology: complete nucleotide sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 78, p.6038-6042.

68. Higgins C.F., Haag P.D., Nikaido K., Ardeshir G., Garcia G., Ames G.F.-L. 1982. Complete nucleotide sequence and identification of membrane components of the histidine transport operon of S. typhimurium. Nature. V. 298, p.723-727.

69. Hinrichs W., Kisker C., Duvel M., Muller A., Tovar K., Hillen W., Saenger W. 1994. Structure of the Tet repressor-tetracycline complex and regulation of antibiotic resistance. Science. V. 264, p.418-420.

70. Hochstadt J. 1978. Adenine phosphoribosyltransferase from Escherichia coli. Methods Enzymol. V. 51, p.558-567.

71. Hou Z., Cashel M., Fromm H.J., Honzatko R.B. 1999. Effectors of the stringent response target the active site of Escherichia coli adenylosuccinate synthetase. J. Biol. Chem. V. 274, p.17505-17510.

72. Hove-Jensen В., Harlow K.W., King С.J., Switzer R.L. 1986. Phosphoribosylpyrophosphate synthetase of Escherichia coli. Properties of the purified enzyme and primary structure of the prs gene. J. Biol. Chem. V. 261, p.6765-6771.

73. Hove-Jensen В., Nygaard P. 1982. Phosphoribosylpyrophosphate synthetase of Escherichia coli. Identification of a mutant enzyme. Eur. J. Biochem. V. 126, p.327-332.

74. Hove-Jensen В., Nygaard P. 1989. Role of guanosine kinase in the utilization of guanosine for nucleotide synthesis in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. V. 135, p.1263-1273.

75. Ichikawa J.K., Li C., Fu J., Clarke, S. 1994. A gene at 59 minutes on the Escherichia coli chromosome encodes a lipoprotein with unusual amino acid repeat sequences. J. Bacteriol. V. 176, p. 1630-1638.

76. Island M.D., Wei B.-Y., Kadner R.J. 1992. Structure and function of the uhp genes for the sugar transport in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. V. 174, p.2754-2762.

77. Johansen L.E., Nygaard P., Lassen C., Agerso Y., Saxild H. 2003. Definition of a second Bacillus subtilis pur regulon comprising the pur and xpt-pbuX operons plus pbuG, nupG (yxiA), andpbuE (ydhL). J. Bacteriol. V. 185, p.5200-5209.

78. Jorgensen C., Dandanell G. 1999. Isolation and characterization of mutations in the Escherichia coli regulatory protein XapR. J. Bacteriol. V. 181, p.4397-4403.

79. Kadner R.J. 1990. Vitamin B12 transport in Escherichia coli: energy coupling between membranes. Mol. Microbiol. V. 4, p.2027-2033.

80. Kerppola R.E., Ames G.F.-L. 1992. Topology of the hydrophobic membrane-bound components of the histidine periplasmic permease. Comparison with other members of the family. J. Biol. Chem. V. 267, p.2329-2336.

81. Kawamura-Sato К., Shibayama К., Horii Т., Iimuma Y., Arakawa Y., OhtaM. 1999. Role of multiple afflux pumps in Escherichia coli in indole expulsion. FEMS Microbiol Lett. V. 179, p.345-352.

82. Kennerknecht N. Sahm H., Yen M.-R., Patek M., Saier M.H. Jr., Eggeling L. 2002. Export of L-isoIeucine from Corynebacterium glutamicum: a two-gene-encoded member of a new translocator family. J. Bacteriol. V. 184, p.3947-3956.

83. Kerr K.M., Cahoon M., Bosco D.A., Hedstorm L. 2000. Monovalent cation activation in Escherichia coli inosine 5'-monophosphate dehydrogenase. Arch. Biochem. Biophys. V. 375, p.131-137.

84. Kessler A.I., Gost J.S. 1985. Regulation of guaC expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 164, p. 1288-1293.

85. Kilstrup M., Meng L.M., Neuhard J., Nygaard P. 1989. Genetic evidence for a repressor of synthesis of cytosine deaminase and purine biosynthesis enzymes in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 171, p.2124-2127.

86. Kobayashi N., Nishino K., Yamaguchi A. 2001. Novel macrolide-specific ABC-type efflux system in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 183, p.5639-44

87. Komatsu Y. 1971. Mechanism of action of showdomycin. IV. Interactions between the mcchanisms for transport of showdomycin and of various nucleosides in Escherichia coli. Agric. Biol. Chem. V. 35, p.1328-1339.

88. Komatsu Y. 1981. A highly showdomycin-resistant mutant of Escherichia coli K-12 with altered nucleoside transport characteristics. Agric. Biol. Chem. V. 45, p.619-628.

89. Komatsu Y., Tanaka K. 1970. Mechanism of action of showdomycin. II. Effect of showdomycin on the synthesis of deoxyribonucleic acid in Escherichia coli. Agric. Biol. Chem. V. 34, p.891-899.

90. Koronakis V., Eswaran J., Hughes C. 2004. Structure and function of TolC: the bacterial exit duct for proteins and drugs. Annu. Rev. Biochem. V. 73, p.467-489.

91. Koronakis V., Li J., Koronakis E., Stauffer K. 1997. Structure of TolC, the outer membrane component of the bacterial type I efflux system, derived from two-dimensional crystals. Mol. Microbiol. V. 23, p.617-626.

92. Koszalka G.W., Vanhooke J., Short S.A., Hall W.W. 1988. Purification and properties of inosine-guanosine phosphorylase from Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 170, p.3493-3498.

93. Kyte J., Doolittle R.F. 1982. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. V. 157, p.105-132.

94. Leung H.B., Schramm V.L. 1980. Adenylate degradation in Escherichia coli. The role of AMP nucleosidase and properties of the purified enzyme. J. Biol. Chem. V. 255, p. 10867-10874.

95. Levine R.A., Taylor M.W. 1981. Selection for purine regulatory mutants in an E. coli hypoxanthine phosphoribosyltransferase-guanine phosphoribosyl-transferase double mutant. Mol. Gen. Genet. V. 181, p.313-318.

96. Levy S.B. 1992. Active efflux mechanisms for antimicrobial resistance. Antimicrob. Agents Chemother. V. 36, p.695-703.

97. Levy S.B., McMurry L. 1978. Plasmid-determined tetracycline resistance involves new transport systems for tetracycline. Nature. V. 276, p.90-92.

98. Li H., Park J.T. 1999. The periplasmic murein peptide-binding protein MppA is a negative regulator of multiple antibiotic resistance in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 181, p.4842-4847.

99. Li X.Z., Nikaido H. 2004. Efflux-mediated drug resistance in bacteria. Drugs. V. 64, p. 159204.

100. Liu J.Y., Miller P.F., Gosink M., Olson E.R. 1999. The identification of a new family of sugar efflux pumps in Escherichia coli. Mol. Microbiol. V. 31, p. 1845-1851.

101. Livshits V.A., Doroshenko V.G., Mashko C.V., Akhverdyan V.Z., Kozlov Y.I. 2001. Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing amino acid. Ajinomoto Co., Ltd. European patent 1149911A2. October 31 2001.

102. Livshits V.A., Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Vitushkina M.V. 2003. Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli. Res. Microbiol. V. 154, p.123-135.

103. Lomovskaya O., Lewis K. 1992. Emr, an Escherichia coli locus for multidrug resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 89, p.8938-8942.

104. Lomovskaya O., Lewis K., Matin A. 1995. EmrR is a negative regulator of the Escherichia coli multidrug resistance pump EmrAB. J. Bacteriol. V. 177, p.2328-2334.

105. Ma D., Alberti M., Lynch C., Nikaido H., Hearst J.E. 1996. The local repressor AcrR plays a modulation role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals. Mol. Microbiol. V. 19, p.101-112.

106. Ma D., Cook D.N., Alberti M., Pon N.G., Nikaido H., Hearst J.E. 1993. Molecular cloning and characterization of acrA and acrE genes of Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 175, p.6299-6313.

107. Ma D., Cook D.N., Hearst J.E., Nikaido H. 1994. Efflux pumps and drug resistance in gram-negative bacteria. Trends Microbiol. V. 2, p.489-493.

108. Maier С., Bremer E., Sehmid A., Benz R. 1988. Pore-forming activity of the Tsx protein from the outer membrane of Escherichia coli. Demonstration of a nucleoside-specific binding site. J. Biol. Chem. V. 263, p.2493-2499.

109. MaIoney P.C., Ambudkar S.V., Anatharam V., Sonna L.A., Varadhachry A. 1990. Anion-exchange mechanisms in bacteria. Microbiol. Rev. V. 54, p. 1-17.

110. Martin R.G., Gillette W.K., Martin N.I., Rosner J.L. 2002. Complex formation between activator and RNA polymerase as the basis for transcriptional activation by MarA and SoxS in Escherichia coli. Mol. Microbiol. V. 43, p.355-370.

111. Martin R.G., Rosner J.L. 1995. Binding of purified multiple antibiotic-resistance repressor protein (MarR) to mar operator sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 92, p.5456-5460.

112. Martin R.G., Rosner J.L. 1997. Fis, an accessorial factor for transcriptional activation of the mar (multiple antibiotic resistance) promoter of Escherichia coli in the presence of the activator MarA, SoxS, or Rob. J. Bacteriol. V. 179, p.7410-7419.

113. Martin R.G., Rosner J.L. 2001. The AraC transcriptional activators. Curr. Opin. Microbiol. V. 4, p.132-137.

114. Matsui H., Kawasaki II., Shimaoka M., Kurahashi, O. 2001. Investigation of various genotype characteristics for inosine accumulation in Escherichia coli W3110. Biosci. Biotechnol. Biochem. V. 65, p.570-578.

115. Mazzariol A., Tokue Y., Kanegawa T.M., Cornaglia G., Nikaido H. 2000. High-level fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli overproduce multidrug efflux protein AcrA. Antimicrob. Agents Chemother. V. 44, p.3441-3443.

116. Meng L.M., Kilstrup M., Nygaard P. 1990. Autoregulation of purR repressor synthesis and involvement of purR in the regulation of purB, purC, purL, purMN and guaBA expression in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. V. 187, p.373-379.

117. Meng L.M., Nygaard P. 1990. Identification of hypoxanthine and guanine as the corepressors for purine regulon genes of Escherichia coli. Mol. Microbiol. V. 487, p.2187-2191.

118. Messenger L.J., Zalkin H. 1979. Glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase from Escherichia coli: purification and properties. J. Biol. Chem. V. 254, p.3382-3392.

119. Mine Т., Morita Y., Kataoka A., Mizushima Т., Tsuchiya T. 1998. Evidence for chloramphenicol/H+ antiport in Cmr (MdfA) system of Escherichia coli and properties of the antiporter. J Biochem (Tokyo). V. 124, p.187-193.

120. Moore K.E., Miura S. 1987. A small hydrophobic domain anchors leader peptidase to the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J. Biol. Chem. V. 262, p.8806-8813.

121. Morita Y., Kodama K., Shiota S., Mine Т., Kataoka A., Mizushima Т., Tsuchiya T. 1998. NorM, a putative multidrug efflux protein, of Vibrio parahaemolyticus and its homolog in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. V. 42, p. 1778-1782.

122. Morona R., Manning P.A., Reeves P. 1983. Identification and characterization of the TolC protein, an outer membrane protein from Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 153, p.693-699.

123. Munch-Petersen A., Jensen N. 1990. Analysis of the regulatory region of the Escherichia coli nupG gene, encoding a nucleoside-transport protein. Eur. J. Biochem. V. 190, p.547-551.

124. Munch-Pctersen A., Mygind B. 1976. Nucleoside transport systems in Escherichia coli K-12: Specificity and regulation. J. Cellular Physiol. V. 89, p.551-559.

125. Munch-Petersen A., Mygind B. 1983. Transport of nucleic acid precursors, p.259-305. In Munch-Petersen A. (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms. Academic Press, Inc., London.

126. Munch-Petersen A., Mygind В., Nicolaisen A., Pihl N.J. 1979. Nucleoside transport in cells and membrane vesicles from Escherichia coli K-12. J. Biol. Chem. V. 254, p.3730-3737.

127. Munch-Petersen A., Pihl N.J. 1980. Stimulatory effect of low ATP pools on transport of purine nucleosides in cells of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 77, p.2519-2523.

128. Murakami S., Nakashima R., Yamashita E., Yamaguchi A. 2002. Crystal structure of bacterial multidrug efflux transporter AcrB. Nature. V. 419, p.587-593.

129. Mygind В., Munch-Petersen A. 1975. Transport of pyrimidine nucleosides in cells of Escherichia coli K-12. Eur. J. Biochem. V. 59, p.365-372.

130. Nagakubo S., Nishino K., Hirata Т., Yamaguchi A. 2002. The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance of Escherichia coli via a novel multidrug exporter system, MdtABC. J. Bacteriol. V. 184, p.4161-4167.

131. Nakamura H. 1965. Gene-controlled resistance to acriflavine and others basic dyes in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 90, p.8-14.

132. Nandineni M.R., Gowrishankar J. 2004. Evidence for an arginine exporter encoded by yggA (argO) that is regulated by the LysR-type transcriptional regulator ArgP in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 186, p.3539-3546.

133. Naroditskaya V., Schlosser M.J., Fang N.Y., Lewis K. 1993. An E. coli gene emrD is involved in adaptation to low energy shock. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 196, p.803-809.

134. Nguyen T.N., Phan. Q.G., Duong L.P., Bertrand K.P., Lenski R.E. 1989. Effects of carriage expression of the Tn 10 tetracycline-resistance operon on the fitness of Escherichia coli K12. Mol. Biol. Evol. V.6, p.213-225.

135. Nikaido H. 1996. Mulyidrug efflux pumps of gran-negative bacteria. J. Bacteriol. V. 178, p.5853-5859.

136. Nikaido H. 1998. Antibiotic resistance caused by gram-negative miltidrug efflux pumps. Clin. Infect. Dis. 27 Supl. 1: S32-41.

137. Nilsen I.W., Bakke I., Vader A., Olsvik O., El-Gewely M.R. 1996. Isolation of cmr, a novel Escherichia coli chloramphenicol resistance gene encoding a putative efflux pump. J. Bacteriol. V. 176, p.3188-3193.

138. Nishino K., Yamaguchi A. 2001. Overexpression of the response regulator evgA of the two-component signal transduction system modulates multidrug resistance conferred by multidrug resistance transporters. J. Bacteriol. V. 183, p.1455-1458.

139. Nishino K., Yamaguchi A. 2001. Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 183, p.5803-5812.

140. Nishino K., Yamaguchi A. 2002. EvgA of the two-component signal transduction system modulates production of the yhiUV multidrug transporter in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 184, p.2319-2323.

141. Norholm M.H.H., Dandanell G. 2001. Specificity and topology of the Escherichia coli xanthosine permease, a representative of the NHS subfamily of the Major Facilitator Superfamily. J. Bactcriol. V. 183, p.4900-4904.

142. Nunoshiba Т., Hidalgo E., Amabile Cuevas C.F., Demple B. 1992. Two-stage control of oxidative stress regulon: the Escherichia coli SoxR protein triggers redox-inducible expression of the soxS regulatory gene. J. Bacteriol. V. 174, p.6054-6060.

143. Nygaard P. 1983. Utilization of preformed purine bases and nucleosides, p.27-93. In Munch-Petersen A. (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms. Academic Press, Inc., London.

144. Orth P., Schnappinger D., Hillen W., Saenger W., Hinrichs W. 2000. Structural basis of gene regulation by the tetracycline inducible Tet repressor-operator system. Nat. Struct. Biol. V. 7, p.215-219.

145. Overton E. 1895. Uber die osmotischen eigenschaften der lebenden pflanzen und tierzelle. Vjsch. Naturf. Ges. Zurich. V. 40, p. 159-201.

146. Padan E., Schuldiner S. 1993. Na+/H+ antiporters, molecular devices that couple the Na+ and H+ circulation in cells. J. Bioenerg. Biomemb. V. 25, p.647-669.

147. Pao S.S., Paulsen I.T., Saier M.H. Jr. 1998. Major facilitator superfamily. Microbiol. Mol. Biol. Rev. V. 1, p. 1-34.

148. Pardee A.B. 1957. An inducible mechanism for accumulation of melibiose in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 73, p.376-385.

149. Pedersen II., Dall J., Dandanell G., Valentin-Hansen P. 1995. Gene-regulatory modules in Escherichia coli: nucleoprotein complexes formed by cAMP-CRP and CytR at the nupG promoter. Mol. Microbiol. V. 17, p.843-853.

150. Petersen C. 1999. Inhibition of cellular growth by increased guanine nucleotide pools. Characterization of an Escherichia coli mutant with a guanosine kinase that is insensitive to feedback inhibition by GTP. J. Biol. Chem. V. 274, p.5348-5356.

151. Petersen C., Moller L.B. 2001. The RihA, RihB, and RihC ribonucleoside hydrolases of Escherichia coli. Substrate specificity, gene expression, and regulation. J. Biol. Chem. V. 276, p.884-894.

152. Phadtare S., Yamanaka K., Kato I., Inouye M. 2001. Antibacterial activity of 4,5-dihydroxy-2-cyclopentan-l-one (DHCP) and cloning of a gene conferring DHCP resistance in Escherichia coli. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. V. 3, p.461-465.

153. Postma P.W., Lengeler J.W., Jacobson G.R. 1993. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria. Microbiol. Rev. V. 57, p.543-594.

154. Rhee S., Martin R.G., Rosner J.L., Davies D.R. 1998. A novel DNA-binding motif in MarA: the first structure for an AraC family transcriptional activator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95, p.10413-10418.

155. Rolfes R.J., Zalkin H. 1988. Escherichia coli gene purR encoding a repressor protein for purine nucleotide synthesis. Cloning, nucleotide sequence and interaction with the purF operator. J. Biol. Chem. V. 263, p. 19653-19661.

156. Rolfes R.J., Zalkin II. 1990. purification of the Escherichia coli purine regulon repressor and identification of corepressors. J. Bacteriol. V. 172, p.5637-5642.

157. Rosenberg E.Y., Ma D., Nikaido H. 2000. AcrD of Escherichia coli is an aminoglycoside efflux pump. J. Bacteriol. V. 182, p. 1754-1756.

158. Rost В., Sander C. 1993. Prediction of protein secondary structure at better than 70% accuracy. J. Mol. Biol. V. 232, p.584-599.

159. Roy-Burman S., Visser D.W. 1972. Transport studies of showdomycin, nucleosides and sugars in Escherichia coli В and in showdomycin-resistant mutants. Biochim. Biophys. Acta. V. 282, p.383-392.

160. Saier M.H. Jr., Beatty J.T., Goffeau A., Harley K.T., Heijne W.H., Huang S.C., Jack D.L., Jahn P.S., Lew K., Liu J., Pao S.S., Paulsen I.T., Tseng T.T., Virk P.S. 1999. The major facilitator superfamily. Mol. Microbiol. Biotechnol. V. 1, p.257-279.

161. Saier M.H. Jr., Tam R., Reizer A., Reizer J. 1994. Two novel families of bacterial membrane proteins concerned with nodulation, cell division and transport. Mol Microbiol. V. 11, p. 841-847.

162. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

163. Schlor S., Kemmer G., Reidl J. 2003. Transposon TnlO. Methods Mol. Med. V. 71, p.211

164. Scripture J.B., Voelker С., Miller S., O'Donnell R.T., Polgar L., Rade J., Horazdovsky B.F., Hogg R.W. 1987. High-affinity L-arabinose transport operon. Nucleotide sequence and analysis of gene products. J. Mol. Biol. V 197, p.37-46.

165. Seeger C., Poulsen C., Dandanell G. 1995. Identification and characterization of genes СxapA, xapB, and xapR) involved in xanthosine catabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 177, p.5506-5516.

166. Silver S., Walderhaug M. 1992. Gene regulation of plasmid- and chromosome-determined inorganic ion transport in bacteria. Microbiol. Rev. V. 56, p. 195-228.

167. Skare J.T., Postle K. 1991. Evidence for a TonB-depended energy transduction complex in Escherichia coli. Mol. Microbiol. V. 5, p.2883-2890.

168. Smith J.L., Zaluzec E.J., Wery J.-P., Niu L., Switzer R.L., Zalkin H., Satow Y. 1994. Structure of the allosteric regulatory enzyme of purine biosynthesis. Science. V. 264, p.1427-1433.

169. Sparrow C.P., Ganong B.R., Raetz C.R.H. 1984. Escherichia coli membrane vesicles with elevated phosphatidic acid levels. Biochim. Biophys. Acta. V. 794, p.373-383.

170. Stayton M.M., Rudolph F.B., Fromm H.J. 1983. Regulation, genetics and properties of adenylosuccinate synthetase: a review. Curr. Top. Cell. Regul. V. 22, p. 104-141.

171. Sugiyama J.E., Mahmoodian S., Jacobson G.R. 1991. Membrane topology analysis of Escherichia coli mannitol permease by using a nested-deletion method to create mtlA-phoA fusions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 88, p.9603-9607.

172. Sullivan K.H., Hegeman G.D., Cordes E.H. 1979. Alteration of fatty acid composition of Escherichia coli by growth in the presence of normal alcohol. J. Bacteriol. V. 138, p.133-138.

173. Switzer R.L. 1974. Phosphoribosylpyrophosphate synthetase and related pyrophosphokinases, p.607-628. In Boyer P.D. (ed.), The Enzymes, vol. 9. Academic Press, New York.

174. Tanaka Т., HoriiT., Shobayama K., Sato K., Ohsuka S., Arakawa Y., Yamaki K., Takagi K., Ohta M. 1997. RobA-induced multiple antibiotic resistance largely depends on the activation of the AcrAB efflux. Microbiol. Immunol. V. 41, p.697-702.

175. Tanner M.J.A. 1979. Isolation of integral membrane proteins and criteria for identifying carrier proteins. Curr. Topics Memb. Transp. V. 12, p. 1-51.

176. Tesfa-Selase F., Drabble W.T. 1992. Regulation of the gua operon of Escherichia coli by the DnaA protein. Mol. Gen. Genet. V. 231, p.256-264.

177. Tikhonova E.B., Zgurskaya H.I. 2004. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli form a stable intermembrane multidrug efflux complex. J. Biol. Chem. V. 279, p.32116-32124.

178. Travers A., Schneider R„ Muskhelishvili G. 2001. DNA supercoiling and transcription in Escherichia coli: the FIS connection. Biochimie. V. 83, p.213-217.

179. Trotschel C., Deutenberg D., Bathe В., Burkovski A., Kramer R. 2005. Characterization of methionine export in Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. V. 187, p.3786-94.

180. Tsuchiya Т., Lopilato J.,Wilson Т.Н. 1978. Effect of lithium ion on mclibiose transport in Escherichia coli. J. Membr. Biol. V. 42, p.45-59.

181. Turner R.J., Taylor D.E., Weiner J.H. 1997. Expression of Escherichia coli TehA gives resistance to antiseptics and disinfectants similar to that conferred by multidrug resistance efflux pumps. Antimicrob. Agents Chemother. V. 41, p.440-444.

182. Urban C., Gelis. R.T. 1990. Purification and properties of a kinase from Escherichia coli K-12 that phosphory lates two periplasmic transport proteins. J. Biol. Chem. V. 265, p. 1783

183. Valentin-Hansen P., Hammer K., Love Larsen J.E., Svendsen I. 1984. The internal regulated promoter of the deo operon of Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. V. 12, p.5211-5224.

184. VandenBoom Т., Cronan J.E., Jr. 1989. Genetics and regulation of bacterial lipid metabolism. Annu. Rev. Microbiol. V. 43, p.317-343.

185. Vieira J., Messing J. 1991. New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene. V. 100, p. 189-194.

186. Vrljic M., Kronemeyer W., Sahm H., Eggeling L. 1995. Unbalance of L-lysine flux in Corynebaclerium glutamicum and its use for the isolation of excretion-defective mutants. J. Bacteriol. V. 177, p.4021-4027.

187. Vrljic M., Sahm H., Eggeling L. 1996. A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebaclerium glutamicum. Mol. Microbiol. V. 22, p. 815-826.

188. Westh Hansen S.E., Jensen N., Munch-Petersen A. 1987. Studies on the sequence and structure of the Escherichia coli K-12 nupG gene, encoding a nucleoside-transport system. Eur. J. Biochem. V. 168, p.385-391.

189. White B.A. 1993. PCR protocols. Current methods and applications., ed. Humana Press, Totowa, New Jersey.

190. Widdas W.F. 1952. Inability of diffusion to account for placetantal glucose transfer in the sheep and consideration of the kinctics of possible carrier transfer. J. Physiol. V. 118, p.23-29.

191. Wright J.K. 1986. The kinetic mechanism of galactoside/H+ cotransport in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. V. 855, p.391-416.

192. Yamaguchi A., Udagawa Т., Sawai T. 1990. Transport of divalent cations with tetracycline as mediated by the transposon TnlO-encoded tetracycline resistance protein. J. Biol. Chem. V. 265, p.4809-4813.

193. Ye J., van den Berg B. 2004. Crystal structure of the bacterial nucleoside transporter Tsx. EMBO J. V. 23, p.3187-3195.

194. Yerushalmi H., Lebendiker M., Schuldiner S. 1995. EmrE, an Escherichia coli 12-kDa multidrug transporter, exchanges toxic cations and H+ and is soluble in organic solvents. J. Biol. Chem. V. 270, p.6856-6863.

195. Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Tokmakova I.L., Troshin P.V., Livshits V.A. 1999. The novel transmembrane Escherichia coli proteins involved in the amino acid efflux. FEBS Lett. V. 452, p.228-232.

196. Zgurskaya H., Nikaido H. 1999. AcrA is a highly asymmetric protein capable of spanning the periplasm. J. Mol. Biol. V. 285, p.409-420.

197. Zgurskaya H., Nikaido H. 1999. Bypassing the periplasm: reconstitution of the AcrAB multidrug efflux pump of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96, p.7190-7195.

198. Zhou G., Smith J.L., Zalkin H. 1994. Binding of purine nucleotides to two regulatory sites results in synergistic feedback inhibition of glutamine PRPP amidotransferase. J. Biol. Chem. V. 269, p.6784-6789.

199. Zimmerman H. 1992. 5'-Nucleotidase: molecular structure and functional aspects. Biochem. J. V. 285, p.345-365.

Информация о работе

Гронский, Сергей Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Поиск и изучение генов, участвующих в транспортировке пуриновых производных из клеток Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы