Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование гуминовых кислот почвенными бактериями
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование гуминовых кислот почвенными бактериями"

На правах рукописи

ииаиьз?47

ПОСТНИКОВА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПОЧВЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003053747

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор

Д.Г. Звягинцев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Д.И. Никитин

кандидат биологических наук Л.М. Барышникова

Ведущее учреждение:

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Защита состоится г. в 15 ч. 30 мин. в аудитории М-2 на

заседании диссертационной совета K501.001.0S в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета Почвоведения МГУ.

Автореферат разослан » 2007г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета по микробиологии и агрохимии МГУ или прислать отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, ^ .^-/бл.

профессор Г.М. Зенова

Актуальность работы. Почвенный гумус, содержащий большое количество гуминовых кислот, играет важную роль в генезисе почв, структурообразовании, водном и воздушном режиме почв, питании растений. Он во многом обуславливает продуктивность ряда почв. Однако разложение гуминовых кислот бактериями, хотя и изучалось рядом исследователей (Мишустин и др., 1960; Никитин, 1960; Flaig, 1968; Теппер, 1976; Туев, 1989; Орлов, 1990; Тейт, 1991; Filip, 2003) не нашло своего окончательного разрешения даже на концептуальном уровне.

По мнению одних исследователей, процессы минерализации 1уминовых веществ обусловлены биохимической деятельностью специфической группы микроорганизмов (Никитин, 1960; Теппер, 1976). Другие связывают эти процессы с деятельностью всего микробного комплекса почв (Кудрина, 1951; Flaig, 1968; Кононова, 1976; Александрова 1980; Filip, 2004).

Большинство известных нам работ проводилось с использованием какого-либо одного метода (силикатные гелевые пластинки, пропитанные гуматами, жидкие среды с гуминовыми кислотами) и с малым числом организмов (чаще всего псевдомонады, нокардии) (Никитин, 1960; Теппер, 1976). Об активности процесса разложения гуминовых кислот судили главным образом по обесцвечиванию питательной среды.

Появившиеся в последнее время современные хроматографические методы (дыхание, азотфиксация) дают возможность более точно оценить процессы разложения различных субстратов, в том числе и гумусовых веществ по выделению диоксида углерода и по интенсивности процесса азотфиксации растущими на них микроорганизмами.

Практически не изучено использование почвенными бактериями гумусовых кислот, адсорбированных на поверхности глинистых минералов, хотя в почве они находятся в значительных количествах именно в таком состоянии.

Изучение процессов использования почвенного гумуса бактериями с помощью современных газохроматографических методов позволит более точно подойти к оценке баланса гумуса в почве и сохранении его запасов, расширит наши знания о катаболизме гуминовых кислот почвенными бактериями, поможет в разработке бактериальных удобрений на основе препаратов гуминовых кислот из бурого угля и теоретическом обосновании действия этих препаратов на растения.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение использования гуминовых кислот почвенными бактериями, а также оценка интенсивности этого процесса с применением газохроматографических методов.

Задачи исследования:

1. Исследование способности к росту чистых культур почвенных бактерий и нативного бактериального комплекса на препаратах гуминовых кислот, в качестве единственного источника углерода и азота, а также в условиях кометаболизма.

2. Оценка интенсивности дыхания и азотфиксации бактерий при росте на свободных и адсорбированных на каолините гуминовых кислотах.

3. Сравнение молекулярно-массового распределения, а также элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия на них бактерий.

4. Изучение использование бактериями гуминовой кислоты, находящейся на поверхности частиц бурого угля.

5. Исследование сохранения жизнеспособности бактерий в препарате гуминовых кислот.

Научная новизна работы. Впервые исследовано разложение гуминовых кислот из чернозема, дерново-подзолистой почвы и бурого угля чистыми культурами бактерий и нативным почвенным бакгериальным комплексом при помощи современных газохроматографических методов. Установлено, что гуминовые кислоты разлагаются довольно интенсивно всеми исследованными бактериями вне зависимости от их систематического положения. Показано, что выделенный из почвы нативный бактериальный комплекс использует гуминовые кислоты в 4 раза интенсивнее, чем чистые культуры бактерий, а в условиях кометаболизма в 10 раз интенсивнее.

Гуминовая кислота, адсорбированная на каолините, используется с той же интенсивностью, что и свободная.

Впервые при помощи газохроматографических методов показано, что почвенные б<иаерии не только присутствуют в значительных количествах в буром угле, но и способны использовать гуминовые кислоты с поверхности частиц угля, причем интенсивность процессов эмиссии С02 и азотфиксации ниже, чем при использовании бактериями гуминовых кислот, выделенных из почвы и бурого угля.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы при балансовых расчетах количества диоксида углерода выделяющегося из почвы за счет разложения гумуса. Полученные результаты о численности и структуре бактериального комплекса в буром угле и препарате гуминовой кислоты из бурого угля, а также сохранении жизнеспособности бактерий в препарате гуминовой кислоты из бурого угля помогут в разработке новых бактериальных удобрений на основе препарата гуминовой кислоты -«Бакгогумуса».

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов - 2002» (Москва, 2002); на IV съезде Докучаевского общества почвоведов «Почвы - как национальное достояние России» (Новосибирск, 2004); на 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты экспериментов, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на7Й^Хтраницах текста, содержат ¿2^5рисунков, аблиц, приложение. Список литературы включаетТ^У источника, в том числе на иностранном языке.

Автор выражает глубокую признательность за помощь в проведении исследований и ценные замечания при написании работы сотрудникам кафедры биологии почв МГУ им. М.В. Ломоносова: к.б.н. Л.В. Лысак, дб.н. А.Л. Степанову, к.б.н. Е.В. Лапыгиной, к.б.н. Т.Г. Добровольской, д.б.н. И.Ю. Чернову, д.б.н. М.М. Умарову, д.б.н. O.E. Марфениной, к.б.н. И.Н. Скворцовой, сотруднику кафедры химии почв к.б.н. A.A. Степанову, а также сотрудникам фирмы «Агросинтез»: Ю.Г. Пуцыкину и А.А Шаповалову за предоставленные препараты гуминовых кислот и образцы бурого угля.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования послужили: препараты гуминовых кислот (ПГК), выделенные по стандартной методике (Орлов, Гришина, 1981) из типичного чернозема (Курская область), дерново-подзолистой почвы (Московская область), а также промышленный ПГК из бурого угля, предоставленный фирмой «Агросинтез».

В работе также использован ПГК из бурого угля, адсорбированный на каолините, а также образцы бурого угля из Гусиноозерского месторождения (Бурятия), отобранные с глубины 10 м.

Культуры бактерий, использованные в работе, получены из Коллекции кафедры биологии почв МГУ от И.Н. Скворцовой и Л.В. Лысак. Всего исследовано 15 штаммов бактерий, принадлежащих к родам Bacillus, Arthrobacter, Rhodococcus, Cellulomonas, Micrococcus, Aquaspirillum, Azotobacter, Cytophaga, Myxococcus, Pseudomonas, Rhizobium выделенных из дерново-подзолистой почвы (Московская область) и чернозема типичного (Курская область).

Во всех опытах по изучению роста бактерий на ПГК (буром угле) использовалась минеральная среда следующего состава (г/л): КН2Р04 - 0.9; K2HP04 - 1.74; MgS04 - 0.3, СаС12 - 0.1; NaCl - 0.5; Н20 - 1.0 л, где в качестве единственного источника углерода и азота использовался ПГК (бурый уголь) в концентрации 0.01% в пересчете на сухое вещество, которые стерилизовали при 1 атм.

Для постановки опытов с накопительными культурами в минеральную среду для подавления роста грибов добавляли нистатин. Для изучения использования ПГК в условиях кометаболизма добавляли глюкозу (0.01%). В качестве инокулята использовали образцы почв из горизонта AI чернозема типичного из Курской области и горизонта AI дерново-подзолистой почвы (Московская область). О разложении ПГК судили по снижению интенсивности окраски среды. Продолжительность опыта 2-3 месяца.

Выделение нативного бактериального комплекса (НБК) из почвы проводили по Кожевину (1989).

Исследование способности чистых культур бактерий и нативного бактериального комплекса расти на гуминовых кислотах: 1). К 5 мл жидкой

минеральной среды добавляли ПГК в концентрации 0.01% в пересчете на сухое вещество. Флаконы ипокулировали бактериальной суспензией или НБК (108 кл/мл). 2). Для изучения способности бактерий использовать ПГК в щелочной среде в минеральную среду добавляли стерильный раствор 20% КОН до рН среды 8. 3). Использование ПГК в условиях кометаболизма изучали на минеральной среде с ПГК (0.01%) и глюкозой (0.01%). Контролем служила среда без источников углерода и азота и среда с глюкозой.

О способности бактерий развиваться на минеральной среде, содержащей ПГК, судили по эмиссии диоксида углерода и азотфиксирующей активности и изменению численности клеток. Эмиссию С02 измеряли на газовом хроматографе с детектором по теплопроводности (модель 3700), активность азотфиксации определяли ацетиленовым методом на газовом хроматографе «Хром 41» с плазменно-ионизационным детектором (Степанов, Лысак, 2002).

Исследование микробиологической характеристики препарата гуминовых кислот и бурого угля. В пенициллиновые флаконы добавляли 5 г измельченного до порошкообразного состояния бурого угля, или 5 мл ПГК. К бурому углю приливали 1 мл стерильной водопроводной воды. Об активности нативных микроорганизмов судили по интенсивности эмиссии С02. Общую численность бактерий и длину грибного мицелия определяли прямым микроскопическим методом с использованием люминесцирующих красителей. Для количественного учета бактерий использовали акридин оранжевый и краситель L-7012, который представляет собой комбинацию флюорофоров SYTO 9 и пропидиум йодида (фирма "Molecular Probes", США). Использование L-7012 позволяет разделить интактные клетки (зеленое свечение) и клетки с поврежденной клеточной мембраной (красное свечение) (Малеев, Гинцбург, 2004). Таксономический состав бактерий определяли чашечным методом на глкжозо-пептонно-дрожжевой среде с нистатином. Идентификацию выделенных культур бактерий проводили на основании морфологических, культуральных и хемотаксономических признаков (Определитель бактерий Берджи, 1997, 1 и 2 т.).

Исследование способности чистых культур бактерий и нативного бактериального комплекса расти на препарате бурого угля. К 5 мл жидкой минеральной среды добавляли измельченный до порошкообразного состояния

бурый уголь в концентрации 0.01%. Флаконы инокулировали бактериальной суспензией или НБК (108 кл/мл). В качестве контроля использовали минеральную среду без источника углерода и среду с глюкозой (0.01%).

Способность бактерий развиваться на среде, содержащей бурый уголь, определяли газохроматографическим методом, а также по изменению численности и таксономического состава, как указано выше.

Исследование молекулярно-массового распределения и элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия бактерий. В колбы со 100 мл минеральной среды вносили ПГК из бурого угля (0.01%) и НБК (4.2><108 кл/г). Использовались варианты: среда с ПГК с НБК - контроль, среда с ПГК с НБК и сахароза (0.01%), среда с ПГК, с НБК и NH4NO3 (0.01%). Инкубировали на ротаторе в течение 2-х месяцев.

Для изучения молекулярно-массового распределения ПГК из бурого угля проводили колоночную жидкостную хроматографию ПГК до и после инкубации с НБК с использованием гелей Sephadex G-50. В качестве элюента использовали 0.025М Tris-HCI буфер (pH 7,2). Для геля G-50 использовалась колонка шведской фирмы LKB 10*560 мм. Скорость элюции 10 мл/ч, чувствительность в зависимости от концентрации раствора образца - 0.05; 0.1; 0.2. Профили элюции получали измерением поглощения раствора с помощью УФ-детектора 2138 Uvicord S в проточной кварцевой кювете при 280 нм. Показания прибора регистрировали в двухканальном самописце 2210. Молекулярные массы рассчитывались по формуле Детермана (Детерман, 1970).

Элементный состав ПГК до и после воздействия бактерий определяли на С-H-N, анализаторе марки Vario EL Ш. Для анализа элементного состава пиков разделение на фракции проводились на хроматографической колонке шведской фирмы LKB 10*600 мм с помощью коллектора фракций LKB 2212.

Исследование сохранения жизнеспособности популяций бактерий, внесенных в препарат гуминовых кислот. Суспензии 3-суточных культур бактерий Bacillus subtilis v. nigricans, Arthrobacter globiformis, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas fluorescens var. lemonnieri, Rhizobium leguminosarum вносили во флаконы с 111 К в количестве 108 кл/мл. Флаконы хранили при комнатной температуре, во избежание подсыхания субстрата периодически

добавляли небольшое количество стерильной водопроводной воды до первоначального объема. Численность внесенных популяций определяли методом посева на глюкозо-пептонно-дрожжевой агар на 15, 30,45,65, 95-е сутки.

Для обогащения Г1ГК бактериями вносили перегнойно-глеевую почву (1 г на 1 л 111 К), а также глюкозу (0.01%). Численность бактерий до и после внесения почвы и глюкозы определяли чашечным методом на 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 и 180-е сутки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование способности почвенных бактерий использовать препараты гуминовых кислот в накопительных культурах

Для изучения способности бактерий использовать гуминовые кислоты в накопительных культурах были использованы препараты гуминовых кислот (ПГК) из бурого угля, чернозема и дерново-подзолистой почвы.

Максимальное снижение интенсивности окраски среды наблюдалось в колбах, в которые были внесены ПГК из чернозема и дерново-подзолистой почвы, менее интенсивно обесцвечивалась среда с ПГК из бурого угля. Во всех вариантах, где наряду с ПГК вносилась глюкоза, обесцвечивание было сильнее. Внесение в среду нистатина замедляло процесс обесцвечивания.

Полученные результаты позволяют заключить, что разложение ПГК в накопительных культурах происходит более интенсивно в присутствии глюкозы, т.е. в условиях кометаболизма. Менее интенсивное обесцвечивание среды в присутствии нистатина (антибиотик, ингибирующий деятельность микроскопических грибов) свидетельствует об активном участии в процессах разложения ПГК почвенных грибов.

Из колб с накопительными культурами, где наблюдалось максимальное снижение интенсивности окраски, были сделаны высевы и проведено выделение и идентификация доминирующих форм бактерий. Бактерии были представлены родами Bacillus, Arthrobacter, Rhodococcus, Cellulomonas, Micrococcus, Aquaspirillum, Cytophaga, Myxococcus. Полученные культуры использовались в

дальнейшей работе по изучению использования бактериями препаратов бурого угля, ПГК из бурого угля и почв.

Спектр родов бактерий, выделенных из накопительных культур, позволяет заключить, что в процессах разложения ПГК участвуют типичные почвенные бактерии, в больших количествах выделяемые из почв.

2. Изучение способности чистых культур почвенных бактерий к росту на препаратах гуминовых кислот газохроматографическими методами (дыхание, азотфиксация)

Изучена способность к использованию ПГК в качестве единственного источника углерода и азота у 15 штаммов почвенных бактерий, принадлежащих к следующим родам: Bacillus, Arthrobacter, Rhodococcus, Cellulomonas, Micrococcus, Aquaspirillum, Azotobacter, Cytophaga, Myxococcus, Pseudomonas Наибольшей активностью в отношении использования ПГК характеризовались бактерии родов Pseudomonas, Arthrobacter и Azotobacter, с которыми мы в дальнейшем и продолжали работу.

Полученные газохроматографическими методами (СО2, С2Н4) результаты по изучению способности чистых культур бактерий к росту на ПГК, свидетельствуют о незначительных различиях в интенсивности дыхания Arthrobacter globiformis 20, Azotobacter vinelandii 15 и Pseudomonas fluorescens 12 при росте на ПГК из чернозема и бурого угля (рис. 1). Интенсивность дыхания бактерий была максимальной при росте культур на среде с глюкозой и составляла от 255 до 393 нМ С02/см3хсут. При росте бактерий на среде с ПГК скорость эмиссии С02 составляла от 100 до 140 нМ С02/см3, что в 3-4 раза меньше, чем на глюкозе. При росте на минеральной среде без источника углерода и азота наблюдались низкие показатели интенсивности дыхания, что свидетельствует о том, что культуры использовали для дыхания запасные вещества клетки (эндогенное дыхание). Эти показатели рассмагривались нами как контрольные и в дальнейшем вычитались из полученных измерений. Показатели интенсивности дыхания бактерий на средах с ПГК из чернозема и из бурого угля практически не отличались друг от друга, что свидетельствует о сходном механизме использования этих соединений бактериями.

Препарат гуминовых Препарат ими новых Контроль

кислот из бурого угля кислот из чернозема

Ш АлЬгоЬас1ег §ЬЬЁ1от1зз 20 ■ р5еи(1отогщ Шюгегеейв 12 Ё Аго1оЬас1сг уЫйгк1н 15

Рис. I Интенсивность дыхания чистых культур бактерий при росте на препаратах гумнновых кислот (5-е сутки).

Изучение динамики использования ПГК в качестве единственного источника углерода и азота свидетельствует об однотипном характере использования ПГК чистыми культурами бактерий. В начальный период роста (3-й сутки) наблюдались низкие значения интенсивности дыхания от 14 до 40 нМ СО/см3, к 5-м суткам инкубации скорость эмиссии СО; увеличивалась примерно в 2-3 раза и составляла от 100 до 140 нМ СО-/см", К 35 суткам происходило снижение активности дыхания.

О способности бактерий использовать ПГК судили также но активности азотфиксацни, Азотфиксирующая активность изученных бакт^й на минеральных средах с ПГК невелика и на 5-е стуки роста бактерий составляла от ! 6.2 до 19.8 нМ Н2/см3*сут, что ниже активности азотфиксацни на глюкоз«, где она была от 1 !3 до 195 нМ ЬУсм3 (почти з 10 раз ниже).

По данным люминесцентной микроскопии (окраска акридином оранжевым) численность клеток бактерий при росте их на ПГК в начале опыта была около 108 кл/мл субстрата для всех культур, к концу опыта этот показатель увеличился на порядок и составил около 10Ч кл/мл, что также подтверждает способность бактерий развиваться на ПГК.

Таким образом, исследованные чистые культуры почвенных бактерий были способны к росту на ПГК из чернозема и бурого угля в качестве единственного источника углерода и азота, что проявлялось в увеличении их численности и осуществлении процессов дыхания и азотфиксации на этих субстратах.

3. Исследование способности нативного бактериального комплекса к росту на препарате гуминовых. кислот газохроматографическим методом (дыхание)

Известно, что в почве разложение органического вещества происходит под действием всего пула бактерий, поэтому нами было изучено разложение ПГК из бурого угля нативным бактериальным комплексом, выделенным из чернозема. Показатели интенсивности дыхания НБК при росте на ПГК были в 4-5 раза выше, чем показатели эмиссии СОг чистых культур бактерий и составляли около 450 нМ С02/см3 (рис. 2) при одном и том же первоначальном значении показателей численности, чю и у чистых культур бактерий (около 108 кл/мл).

Нативный бактериальный комплекс

АйЬгоЬайег цЬЬйопш

Рвеиёотопаз Аиогезсегв

АяЛоЬайег тое!апсШ

Рис. 2 Интенсивность дыхания чистых культур бактерий (5-е стуки) и нативного бактериального комплекса (10-е сутки) при росте на препарате гуминовых кислот из бурого угля.

К концу опыта этот показатель увеличился на порядок и составил около 10® кл/мл, что также подтверждает способность бактериального комплекса развиваться наПГК.

Таким образом, исследованный НБК, выделенный из чернозема, был способен осуществлять процессы дыхания и увеличивать численнос% бактерий при росте на ПГК из бурого угля более активно, чем чистые культуры бактерий.

4. Использование препарата гуминовых кислот почвенными бактериями в присутствии глюкозы

Известно, что трудноразлагаемые субстраты лучше используются микроорганизмами в присутствии невысоких концентраций сахарозы или глюкозы, что связано с процессом кометаболизма (Скрябин, Головлева, 1976). Способность использовать ПГК в присутствии глюкозы (0.01%) изучали у бактерий родов Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus и НБК почв.

На 5-е сутки роста чистых культур бактерий и НБК на препарате гуминовых кислот из бурого угля (рис. 3) интенсивность дыхания была невысока и составляла от 100 до 450 нМ ССЬ/см3 соответственно.

При внесении глюкозы (0.01%) показатели эмиссии СО2 увеличивались в 5 раз для чистых культур и в 3 раза для НБК и были равны 550 и 1250 нМ С02/см3 соответственно.

По данным люминесцентной микроскопии происходило увеличение численности бактерий при росте на ПГК и глюкозе на порядок по сравнению с первоначальными значениями от 108 до 109 кл/мл.

Таким образом, ПГК из бурого угля наиболее активно используется НБК и чистыми культурами бактерий в присутствии небольших концентраций глюкозы, т.е. в условиях кометаболизма.

Нативный Pseudomonas Rhodococcus sp Arthrobacter бактериальный ftuorescens globiformis

комплекс

IПГК + глюкоза

Рис. 3. Интенсивность дыхания чистых культур бактерий и нативного бактериального комплекса при росте на препарате гуминовых кислот (ПГК) из бурого угля (5-е сутки).

5. Использование препарата гуминовых кислот, адсорбированного на каолините почвенными бактериями

Известно, что гуминовые кислоты в почве адсорбированы на глинистых минералах (Тейт, 1991), поэтому нами была изучена способность почвенных бактерий к использованию ПГК из бурого угля, адсорбированного на каолините.

Интенсивность дыхания всех исследуемых штаммов бактерий Arthrobacter globiformis, Azotobacter vinelandii и Pseudomonas fluorescens на ПГК, адсорбированном на каолините, в первые пять суток практически не отличалась от интенсивности дыхания бактерий на свободном ПГК и составляла около 100 нМ С02/см3, что в 3 раза ниже, чем на среде с глюкозой.

Более детально была изучена динамика эмиссии С02 исследуемых штаммов. По мере роста Ps. fluorescens на используемых субстратах происходило снижение интенсивности дыхания в обоих вариантах опыта почти в 3 раза по сравнению с 5 сутками опыта. Во все сроки опыта показатели интенсивности дыхания на свободном ПГК и адсорбированном на каолините были близки. При добавлении новой порции ПГК как свободного, так и адсорбированного, наблюдалось увеличение интенсивности дыхания.

Полученные закономерности можно объяснить тем, что почвенные бактерии активно используют легкогидролизуемые углеводные и аминокислотные остатки, расположенные в периферической части молекулы, как свободных, так и адсорбированных гуминовых кислот.

6. Использование препарата гуминовых кислот почвенными бактериями в щелочной среде

Известно, что внесение некоторых удобрений в почву вызывает увеличение значений рН, а подщелачивание почвы способствует более интенсивному разложению почвенными бактериями гумуса (Туев, 1989). Изучали рост бактерий на среде с ПГК при рН 8 и 6.5. Способность почвенных бактерий использовать ПГК оценивали по азотфиксирующей активности культур, поскольку С02, выделяемый при дыхании клеток поглощается щелочью.

Оказалось, что подщелачивание приводит к увеличению азотфиксирующей активности чистых культур бактерий приблизительно в 2 раза (рис. 4).

Рис. 4. Азотфиксирующая активность чистых культур бактерий при использовании препарата гуминовых кислот в слабощелочной среде (7-е сутки).

Так для Аг \inelandii интенсивность азотфиксации увеличилась с 10 до 16 нМ Ы^/см3, а для Рв. Аиогезсет с 14 до 23 нМ Ы2/см3. Вероятно, это связано с тем, что происходит изменение конформации молекул гуминовой кислоты и ее периферические части становятся доступными для использования бактериями.

7. Исследование молекулярно-массового распределение (ММР) и элементного состава препарата гуминовых кислот до и после воздействия на него бактерий

Для изучения процессов деструкции ПГК и характеристики изменений, произошедших в его структуре после действия нативного бактериального комплекса (НБК), был использован метод гель-фильтрации. Характер наблюдаемых изменений ММР (рис. 5-А, Б) позволяет констатировать, что появление на хроматограммах в различных вариантах опыта низкомолекулярной фракции связано с жизнедеятельностью бактерий и накоплением продуктов деструкции гуминовых кислот - сравнительно простых органических соединений, составлявших ранее периферийную часть молекул. Появление дополнительных максимумов в высоко- и среднемолекулярной области хроматограмм обусловлено формированием надмолекулярных структур - мицелл и агрегатов гуминовых кислот и, возможно, молекул белка или других продуктов микробного синтеза, устойчивость которых поддерживается многочисленными водородными мостиками, гидрофобным взаимодействием или другими слабыми связями.

Добавление сахарозы (0.01%) (рис. 5-В) приводило к тому, что пики в низкомолекулярной Йб^асти имели более высокую интенсивность, увеличивалась доля низкомолекулярных фракций и уменьшалась доля высокомолекулярных.

Добавление нитрата аммония (0.01%) также способствовало увеличению интенсивности разложения ПГК микроорганизмами (рис. 5-Г). Азот в форме нитрата аммония легко усваивается микроорганизмами и может активизировать разложение более устойчивой центральной части молекулы гуминовой кислоты. В периферической легкогидролизуемой части гуминовых кислот углеводов больше (около 30%), чем в центральной части молекулы, поэтому добавление сахарозы приводит к активному разложению.

Таким образом, изучение молекулярно-массового распределения ПГК до и после воздействия на него бактерий выявило увеличение доли низкомолекулярных фракций, что связано с накоплением продуктов деструкции ПГК и жизнедеятельности бактерий. Добавление в среду нитрата аммония и сахарозы увеличивало долю низкомолекулярных фракций и уменьшало долю высокомолекулярных фракций, что свидетельствует о более интенсивном разложении ПГК и использовании бактериями легкодоступных периферических частей молекулы гуминовой кислоты.

Нами также был определен исходный элементный состав ПГК до воздействия НБК (общее содержание в массовых процентах): С - 56.59% Н -3.97% N-1.48% 0-37.5%.

После воздействия бактерий измененный элементный состав был определён по фракциям. Разделение производилось на коллекторе фракций ЬКВ 2212. 1 пик (высокомолекулярная фракция): С - 57.26% Н - 2.22% N - 1.56% О - 38.1%; 2 пик (среднемолекулярная фракция): С-56.31% Н-2.73% N-1.58% 0-38.9%; 3 пик (низкомолекулярная фракция): С - 30.07% Н - 2.13% N - 1.70% О -65.2%.

На основе полученных данных можно отметить, что элементный состав первых двух пиков хорошо соотносится с элементным составом исходного препарата, а состав третьего пика заметно отличается. В нём сильно понижено содержание углерода и относительно повышено содержание кислорода. Поскольку состав низкомолекулярной фракции сильно отличается от состава препарата в целом эта фракция, видимо, представляет собой продукты деструкции ПГК и жизнедеятельности микроорганизмов.

Полученные результаты подтверждают сделанные ранее выводы о том, что бактерии способны к деструкции ПГК и в первую очередь, видимо, за счет использования периферических, легкодоступных частей молекулы гуминовой кислоты.

ПГК после воздействия НБК

ПГК с добавлением нитрата аммония после воздействия НБК

Рис. 5. Молекулярно-массовое распределение: А - исходного препарата гуминовых кислот (ПГК); Б - после воздействия натнвного бактериального комплекса (НБК); В - после воздействия НБК с добавлением сахарозы; Г - после воздействия НБК с добавлением нитрата аммония.

Ö. Способность чистых культур бактерии и нативного бактериального комплекса расти на препарате бурого угля

Гуминовые кислоты r буром угле находятся на поверхности бурого угля и могуг быть использованы микроорганизмами в их природном состоянии, i3 связи с этим, интересно было исследовать использование гуминовых кислот бурого угля чистыми культурами бактерий и выделенным из почвы НБК,

Попяченные результата {рис. 6) по изучению способности к росту чистых культур бактерий на измельченном образце бурого угля в качестве единственного источника углерода и азота свидетельствую® о высокой интенсивности дыхания Arthrobacter globiformis, Pseudomonas ftuorescens и Rhodococcus sp. Скорость эмиссии СОг к 7-м суткам роста на буром угле была в 3 раза ниже, чем на Г1ГК и составляла около 25 пМ С Oi/см3, при увеличении численности бактерий на торядок по сравнению с первоначальным значением (около 10' кл/г).

350 S, 300

S. 250 ; з 2ш

1 150 u 100 1 50

Препарат гуминовых Бурый уголь,

кислот го бурого у г/1 я обработанный

ультразвуком

S Нативный бактериальный комплекс U Pseudomonas fhiorescens S Rhodococcus sp И Arthrobacter globiformis

Вурый уголь

Рис. 6. Интенсивность дыхания чистых культур бактерий и нативного бактериального комплекса при росте на среде с бурым углем (7-е сутки).

Образец бурого угля подвергли измельчению г: обработке ультразвуком, Чтобы сделать гуминовые кислоты более Доступными для бактерий. Оказалось, что

при воздействии ультразвука на бурый уголь значения интенсивности дыхания чистых культур бактерий увеличились примерно в 2.5 раза с 25 нМ С02/см3 до 60 нМ С02/см3 (рис. 6).

Показатели интенсивности дыхания бактериального комплекса при росте на обработанном ультразвуком буром угле значительно отличались от значений интенсивности дыхания при росте комплекса на ПГК и составляли 195 и 320 нМ С02/см3 соответственно (рис. 6), при увеличении численности клеток на порядок как при росте на буром утле, так и при росте на ПГК.

Таким образом, исследованные чистые культуры почвенных бактерий и НБК были способны к росту на буром угле в качестве единственного источника углерода и азота. Воздействие ультразвука на бурый уголь разрыхляло молекулу гуминовой кислоты, находящуюся на поверхности частиц бурого угля, и она становилась более доступной для использования бактериями, что проявилось в увеличении численности клеток бактерий и интенсивности дыхания.

9. Микробиологическая характеристика образца бурого угля и препарата гуминовых кислот из бурого угля

Известно, что в буром угле гуминовые кислоты находятся на поверхности частиц бурого угля, поэтому для того чтобы лучше понять, как используется бактериями гуминовая кислота, нами были исследованы микробиологические свойства образца бурого угля и ПГК из бурого угля.

Неоднократно проведенные опыты по определению показателей общей численности бактерий в образцах бурого угля (спустя 1, 6 и 12 месяцев после отбора проб) показали, что численность бактерий сразу после отбора составляла около 107 клеток в 1 г субстрата. Применение красителя 1.-7012 показало, что в образцах бурого угля присутствовали клетки с ненарушенными мембранами (интактные) клетки, окрашивающиеся в зеленый цвет, так и клетки с поврежденными мембранами (нарушенные), окрашивающиеся в красный цвет. Доля интактных клеток составляла около 70%, у остальных 30% мембрана была нарушена. Следует отметить, что численность бактерий в буром угле была на 2 порядка меньше показателей численности бактерий в верхних горизонтах почв, где

их численность обычно составляет 9-10 млрд. клеток в 1 г почвы (Полянская и др, 2004).

Результаты традиционного метода посева показали, что на использованной нами глюкозо-пептонно-дрожжевой среде из образца бурого угля выделялись обычные сапротрофные бактерии, характерные для почв. Численность их в среднем составляла около 104 КОЕ/г, что на 2 порядка ниже, чем в почвах. Доминирующей группировкой (>90% от числа бактерий, учитываемых на использованной среде) являлись грамположительные бактерии, представленные родами Bacillus, Rhodococcus, Micrococcus и Arthrobacter, в то время как грамотрицательные, представленные родами Cytophaga и Aquaspirillum хотя и выделялись, но в минимальных количествах.

Поскольку показатели численности бактерий в буром угле, полученные прямым методом, были значительны, а метод посева давал низкие величины численности, интересно было определить, в каком состоянии находятся здесь микроорганизмы. О потенциальной активности микроорганизмов судили по выделению диоксида углерода, оцененного газохроматографическим методом. Так, интенсивность дыхания микроорганизмов бурого угля составила около 30 нМ ССЬ/см'хсут, что значительно меньше, чем в почве, где скорость эмиссии СОг составляет обычно около 500 нМ С02/см3 (Новиков и др, 2004). Выявленные различия в показателях численности бактерий, полученные прямым методом и методом посева, а также невысокая интенсивность дыхания клеток свидетельствуют о том, что значительная часть бактериальных клеток в буром угле находится в покоящемся (анабиотическом) состоянии, хотя некоторая часть способна к дыханию.

Также нами был проанализирован ПГК, полученный из того же бурого угля. По данным люминесцентной микроскопии численность бактерий в этом препарате составила около 108 кл/мл субстрата, что на порядок больше, чем в препарате бурого угля и на порядок меньше, чем в верхних горизонтах почв. По данным неоднократных высевов ПГК, проводимых в течение 6 месяцев на твердую глюкозо-пептонно-дрожжевую среду общая численность бактерий в первый месяц была около 105 КОЕ/мл, однако к 180 суткам уменьшилась на 2 порядка, что

свидетельствует о том, что бактерии в ПГК способны сохраняться в течение длительного времени (рис. 7).

| А ПГК —ш - ПГК + почва - - ПГК +■ почва + глюкоза [

Рис. 7. Изменение численности бактерий препарата гуминовых кислот из бурого угля (ПГК) после внесения перегнойно-глеевой почвы и глюкозы.

Полученные результаты по измерению интенсивности дыхания микроорганизмов, находящихся в ПГК, показали, что скорость эмиссии С02 составила около 40 нМ С02/см3, что значительно ниже, чем показатели интенсивности дыхания для почвы.

Таким образом, в буром угле и в ПГК из этого бурого угля были обнаружены бактерии, которые способны осуществлять процесс дыхания и сохраняться в этих препаратах в течение длительного времени.

10. Сохранение жизнеспособности популяций бактерий, внесенных в препарат гуминовых кислот

Поскольку нами было показано, что в ПГК присутствует своя «автохтонная» бактериальная микрофлора, то представляло значительный интерес исследовать судьбу внесенных в ПГК популяций бактерий.

Оказалось, что внесенные в ПГК популяции Bacillus subtilis v. nigricans 11, Arthrobacter globiformis 16, Rhodococcus erythropolis 23; Pseudomonas fluorescens

var. lemonnieri 10, Rhizobium leguminosarum 24 ведут себя по-разному. В начале опыта численность всех исследуемых культур бактерий составляла 108 КОЕ/мл. Внесенная популяция Rh leguminosarum снижала численность до величин, не регистрируемых методом посева практически в начале опыта. Снижение численности популяций Ps fluorescens var. lemonnieri и A globiformis до величин, не регистрирумых методом посева, происходило к 65-м суткам опыта. Наиболее устойчивыми к хранению в ПГК оказались популяции, В subtilis v. nigricans и R erythropolis - организмов, устойчивых за счет образования спор (бациллы) или способных к активному использованию гуминовых веществ (родококки) (рис. 8).

» \ \is * -

% \ \

% --,-£-

30 Сутки 45

- Pseudomonas fluorescens v. lemonnieri

— Rhodococcus erythropolis

- Bacillus subtilis v. nigricans__

■ Arthrobacter gfobiformis 1 Rhizobium leguminosarum

Рис. 8. Изменение численности популяций почвенных бактерий внесенных в препарат гуминовых кислот.

Выявленная специфика поведения внесенных в ПГК популяций бацилл и родококков представляет определенный интерес для биотехнологии, так как известно, что бациллы способны к азотфиксации и синтезу физиологически активных веществ, а родококки зарекомендовали себя как активные деструкторы нефти.

Существенное увеличение численности бактерий в ПГК удалось достичь путем внесения перегнойно-глеевой почвы, которая, как известно, характеризуется

высокими показателями численности бактерий (около 109 кл/г). Если до внесения почвы численность бактерий на глюкозо-пептонно-дрожжевой среде не превышала 7x105 КОЕ/мл субстрата, то после внесения она увеличилась почти на 2 порядка и составила 4.7х 107 КОЕ/мл (рис. 7).

Добавление глюкозы еще больше увеличивало численность, что свидетельствует о том, что внесенные с почвой бактерии могут в течение длительного времени (до 6 месяцев) сохраняться в ПГК, что позволяет рассматривать модифицированный ПГК (ПГК + почва + глюкоза) как эффективное бактериально-гумусовое удобрение («Бактогумус»).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение современных газохроматографических методов (дыхание, азотфиксация) позволило показать достаточно эффективное использование препарата гуминовых кислот (ПГК) как чистыми культурами бактерий, принадлежащим к разным таксономическим группам, широко представленным в почве, так и нативным бактериальным комплексом (НБК). ПГК наиболее интенсивно используются бактериями в присутствии глюкозы, т.е. в условиях кометаболизма. Подобное явление отмечалось рядом авторов (Скрябин, Головлева, 1976; РШр, 2003) для других трудноразлагаемых микроорганизмами веществ.

Исходя из полученных нами численных показателей интенсивности дыхания бактерий, было рассчитано количество углерода, выделяемого из ПГК за счет дыхания в модельных опытах. Полученные расчеты показали, что за месяц чистыми культурами почвенных бактерий используется около 3-5% углерода гуминовой кислоты, в условиях кометаболизма около 6-8%, что согласуется с данными других исследователей (Мишустин, Никитин, 1960; Никитин, 1960; РШр, 2003). Нативным бактериальным комплексом за месяц используется 6-8% углерода гуминовой кислоты, в условиях кометаболизма около 12%. Такие показатели дают возможность предположить, что процесс дегумификации, связанный с деятельностью бактериального комплекса, более интенсивно идет в почве загрязненной легкодоступными органическими соединениями.

Экспериментальные исследования образцов бурого угля позволили впервые выявить значительную численность автохтонных бактерий бурого угля, являющихся, видимо, обитателями так называемой «подземной биосферы». Помимо теоретического интереса изучение микроорганизмов бурого угля имеет и практическое значение, поскольку бурый уголь, помимо традиционного использования его как топлива, начинает широко использоваться в биотехнологии как сырье для производства гуминовых удобрений.

Обнаружение бактерий в ПГК из бурого угля позволяет предположить, что процесс получения ПГК (экстракция щелочью и осаждение кислотой) не вызывает полной гибели бактерий, обитающих в буром угле. Более того, внесенные в ПГК популяции некоторых почвенных бактерий способны сохраняться там длительное время (до 6 месяцев)

Внесение перегнойно-глеевой почвы в ПГК значительно увеличивало численность бактерий, что позволяет рассматривать ПГК, обогащенный почвенными бактериями, с точки зрения разработки довольно перспективного бактериально-гумусового удобрения («Бактогумус»).

1. Впервые газохроматографическими методами показано, что представители многих родов почвенных бактерий способны использовать гуминовые кислоты из чернозема и бурого угля. Об этом свидетельствуют увеличение их численности и значительная интенсивность дыхания и азотфиксации. Максимальная интенсивность эмиссии С02 наблюдалась в условиях кометаболизма.

2. Нативным бактериальным комплексом гуминовые кислоты используются в 4 раза интенсивнее, чем чистыми культурами бактерий, а в условиях кометаболизма в 10 раз.

3. Исследованные чистые культуры почвенных бактерий были способны использовать как свободные, так и адсорбированные на каолините гуминовые кислоты. Повышение интенсивности дыхания через 5 суток после добавления в среду новой порции гуминовой кислоты свидетельствуют в пользу усвоения бактериями легкодоступных периферических частей молекулы полимера.

4. Изучение молекулярно-массового распределения и элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия на них почвенных бактерий показало появление новой низкомолекулярной фракции, что подтверждает использование препарата гуминовых кислот почвенными бактериями.

5. Впервые в буром угле и в препарате гуминовой кислоты из этого угля были обнаружены бактерии, способные осуществлять процесс дыхания и увеличивать свою численность при создании благоприятных условий. После обработки бурого угля ультразвуком увеличивается интенсивность дыхания бактерий до величин, сравнимых со значениями скорости эмиссии углерода при росте их на гуминовой кислоте.

6. Внесенные в препарат гуминовых кислот популяции почвенных бактерий были способны сохраняться в течение длительного времени. При добавлении перегнойно-глеевой почвы и глюкозы, численность бактерий увеличилась, что может представлять определенный интерес для биотехнологии.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССРЕТАЦИИ

1. Буланкина М.А. Микробная трансформация гуминовых веществ в почве // Тез. докл. IX Междунар. конф. студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «JIomohocob-2002», М.: МГУ, 2002. С. 23.

2. Буланкина М.А. Разложение гуминовых веществ микроорганизмами // Тез. 6-ой Путинской школы-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века». 20-24 мая 2002 г. М.: Пущине. 2002. С. 10.

3. Пуцикин Ю.Г., Шаповалов A.A., Буланкина МА., Лысак Л.В., Степанов А Л., Звягинцев Д.Г. Микробиологические методы оценки разложения гуминовых кислот // Труд. МБЦ МГУ по 2-ой Междунар. конф. «Биотехнология - охране окружающей среды». Ч. 1. М.: Спорт и культура. 2004. С. 26-29.

4. Звягин11ев Д.Г., Шаповалов А.А, Пуцыкин Ю.Г., Степанов А Л., Лысак Л.В., Буланкина М.А. Устойчивость гуминовых кислот к микробной деструкции // Вестник Московского Университета, сер. 17 почв. 2004. № 2. С. 44-47.

5. Буланкина М.А. Устойчивость гуминовых кислот к микробной деструкции // Сборник тезисов IV съезда Докучаевского общества почвоведов «Почвы как национальное достояние России». Новосибирск. 2004. Кн. 1. С. 603.

6. Буланкина М.А. Изучение деструкции гуминовых кислот почвенными микроорганизмами с помощью газохроматографического метода // Тез. 2-ой Междунар. науч. конф. «Биотехнология - охране окружающей среды» и 3-ей школы-конф. молодых ученых и студентов «Сохранение биоразнообразия и рациональное использование биологических ресурсов». М.: Спорт и культура. 2004. С. 198.

7. Буланкина М.А., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Комплекс микроорганизмов бурого угля // Доклады Московского общества испытателей природы - «Биотехнология - охране окружающей среды». М.: Графикон. 2006. Т. 39. С. 42-45.

8. Putsykin Y.G., Shapovalov АЛ., Lisak L.V., Bulankina М. A., Stepanov A.L., Zviagintsev D.G., Troshanin. Application of Humilat-Gel in Environmental pollution Control and Crop Production // Proceeding of the 13 Meeting of the Intern. Humic Substaces Soc. July 30 to August 4, 2006. Universität Karlsruhe. Fritz H. Frimmel and Gudrun Abbt-Braun, Karlsruhe, 2006. C. 1005-1007.

9. Буланкина M.A., Лысак Л.В., Звягинцев ДГ. Микроорганизмы бурого угля // Известия РАН. Сер. биол. 2007. № 2. С.1-5.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 31.01.2007 г.

Содержание диссертации, кандидат биологических наук , Постникова, Мария Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:

Глава 1. Краткая характеристика органического вещества почвы.

1.1. Строение гумусовых кислот.

1.2. Функциональные группы гуминовых веществ.

1.3. Формы связи гуминовых веществ с минеральными компонентами почвы.

Глава 2. Биосферные функции гуминовых кислот.

Глава 3. Гуминовые вещества и микроорганизмы.

3.1. Использование гуминовых веществ микроорганизмами.

3.2. Физиологическое действие гуминовых кислот на живые клетки.

3.3. Препараты на основе гуминовых веществ.

Глава 4. Некоторые химические и микробиологические свойства бурых углей.

4.1. Формирование бурых углей.

4.2. Роль микроорганизмов в генезисе бурого угля.

4.3. Состав бурых углей.

4.4. Структура бурых углей.

4.5. Микроорганизмы бурого угля.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:.

Объекты исследования:.

Биологические объекты исследования.

Методы исследования:.

1. Изучение использования гуминовых кислот в накопительных культурах.

2. Исследование способности чистых культур бактерий и нативного бактериального комплекса расти на гуминовых кислотах и буром угле.

3. Исследование молекулярно-массового распределения и элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия бактерий.

4. Хроматографические методы исследования.

5. Исследование микробиологической характеристики препарата гуминовых кислот и бурого угля.

6. Определение общей численности бактерий и грибов прямым методом.

7. Определение численности и таксономического состава микроорганизмов в препарате гуминовых кислот и образцах бурого угля.

8. Исследование сохранения жизнеспособности бактерий в препарате гуминовых кислот.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование способности почвенных бактерий использовать препарат гуминовых кислот в накопительных культурах.

2. Изучение способности чистых культур почвенных бактерий к росту на препаратах гуминовых кислот газохроматографическими методами (дыхание, азотфиксация).

3. Исследование способности нативного бактериального комплекса к росту на гуминовых кислотах газохроматографическим методом (дыхание).

4. Использование гуминовой кислоты почвенными бактериями в присутствии глюкозы.

5. Использование почвенными бактериями гуминовой кислоты, адсорбированной на каолините.

6. Использование гуминовой кислоты почвенными бактериями в щелочной среде.

7. Исследование молекулярно-массового распределения и элементного состава препарата гуминовых кислот до и после воздействия на него бактерий.

8. Способность чистых культур бактерий и нативного бактериального комплекса к росту на буром угле.

9. Микробиологическая характеристика образца бурого угля и препарата гуминовых кислот из бурого угля.

10. Сохранение жизнеспособности популяций бактерий, внесенных в препарат гуминовых кислот.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование гуминовых кислот почвенными бактериями"

Актуальность темы: Почвенный гумус, содержащий большое количество гуминовых кислот, играет важную роль в генезисе почв, структурообразовании, водном и воздушном режиме почв, питании растений. Он во многом обуславливает продуктивность ряда почв. Однако разложение гуминовых кислот бактериями, хотя и изучалось рядом исследователей (Мишустин и др., 1960; Никитин, 1960; Flaig, 1968; Теппер, 1976; Туев, 1989; Орлов, 1990; Тейт, 1991; Filip, 2003) не нашло своего окончательного разрешения даже на концептуальном уровне.

По мнению одних исследователей, процессы минерализации гуминовых веществ обусловлены биохимической деятельностью специфической группы микроорганизмов (Никитин, 1960; Теппер, 1976). Другие связывают эти процессы с деятельностью всего микробного комплекса почв (Кудрина, 1951; Flaig, 1968; Кононова, 1976; Александрова 1980; Filip, 2004).

Большинство известных нам работ проводилось с использованием какого-либо одного метода (силикатные гелевые пластинки, пропитанные гуматами, жидкие среды с гуминовыми кислотами) и с малым числом организмов (чаще всего псевдомонады, нокардии) (Никитин, 1960; Теппер, 1976). Об активности процесса разложения гуминовых кислот судили главным образом по обесцвечиванию питательной среды.

Появившиеся в последнее время современные хроматографические методы (дыхание, азотфиксация) дают возможность более точно оценить процессы разложения различных субстратов, в том числе и гумусовых веществ по выделению диоксида углерода и по интенсивности процесса азотфиксации растущими на них микроорганизмами.

Практически не изучено использование почвенными бактериями гумусовых кислот, адсорбированных на поверхности глинистых минералов, хотя в почве они находятся в значительных количествах именно в таком состоянии.

Изучение процессов использования почвенного гумуса бактериями с помощью современных газохроматографических методов позволит более точно подойти к оценке баланса гумуса в почве и сохранении его запасов, расширит наши знания о катаболизме гуминовых кислот почвенными бактериями, поможет в разработке бактериальных удобрений на основе препаратов гуминовых кислот из бурого угля и теоретическом обосновании действия этих препаратов на растения.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение использования гуминовых кислот почвенными бактериями, а также оценка интенсивности этого процесса с применением газохроматографических методов.

Задачи исследования:

1. Исследование способности к росту чистых культур почвенных бактерий и нативного бактериального комплекса на препаратах гуминовых кислот, в качестве единственного источника углерода и азота, а также в условиях кометаболизма.

2. Оценка интенсивности дыхания и азотфиксации бактерий при росте на свободных и адсорбированных на каолините гуминовых кислотах.

3. Сравнение молекулярно-массового распределения, а также элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия на них бактерий.

4. Изучение использование бактериями гуминовой кислоты, находящейся на поверхности частиц бурого угля.

5. Исследование сохранения жизнеспособности бактерий в препарате гуминовых кислот.

Научная новизна: Впервые исследовано разложение гуминовых кислот из чернозема, дерново-подзолистой почвы и бурого угля чистыми культурами бактерий и нативным почвенным бактериальным комплексом при помощи современных газохроматографических методов. Установлено, что гуминовые кислоты разлагаются довольно интенсивно всеми исследованными бактериями вне зависимости от их систематического положения. Показано, что выделенный из почвы нативный бактериальный комплекс использует гуминовые кислоты в 4 раза интенсивнее, чем чистые культуры бактерий, а в условиях кометаболизма в 10 раз интенсивнее.

Гуминовая кислота, адсорбированная на каолините, используется с той же интенсивностью, что и свободная.

Впервые при помощи газохроматографических методов показано, что почвенные бактерии не только присутствуют в значительных количествах в буром угле, но и способны использовать гуминовые кислоты с поверхности частиц угля, причем интенсивность процессов эмиссии С02 и азотфиксации ниже, чем при использовании бактериями гуминовых кислот, выделенных из почвы и бурого угля.

Практическая значимость: Полученные результаты могут быть использованы при балансовых расчетах количества диоксида углерода выделяющегося из почвы за счет разложения гумуса. Полученные результаты о численности и структуре бактериального комплекса в буром угле и препарате гуминовой кислоты из бурого угля, а также сохранении жизнеспособности бактерий в препарате гуминовой кислоты из бурого угля помогут в разработке новых бактериальных удобрений на основе препарата гуминовой кислоты - «Бактогумуса».

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Постникова, Мария Александровна

1. Впервые газохроматографическими методами показано, что представители многих родов почвенных бактерий способны использовать гуминовые кислоты из чернозема и бурого угля. Об этом свидетельствуют увеличение их численности и значительная интенсивность дыхания и азотфиксации. Максимальная интенсивность эмиссии С02 наблюдалась в условиях кометаболизма.

2. Нативным бактериальным комплексом гуминовые кислоты используются в 4 раза интенсивнее, чем чистыми культурами бактерий, а в условиях кометаболизма в 10 раз.

3. Исследованные чистые культуры почвенных бактерий были способны использовать как свободные, так и адсорбированные на каолините гуминовые кислоты. Повышение интенсивности дыхания через 5 суток после добавления в среду новой порции гуминовой кислоты свидетельствуют в пользу усвоения бактериями легкодоступных периферических частей молекулы полимера.

4. Изучение молекулярно-массового распределения и элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия на них почвенных бактерий показало появление новой низкомолекулярной фракции, что подтверждает использование препарата гуминовых кислот почвенными бактериями.

5. Впервые в буром угле и в препарате гуминовой кислоты из этого угля были обнаружены бактерии, способные осуществлять процесс дыхания и увеличивать свою численность при создании благоприятных условий. После обработки бурого угля ультразвуком увеличивается интенсивность дыхания бактерий до величин, сравнимых со значениями скорости эмиссии углерода при росте их на гуминовой кислоте.

6. Внесенные в препарат гуминовых кислот популяции почвенных бактерий были способны сохраняться в течение длительного времени. При добавлении перегнойно-глеевой почвы и глюкозы, численность бактерий увеличилась, что может представлять определенный интерес для биотехнологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение современных газохроматографических методов (дыхание, азотфиксация) позволило показать достаточно эффективное использование препарата гуминовых кислот из бурого угля и из почв как чистыми культурами бактерий, принадлежащим к разным таксономическим группам, широко представленным в почве, так и нативным бактериальным комплексом. Препараты гуминовых кислот наиболее интенсивно используются бактериями в присутствии глюкозы, т.е. в условиях кометаболизма. Подобное явление отмечалось рядом авторов (Скрябин, Головлева, 1976; Filip, 2003).

Результаты, полученные в ходе работы, показали, что гуминовые кислоты используются исследованными чистыми культурами бактерий, принадлежащих к разным родам примерно с одинаковой скоростью, что может говорить о сходном механизме использования этих субстратов, заключающемся в использовании, в первую очередь, периферических частей молекул гуминовых кислот.

Особого внимания заслуживают результаты, полученные в ходе экспериментов по использованию гуминовых кислот нативным бактериальным комплексом, выделенным из чернозема. Оказалось, что бактериальный комплекс разлагал гуминовые кислоты, выделенные как из почв, так и из бурого угля в 4 раза интенсивнее, чем чистые культуры бактерий, а в условиях кометаболизма в 10 раз при одном и том же уровне численности клеток бактерий.

В силу того, что бактериальный комплекс содержит большое количество разнообразных бактерий, он может действовать на гуминовую кислоту как «батарея ферментов», необходимых для более полного использования как периферической, так и центральной части молекулы гуминовых кислот.

Исходя из полученных нами численных показателей интенсивности дыхания бактерий, было рассчитано количество углерода, выделяемого из гуминовых кислот за счет дыхания. Полученные расчеты показали, что за месяц чистыми культурами почвенных бактерий используется около 3-5% углерода гуминовой кислоты, в условиях кометаболизма около 6-8%, что согласуется с данными других исследователей (Мишустин, Никитин, 1960; Никитин, 1960; Filip, 2003). Нативным бактериальным комплексом за месяц используется 6-8% углерода гуминовой кислоты, а в условиях кометаболизма около 12%. Такие показатели дают возможность считать, что процесс дегумификации, связанный с деятельностью бактериального комплекса, более интенсивно идет в почве загрязненной легкодоступными органическими соединениями.

Интересно, что чистые культуры почвенных бактерий были способны осуществлять азотфиксацию при росте на гуминовых кислотах, т.е. использовать их как источник углерода для этого процесса, хотя интенсивность процесса была ниже, чем на глюкозе.

При изучении молекулярно-массового распределения и элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия на них бактерий, выяснилось, что после воздействия на гуминовые кислоты бактериального комплекса увеличивается доля низкомолекулярных соединений, т.е., вероятно, бактериями используются как легкодоступные периферические части гуминовых кислот, так и ядро молекулы. Элементный состав гуминовых кислот также меняется. Снижение содержания углерода в низкомолекулярной фракции свидетельствует о том, что в первую очередь бактериями используется низкомолекулярная фракция гуминовых кислот, т.е. бактерии развиваются за счет разрушения гуминовых кислот.

Экспериментальные исследования образцов бурого угля позволили впервые выявить значительную численность автохтонных бактерий бурого угля, являющихся, видимо, обитателями «подземной биосферы». Внесение в среду, содержащую бурый уголь чистых культур бактерий и нативного бактериального комплекса показало, что внесенные бактерии способны использовать гуминовые кислоты с поверхности частиц бурого угля. Помимо теоретического интереса изучение микроорганизмов бурого угля имеет и практическое значение, поскольку бурый уголь, помимо традиционного использования его как топлива, начинает широко использоваться в биотехнологии как сырье для производства гумусовых удобрений.

Обнаружение бактерий в препарате гуминовых кислот из бурого угля позволяет предположить, что процесс получения этого препарата (экстракция щелочью и осаждение кислотой) не вызывает полной гибели бактерий, обитающих в буром угле или попадающих туда из воздуха во время получения гуминовых кислот. Более того, внесенные в препарат гуминовых кислот популяции некоторых почвенных бактерий {Rhodococcus, Bacillus) способны сохраняться там длительное время (до 6 месяцев).

Внесение перегнойно-глеевой почвы и глюкозы в препарат гуминовых кислот значительно увеличивало численность бактерий, что позволяет рассматривать обогащение препарата гуминовых кислот почвенными бактериями с точки зрения разработки перспективного бактериально-гумусового удобрения («Бактогумус»).

Библиография Диссертация по биологии, кандидат биологических наук , Постникова, Мария Александровна, Москва

1. Александрова И.В. Об использовании гумусовых веществ микроорганизмами // Почвоведение. 1953. № 6. С. 680 686.

2. Александрова JI.H. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. Д.: Наука. 1980. 287 с.

3. Алиев С.А. Азотфиксация и физиологическая активность органического вещества почв. Новосибирск. Наука, 1988. 144 с.

4. Ананьева Н.Д. Микробиологические аспекты самоочищения и устойчивости почв. М.: Наука, 2003. 223 с.

5. Аристовская Т.В. Микробиология подзолистых почв. М.: Наука, 1965. 187 с.

6. Аристовская Т.В. О разложении фульвокислот микроорганизмами//Почвоведение. 1958. № 11. С. 723 729.

7. Безуглова О.А. Препараты на основе гуминовых веществ. М.: Агромир, 2004.210 с.

8. Биотехнология принципы и применение / Под. ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. М.: Мир, 1988. 479 с.

9. Бирюков MB. Биологическое действие гуминовых кислот и его пространственная локализация в почве. Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2006. 24 с.

10. Бобырь Л.Ф. Влияние гумусовых веществ на процессы фотосинтеза // Тр. Междунар. симпоз. IV и П Комис. МТО. Минск. 1982. С. 159163.

11. Бобырь Л.Ф. Влияние физиологически активных гумусовых веществ на фотосингетические процессы у растений // Автореф. дис. канд. биол. наук. Кишинев. 1984.24 с.

12. Бузолева Л.С., Сидоренко MJL Влияние органического вещества гуминовых кислот на размножение энтеробакгерий // Микробиол. 2001. № 2. С. 89-91.

13. Вахмистров ДБ., Зверкова OA, Дебец УЮ., Мишустина НЕ. Гуминовые кислоты: Связь между поверхностной активностью и стимуляцией росшрастений//Докл. АН СССР. 1987. Т. 293. № 5. С. 1277-1280.

14. Вернадский В.И. Очерки геохимии. М: Госиздат, 1927.368 с.

15. Ветрова К.Ю. Дубровский В.Я. Гуминовые препараты: животноводство и сельское хозяйство. М.: Агромир, 2003. 178 с.

16. Вильяме В.В. Разложение и количественное определение перегнойных кислот почв // Изв. ТСХА. 1965. вып. 2. С. 126 -141.

17. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. М.: АН СССР, 1952. 792 с.

18. Гапеев А. А. Твердые горючие ископаемые (каустобиолиты). М.: Гос. изд-во геол. лит., 1949. 335 с.

19. Головченко А.В., Полянская Л.М., Добровольская Т.Г. Особенности пространственного распределения и структуры микробных комплексов болотно-лесных экосистем // Почвоведение. 1993. № 10. С. 78-89.

20. Голубков М.А., Чуков С.Н. взаимосвязь структурных параметров и биосферных функций гуминовых веществ // Тез. док. VII конф. «Докучаевские чтения». СПб.: СПбГУ, 2004. С. 127-129.

21. Горовая А.И. Роль физиологически активных веществ гумусовой природы в адаптации растений к ионизирующей радиации и пестицидам // Дис. д-ра биол. Наук. Днепропетровск. 1984. 440 с.

22. Горовая А.И. Роль физиологически активных веществ гумусовой природы в повышении устойчивости растений к действию пестицидов // Биол. Науки. 1988. № 7. С. 15-16.

23. Горовая А.И., Орлов Д.С., Щербенко О.В. Гуминовые вещества. Киев.: Наук, думка. 1995. 304 с.

24. Гришина JI.A. Гумусообразование и гумусное состояние почв. М.: МГУ, 1986.204 с.

25. Гуминовые вещества в биосфере / Под ред. Орлова Д.С. М.: Наука, 1993.236 с.

26. Гуминский С. Влияние гумусовых веществ на физиологические процессы и питание растений // Этюды о гумусе: Сб. докл. Междунар. симпоз. «Гумус и растение IV». Прага. 1967. С. 255-264.

27. Гуминский С., Гуминская 3. Физиологическое воздействие гуминовых соединений в сочетании с воздействием различных металлов // Докл. на Междунар. симпоз. IV Комис. МТО. М.: Мир. 1973. С. 32-33.

28. Демин В.В., Терентьев В.А., Завгородняя Ю.А. Механизм действия гуминовых веществ на живые клетки / Тез. докл. 2 Межд. конф. «Гуминовые вещества в биосфере». М.: МГУ, 2003. С. 38.

29. Демин В.В., Терентьев В.А., Завгородняя Ю.А., Бирюков М.В. Вероятный механизм действия гуминовых веществ на живые клетки / Материалы IV съезда Докучаевского общества почвоведов. Новосибирск. Наука-центр. 2004. С. 494.

30. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. 252с.

31. Добровинская Г.Р., Милановский Е.Ю. Характеристика гумусовых веществ почв катен Южной тайги // Вестник МГУ. Сер. 17 почв. 2000. № 4. С. 40-46.

32. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: ИКЦ Академкнига, 2002. 282 с.

33. Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н., Лысак Л.В. Методы выделения и идентификации почвенных бактерий. М.: Изд-во Московского университета, 1989. 71 с.

34. Драгунов С.С., Желеховцева Н.Н., Стрелкова Е.И. Сравнительное исследование почвенных и торфяных гуминовых кислот // Почвоведение. 1948. №7 С. 409-420.

35. Жемчужников Ю.А., Гинзбург А.И. Основы петрологии углей. М.: Наука, 1960. 258 с.

36. Заварзин Г.А. Круговорот углерода на территории России. М.: МГУ, 1999. 500 с.

37. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии, М.: Наука, 2003. 347с.

38. Заварзин Г.А. Становление биосферы // Вестник РАН. 2001. Т. 71. № 11. С. 988- 1001.

39. Завгородняя Ю.А. Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов. Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2000. 24 с.

40. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: МГУ, 1987. 388 с.

41. Зикеев ТА. Справочник по качеству ископаемых ушей и горючих сланцев Советского Союза. М: Недра, 1957.3 85 с.n n

42. Зякун AM., Дилли О. Использование отношения С/ С для характеристики акшвности микробиогы в пахотных почвах // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. № 5. С. 582 591.

43. Карпухин А.И. Функциональная роль комплексных соединений в генезисе почв и питании растений // Гуминовые вещества в биосфере. 1993. С. 117 125.

44. Касаточкин В.И., Ларина Н.К. Строение и свойства природных углей. М.: Недра, 1975. 157 с.

45. Каталог сельскохозяйственных препаратов на основе гуминовых веществ «Агромир +». М.: Агромир, 2004. 564 с.

46. Квасников Е.И., Писарчук Е.Н. Артробактер в природе и производстве. Киев. Наукова думка, 1980. 234 с.

47. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М.: МГУ, 1989. 168 с.

48. Комисаров И.Д., Логинов Л.Ф., Молекулярная структура и реакционная способность гуминовых кислот // Гуминовые вещества в биосфере. 1993. С. 36-44.

49. Кононова М.М. Проблема почвенного гумуса и современные задачи его изучения. М.:АН СССР, 1951. 390 с.

50. Кононова М.М. Формирование гумуса в почве и его разложение//Усп. микробиол. 1976. Т.П. С. 134-149.

51. Кудрина Е.С. Влияние гуминовой кислоты на некоторые группы почвенных микроорганизмов и ее значение для этих организмов, как источника питательных веществ // Тез. докл. Почв, инст. им. Докучаева АН СССР. 1951. Т. 38. С. 34-42.

52. Кузнецов С.И., Иванов М.В., Ляликова Н.Н. Введение в геологическую микробиологию М.: АН СССР, 1962. 239 с.

53. Лиштван И.И., Абрамец A.M. Гуминовые препараты и охрана окружающей среды // Гуминовые вещества в биосфере. 1993. С. 126-138.

54. Лысак Л.В., Добровольская Т. Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификация почвенных бактерий. М.: Макс-Пресс, 2003. 120 с.

55. Малеев Г.В., Гинцбург А.Л. Методы флюоресцентной детекции и их применение в микробиологии // Журн. Молек. генет. микробиол. и вирусол. 2004. № 3. С. 30-40.

56. Мальцева Н.Н., Гордиенко С.А., Изжеурова В.В. Использоание гуминовых кислот олигонитрофильными микроорганизмами // Почвоведение. 1974. № 12. С. 84 89.

57. Марфенина О.Е. Антропогенная экология почвенных грибов. М.: Медицина для всех, 2005. 196 с.

58. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Звягинцева Д.Г. М.: МГУ, 1991. 303 с.

59. Минеев В.Г. Экологические аспекты агрохимии. М.: МГУ, 1988. 284 с.

60. Михайлов Ф.К., Соснин Р.Е. Экологическая роль гуминовых веществ. М.: Экология, 1997.204 с.

61. Мишустин Е.Н., Никитин Д.И. Атакуемость гуминовых кислот почвенной микрофлорой //Микробиология. 1961. Т. 30. вып. 5. С. 841 -849.

62. Мишустин Е.Н., Никитин Д.И., Очилова М. Микроорганизмы, разлагающие гуминовую кислоту почвы. // Докл. сов. почвоведов к VII Межд. конгр. в США. М.: АН СССР, 1960. С.45-56.

63. Мрыша Г.Н Микроорганизмы рода Pseudomonas усваивающие перегнойные кислоты почв // Изв. ТСХА. 1967. вып. 2. С. 35 41.

64. Наумова А.Н. Методы непосредственного счета микроорганизмов в почве и характеристика отдельных почв Союза // Тр. Науч. Ин. Удобрений. 1933. Вып. 108. С. 45-50.

65. Нестеренко О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев, Наукова думка, 1985. 234 с.

66. Никитин Д.И. Разложение почвенных гуминовых кислот микроорганизмами // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1960. № 4. С. 618-625.

67. Новиков В.В., Степанов A.JL, Поздняков А.И., Лебедева Е.В. Сезонная динамика эмиссии С02, СН4, N2O4, N0 в торфяных почвах Ростовской низины // Почвоведение. 2004. №7. С. 808 -811.

68. Определитель бактерий Берджи. М.: Мир. 1997. (в 2-х томах). 799 с.

69. Орлов Д.С. Гуминовые вещества в биосфере // Сорос, образ, журн. 1997. № 2. С. 56-63.

70. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: МГУ, 1990. 325 с.

71. Орлов Д.С. Кинетическая теория гумификации и схема вероятного строения гуминовых кислот // Науч. докл. высш. школы. Биол. науки.: 1977. № 9. С. 5 16.

72. Орлов Д.С. Теоретические и прикладные проблемы химии гумусовых веществ // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Почв, и агрохим. 1979. №2. С.58-132.

73. Орлов Д.С., Гришина JI.A. Практикум по химии гумуса. М.: МГУ, 1981.272 с.

74. Парниковый эффект, изменение климата и экосистемы / Под ред. Болина Б. JL: Гидрометеоиздат, 1989. 570 с.

75. Перминова И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кислот. Автореф. дис. канд. хим. наук. М., 2000. 24 с.

76. Перфильев Б.В., Габе Д.Р. Капиллярные методы изучения микроорганизмов. М. JL: Изд-во АН СССР, 1961. 534 с.

77. Пироговская Г.В., Богомаз И.А., Шагиев Е.И., Коваленок М.Ф., Кулешова С.И., Наумова Г.В., Райцина Г.И. Использование гуминовых препаратов в получении минеральных удобрений // Гуминовые вещества в биосфере. Наука. 1993. С. 166- 173.

78. Полянская JI.M. Микробная сукцессия в почве. Автореф. дис. док. биол. наук. М., 1996. 96 с.

79. Сидоренко M.JL, Бузолева JI.C. Влияние фракций гуминовых кислот и фульвокислот на рост и размножение патогенных листерий и иерсиний / Тез. докл. III Съезда Докучаевского общества почвоведов (11-15 июля 2000 г., Суздаль). М.: 2000. Кн. 2. С. 51 52.

80. Сидоренко О.Д., Аристархова В.И., Черников В.А. Изменение состава и свойства гуминовой кислоты под воздействием микроорганизмов рода Nocardia // Изв. АН СССР. 1978. Сер биол. № 2. С. 195-202.

81. Скрябин Г.К., Головлева JI.A., Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М.: Наука, 1976. 336 с.

82. Смалий В.Г., Лесовая ВА, Лященко О.Н, Боярская МП. Тихонюк ТА (Цит. по Теппер, 1976).

83. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев. Наукова думка, 1990. 240 с.

84. Смирнова З.С. Определение границы проникновения бактерий из глинистого раствора в керны различных пород // Микробиология. 1957. Т. XXVI. Вып. 6. С. 88-93.

85. Степанов A.JL, Лысак Л.В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии. М.: МАКС Пресс, 2002. 88 с.

86. Таусон В.О. Наследство микробов. М.: АН СССР, 1947. 148 с.

87. Тейт Р. Органическое вещество почвы. М.: Мир, 1991.437с.

88. Теппер Е.З. Микроорганизмы рода Nocardia и разложение гумуса. М.: Наука, 1976. 199с.

89. Трофимук А.А., Молчанов В.И., Параев В.В. Биогенный кислород атмосферы эквивалент углеводородной оболочки во взаимодействии внешних геосфер // Вестник ОГГГГН РАН. 2000. № 3 (13).

90. Туев Н.А. Микробиологические процессы гумусообразования. М.: Агропромиздат, 1989. 239с.

91. Тумасян Н.И. Бактериальные удобрения: предложения современного рынка. М.: Агромир, 2004. 128 с.

92. Тюрин И.В. Органическое вещество почвы и его роль в плодородии. М.: Наука, 1965. 300 с.

93. Федоров М.В., Ильина Т.К. Микробная трансформация гумуса // Микробиология. 1963. Т. 32. С. 272 282.

94. Христева Л.А. Об общности и различиях в действии физиологически активных веществ на растения // Почвоведение. 1973. Т. 4. № 10. С. 25-34.

95. Чуков С.Н. Структурно-функциональные параметры органического вещества почв в условиях антропогенного воздействия. СПб.: СПбГУ, 2001. 199 с.

96. Чуков С.Н., Голубков М.С. Сравнительное изучение физиологической активности гуминовых препаратов различного происхождения // Вестник СПбГУ. 2005. Сер. 3, биол. Вып. 1. С. 103 — 113.

97. Экзерцев В. А. Определение мощности микробиологически активного слоя иловых отложений некоторых озер // Микробиология. 1948. Т. XVII. Вып. 6. С. 24-29.

98. Aleem M.I.H, Bhattacharyya D., Huffman G.P., Kermode R.Y., Murty M.V.S. Microbial hydrogenation of coal and diphenylmethane // Am. Chem. Soc. Div. Fuel. Chem. 1991. V. 36. P. 53 57.

99. Amann R., Glockner F-O., Neef A. Modern methods is subsurface microbiology: in situ identification of microorganisms with nucleic acid probes // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. № 3-4. P. 191200.

100. Anderson D.W., Saggar S., Bettany J.R. Particle size fraction and their use and studies of soil organic matter: I. The nature and distribution of forms of carbon, nitrogen, and sulfur. // Soil Sci. Soc. Am. J. 1981. №45. P. 767-772.

101. Balkwill D.L., Reeves R.H., Drake G.R. et al. Phylogenetic characterization of bacteria in the subsurface microbial culture collection // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. № 3-4. P. 201-216.

102. Bhardwaj K., Gaur A. Zbl. Bakteriol. Parasitenk. Infections. Krankh. Und Hyg. 1971. V. 2. № 3. P. 307.

103. Burges A., LatterV. Decomposition of Humic Acid by Fungi // Nature. 1960. № 4722.Vol. 186. P. 404 405.

104. Bums R. G., Dell'agnola G., Miele S. Humic substances effects on soil and plants. Prague. 1986.170 p.

105. Chandler D.P., Brockman F.J., Fredrickson J.K. Use of 16S rDNA clone libraries to study changes in a microbial community resulting from ex situ perturbation of a subsurface sediment // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. № 3-4. P. 217-230.

106. Christeva L.A., Galushko A.M., Gorovaya A.I. The main aspects of using physiologically active substances of humus nature // VI Intern. Peat congr. " The role of peatlands a world of limited resources energy, food and natural reas". Duluth. 1980.

107. Didier S.A.R. Contribution a l'etude de la degradation de l'humus par les microorganisms du sol // Rapp. VI Congr. Intern. Sci. du Sol. V. 1. P. 21-25.

108. Domsch K.H., Gams W. Compendium of soil fungi. Germany. Traute Heidi Anderson. Reprint der Ausg. von 1980 - Eching: IHW -Verlag. 1993.859 p.

109. Fakoussa R.M. Coal as substrate for microorganisms: investigations of the microbial decomposition of untreated hard coal // Ph.D. Thesis, Universisty of Bonn, Germany. 1981.

110. Fakoussa R.M., Hofrichter M. Biotechnology and microbiology of coal degradation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 52. № i.p. 25-40.

111. Filip Z., Kubat J. Aerobic short-term microbial utilization and degradation of humic acids extracted from soils of long-term field experiments // Eur. J. Soil Biol. 2003. V. 39. P. 175 182.

112. Filip Z., Tesarova M. Microbial degradation and transformation of humic acids from permanent meadow and forest soils // Int. Biodeter. Biodegr. 2004. № 4. P. 137 146.

113. Flaig W. Organic compounds in soil // Soil Science. 1971. V. III. № 5.

114. Flaig W.J., Schmidt H. Uber die Einwirkung von Huminsauren auf das Wachtsum einiger Penicillium Arten. // Arch. Microbiol. 1957. В. 27. H. 1.

115. Harvey R.W. Microorganisms as tracers in groundwater injection and recovery experiments: a review // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. № 3-4. p. 461-472.

116. Hayes M.H.B., Wilson W.S. Humic Substances, Peats and Sludges: Health and Environmental Aspects // Royal Soci. Chem. Cambr. 1997. P. 210-210.

117. Khandelwal K.C., Gaur A.C. Indian. J. Microbiol. 1969. V. 9. № 4. P. 87.

118. Kleinhempel D. Albrecht Thaer - Archiv, 14,3.1970.

119. Krumholz L.R. Microbial communities in the deep subsurface // Hydrogeology J. 2000. V. 8. p. 4 10.

120. Kiister E. Untersuchungen tiber die Bildung Und Zersetzung von Humusstoffen durch Microorganismen // Arch. Microbiol. 1952. B. 15. H. 1.

121. Ladd J.N., Buttler J.M.A. Humus-enzyme systems and synthetic organic polymer-enzymes analogues // Soil Biochem. 1975. V. 4. P. 3-24.

122. Laird D.A, Martens D.A., Kingery W.L. Nature of Clay-Humic Complexes in an Agricultural Soil: Chemical, Biochemical, and Spectroscopic Analysis // Soil Sci. Soc. Am. J. 2001. V. 65. P. 238 247.

123. LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits // Molecular Probes, 1999.

124. Lovley D.R., Phillips E.J. Novel mode of microbial energy metabolism. //Appl. Environ. Microbiol. 1988. Vol. 54. P. 1472-1480.

125. Maggioni A. Pinton R. Varanini Z. Influenze of humic substances on properties of root cell plasmalemma // Intern, symp. "Humus et planta DC'. Prague. 1988. P. 127.

126. Martin J.P., Branson R.L., Jarrell W.M. Decomposition the organic materials used in planting mixes and some effects on soil properties and plant growth // Agrochimica. 1978. Vol. XXLL. № 3-4. P .248-261.

127. Pedersen K. Microbial life in deep granitic rock // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. № 3-4. P. 399^14.

128. Pignaud G., Milkowska Charvignac MA, Gerd. R.M. , Pochon I. 1966. Ann. Inst. Psteur, № 1,76.

129. Pullerton V. Humic Substances and microorganisms: influence and answer // Royal Soc. Chem. Cambr. 2000. P. 234-245.

130. Schnitzer M., Khan S.U. Humic substances in the environment. New York, 1972. 327 p.

131. Steinbrenner K. Mundstok J. In "Symp.Humus.et Planta V". 1971. Pragua.

132. Stevenson F.J. Humus chemistry // 2nd ed. Wiley & Sons, New York, 1994. P. 87-103.

133. Stevenson F.J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reaction. N.Y.: Willey. 1982. V. 1. 443 p.

134. Taha S., Zayed M., Zohddy L. (цит. по Теппер, 1976).

135. Terzieva S., Donnelly J., Ulevicius V. et al. Comparison of methods for detection and enumeration of airborne micoorganisms collected by liquid impigement // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. № 7. P. 2264-2272.

136. Young J.L. Water-dispersible soil organic mineral particles: I. Carbon and nitrogen distribution // Soil Sci. Soc. Am. J. 1979. V. 43. P. 324-332.

137. Ziechmann W. Humic Substances. B.I. Wissenschaftsverlag, Mannheim, 1993.244 p.

Информация о работе
  • Постникова, Мария Александровна
  • кандидат биологических наук
  • Москва, 2007
  • ВАК 03.00.07
Диссертация
Использование гуминовых кислот почвенными бактериями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Использование гуминовых кислот почвенными бактериями - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы