Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование модельных и природных мембран с помощью родаминильных, антрилвинильных и периленоильных флуоресцентных липидных зондов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование модельных и природных мембран с помощью родаминильных, антрилвинильных и периленоильных флуоресцентных липидных зондов"

РГБ ОД

ЫОСКОВ&КИЙ ЛШщ'/ТРУДОБОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ШзИКО--ТЕХНК71ЕСККИ

ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 577.336:547.81 5-4:^35.375

?аз:шков Владимир 'Иванович

исследование МОДЕЛЬНЫХ -И ПРИРОДНЫХ ъш^Дн. с ПОМОЩЬЮ годлмжсшъшх, Андаишшькых и перилекоильнкх флуоресцентных ЛШИДНЫХ зондов

33.00.02. - биофизика

Автореферат на соискание уч>. ,ой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Институт бкоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова Российской' академии наук.

Научный руководитель:-'

доктор х мичлских наук Юл.Г. Моло^овокий Официальныз оппоненты:

доктор физико-математических наук Иванов В.К. кандидат химических наук Барсуков Л.И.

Веду.,ля организация: Физический Институт им. П.Н. Лебедева РАЛ

3 &

Защита состоится ■ ^О ~Э94 года е У^/чааоъ на ьаседаник Специг чзированного ученого соЕета К.063.91.10 при Московском физико-техническ л институт«- по адресу : 14X700, Московская облг ть, I'. Долгопрудный, Институтский пер., Э, МФТИ, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ

% ■ п 9 9

Автореферат разослан ^ • ^ ■ ^ '

Учений секреть^ь

Специализировант-.'о ученого совет-кандидат физико-математических наук

тз.б.

Киреев

г

Лшуслъноапь проОле.'т. При исследовании биологических мембраь вирско применяются флуоресцентные лилкдгше пойди; с их пс1. дьп получена многие важгае данные о структуре мембраь, взаимодействии их компонентов, с процессах., 'б .ом числе быстротекущих, в мембранных системах. Для эффективного использования флуоресцентных липидных "ендов требуется ьсосторомнее зкснке иг свойств и поведения.

Изучений слияния mc-v.jpэн - одна из .бластей широкого пркмеггеная флуоресцентных лияздных зондов. Вахяость работ в -той области обусловлена не только той рс..ыо, » орув кгреат процессы сдкяния при функитокироважта ¡'.-поток, ко а значением этих крсцессоз в практическом примемении м-л 'рашшх -препаратов, прежде всего при достаьке лклосомалышх ' лекарственных 4ор;.( к целевом тканям и органа-. Исследог ная, пропадеюте в от..» области, г- : явили слохяув картину событий, приводящих к слиянии. Да настоящего време;ш з такого рода экспериментах использ"ется -сггально огрякичет-з"* набор зондов, поведение их в мембране зачастую детально не изучено.

Другой областью использования (¡Флуоресцентных зондов является исследование изменения структуры мембран -.леток пря их функць..-нировашп Любые процессы, в которых участвуют мемс«,акные белки, например связывание антигена с антителом, взаямодсйст :э лиганда с рецептором, вызывает изменения состояния липидных ког/понентов мембраны, что может быть зафиксировано мембранными зондами. В частности, недавно было показано, что лигтд-спецкф'лческие флуоресцентное зонда, т.е. природные липида, несущ«" флуорофзр а гидрофобной ' области и поэтому близкие по свойствам исходным природным веществам, позволяют количественно оцешпзать взаимодействие лгтакд' с мембранными рецепторами; дальнейшие иссле. 'жакия в этом направлении доляяъ. обрисовать границы применения метода и степень его надежности.

Сокращения: ДЦС - додецилсульфат натрия; ДМСО - диметилсу.'"фоксид; ЛПР - .жнвдненг ¡гра-4«шо"днае- радоши**и';- Ш Htrcnínyia1 - илгаттясомяинентаде" везикулы; ГПЭ - резонансный перенос энергии; ¿PC - 1 -ацил-2-Шранс-12-(9-антрил)-11 -додеценоилЗ-згс-глшдеро-З-фосфохоли": AS" - M-íÍraa3-I£-(Э-антрил)-11-додецексил]сфингозш1-1-фос(£охо.пин; bftol - холестерин; Con А - конканавалин А; ЕРС - яичный фосфатидилхолкн; PTG - ГОС-1 ,2-диолеоил-3-(9-(3-периленомл)пропионил)глкцерин. RhB-DG - гас~(2."~ диолеоил)глицериноьый эфир рода?лина В; Г J3-01 - цыс-9- октэдецокаловый эфир родамина В; Kh.101~D3 - гас-(2,3-диолеоил) глицериновый эфир родамина ХОХ; Rh.101-01 - цис-Э-октадецениловыИ эфир родамина 101; Rh6G-01 - цис-9-октадеценидоЕый вфир родамина 6G;

£и;е одна малоизученная область гтримснения флуоресцентных зондов использование их б качестве прямых участников биофизических процессов Как оказалось, зонда могут быть участниками фотосиктетическкх процес сов в хлоропластах растений, повиая светособирав'дую способност хлорофилла. Дальнейшее увеличение этой способности*" может иметь о^лько практическое значение.

Цель г/лботы. Настоящая работа посвящена изучению свойств ряд иодзмннилышх лштидных зондов: их флуоресцентных характериет:ас поведения в модельных мембранных системах, взаимодействия с флуорес центними зондами другого типа - периленоп -мечеными фосфолипидами.

Другим направлением работы было исследование слияния модельни мембран с помощью флуоресцентных яглиг :х зондов, в час мости разработка методики количествегшого расчета степени слияния.

Ьще одной поставленной задачей было применение флуоресцентны лхявдшх зондов для изучения рецепмки растительного лектин конкан&валина А плазматической мембраной лимфоцитов, а также дл погашения светособираюл,ей пособности растительных хлоропл~^тоз.

Научная новизна и практическая ценность работу.

Методами флуоресцентной спектроскопии было исследовано поведени новых лппофильных родам1п:ильнык зондов, содержащих флуорофор родамин 3, родамина 101 и родам"ча 6С, в модельных системах - л.игасомах Определены осно! 'це параметры встраивания этих зондов в мембран лилосом: коэффициенты распределения между липидной и водной фазами среднее время встраивания, оценена полнота встраивания. По данны туиения родаминильных зондов ионами иода были сделаны вывода сравнительной локализации флуорофоров зондов в бислое. Показано, чт родаминильные флуорофорц - &^£>ективные акцепторы энергии во..бужденп периленоильного фяуорофора; определена Фбрстеровские радиусы для па зо до б периленоил/родаки...:л в липшшой мембране.

При помощи родаминильных флуоресцентных зондов, образуют;: донорно-акцепторную пару, исследован процесс мембранногс слияния Предложен метод рас ета доли слившихся лилосом на основе регистращ: резонансного переноса энергии, причем для повышения точное; учитываются размеры взаимодействующие лкпосом. Метод проверен экспериментах по слиянию фосф&тидгь—еряновых лилосом.

С помощью флуоресцентных зондов • исследовано СЕязъшанг к«д<анаБалина А с мембранами лимфоцитов мышей разного возрос! а Обнаружено отличие в константах связывания локтина с рецептор:^

RhB-01: R - Y; RhB-DG: R = X

CI

№6G-0J., R = Y

•COX

CCOR

ШП01-01: R = Y Rh101-PG: R = X

CH-CH-

Дпч

X - -CH3

HCOOCC CH., 37CH=CHC CH7 >7CH3

I

СН200СС СН.Д )7CH=CHC CHa ?7CH3 -C CH3 3SCH=CH< CHj }7CH3

Рог =

fîC00CH2 I.

Anv-Ç CH2 >aCOOCH 0

I li

CH,OPOCH~CH2NMe3

АГС

CH3< Cr. J 37CH-CHtCH2 37C00CH CH3C CH2 _>7f '-CHC CHj >,CCCCH Por-C -l2 ЭаС00СН2

PTG

о

ii ♦

CHjC CHj )13CH=CHCHCHCH=OPOCH:r:H3NMe3

HO NH 0 I

Arw-CCHa53C0

At./

' 4 '

лимфоцитов молодых г старых кшшьл и сделаны выводи о возможных причинах такого отличия.

Ряд новых родашгаилг>"ух зондов Оил применен для повышения сгетособирающей сг..собности хлоропластов растений. Показано, что анергия возбуж, ния с зо-чов переносится на фотосистему 2; определена зависимость относительного увеличения флуоресценции хлорофилла от мольного отношения зонд/хлорофилл.

ПуО.шкгц'и^.. По м^.'еркалзм диссертзщш опубликовано ^ статей. Объем ра1ош Диссертация сложена на

/о?

страницах машинописного текста. Она состоит иг. введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, заключения и выводов. Список использог^нной литературы включаст/^/^яОст.

Флуоресцензпше харжтерисшжи. ЛПР

Мы' исследоь ли поведете в мембранах новых родаьиямльннх зондов: дигллцеридяых прои^вод' ;х родамина Б (ЮгВ-БО) и родамина 101 ■ "(121101-СО), имеющиг в гидрофобной части молекулы два неп&лнцотшх (оле мькыт1 с татка, а также олеи.и-нызг (цис-:9-октадеценкльных) пролуЕодких родаминов », 101 и 60 (ЮгВ-01, ГЛг101 —01 и Н!гб0-01 ооот'зетотЕ.етшо) о едж лейасы«» ным остаткам в ыолзкуле.

Как известно, родамкнильные флурофоры отличаются значительной молярной екстинкциеи С'Ю5) и флуоресцируют в красной области спектра, иггектрц описыааемых здесь зондов охватывают длит волн от 550 №60-01) до (:' 3 нм <ЯП101-зонды). »¿а Рис. I оказаны спектры возбуждения и испускг. ля г иа Н1г101 -01, встроенного в фосфатид..лхолиловые липосомы. в • табл™це i приьед'-чы положения максимумов возбуждения и испускания изученных вонзеь а растворителях различной полярное"'''!; видно, что уве-шченке полярности среда (в ^ом числе и за счет добавления води) »•чло с трака--'ся на _луоресцентных характеристиках ЛПР; надо полагать, вода в малой степени способна тушить родгаошильную Флуоресценцию. Это .вполне согласуется с небе ьшкм Стоксовым сдви^м в тих флуорофоров.

Ветра 'аше ^ ждав б мтосом. ,ьные мелбрани.

В ка««отг искусственны* модальных систем мы применяли замкнутые бисло. ,гые монолчмелшрнне "Сразс ■«тля ,■ (-тзикулы) де/х типов: ^покомпонентные, яз -.ЕГО,, и маогокбмцоненте . ? ДЬК-веагкудоО, I ' с:»м

ЕРС - сфкигомкеДкн -. холестерин - . дицетклфосф'ат, 4-"":2:0,5, чьи свойства должны больше соответствовать свойствам большинства природних мембран, хотя дкцетилфосфат. - . »природное вещество (его добавляли для повышения устойчивости препаратов везикул). При этом ЕРС-зезикулы -нейтральные, а МК-везккули несут на повер: :остн отрицательный _аряд. Для получения везикул пол зовались ..¡зтодс обращения фаз, а не прямой обработкой ультразвуке.., поскольку последний метод дает везикулы минимального размера со зна- ттельной кривизной бислоя и свойствами, отличными от свойств природных мембран.,

Таблица I. Положения максимумов возбукдгния (числитель) и испускания (знаменатель) ЛПР в средах различного состава пи 37° С; концентрация зондов 0,5 мкМ

~5оГ;д

Среда

RK6G-01 * RiiS-DG EliB-01 Rh101-DC RM01-01

Хлороформ

Этанол

Метанол

Метанол-вода 1:1

Метанол-вода 2:5

ЕРС лилосомы

531/550 533 551

531/550 533/553

533 551 538/559

559/574 559 57G

559/578 562/579

565 583 Б67/585

560/575 560 575

561/579 ,562/581

567 584 563/587

578 592

579 595

579/596 583/598

533 599 586/606

580 591 580 591

581/594 582/593

587 606 587/606

Для применения зондов в мембранных :сследованиях. bi :ъмо важно1' характеристикой явл,- .тся иг способность эффективно встраиваться е: бислой. Мы добавляли зонда растворенными в ДМСО и следили за нарастанием флуоресценции во времени. Было показано , что в МК~везикулы встраивание происходит существенно б'-^трее чем в однокомпонентные. По-видимому, это/ обусловлено отрицательным зарядом первых, который облегчает включение в полярную область бислоя .сатт дых флуорофоров ЛПР. ■' - ..,.;.■ ■ . . •'. .

Среди зондов по скорости встраивания наблюдаются анэчитслы .е различия; для везикул, обоих типов по времени . выхода интенсивности испускания на плато образуется ряд: RhB-DO < Eh10" -01 < KM01-IX3 < RhB-01 < RJ16G-OI. При втом, чгласно нашим результатам, встраиваете- от 40 до 70S добавленного.зонда. : ■ . • *

б

г

О 0,02 0,04 п.Об 0,08 0,1 0,12 0,14

Рис. 2 ЗОНД/ЛИПЯЕ

Рис. I. Спектры возбуждения (1) и испускания (2) зонда Ил.101 -ВС ( мкМ) в фосфэтидилхолиновых везикулах. Рис. 2. Зависимости интенсивно флуоресценции родамишлышх зондов от соотношения зонд липкд №К-везикулах: 1 - ИйВ-СС. - ВЫ. 01, 3 - ЙП60-01, 4 - №101-01, . Ич1'01~ВС. Концентрация липида 70 мкМ, температура 37 'С.

Агрегация зондов б бислое и глубина погружения флуорофороб

Способность флуоресцентных зондов образовывать агрегаты молекул ластера) в бнслос может существенно влиять на параметры флуоресценции тем самым искажать истинную картину состояния мембраны. Способность зличных -зондов образовывать кластеры зависит от }--<зткх факторов, ежде всего от фазового состояния мембраны. Например, известно, что изкий по свойствам нашим зондам родаминильный зонд Н-(лиссамин-'Дамин В-сульфонил)дкпальмитоилфос({)атидилэтаноламш! в везикулах из ттальмитоилфосфатидилл. .тина при 20 °С (матрица в голевой фазе) ;рпзует агрегаты при мольной доле зонда 0,1, а при бсРс (матрица [дкокристаллическяя) - при доле 0,2.

Для исследованных нами зотщоь были построены зависимости интен-шнос-л флуоресценции .оадсв от их концентрации б МК-везикулах при ' °С (Рис. 2). При этой температуре матрица жидкокристаллическая (это утверждают данные по анизотропии флуоресценции - см. ниже). Графики жазывают, что изменение пропорциональности между интенсивностью туоресценцги и концентрацией зон 1в в ьезик-'лах, т.е. начало образо-тия агрегатов зондов, происходит при 0,5-1,о мол. %. Это примерно на )рпдок вы'че концентраций, обычно применяемых при мембранных ¡следовашшх.

На Рис. 3 показаны зависимости флуоресценции родаминильных зондов с концентрации лиггида в водном растворе в обратных координатах. На зновании получегашх зависимостей С .ли вычислены коэффициенты ^определения зондов мекду липидной I! водной фазами. Наибольшими

зоффлциентами обладают диглицерида родаминов В и 101 (0,68*10"' к р

,50*10 ). Коэффициент распределения ШгбС-О! примерно в два разе меньше 3,22*10®). .

Измерения температур;-а. зависимостей а1гизотро!лш флуоресценции ЛПР МК-Еезикулах (Рис. Л) показывают, что с повышением температуры зличина г монотонно убывав для всех зондов, что подверждаот гсутствие заметного с. разования к» зтеров (см. выш . Обротает на себя яимани .то, что значсн-ч анизотропии могут довольно сильно отличаться гжду собой как для пар зондов с одинаковым фяуорофором, но разными здрофобными частями (кривые- 1 4), .так и для пер с различила, луорофорами, но одинаковыми н^полярными заместителями (графики 1 и 2).

Для зондов с одинаковым флуорофором различна в величина., г бусловлены, очевидно, различным положением флуо^.-фора в ( слое, превде сего, разной глубиной погружения. Известно, что в бислое жидкостность сзрастает от поверхности к сред' й его част5!, поэтому данные Рис. 4

8 Л

20 23 >0

0,2«Ю"4 1/М

Рис. 3

0,з

0,2

Ъ»ООООООООООС

О ос о о о о и о с В, о 5'

о и. 25

30 35 40

Рис. 4

43

50

Рис. и.-. Тушение ■ и< идом калия фл-горесцеиции родпминилышх зондов, 'встроенных'8 МК-^язикуош. 1 - Ш101-ВС, 2 - ШВ-В0; 3 — Ш1101-01, А -. ШЗ-01, 6 - ШЬи-01. Концентрг.4Ия липида 70 мг.М. лонда 0,1 мкМ, температура 3™ : ■ С. Рис. 4. Зависимости- анизоторсгми д?луоресцени.ии г - родаи«. и/, иых зонде в МК- езикулах от температуры. 1 - г&Е-01, 2 --. Ш0. -01. 3. - Ш 01-00, 4 - Н'-Ч-Ш. ' - Р&6С- Г1. Ковцг-.трацкя лишда 70 чкМ, зонда - 0,1 -цеМ.

8Б

Р/<!Р

Рис. 5. Зависимости интенсивности флуоресценции зондов 01 концентрации литшда в суспензии липосом т обратных координатах. Концентрация зснда 0,5 мкМ. Температура 37 °С. / - №50-01, 2 - ЙМ01-01, 3 ЙЙЮЬ-БС, ШгВ-01, 5 - К1В-Ба.

щ

Рис. 6. Нормализованные епекттзы: испускания периленоильного зс.^а РТС (?) и возбуждения родамини-.ьшх з<"дов НЬби-О! (?) ТШВ-01 ( ), Й1101-01 (4) в Ж-возикулах. Концентрация липида 70 мкМ, .-видов - 0,1 мкМ. Температура 37 °С.

показывает, что у зондов с -одним гидрофобным заместителем RhB-01 и Rh.01-01 (кривые 1 и 2) флуорофоры в большей степени экспонирован},! в водную фазу, чем у зондов в двумя заместителем (3 и 4) Это естественно: гидрофобные взаимодействия ■ с лиггодами бислоя у вторых выражены сильнее. Особенно значительна разница (в 2 раза) мекду величинами г зондов RhB-01 и RhB-DG (графики 1 и 4) ; Rh101-01 и -vh.101-DG разнятся мевду собой меньше (графики 2 и 3), возможно, из-за значительной гидрофобности самого флуороф^ра.

Труднее сравнивать между собой зонды с различными флуорофорами -ведь величина анизотропии зависит не только от вязкости среды, "о и от времени жизни возбужденного состояния, гидродинамических свойств флуорофора и др. Но и здесь можно сделать некоторые осторожные выводы, опираясь на то, что в вязкой изотропной среде, I,3-пропандиоле, три типа исходных флуоресцентных красителей имеют близкие величины Г: родамин В - 0,350, рох мил 101 - 0,370, родамин 6G - 0,330 (температура 37'JC, концентрация 0,3 мкм;. Поэтому данные Рис. 4 позволяют заключить, что флуорофор зонда RhB-01 в большей степени экспонирован в водную фазу, чем флуорофоры зондов Rh101-01 и Rh101-DG (1, 2 и 3); о положении относительно последних двух флуорофора зонда RhB-DG судить трудно; скорее всего он локализован близко к ним. Наши заключения относительно локализации флучзофюров ЛПР согласуются с данными по тушению флуоресценции ЛЕг иодидом (см. гис. 5 и Табл. 2). Сравнение величин констант тушения отчетливо показывает, что они больше для олеилышх производных по сравнению с диглицериднкми, кроме того, первые (RhB-01 и Иг,01-01) более доступны для тушителя и, значит, более экспонированы в водную фазу, чем ьторые (RhB-' ' и Rh101-DG).

Таблица 2. Параметры тун-^ния ЛПР ионом I в МК-везикулах: константа тушения -'X ) и доля доступного для тушителя зонда (/). Концентрация липида 50 мхМ, зонда 0,1 мкМ, температура 37 °С.

Зонд

Rh6G-ri RhB-DG RhB-01 Kh101 -DG Rh101 -01

к , м"1 5,07 4,80 5,73 4,52 5,80

/ 1 ,00 0,90 0,90 0,83 0,85

ю

Перенос энергии возбуждения периленсш ■* родажтш.

Многие мембранные процессы моасно изучать путем регистрации перенося энергии возбуздения донор ■* акцептор в паре ■'шуоресцентгшх зондов. Мы .нахди, что для ЛПР хорош:-«'донором, может бить пориленоилыкД флуорофор, который гидрофобен и локализован ь неполярноЯ области мембраны. Спектральные характеристики - значительная м( ярная экстинк-шм (а - 24000 при \ = 44? нм) и положение максимума испускания

та;<

(510-520 нм в липидных мембранах) - вполне соответствуют указанной цели. В качестве периленоилъного зонда в модельных опытах бия применен ГТС - триглицерид, несущ-. остаток .3--(З-периленоил)пропионовой кислоты. Этот зонд, как и все тркглшерида, неспособен к :/.:грации через водную фазу; при наиболее вероятном положении зонда с бис.тсе (со сложноофяр-ными группами в общем ряду с такими же группами липидоз мембраны) флуорофор зонда должен находиться достаточно близко к полярной'зоне. На Рис. 6 показан спектр иг усканкя РТ0 и длинноволновые области спектров возбуди. 1шя родамаяильних. зондов всех трех типов. Видно, что наибольшее перекрывание спектров достигается в случае Rh6G-01, а для Rh1Ö1-0l cüo наименьшее, хотя и в этом случае ь .ачитель'но.' 7ы определелили величины С-йрстеровского радиуса (К ) для трех донорко- акцепторных пар: периленоил/р^даминил 6G ■- 55 'к, тк лленокл/родаминил В - 53 периленокл/ родаминил IUI - 4P Т.е. значения Л довольно велики и соответствуют толщине Сис.'оя, это позволяет применять умеренные количества этих зондов в ¡экспериментах, основанных па регистрации резонансного переноса энергии ' возбуждения. Были такта определены ВДрстеровские радиусы для перенося энергии с родамина 60 на другие род-!.\синилькые зонды: ?-0(для пари Rh6G/KhB) - 66 Я (для пары

Rh.6G/Rh101 ) = 60 X

Semod количественного определения слияния лелбрсн

При разработке нашего подхода к определению степ ~и слияния двух мсмбран:шх препаратов № применили метод, основанный на вве/ пти в одну популяцию пары «флуоресцентных зондов - донора (RhvG-01) и акцептора (ЯЫ01-0л) Бпергии воз. „изделия; слияние таких частиц с немечеными приводит к уменьшении поверхностной плотности зондов и, соответственно,' к падению эф{>ектггности резонансною переноса экерг *и (РПЭ).

Известно, что еффективность переноса (Е) для дг>"ноЯ пары донор/ акцептор днозначно с* чзоиа с поверхностной плотностью (о) акцептора. На Рис. " приведена зависимости Е от а, поверхность^! плотности акцепторов в ф^сфатидилсериновых липосомах, содержащих зонды в

. II

извеотной концентрации п^"* постоянном соотношении донор/липид.

Для экспериментальной проверил нашего "етода мы использоеэли • инициированное ионами кальция слияние двух популяций (меченой и" немеченой) моноламеллярных липосом из фосфатидилсерина, полученных ■продавлибепиэм черь _ поликарбонатные мембраны. Применяли лилосомы двух Типов: "большь ' (ЕЩ) т змегром "'0,2 мкм и "средние'1 (СМЛ) диаметром -•"0,1 мкм. Размеры их определяли с помощью корреляционной лазерной "спектроскопии, данные которой (см. Табл. '3) показывают узкое распре .еление лилооом по размерам: отклонение от среднего диаметра 95% ли: )сом но превышало 15%. В некоторых опытах мы применяли аналогичным способом получеь.ле липосомы из смеси фосфатидалхолино и холестерина тгад/ипо1; эти препараты не способны к заметному слиянию при добавлении ионоь С::'" внутри своей популяции и незначительно сливаются с ■ РЗ-липосомеия» .(см, , ниже). Во всех экспериментах количественное у-»отношение меченых и немеченых липосом составляло 1:10 с тем, чтобы уменьшит* вероятность слияния между собой меченых липосом.

. Таблица 3. Распределение по размерам лиг 'сом, прю,:еняв1шхея в опытах по слиянию, полу энное по. данным корреляционной лагери.й спектроскопии Температура 37 °С. Концентрация липида 0,25 мМ.

Состав и кш л юсом

РЭ РЗ ЕР0/0По1 Р5(слившиеся)

сиг . . втаг . "шг; ЗУ7Ш

Размер, им 207--30 210*23 330-80

Зонды в липосомц вводили добавлением их к ио-одной смеси лигыдов. Яами было показгно (см. Риг. Я), что. в применявшихся условиях зг зтная клаоте.. (зация рода». . ловкх . зовдоб наблюдается при их концентрации в ме-'^ране выше 0,5-1 мол. %. Следов' телько, в наши экспериментах распределение молеку зондов в и. .бране мохаю считать равномерным.

В роз, ¿тате слкян"я меченой и .-цемоч&ной лилооом происходит распределение зон в 'в рэзультирук«цей мембране. Пх этом наблюдается падени> о^фективнооти де^нооа и соответствующее возрастание интенсивности флуоресценции донора. В. ссю^ветстти о полученным распределением по размерам (см. Табл. 3), отношение диаметров БМЛ и С1ЛГ равно 3, тогда

отношение поверхностей таких лилосом равно 4. Соответствующие эффективности РГО можно найти из экспериментального графика (см. Рис. 7). Б Табл. 4 приведены поверхностные плотности акцептора, вели .ины фактора Я и эффективности РПО для различных сочетаний взаимодействующих липосом.

■ Эффективности РПЭ пари донор-акцептор вычисляли согласно уравнению: ■ Е = 1 - i03/^ (I), где •- интенсивность флуоресценции донора в присутствии, а - в отсутствие акцептора. Будем полагать, что

распределение донора и акцептора на поверхности мембраны равномерное как в неслившяхся, так у, в сливаихся липосомах. В нашу задачу входит определить долга слившихся меченых лилосом (а).

Таблица 4, Расчетные параметры г. лилосомах, полученных при слиянии X мечено!, и X немеченой липосомы; мольное соотношение липида в исходных липосомах (К), поверхностная плотность акцептора (a) s мольном соотношении зенд/липнд и соответствующая еффэктивность переноса энергии (&-',. В меченых липосомах до слияния о = 0,0016 и Е = 0,51.

Взаимодействующие липосомы ^леченые/немеченые)

еш1/емл или смл/сш1 смл/емл БМЛ/СМЛ

к i ■ 4. 0,25

ОТ о.оооа 0,0003 0,0012

0,25 . 0,15 0,4

Обозначим: ст - поверхностная плотность акцептора ;юльное отношение зонд/луиид) в "чпосоме; а^ - поверхностная плотност! акцептора в слившихся липосомах; - поверхности? плотность акцептор? в неслившихся липосомах (начальная поверхностная плотность).

Если полагать, что ггроис дат слияние одной ме. ной. липосомы с одной немеченой и обозначить К моль* 1е отношение ко •честв «_лида в немечен .г и меченой липг'чшах, то: "¿/"ц = + К) (2)

Тогда доля слившихся липосом (вывод формулы не.показан): .

« = (Еи - Е')/(Еи - Ер (3), ■

где Яи - эффективность переноса енерх-ии в липосома„ до слияния, Е' -8ф{юктивность переноса энергии, полученная из непосредстг ч» измеренных иятенсивностей флуоресценции в данный ломент вг -мени.

При невысоких концентрациях донора в биолое и. самого мембрашог<

ропарата, i гда с достаточной степенью точности соблюдается равенство * = ^t ~ Ф Уравнение '"} преобразуется в

о - cf ~ if )/uf - ïf >, (Л)

Согласно формуле (2) мы можем найти поверхностные плотности' хцоатора в .слившихся к- неслившихся лкпосомах, по отим данным, люльиуя экспериментальную зависимость Е(о ) - соответствующие Гфзкткгшсти и^реноса s: priai и долю слившихся меченых липооом.

С помощью разработанного метода мы исследовали зависимость степени

таяния r-S-jnioooM от концентрации ионов кальция (Рлс. 8). Видно, что

¿j

-iv'fc'rc.. пороговая концентрация Са , индуцирующая полное слия!ше -, kií. Этот ypc-.tiirô сопоставим о величиной, полученной Сукумараном и (1£о0;, - 0,ü t£¿ C3t+ в присутствии 30 мМ NaOl при ?.5°С. Ь 5 прниед&кы основные результаты по слиянию липосом

о рис;.. ;ра. Оя.: показывают, что EPC/Chol-яшюсомы между собой э же PS-Jamoc&M с EPC/Cíi^l-.Tmroooiíswi происходит в

»2. (1,5 ч при 3~°С) в незначительной степени. Превышение

OCíi-usr- урозц.'. ¿ода слипшихся липосом для экспериментов с iüozinc., по-видимому, слиянием боле© чем двух частиц. При icjvO.r^cn-:::— ?К~.пппооом о ионам Са процесс, как следует из Табл. 5, стаЕсз.'"заатся (или сильно замедляет.л) после слияния ьез!ьточ фхуоре сцетными измерениями регистрируется л:.:..-.: мвч<г::с.\ а /"•мгченой: Ч8С1ИЦ. Ото, вероятно, еызвэяо ос :бетос~

pu.

"-вел iiwx-r. Са о фосфати„илсориношм бислосм. Как ранее

нл® пргдвати" »лыхая инкубация с ионами кальция РЗ-липосом

редохраняет поолохдео от слиян- л « ноцс? популяцией.

Mu íipoiítíjiii подобный эксперимент в наших условиях. Добавление CaCl,

омеск печеных Доумя зондами ГЗ-лилосом и 10-кратного (по числу

астиц) количества немечейых приводит к слиянии, чему соответствует

зук- '.тное возрастание флуоресценции д topa (дашше не показаны). Если

2+

е пре зари лыю инкубировать меченые литзосомь. с ионами Са , то оследующее добавлерме немеченых и нозой аликвоты СаС1а приводит ..ишь к «значительному росту флуоресценции и, следовательно, к незначительному л1..,1шю. Эти данные также косв^чно подтверждают отсутствие перехода онда через чодную í, зу при наличии ионоь Са в растворе.

То, что ь описанных условиях процесс останавливается (или сильно амедляятся) поел- ели шя- примерно двух .частиц, подтверждают и езультаты экспери >нтов по лазерт зму светорассеянии: определенный тим nyrei диам!.-р частиц,, пол, данных после слияния БМЛ из PS в тандартных ус эвиях, составил 330 - 80 им, хотя распределение гораздо

шире, чем до слияния. '

Нами был также проведен експеримент для /••чюлнительной провер!

приведенных выше основных положений метода. Немеченые РБ-лягосо!

2+

инкубировали в присутствии Са со смешанной популяцией мечены: содержащих в разных пропорциях (25:75; ""0:50; 75:20) 13-ла ссм! которые в условиях эксперимента способны к полному слиянию ЕРи/СЬо1-липосомы, негчачительно сливающиеся с ГЗ-липоеомагот (с выше). Моймо было ожидать- что найденная флуоресць.,<тн.ум ?тод| величина а будет близка доле РЭ-липосом в меченой популяции. Да ига Табл. 5 показывают такое соответствие: найденные величины « о чичэг от расчетные на ¿-5%.

Таблица 5: Доля (%) слившихся меченых липосом различного рагме; х ' состава, рассчитанная по уравнению (5), п.сле инкубации меченых : немеченых липосом з соотношении 1:10, в присут :вии ипнов Са11" Конечная концентрация липида 0,25 мМ. Концентрация СаОх, 0,5 мМ температура 37 °С. Каждая величина - среднее значение величин из независимых экспериментов. Отклоке.шя от указанных з"аченкй « к превышали 10%.

Меченые липосомы

РЭ (СМ) РЗ (БМЛ1 ЕРС/СИо! (НА!)

РБ

ш

112 102 0

Немеченые липосомы

ШЯ

Е?С/С1ю1

""ЕЙГ"

125 115 О

Таблица 6. Доля слившихся липосом при инкуСацпи немечешх РЗ-^гиосс со смешанной меченой популяцией РЗ- и ЕРС/С1ю1-липоссм. Условия сжян см. в подписи к Табл. 6.

Соотношение мечешх РБ- и ЕРС, .лотосом 25:75 50:50 75:25

а, %

30

54

75

Рис. 8 • зонд/липид

Рис. 7. Зависимость эффективности переноса энергии между парой донор-акцептор ( от поверхностной плотности акцептора (КЬЮ1-0Х) в РБ-липоссмах (СМЯ). Концентрация липида 50 мкМ, соотношение донор (НЬ6С-01)/липид - 1/500. Рис. 8. Зависимость доли слившихся мечених Р?1-Л1шооом (СМЛ) от конце..грации Сас~. Температура 37 С, концентрация липида 0,35 мМ.

Как было уже,сказано выше, при условиях, когда концентрация частиц . невысока и слияние не сопровождается ощутимым изменением оптической плотности системы, if = Й » ¡f и уравнение ..3) превращается в (4).

я«

Расчеты при этом.упрощаются, однак определение íj . требует построения калибровочного графика -для каждого эксперимента, тогда как при использовании формулы (3) достаточно, одной калибровочной, кривой для 2?(о), так как величина Е от концентрации донора не зависит.

Аналогичные результаты по определению доли слившихся липосом.были получены и с применившем доно рно-акце пторной пари флуорофоров антрилви1[ил " Периленоил (данные не приведены). .

■ Отметим, что в уряь тнии (3) для вычисления уш слившихся частиц E'j есть величина еффектш.'чости РПЭ в меченых частицах, после полного их слияни.-: с немечеными; если этот процесс завершен, величину мсжно измерить непосредственно. Это позволяет оценить размеры образованных слиянием частиц. В. .наше.... случае ш попытались оценить такой размер, исходя из "анных по слиянию PS-липосом меченых (БМЛ) с немечеными . (БИЛ). Эффективность РПЭ,.измеренная при полном слиянии, составила 0,20 при; начальной ; РШ = 0,58, что, дало значение « = II5Í5. Если предположить, что с = IC0Ü, то величина РПЭ равная 0,20 будет соответствовать величин1 = О,ООО? при полном слиянии,.что позволяет ' найти ■ К"-из ' (2):-<»j'/o =1/(1 + К) =. , где Df и Г^ - диаметры

липосомы, образованной слиянием и липосом до слияния. В нашем случае о^ = 0,0016 и, следовательно, Dj = 302 нм. "то ниже размера, полученного при помощи лазерной спектроскопии и указанного в Табл. 3, что, как уже Упоминалось выше, , коагно объяснить отклонения:',>. от принятой . модели слияния сферических липосом. Кроме того, липосомы могут arpei.гровать без дальнейшего слияния, образуя крупные частицы.

. 'Применение' анприлвшиллеченьо: фосфашдилхолина и' сфингожасмаю. для изучения взаимодействия брлна С^ч А с дежбрачажи ли.«фс.,мпой мшей.

Липид-специфическ л флуоресцентные зонда, нах' /ящиеся; а мембране /вблизи;- ■щеггтора, позволяют регистрировать мганд-рец-зпторное взаимодействие, если последнее вызывает, конформационныепере стройки белка: йти перестройки, воздёйствуя на ок^ужащие мембранные липиды, приводя* к изменению чувствительных. параметров флуорофора зонда, в частности, его анизотропии (Бергельсон и др.. 1985). С помоадю. этого метод.- мы исследовали связывание, природного , лектина Con А с - мембр тами мышиныЯ лимфоцитов.: :: ,■

Нами была снята зависимость з-1чений анизотропии флуоресцеящж (г!

It

i APC и ASM в плаз?" тичоской момбране лимфоцитов молодых и старых от коицентраг n Cori А; на Риа. 9А пркве ->вд графики для мем ран ток мо.тодкх животных', во всех остальных окспериментах наблюдалась ична» картина. Данные Рис. 9А показывают, что зонды но распреде- . юпномерио в „(вмбране, а находятся больией частью в ближайшем к (агшуля\../ом) слое рецепторных белков и реагируют ьа изменение ния :к>слэ щп-я. В'' íiTC'M - существен"ое преимущество липид-ич.йски» зопдоь перед нелипидиыми: ранее было показано что .о г флуоресценции нолитшдього яонда дифенилгексатриена, много л плазмаучческу» мембрану человеческих лимфоцитов, не отоя при алтиващги их Con А.

•ависимости изменения лг этих зондов от концентрации Сол А в фм;леских координатах доказаны на Рис ЭВ. Для всех исследованных слеуок онячения удовлетворительно аппроксимируются пря'-ыми;

иные по етим. данным значения ¡L (см. Табл. 8) находятся е

—3 —7

aj- от 8*10 до 5*10 М. Наблюдаемые аф1«кты и выведенные на их величины ооусловланы именно связыванием Con А с его срами, а н© последухчцимя процесс ми ответа клеток (активация иктоске «та, перенос сигнала вторичными мессендж ерами в азму и т. д.). Об этом говорят слэдулздке соображения. Во-первых, Лро и ASM посче встраивания в плазматическую мембрану л. ..(фоцитов ся в .чей в течение, по крайней к—ре, 4Ь мин, т.е. дольше, чем л-мсъ измерения, ~>-вторых, мы провели измерения связывания Con А мч чритроцчтов, которые п 10чН0 лимфоцитам способны связывать Con ¡ajeo в тенях эритроцитов отсутствуют все последующие процессы ройки плазма, «ne ской мзмбраны. Измерение связывания Con А с ю юл ко зокдов АРС и ASM проводилось при 14 °С (для сведения к му - влияния ггрот-?олит. (еских форг чтов) и дало величины Кл 0,4 и j ' сс пкл'отвепно. Оба пршлеиешшх нами зокда дают близкие ия Kd при поптроедии зависимости Лг от концентрации Con А в катах Хяллд. Это может овидетельстиов&ть о том, что, хотя в не и присутствует не сколы«" типе.., рецепторов Con А, их литшдное иис однотипно.

то же ьремя видно. что величины лг, достигаемые при добавлении встроенным j пла- 'атйческую мембрану,, лимфоцитов зондом АРС, чим аналогичны« значения Аг длг зонда ASM (см. Табл. 7 и Рис. 9). pes; ътат .гоказывьет, чг. в данной популяции лимфоцитов кдилхоли" ' преобладает оравцитаяьно со <-фит омиодиком в ;.>пом слоя р«;-ц^тороп u>n А. "■•'

Рис. ЭА

IS ^тах/йг ~ 1 }

Рис. 9. (А) Зависимость акизс .лэпии Флуоресценции зондор АТС (1) (21, шючешшх в мембрану лимфоцита молодых мышей, от коацеп Con А при 37 ' С. Концентрация зондов от суммы линидо-

Зависимости анизотропии флуоресценции зондов АРС (1) и ASM Рис. £U) в логэри£мнчеюнс координатах. •

Видно также, что константа связывания Con А на лимфоцитах молодых

животных в 2-3 раза выше, чем на лимфоцитах старых. Возможными

причинами могут быть вызванные старением изменения в липидной мембране,

ухудшающие условия связывания рецептором, или vразличное у клето..

молодых и старых мышей соотношение между рецепторами Con А

неодинакового сродства (Con А на поверхности лимфоцитов могут связывать

несколько белков; их относительное сродство к лиганду неизвестно).

Полученные в втой работе величины К. для связывания Con А с —8 —V

мембранам лимфоцитов (8*10 - 5*10 М) весьма близки значению К.

+ . а

(5,0-0,6*10 М) для взаимодействия Con Ас перитонеальными мышиными макрофагами, полученному с помощью другого метода - прямым флуори-мегрическим измерением связывания с клетками флуоресцеинового производного Con A (FITC-Con А). Эта соответствие служит хорошим подтверждением достоверности величин лай^нных еще мало испытанным методом. . .

Таблица 8. Еелкчины изменения анизотропии флуоресценции (Дг) зондов . АРС и ASM в лимфоцитах молодых и старых мышей и определенные с их помощью константы диссоциации Kd (мкМ) для Con А при 37 °С (данные отдельных опытов ).

Клетки ■ мышей

Зонд _________!_ ' • _ '

Молодых ' " Старых ~ * :

Дг , мкМ

0,5 0,018

0,4 0,3

Как показывают данные Рис. 9Б, тангенс утла наклона графиков Хилла, ., полученных с помощью обоих зондов, близок к I; то же наблюдалось для всех остальных случаев. Известно, что молекула Соп А имеет четыре места

для связывания Сахаров. Поэтому логично предположить, что все места ,

связывания располагаются, на одном рецепторе, что можно согласовать с •

данными, .полученными разными зондами. /■ ..• : . . . ;

.• Результаты настоящей работы, кроме ..всего■.': прочего/ доказывают . ; |

Дг К , мкМ

АРС

AS"

0,024 0,035 0,021

0,011

0,2 0.08 0,013

0,ГЗ .

0,037. 0,028

0,012 0,012

хорошие возможности липид-специфических флуорв! .ентных зондов, которые могут быть' применены для исследоз£ ля даже такой сложной системы как мембрана лимфоцитов, что хорошо демонстрирует их возможности.

Применение родсиктшънмг зондов для искусственного повышения свшособиратей способности, хлорофилла

Как известно, фотосшггезирующая система высших растений относительно слабо поглощает сi.'T в желто-зеленой области спектра, т.е. там, где солнечная радиация наиболее интенсивна. Ранее было показано, что липофильное производаое родамина В, флуоресцентный зонд RhB-DG, введенной в изолированные тилакоидные мембраны хлороплаегтов, в условиях ненасыщающего освещения может увеличивать интенсивность реакции Хиллз

на 30%. При етом RhB-juG. чье поглощение (х 558 нм) частично

птах

заполняет область ' низкого поглощения пигментов хлорвпластов, абсорбирован ую энергию (\Пмог Б8Г нм) передает н? реакционные центры

WOK

фотосистем I и 2 по мехагмзму безызлучатедьного резонансного переноса,' увеличивая сротссобирвющую способность хлороплястов. Это было показано как с помощью спектр, л'ышх методов, по увеличению флуоресценции хлорофилла а в присутствии ГОгВ-DG, так и измерениями выделяющегося в реакции Хилла кислорода.

Мы исследовали другие липофильные , эдажшовые зонды как доноры энергии возбуздения фотосистемы 2 для повышения ее светособирающей способности. С стой целью в опытах по кзмо. нига переноса энергии возоукдения зонд ■+ хлорофилл наряду с RhB-DG был применен его аналог ;ihB--01, имеющий ке> два, а один гидрофобный остаток, а также зонда Rh6G-01 (X 531,->»г|иог 555 нм) и Rh101-01 (х 78, хг,ыог 601 нм).

max rrax птах rrax

В хлоропласта красители вводили добавлением в cpejrv инкубации их растворов в диметилсульфоксиде. •

Спектры возбужден...! хлоропласте иитактных и о зондами (Рйс. 10), показывь.от, что встргг'вэние последних риводат . к значительному увеличению флуоресценции хлорофилла, что отражается появлением полос в области 530-580 нм, соответствуют! полосам возбуждения зондов (спектр. 2-4). Аналогичное увеличение флуоресценции наблюдается и в спектрах испускагш" хлороплаетоя с зондами Жданные не приведены). При сравн ли между собой зондов в качестве доноров энергии возбуждения . лорофилла мы не стали оперировать общепринятым в таких случаях параметром как эффективность переноса энергии (Е = 1 - F/Fa; ? и 7„ -- интенсивности

F

0.5 |

I

о1—

300

400 Рис. 10

500

600

700 HM

Piic. 10. О ■>ктры возбуждения хлоропластовг иг тактных (?) к с ьклхчешшми- зондами - Р.ЬВ-01 (Я), Fh6G-Ül (3), Ш01-01 (4); испускание регистрит при 700 нм, температура 20 С, мольн.

ст1:сте:шз зонд/хлорофилл, 1 :10.

dF/F

зонд/хлорофилл

Рис. II. (А) Зависимости относительного возрастания интенсивности Фдуопесщ. дцпт х^ороплаотов при ¿85 нм от содержания в них зондов: Rill01 -DG (/) Ю16П-01 (2), fihB-01 (3), ГШВ-Г-Q (4); температура 20"С. (S).l л« Mica флуор зцешда при 685 нм хлоропластов: 1 - кктактных, 2 и 3 о зондом НП101-01; -ооднс эние v.o. д/хло'роИ-'лп С,05 и 0,1' ' соответственно, температура «¡0 С, стрелк- указывает начало •эсь.щекяя (открывай ) шторми фдуоримзтра,).

флуоресценции донора о акцептор су и без) очеси

оксперлментэльпк:'. трудностей такого подхода - at _>змо-*-:нс сти достой --ерить F0. "сатому мц срэаиь между собой зонды по их завялило относительного увеличен":!.! фдуоресц«>1Яев* хлорофилла AF/F0 (Л? » Fr от мольного- отпопиния зонд/хлорофилл, о.тсоде..ошюго Фотометричеок...

.Тэнвк» Рис. НА иокзга.'.аюг прежде всег , что природа ¿зткдоой ч зозде (остаток лиг.гпцеркда или олеклового спирта) практичною' ке бл на степень переноса энергии (. ривие ' а 4). Оленлыше же про.чзвод^ь степени переноса располагаются в ряду. Кл101 --01 > RhC0-01 > Ph (кривые 1-3). Г «большая■ степень переноса дл-т ЙИСИ-'. '. о©ы—яяо очевидно, Сольеим, чем для остальных зондов, перекрыванием его ото попускан'я со спектром возбуждения хлоро' 'лла. У RhB-OI перекрывай« Сольце, чем у Bh6G-0I, но siusoe меньше кз&этешй ~ап.ох 'флуоресценции (0,5 и 1,0 ооотг"тотвенно;, что я объясняет прекауи» PJ16O-O] . Также видно, что с ростом концентрации зонда пер roe cm возбуждения зонд ♦ хлорофилл эффективно возрастает ьплс-ч дс отношения ТгЮ, после чего рост суи^стьешю : !ь;едляется (Рис. ПА) Сокт:денно в присутствии зонда RhB-01 яидукцяошю: периода выходя флуоресценции хдороп..jctob на плято наблюдалось т.---те для ?с pjigg-ql к Rh101-0l, что говорит об аналогичном переносе энергии о : на фотосистему 2. Из рисунке 11В показаны индукционные кт нарастания флуоресценции для хлоропластов без зонда к со нстрое R!i101 - 01.

Все это показывает, что лкпофилыше производное род-лминов типов (ро^лминов 6G, ■ В и 101) .являютс-я полноценны- "t донорами эне возбуждения для фотосинтезируг'ей системы растений и еущест; повывают ее светособь.рающую способность. Такого рода доноры могут весьма полезными при создают в дальнейшем биотехнологии преобразователей солнечной энергии.

вывода

J. Изучено поведение и свойства липидных производных родамкнов В, 101 и 6G в липосомальных мембранах. Определены константы тушения и степень доступности для ионов-i". Установлены константы распределения зондов между липидной и водной фазами. Определены ©брстеровские радиусы переноса ¡ергии между флуорофорзкш зондов и на родаминильяые зонды с "ерилеиоильного флуорофорз в модельных мембранах.

2. Усовершенствован метод определения слияния мембран при помочи резонансного переноса энергии. При попоит двух типов зондов исследован процесс слияния фосфатидилсериновых лжюсом различнаг размера.

3. С помощью лщид-специфических зондов изучено взаимодействие лектина Con А с плазматической мембраной лимфоцитов. Определены константы связывания белка с мембранными рецепторам". Обнаружено отличие в константе связывания у мышей разного возраста.

4. Липидные производные родаминов испо.чьзоваш для повышения светособирающей способности хлоропластов путем переь-са энергии возбуждения с зондов на хлорофилл.

Основное содержание диссертации опубликовано в слсдупцих работа,. :

1. ¡.'.олотковская И.М., Разинкоз В.И., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д.Связывание конканавалина А плазматической мембраной лимфоцитов молодых и старых уьшей, изучение с помощью флуоросцетных зондов,Биологические мембраны. 1992. Т.9. !?1. С. 32-40.

2. Разинкпв В.И., Молот-овский Юл.Г. Поведение родаминальных зондов в модельных мембранах. Биологичзскио мембраны. 1993. Т. 10. .'"6. С. 655-663.

3. Разинков В.И., Молотковский Эл.Г. НсвыЯ подход к количественному флуоресцентному определению слияния мембран, основанный на измерении резонансного перекоса энергии. Биологические мембраны.

1994. Т. П .7-5: ( в печати).

4. Разли.ч?! В.И., Сорок;!!! ?..'<!., Бобылев Г.С., Молотковский 3.1.Г. Увеличение ветособирающей способ ->с?и изолированных хлоропласти-тов с помощью липидных производных родаминов .Биологические мембран ы Т.П. ."6. ( в печати).

Тиг>. 80