Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование двойных флуоресцентных зондов для изучения мембранных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Использование двойных флуоресцентных зондов для изучения мембранных белков"

Форма 3.3

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

КАЛАЧЯН Асмик Вячеславовна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДВОЙНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ '

ОЗ.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван- 1991

Форма 3.3

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

К.ЛЛЛЧЯК Асггик Вячеславовна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДВОЙНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ 30ВД0В ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ■

ОЗ.СО.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван- 1991

Работа выполнена з Институте молекулярной биологии АН Республики Армения.

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

ведущий научный сотрудник АРУТШЯН A.A.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ВАРДЕВАНЯН ILO. кандидат биологических наук ТАДЕВОСЯН Ю.В.

Ведущее учреждение - Институт кардиологии им.Л.А.Оганесяна, МЗ РА. ■

Защита диссертации состоится 1992 г.

в "/У " час. на заседании специализированного совета'К. 055..01.( Севанского государственного университета (Ереван, 375049, уд. Мравяна, I, Ереванский государственный университет, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией .модно оьнякошться в библиотеке университета.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук(

старший научный сотрудник Л.Г.АНАНЯН

.Автореферат разослан "/1992 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопросы биодеградации , а именно специфического, биологически целесообразного и строго контролируемого протеолиза белков и разрушения надмолекулярных структур, находятся в поле зрения многих исследовательских групп. Работы, проведенные в этой области, достаточно четко можно соотнести к двум направлениям:

1. концептуальные работы, посвященные выяснению общих закономерностей биодеградации,

2. работы проводимые с целью выявления конкретных особенностей биодеградации, которые часто связаны с постановкой побочных задач.

К последнему типу работ относятся исследования биодеградации пептидных гормонов, преследующие цель прослеживания путей генерации и инактивации пептидов - носителей тех или иных биологически - важных активностей. Химики-синтетики подходили к этой проблеме апробированием на биологическую активность тех же коротких пептидов,образовавшихся в результате протеолиза прогормо-на. В работах же концептуального плана первостепенное значение приобретает изучение физико-химических свойств как самих подвергаемых биодеградации объектов,так и их ближайшего молекулярного окружения. В целом оба эти направления исследований дополняют друг друга.

Настоящее исследование относится к первому направлению работ. Поставленная задача предопределила поисковый, методический характер работы, и с самого начала мы поставили задачу как разработки адекватных методов исследования,так и поиска соответствующих субстратов.

В данной работе новый методический подход с условным названием "многокоординатная экстракция" был реализован на примере мембранных белков эритроцитов человека. В итоге, начиная с синтеза белковых субстратов с двойными флуоресцентными зондами, получения модифицированных теми же зондами эритроцитарных мембран, работа завершена изучением физико-химических особенностей меченных флуоресцентными зондами белков.

При этом получена качественно новая информация о биодеградации белков,входящих в состав мембраны.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы

явилось изучение физико-химических особенностей меченных флуоресцентными зондами мембранных белков эритроцитов человека.

В работе были поставлены следующие основные задачи:

- синтезировать белковые субстраты с флуоресцентными метками для определения протеолитической активности;

- получить плазматические мембраны эритроцитов человека,меченных теми же флуоресцентными зондами;

- экспериментально реализовать идею нового методического подхода-метода многокоорданатной экстракции-дня плазматических мембран эритроцитов человека;

- изучить особенности автолиза и последующего протеолиза внепшвдобавленными протеолитическиш ферментами мембранных стру! аур;

- исследовать особенности экстракции мембранных белков в норме и при патологиях.

Научная новизна и практическая ценность работы. Синтезированные субстраты с флуоресцентными зондами,являясь весьма чувствительными, и неспецифическими субстратами протеиназ,одновременно позволяют дискриминировать гидролизованные молекулы от исходных в растворах соли, т.е. в условиях,вызывающих изменение пространственной локализации глобулы белка. Модификацией флуоресцентными зондами получены разные типы мембран с ожидаемыми свойствами, изучены их физико-химические особенности. Показано-, что, в зависимости от црироды модифицирующего агента введение зондов в той или иной степени вызывает расслабление связей мембранных белков с материнской структурой.

Исследование особенностей экстракции белков, автолиза и цротеолиза внешне добавленными протеолитическиш ферментами модифицированных целостных мембранных структур позволило изучить общие закономерности биодеградации белков в составе надмолекулярных комплексов.

Применение чувствительного, нового методического подхода -метода многокоординатной-экстракции позволило выявить достоверные отклонения в белковой картине у больных с отклонениями сердечного кровообращения. Эти данные могут найти применение в клинической практике в качестве тест - анализа в диагностических целях.

Апробадия работы. Материалы диссертации были представлены на 17 Республиканской молодежной конференции по физико-химичес-

кой биологии (Ереван, 1987), на III конференции молодых ученых ИЗБ ЛН Арм. ССР (Ереван, 1988), на конференции молодых ученых к специалистов р-на 26 Комиссаров (Ереван, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссдртадии, Работа состоит из введения, трех глав (I - обзор литературы, П - объект и методы исследования, Ш - результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на III страницах машинописного текста.

Библиография включает 106 наименований литературных источников.

В обзоре литературы подробно изложены современные данные о физико-химических свойствах мембранных белков эритроцитов человека, о мембран-овязанных протеолитических ферментах и методах определения лротеолнтической активности, а также обсуждаются методы солюбилизации белков.

Краткое содержание остальных глаз приводится зшжэ.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение фосфопиридоксилглобина и измерение его активности протеазами проводили по методике (Т.Н.Акопян, 1978), Для получения фосфошфидоксильного дансилщэоизводного глобина к 100 мг фосфопиридоксилглобина в 20 мл 0,1М'УоЯС03 и добавляли 5 мл 0,05$ дансил хлорида в ацетоне. Смесь оставляли на 5 часов при комнатной температуре. Полученный субстрат очищали от побочных продуктов реакции на колонке с сефадексомС-25/5x30 им; 0,01 М у'/а-фоо-фатный буфер рН 7,4. Для получения фосфошфидоксилфдуоресцеиктио-карбамильного производного глобина 100 мг фосфопирадоксклглобина растворяли в 20 мл 0,1$ флуоресцеинизотиоцианата в этаноле; далее постулата как описано выше. Субстраты разливали в ампулы и хранили при -20°С. Для изучения гидролизуемости субстратов под действием трипсина, хкмотрипсина и пепсина до 100 мкг субстрата инкубировали (30 мин; 37°С) с 0,2 мкг фермента з 0,5 мл пробы, содержащей 0,1 М у*/а-фосфатный буфер, рН 7,6, либо \л/а-цитратный буфер, рН 3,5.

При изучении влияния солей на флуоресцентные характеристики субстратов и гидролизатов субстратов 100 мкг каждого из субстратов гидролизовали трипсином ь соотношении 10:1 в течение ночи при 37°С. За 30 мин. до измерений в пробы добавляли необ-

ходимое количество насыщенного раствора соли, брали йликвотн и без осаждения приступали к измерениям.

Для измерения зон протеиназ непосредственно в столбике ге ля после электрофореза в описанных условиях гель погружали на 30 мин. в 0,02$-ный раствор фосфотфидоксилфлуоресцеинтиокарб-амилглобина в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, при 0°С. Далее гель переводили в пробирку с тем же раствором, выдерживали 10 мин., сливали буфер и добавляли насыщенный раствор сульфата а» мония. Через 1ч. образцы рассматривали при дайне волны 495 ш используя монохроматический пучок света в измерительной ячейке флуориметра.

Получение отмытых эритроцитов и эритрооитарных тене%. В р боте использовали эритроцитарную цитратную венозную массу здо ровых доноров (отмытую уже от плазмы в НИИ переливания крови М РА) и цельную кровь большее, находившихся на излечении в НИИ х рургии МЗ СССР с диагнозом венозная и артериальная недостаточность.

Отмывку эритроцитов и эритроцитарных теней производили со гласно методике (Тулак П.В., 1983) с некоторыми модификациями.

Гемолиз проводили путем постепенного добавления эритроци-тарной массы в 20-и кратный объем 5мМ Т£ис-НС1 буфера с рН 8,С при перемешивании на магнитной мешалке в холодильнике. После гемолиза полученную суспензию 2-3 раза центрифугировали при 14000 об/мин по 30 мин. до получения бесцветного надосадка, св бодаого от гемоглобина. Затем тени центрифугировали ,1-2 раза в тех же условиях, но при рН буфера равном 7,4 (препарат при это становится практически белым, что соответствует окончательной отмывке от гемоглобина). Готовый препарат теней хранили при 4° для использования в эксперименте в течение 1-3 суток, либо в з мороженном виде при использовании в течение месяца (допускаете лишь однократное размораживание).

Экстракция мембранных белков. Исследование характеру экст гируемости белков из мембранного матрикса в двухкомпоненгнше средах проводили в 16 отдельных пробах. В каждую пробу с 200ум суспензией мембраны (концентрация белка 2 мг/мл/по белку) доба ляли 200уи/ буфера, цриготовленного таким образом, чтобы конеч ные концентрации экстрагирующих веществ в эпендорфе ооответота вали координатам определенной точки экстракции. Значения коорл

на? на осях экстракции соответствовали для >л/аС1 - концентрациям 0; 0,14; 0,35; 0,7 М, .для тритона Х-100 - концентрациям 0; 0,05; 0,25;1,25 % и расположены на осях в порядке их возрастания. Экстракцию проводили в течение I ч. при 0°С при непрерывном перемешивании. Экстрагированные белки отделяли от мембраны центрифугированием 14000 об/мин в течение 1ч., надосадки отбирали для проведения электрофореза. Операции солюбилизации и осаждения проводили строго идентично для всех проб, что достигалось использованием общего штатива для перемешивания и специально изготовленных деревянных вкладышей в центрифужные гнезда, содержащая по 8 позиций для отдельных проб (т.е. одновременно можно было осаждать до 64 образцов).

Получение плазматических мембран - меченных Флуоресцентными зондами. Выделенные из человеческих.эритроцитов мембраны модифицировали флуоресцентными зондами вышеуказанным методом. Сшивку флуорофоров с плазматическими мембранами проводили в ледяной бане в течение 2-х ч., при перемешивании магнитной мешалкой. Очищали от побочных продуктов последовательным промыванием в растворе 10 мМ vJaHCCu. Экстракцию меченных мембранных белков проводили вышеизложенным методом. Белок в аликвотах определяли методом Брэдфорда ( Bradford М.Е., 1976), а измерение флуоресценции на спектрофотометре " Fsrrand " (США).

Получение автолизированных мембран. В работе использовали плазматические мембраны, которые были подвергнуты автолизу. При этом изучали:

а) автолиз интактных эритроцитов

б) автолиз выделенных плазматических мембран

Автолиз на обоих уровнях проводили при комнатной температуре в течение G, 3-х и 18-и часоЕ. Выделение эритроцитарных теней производили вышеописанным методом. Автодизир с/ванные на обоих уровнях мембраны подвергались обработке протеолитическими ферментами трипсином и химотрипсином в соотношении I:I000Q по белку в течение 10 минут при комнатной температуре. После чего проводили 2-3-х кратную промывку в Трис KCl буфере с pH 7,4 .для освобождения от гидролизованных белков. Экстракцию проводили вышеописанным методом.

Электрофорез белков эритроцитов. Разделение белков зрит-роцитаркых теней проводили ДСН - гель - электрофорезом в двух-

ступенчатом ПЛАТ 3% и 10$ согласно Лаэмшш ( Laenmii U.K., 1970) с использованием silane -AI74 ( sigmo) для сшвки геля к стеклу. В аликвотах солюбилизированного белка белок определяли методой Брэдфорда (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта сывороточный глобин. После окончания электрофореза гель окрашивали 0,25$ раствором Кумасси (К-250) в 40$ изопропаноле и 10$ уксусной кислоте. Обесцвеченный гель на 5 минут пох'ружали в фиксирующий раствор, содержащий 3$ глицерина и 70$ изодропанола,и сушили на Еоздухе.

Сканирование денситограмм. Денситометрирование белковых по лос проводили на uitrascan XI (ШЗ) при 633 нм. В качестве вели чины, характеризующей концентрацию белка в экстракте, рассматривается лишь высота пика Г, регистрируемая при сканировании электрофореграммы. При этом т исходим иэ того, что полуширина гауссозских пиков благодаря одинаковой дистанции миграции белка на разных треках практически одинакова, и эта постоянная состав ляющая при сравнительных исследованиях теряет смысл.

РЕЗУЛЬТАТЫ К ОБСУЖДЕНИЕ

Белковые субстраты протеиназ с двойными флуоресцентными зондами. При работе с фо сфопиридо к си лгло бином наш было замечено, что этот субстрат хорошо растворим при различиях значениях рН к по сравнению с немодифицированным исходным белком-глобином гидролизуется под действием самых разных протеиназ. В то я« врет известно, что наиболее часто используемые и удобные ддя ковалеятной модификации белков флуорофоры, такие как, дансил и флуоресцеин, не только снижают растворимость, но и ухудшают атакуомость субстрата протеазаш. Поэтому при синтезе субстратов, обладающих флуоресценцией в ьидамой области, в качестве исходной белковой молекулы мы использовали уже модифицированный пиридоксаль-5-фосфатом глобин, предполагая, что фосфопиридок-сильный фяуорофор в синтезируемых субстратах обеспечит хорошую растворимость и хтсдролизуемость на фоне указанных отрицательных свойств дансила и флуоресцеянтиокарбашила.

Исходный субстрат, фосфошфидоксЕлглобин, дополнительно модифицировали, по описанному в методической части способу , дансил хлоридом или флуоресцеинизотиоцианатом. При этом было получено два субстрата с двойной флуоресцентной меткой; фосфо-

гатридоксилфдуоресцеинтиокарбамилглобин и фосфопиридоксилдансил-глобин. С помощью трипсина, химотрипсина и пепсина была изучена гидролизуемость полученных субстратов. Наибольшую гидролизу-емость обнаруживает фосфопиридоксилфлуоресцеинтиокарбамилгло-бин. Эти данные позволяют представить следующий ряд субстратов характеризирующихся возрастающей гидролизуемостью протеазами: фосфопиридоксиддансилглобин, фосфопиридоксилглобин, фосфопири-доксил-фпуоресцеинтиокарбамилглобин. Результаты свидетельствуют о том, что дансильная метка сильно препятствует протеолизу субстрата. В дальнейшем наше внимание было сконцентрировано на более детальном изучении фосфопиридоксилфлуоресцеинтиокарбамил-глобина. Получены спектры поглощения и флуоресценции этсго субстрата (фиг.1А,Б). Флуоресценция при Л = 525 нм, обусловленная флуоресцеинтиокарбамилом, наблюдается при ^воз^.= 330 нм (кривая I) и 495 нм (кривая 2).

Фигура I. Спектры поглощения' (А) и флуоресценции (Б) фосфопи-ридоксилфлур есцеинтиокарбамилгло бина. Фпуоре сценция при А = 525 нм, обусловленная ФТК при Л возй>=330 (кривая I) и 495 нм (кривая 2).

Однако интенсивность флуоресценции,вызванная возбуждением при '^ возб = нм'примерно в 20 раз превышает таковую для волны

возбуждения 330 нм. Одновременно интенсивность флуоресценции,

*

обусловленная флуоресцеинтиокарбамилом, примерно в 20 раз выше, чем фосфопиридоксилом (рК 7,5). Приведенные данные свидетельствуют о том, что с этим субстратом чувствительность обнаружения протеолкза может быть ка порядок выше, чем с фосфопири-доксилглобином. Модальные опыты с использованием трипсина, хи-мотрипсина и пепсина показали, что при работе с этим субстратом можно достоверно обнаружить протеолиз, используя 0,01 МКГ фермента.

Измерения, проведенные в интервале т.>Н 3-9, свидетельствуют о том, что при рН ниже 5 флуоресценция, обусловленная флуоресцеинтиокарбамилом подавляется, причем при повторном повышении рН она не достигает исходного значения. По-видимому, при кислых значениях рН гояуоресцеинтиокарбамил претерпевает необратимые изменения. В то же время колебания интенсивности флуоресценции, обусловленные фосфопиридоксилом в указанном интервале рН, обратимы.

На фиг.2 представлены результаты модельных опытов, в которых фосфопиридоксплфлуоресцекктиокарб амилглобил был йспользован в качестве субстрата для определения протеиназной активности в вырезанных ломтиках геля после электрофореза (см. методы). Отклонения,полученные с параллельных гелей, не превышали 10-15$. Следует отметить, что обнаружение проведено с использованием всего 5 мкг субстрата.

При глубоком гидролизе фосфопиридоксилфлуоресцеинтиокарба-милглобина ферментами было установлено, что интенсивность флуоресценции гидролизата в 2-3 раза превышает исходное значение интенсивности флуоресценции нещцролизованного субстрата. Сходные результаты были впервые получены в опытах по изучению гид-ролизуемости субстратов. По-видимому, вследствие протеолиза существенно меняется окружение флуорофора, и его квантовый выход увеличивается. Мы попытались использовать это явление для разработки метода непосредственной регистрации результатов гидролиза без осаждения ТХУ. С этой целью было изучено влияние различных солей ка флуоресцентные характеристики исходного и гид-ролизованного трипсином субстрата. Апробировались различные соли, и было обнаружено, что сульфат аммония проявляет удовлетво-

я

а

ф я ж

(И (Н

и

о о и н о

495-525

си

а

о

0) &

Е?

Фигура 3,

я

- я

§ а

й си

ф ф

8" я

ф

Рн О

60 80 100$ концентрация (у/Н^й

Влияние разных концентраций сульфата.аммония на интенсивность флуоресценции гидролизованного трипсином 3,3'и 4 и исходного 1,1'и 2 фосфопиридоксил, флуорсце-интиокарбамилглобина в 0,1 М/а-фосфатном буфере, рН 7,5. В скобках рядом с кривыми даны длины волн соответственно возбуждения и флуоресценции, при которых регистрировали значения. За 100% принята концентрация сульфата аммония в условиях насыщения при 20°С.

Д

>1.

I

10

20 30 40 50

номера фракций

Фигура 2. Измерение протеиназной активности после электрофореза в 7,5% ПААг белков растворимой фракции тонкой кишки крысы.

рительный для выдвинутой задачи эффект. На фиг.З представлены данные о влиянии разных концентраций сульфата аммония на интенсивность флуоресценции гидролизованного и исходного субстратов. По мере увеличения концентрации соли интенсивность флуоресценции негидролизованного субстрата (кривые I, 1'и 2) подавляется по обоим флуорофорам, что по-видимому, обусловлено сворачиванием молекулы субстрата в нерастворимую, взвешенную в'растворе форму. На гидролизованном субстрате обнаруживается иная картина: при концентрации; сульфата аммония более 5-10% интенсивность флуоресценции, обусловленная фосфопиридоксилом, возрастает на 20-30% (кривая 4), а флуоресцеинтиокарбашлом - гасится на 6070% (кривые 3, 3"). Таким образом с помощью сульфата аммония можно отдифференцировать гидролизованный субстрат от исходного.

Изучение плазматических мембран эритроцитов человека*меченных флуоресцентными метками

Следующий этап в нашей работе - получение меченных флуоресцентными метками мембран. Мы предполагали, что особенности, обнаруженные на модельных меченных флуоресцентными зондами белках, могут быть полезны при изучении сложных надмолекулярных объектов, например мембран эритроцитов. Мы ожидали, что исследование даст информацию о влиянии флуоресцентной метки на характер взаимодействия белка в процессе выхода из состава структуры. При этом сами белки могут являться субстратом для протеолити-ческих ферментов и через них можно будет подходить к изучению особенностей биодеградации белков в составе надмолекулярных комплексов.

Нами были получены меченные флуоресцентными зондами мембраны следующих типов:

1. ИЛ - Р1.Р (плазматическая мембрана,меченная пиридоксаль -

- 5'-фосфатом).

2. ПМ - ДНС (плазматическая мембрана,меченная дансил хло-

ридом) .

3. Ш - ФТК (плазматическая мембрана,меченная флуоресцеин-

изотиоцианатом).

4. ПМ - РЬР^ФТК (плазматическая мембрана,меченная одновре-

менно пиридоксилфосфатом и флуоресценизо-тиоцианатом).

- 13 -

Дальнейшая работа с перечисленными меченными мембранами сводилась к изучению их свойств с применением метода многокоординатной экстракции мембранных белков. Эти опыты проведены со всеми вышеотмеченными модифицированными мембранами, кроме мембран с двойной меткой ПМ - ФТК^ДНС, поскольку сшивка этой пары меток с мембранными белками приводит к дестабилизации мембранной структуры и уже на этапе очищения от побочных продуктов мембрана разрушается.

В системе \л/аС1-тритон для всех вариантов меченных мембран были получены данные в виде таблиц-диаграмм экстрагируемос-ти всех белков и поверхностей экстракции. В качестве контрольных проб служили немеченные плазматические мембраны.

Работы по экстракции белков из модифицированных флуоресцентными зондами плазматических мембран показали, что введение зондов в той или иной степени (в зависимости от природы модифицирующего агента) вызывает расслабление связей мембранных белков с материнской структурой. Этот эффект наблюдается как для меченных,так и для незатронутых модификацией белков (фиг.4А).

Обнаружены некоторые четкие общие закономерности. Все типы меченных мембран обнаруживают тритон-зависимый выход белков. Соль-зависимый выход выражен в случае фосфопиридоксил содержащих и слабее - дансил содержащих плазматических мембран. Флуо-ресцеинизотиоцианат-модифицированные белки не обнаруживают солевую экстракцию. Эти особенности свидетельствуют о том, что модифицированная мембрана практически не содержит слабо ассоци-рованных белков. Они,по-видимому, удаляются уже на стадии процесса модификации.

Таким образом модифицированная флуоресцентными зондами мембрана содержит лишь сильно ассоцированные с липидным бисло-ем белки (трансмембранные и резко гидрофобные белки).

С целью выяснения особенностей пространственной локализации флуоресцентных зондов на мембране и оценки гидролизуемости белков при наличии вышеотмеченных флуоресцентных меток наш были проведены эксперименты,в которых меченные плазматические мембраны обрабатывались протеолитическими ферментами, трипсином и химотрипсином (фиг.4Б). Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что после гидролиза количество меченного белкового материала составляет порядка 8-10$ от исходного, однако по белку - около 40-50$. Этот факт указывает на то, что,по-ви-

Фигура 4(А). Поверхности экстракции в системе ЫаС1-тритон для белков плазматических мембран, модифицированных двойной флуоресцентной меткой РЬР-^ТК: 1/контроль, 2/выход по белку, 3/выход по флуоресценции РЬР, 4/выход по флуоресценции ФТК.

дошому,модификации подвергается небольшая доля белковых цепей, которые затем эффективнее подвергаются гидролизу, чем нативные участки.

Экстракция оставшихся после гидролиза белков практически не зависит от концентрации соли. Этот факт легко объясним - гад-ролизованы экспонированные в водную среду гидрофильные полипептидные цени трансмембранных и слабо ассоцированных белков, следовательно ионные взаимодействия практически отсутствуют и потому нет эффекта от срли. Наоборот, выход в зависимости от тритона выражен, хотя обнаруживается пока необъяснимый эффект -при высоких концентрациях тритона еыход белков подавлен.

Анализ результатов этого раздела показывает, что сочетанием модификаций флуоресцентными зондами и ограниченного проте-олиза можно подучить препараты мембран с особым белковым компонентом (меченным, частично гидролизовашшми гидрофильными полипептидными целями и т.д.), которые могут служить в качестве удобной модели при решении различных биохимических задач.

Сравнение данных также (рис.4Б) свидетельствует о том, что при гидролизе в большей степени удаляются ФТК-содержащие пептиды,чем РЦР-содержащие полипептидкые цепи. Детали хода экстракции, выявленные на диаграммах.свидетельствуют о том8 что экстракция гидролизованных белков резко отличается от таковой для не-гидролизованного материала. В этом случае обе координаты становятся как бы неэффективными (в данных пределах экстрагирующих концентраций). Этот феномен,как было отмечено,объясняется,по-видимому, отсутствием в гидролизованком материале периферически ассоцированных белков или белков с гидрофильными полипептидными цепями. Гидролизованная мембрана представляет из себя более жесткую структуру, а для ее разрушения нужны более высокие концентрации деструктирующих агентов.

Исследование плазматических мембран эритроцитов человека после автолиза и гидролизованных внешне добавленными про-теолитическими ферментами

Получение путем гидролиза внешне добавленными протеолитичес-кими ферментами вышеотмеченных структур натолкнуло нас на мысль проводить более детальное исследование мембранных структур, подвергаемых автолизу и дальнейшему воздействию внешне добавленными

TRYPSIJV

СHYMOT HYPS! Я

Фихура 4(Б). Поверхности экстракции белков в системе NaCI-три-тон. для ПМ-РиР~ФТК, гидролизованных внешне добавленными протеолитическими ферментами: I/ тршсин-обработанных, 21 химотршсин-обработанннх, а/ выход по флуоресценции РЦР, б/ выход по флуоресценции ФТК.

протеолитическими ферментами. Нас интересовал вопрос:«каким приблизительно конструкциям мембраны приводит автолиз и к каким - внешний протеолиз. Для проведения этих работ предварительно были получены диаграммы-таблицы экстракции контрольных и автоли-зированных в течение 18 часов образцов. Поскольку расные вариации условий эксперимента,которые предстояло изучать,были очень велики, мы решили предварительным экспериментом выявить такие точки на диаграмме экстракции, через которые проходят (или близко расположены) линии полувыходов белков. Мы ожидали, что маленькие сдвиги в характере ассоциации белков будут видны на этих "чувствительных" точках,

В этих экспериментах для полюбилизации мы использовали двух-коордаиатную экстракцию с осями 0,00 - 0,17 - 0,35 - 0,7 M VaCI и 0,00 - 0,05 - 0,25 т- 1,25$ тритон. На основе этих экспериментов были выбраны точки 8,11 и 14 в качестве чувствительных,и дальнейшая работа выполнена на этих точках. Эта точки на даухкоординат-ной сетке расположены как бы на одной линии и представляют из себя сочетания из разных концентраций соли и тритона: точка 8 -0,17 M 1л/аС1 1,25% тритон, II - 0,37 M v^aCI 0,25$ тритон и 14 -0,7 M WaCI 0,05$ тритон. В дальнейших экспериментах варьировались следующие условия:

1. зремя автолиза,

2. присутствие или отсутствие ионов Са Т

В результате серии опытов был выбран временной интервал автолиза , соответствующий 0, 3 и 18 часам. Практически во всех точках экстракции (8, II и 14) обнаруживается примерно однотипный выход белков. При этом четко разграничиваются три типа белков.

1. Белки,экстрагируемость которых не зависит от автолиза (белки полосы 13 ЭР, ИМ - 18 ЭР, ПМ - 17 ЭР, ПМ).

2. Белей,выход которых увеличивется по мере автолиза (белки полосы 2 ПМ, - 7 ЭР, IM - 8ПМ - 9 "ЭР, Ш - 10 ЭР, ПМ

- II ЭР, ПМ - 14 ПМ - 15 ЭР, ПМ).

3. Белки,выход которых проявляет двухфазный характер:

- увеличение при 3-х чассвом автолизе и уменьшение - при 18 часовом.

(белки полосы 2 ЭР - I ЭР, Ш - 3 ЭР, Ш - 4 ЭР, ПГЛ -8 ЭР).

Очевидно, что первый тип гкетракции относится к белкам, которые .не подвергаются автолизу- и автолиз соседних молекул не от-

- 18 - •

ражаетсн на их сродстве к мембране. Второй тип экстракции хараг< терен для белков, которые,по-видимому,сами не подвергаются автс лизу, однако в результате автолиза соседних молекул либо расщепления очень небольших пептидов, либо концевых аминокислот, поддерживающих,их в составе мембраны, они высвобождаются по мере автолиза. Третий тип экстракции относится к автолизируемым белкам, о чем свидетельствует ход кривых из экстракции в зависимости от времени автолиза. Уменьшение их количества при 13-часовом автолизе в анализируемых точках (8, II и 14) свидетельствует о том, что мы имеем дело не с затруднением экстракции в этих точках, а просто их малым количеством,остающимся в мембране. Увеличение выхода при 3-х часовом автолизе имеет аналогичное с типом 2 .объяснение с наложением собственного автолиза,прс исходящего по малым фрагментам (которые практически не отражаются на их электрофориетической подвижности).'

Данные по изучению влияния ионов Са^+ на автолиз белков в составе нативных эритроцитов и выделенных мембран приведены на фиг.5(1,2). Результаты указывают на то, что в целом обнаруживаются те же закономерности (типы I, 2 и 3), которые обсуждались выше. Однако заметны существенные сдвиги в сторону усиления автолиза з присутствии Са2+. Сравнение данных автолиза в присутствии Са^"'г на уровне нативных эритроцитов и плазматических мемс ран показывает, что практически во всех случаях автолиз усилен для выделенных Ш. Этот результат закономерен,поскольку если I мембране нейтральные прстеиказы могут активироваться Са^+, то I натиьном эритроците сама мембрана и другие внутриклеточные мехг цизмы воспрепятствуют активирующему воздействию С другой

стороны сравнение результатов автолиза в присутствии Са'"+ в ко! троле показывает, что Са~+ активирует автолиз белков как в составе мембраны, так к в составе выделенных ИМ.

Для выяснения особенностей комплексообразования' белков в составе надмолекулярных комплексов препараты мембран подвергал! дальнейшему протеолизу внешне добавленными протеазада. При этом мы предполагали, что если автолиз происходит более или менее равномерно по всему объему мембранной структуры, то дальнейшая обработка автолкзированных препаратов должна проявлять большую гидролизуемость внешними протеазами при более глубоких автолитз ческих превращениях. Выяснилось, что после автолиза 0-3-18

РгоСехп 17

Фигура 5(1,2). Поверхности экстракции в система */аС1-тритон белка полосы 1Ь 17: 2/ в безкальциевой среде, I/ в присутствии ионов

а/ в составе нативных эритроцитов

б/ в составе выделенных мембран (условия см. в

тексте).

часов и последующего трипсинолиза в зонах преимущественно высо комолекулярных пептидов для Ш - автолизированных препаратов вы деленных мембран при поздних временах автолиза трипсин действуе эффективнее, и количество экстрагированных белков резко уменьшается (фиг.6). Эта закономерность обнаруживается также для хшло-трипсин-обработанных препаратов (хотя менео слабо выражений. ), случае автолизированных эритроцитов глубина автолиза также отра жается на результатах последующего протеолиза. Объяснение этого эффекта возможно заключается в том, что нативный эритроцит хотя и более подвержен автолизу, но слабо поддается внешнему протео-литическому воздействию, что и следовало ожидать.

Спектры экстрагируемых белков эритроцитаркых мембран

у больных с отклонениями сердечного кровообращения

Для выполнения этой работы предварительно в нашей лаборатории была изучена воспроизводимость данных экстракции белков в точке II двухкоординатной диаграммы экстракции эритроцитов у . разных доноров. Серии опытов,доведенные на группах по шесть до норов показали, что для большинства белков воспроизводимость ре зультатов составляет порядка 15-20%. Для трех белков обнаружена достоверные воспроизводимые отклонения от средне статистического значения порядка 40%. При изучении аналогичных параметров у больных опыты выполнены в сериях на шести больных с артериальной и венозной недостаточностью, на двух точках экстракции (точ ки II и 16). Точка II, как было отмечено выше,является чувствительной точкой перехода на двухкоординатной диаграмме тритон -\л/аС1. Точка же 16 является максжлально-экстрагирующей точкой. Эти данные представлены на фиг.7. На основании этих результате! условно можно выделить три группы белков (по граничным условиям выявленным на донорах).

Первая - 6елки,отклонение которых от средне стат^гстическо! значения составляет менее 20% (фиг.7,а), белки полос 1,8,10,1-! 18. У второй группы.белков (белки полос 2,4,5,6,9,11,12,13,15, 17,20) отклонения их количества от средне статистического значения составляет до 40% (фет.7,6). Б третью группу входят два белка (белки полос 16 и 19), у которых отклонения выше 40% (фиг.7,в). Сравнение результатов опытов на донорах и на больнш свидетельствует о том, что у больных в среднем обнаруживается

Ch— Trypsin

Фигура 6(1,2). Поверхности экстракции в системе ЫаС1-тритон белка полосы 17: I/ обработанных трипсином, 2/ обработанных химотрипсином препаратов.

а/ в составе нативных эритроцитов

б/ в составе выделенных мембран (условия см. в тексте).

Рго1е1п 1 в

Ч

Рго1е1п 1 €>

<йиура 7. Величина выхода белковых фракций Ш 18, 16 ,и 2 в точке 14: № I - контроль (донорская кровь), № 2-4 больные с артериальной недостаточностью, № 5-7 с венозной недостаточностью.

больше отклонений чем у доноров» Эти эксперименты являются, предварительными^ на данном этапе мы не можем однозначно заключить, что эти отклонения именно отражают болезненное состояние. Мы лишь уверены, что по мере накопления данных в этом аспекте станет возможным использование данного подхода в качестве поддающегося количественной оценке тест-анализа для диагностических целей.

выводи

1. Синтезированы белковые субстраты протеиназ с двойной флуоресцентной меткой. Изучены спектральные характеристики и тидроллзуемость полученных субстратов, а также влияние некоторых неорганических солей на флуоресцентные характеристики этих субстратов. Показано, что с помощью сульфата аммония можно отдифференцировать гидролизованннй субстрат от исходного.

2. Для плазматических мегд^шан эритроцитов человека экспериментально реализована идея нового подхода - метода многокоординатной экстракции.

3. Получены модифицированные флуоресцентными зондами - ли-ргдоксал^-5-фосфатом, дансил хлоридом и флуоресцеинизотиоциана-том пл.азматические мембраны орзтроцатов человека, а также мембраны, модифицированные двойной меткой РЦР я ФТК. Показано, что введение зондов в той или иной степени (в зависимости от природы модифицирующего агента) вызывает расслабление связей мембранных белков с материнской структурой.

4. Об^аружэн тритон-зависимый выход белков всех типов меченных плазматических мембран'.

5. Проведено изучение подвергнутых автолизу, а также воздействию внешне добавленными протеолитическими ферментами мембранных структур. Показано, что после автолиза и последующего трипсинолиза, в зонах преимущественно высокомолекулярных пептидов количество экстрагированных балков резко уменьшается.

6. Показано, что балки мембран в составе эритроцитов более подвержены автолизу, чем в составе выделенных плазматических мембран.

7. Изучены особенности экстракции белков мембран эритроцитов у шести больных и выявлены достоверные сдвиги в изучаемом параметре по сравнению с таковыми у доноров.

- 24 -

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Arutunian A.A., Abramian A.Sh., Kalachiftn H.S., Mnatsa nian G.A., Sarvazian N.A., Akopian Т.Л. A new approach ior efcr tural protein investigation. Abs. o,f 10-th Intern. Biochem. Co ress, р.^б, Prague, 19B8.

2. A.C.Калачян, Мнапакадуш I.A., Акопян Т.Н., Арутюнян А.. Белковые субстраты протеиназ с флуоресцентными метками. Украин кий биохимический куриал, 1988, т.60, № 2, с.П-15.

S. Калачян A.C., Агаджанян А.Г. Метод прямой детекщйг про теиназной активности в ПЛАТ. Тезисы, докладов 1У республиканско молодежной конференции по физико-химической биологии. - Ереван 1987, с.20.

4. Мнацаканян Г.Л., Калачян A.C., Арутюнян A.A. Исследова ние белков мембран эритроцитов с помощью двухкомпонентных солю билизаторов. Тезисы докладов Ш конференции молодых ученых института экспериментальной биологии АН Арм.ССР. - Ереван, 1938, с.54, , '

5. Мнацаканян Г.А., Калачян A.C., Шагинян К.А., Арутюнян A.A., Акопян Т.Н. Двухкоординатная солюбилизация мембранных белков. Биологический журнал Армении, 1989, 6 ,/42/, с.538-546.

6. Мнацаканян Г.А., Калачян A.C., Оганесян А.И. Исследова ние белков эритроцитов кур методом многокоординатной экстрara.pi Тезисы докладов 6-ой научно-технической конференции молодых уч ных и специалистов р-на 26-и Комисс. - Ереван, 1990, с.74.

7. Мнацаканян Г.А., Калачян A.C., Шагинян К.А., Акопян Т. Арутюнян A.A. Графическое описание динамически равновесного со тоянил мембранных белков в составе макроструктуры. Биол.ж.Арме нии, 1990, т.№ 12 /43/, с.984-991.

8. Мнацаканян Г. А,, Калачян A.C., Абрамян А.Ш., Аруиояян A.A. Исследование изменений в статусе белков мембран эритроцит человека, вызванных длительным хранением крови и модификацией мембран фосфолипазой Ар, Биол.ж.Армении (в печати).