Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4

Чупров-Неточин, Роман Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4"

На правах рукописи

ЧУПРОВ-НЕТОЧИН РОМАН НИКОЛАЕВИЧ

Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

Москва 2012

005055791

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биоинженерии ФГБУН Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук МИРОШНИКОВ Константин Анатольевич

Официальные оппоненты:

ЕГОРОВА Татьяна Алексеевна доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет», биолого-химический факультет, кафедра органической и биологической химии, профессор кафедры

КУЛИКОВ Евгений Евгеньевич кандидат биологических наук, ФБУН Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, лаборатории вирусов микроорганизмов, старший научный сотрудник

Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Защита состоится 24 декабря 2012 г. в 15.00 часов минут на заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет» по адресу: 119021, г. Москва, ул. Кибальчича д.б, корпус 4, ауд. 205

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Mill У по адресу: 119991, Москва, ул. Малая Пироговская, д.1.

Автореферат разослан » ноября 2012

г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

Холмогорова Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Для гетерологической продукции рекомбинантных белков в научных, медицинских и промышленных целях применяется отработанная система экспрессии в энтеробактерии Escherichia coli. При этом исследователи зачастую сталкиваются с проблемой образования нерастворимых белковых агрегатов - тел включения. Эта проблема особенно актуальна в случае фибриллярных белков, так как помимо принятия белками правильной третичной структуры они должны иметь и нативную четвертичную структуру. Такие белки, кроме того, обычно склонны к агрегации в силу периодичности последовательности полипептида. Разработка эффективной стратегии получения олигомерных фибриллярных белков в рекомбинантном виде является важной практической задачей.

Чтобы избежать образования тел включения при гетерологической экспрессии, применяют различные стратегии: рефолдинг белка из тел включения, подбор штаммов Е. coli и условий экспрессии, улучшающих фолдинг, делеционный мутагенез, совместную экспрессию с шаперонами и разные другие белково-инженерные подходы.

Одним из современных методов преодоления образования тел включения и агрегации рекомбинантных белков, синтезируемых E.coli, является технология создания химерных белков (fusion technology). В основе метода лежит конструирование плазмиды, экспрессирующей в непрерывной рамке считывания ген, состоящий из двух частей. Одна часть химерного гена кодирует целевой белок, а другая - "белок-ассистент", который способствует укладке целевого белка, увеличивает его растворимость и повышает уровень экспрессии.

Цель и задачи исследования

Целью нашей работы являлась разработка новых технологий рекомбинантного синтеза фибриллярных белков в корректном олигомерном состоянии, использующих белковые факторы фолдинга. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- Создание плазмидных конструкций, содержащих фрагменты гена белка-адгезина g37 бактериофага Т4 и ген белка-ассистента в объединенной рамке считывания под общим индуцируемым промотором

- Экспрессия и очистка химерных рекомбинантных фаговых белков

- Исследование физико-химических и биологических свойств полученных белковых продуктов

Научная новизна и практическая значимость работы

В рамках данной работы нами впервые была показана возможность использования тримерного бета-спирального С-концевого домена белка базальной пластинки бактериофага Т4 - gp5 для управления сворачиванием и олигомеризацией фибриллярных белков, то есть нами был обнаружен и описан новый эффективный белковый домен - ассистент фолдинга.

Впервые описана способность пептидил-пролил-изомеразы SLyD E.coli эффективно направлять фолдинг фибриллярных белков, что значительно расширяет существующие границы использования SLyD в качестве белка-ассистента фолдинга.

Опыт использования данных белков-ассистентов фолдинга будет несомненно востребован в биотехнологии, равно как и разработанная нами методика экспрессии и очистки получаемых на их базе химерных белков.

В качестве целевого белка - модели нами был выбран фибриллярный адгезин бактериофага Т4 - белок gp37, играющий ключевую роль на начальной стадии инфекции. Он узнает специфические рецепторы на поверхности Е. coli. Исследование функционально важного участка gp37, определение его структуры и механизма взаимодействия с рецепторами Е. coli представляет несомненный интерес как с фундаментальной точки зрения - для более глубокого понимания процесса фаговой инфекции, так и с практической - например, для разработки тест-систем для типирования и детекции бактерий и биосенсоров.

Для контроля получаемых продуктов экспрессии нами была разработана новая методика оценки нативности рекомбинантных адгезинов бактериофагов in vivo, на примере белка-адгезина фага Т4 gp37.

Апробация работы и публикации

Основные материалы диссертации были представлены на международной конференции «Protein folds in infectious and neurodegenerative diseases» (Aussois, Франция, 2009), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), на международной конференции «Phages in interaction Ш» (Leuven, Бельгия, 2009).

По теме диссертации опубликовано 4 работы, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего ¡£j£_ наименований. Работа изложена на страницах,

содержит рисунков и 5" таблиц.

Содержание работы

Создание химерных конструкций, содержащих фрагменты гена белка-адгезина g37 бактериофага Т4 и гена белка-ассистента

Ключевой момент инфекции клетки Escherichia coli бактериофагом Т4 -связывание с поверхностными рецепторами бактерии длинных хвостовых фибрилл фага. Специфичность связывания определяется белком-адгезином gp37, гомотримером, непосредственно формирующим дистальную часть длинной хвостовой фибриллы фага (Leiman et al., 2004).

В ходе естественной фаговой инфекции сборка и олигомеризация этого белка требует участия по крайней мере, двух дополнительных фаговых белковых факторов-шаперонов - gp57A и gp38, что сильно затрудняет получение нативного рекомбинантного gp37. Попытки получить рекомбинантные варианты фрагментов gp37 с использованием стандартной Т7-индуцируемой системы

экспрессии в естественном хозяине бактериофага Т4 - E.coli обернулись неудачей. Достигнутый нами уровень экспрессии рекомбинантного белка был достаточно высоким, но синтезируемый белок образовывал нерастворимые тела включения. Оптимизация условий экспрессии не оказала существенного положительного влияния на растворимость белка. Попытки химического рефолдинга тел включения привели к переводу части белка в растворимую форму, но последующие эксперименты показали отсутствие корректной четвертичной структуры у химически рефолдированных белков. Видимо, белки не смогли принять нативную конформацию, или тримеризация белковых фрагментов была неточной.

Для преодоления необходимости совместной экспрессии этого белка с шаперонами нами было решено применить одну из современных белково-инженерных стратегий — создание химерного белка, имеющего в своем составе «белок-ассистент», то есть домен, направляющий правильную сборку целевого белка.

В качестве таких ассистентов нами были использованы тримерный бета-спиральный С-концевой домен другого белка фага Т4 - gp5 и белок «теплового шока» E.coli пептидил-пролил-изомераза SLyD* с делецией ее С-концевого фрагмента, у которого отсутствует биологически значимая вторичная структура.

Рекомбинантная форма С-концевого домена gp5 (435-575 АК), обозначенная как 5HENS (His-tag - Enterokinase - Non-Stop; Protein Data Bank number: 1PDL, 1K28), формирует тример, в нативном виде устойчивый к действию SDS (додецилсульфату натрия) (рис. 1). Способность к олигомеризации этого домена определяется наличием в его структуре 11 октапептидных повторов Val-X-Gly-X-X-X-X-X, которые стабилизируют взаимное положение Р-тяжей в призме, и способствуют правильному формированию как С-концевого домена, так и gp5. Наша гипотеза, обусловившая выбор домена 5HENS как белка-носителя, заключалась в том, что самособирающаяся Р'-спираль gp5 сможет обеспечить пространственное выравнивание и тримеризацию присоединенных к ней полипептидных цепей фибриллярного белка gp37, и, таким образом, обеспечит правильный фолдинг слитого с этим доменом целевого белка.

Рисунок 1. Структура домена 5НЕМ8 §р5 Т4; три полипептидные цепи выделены разными штриховками (Коэвтапп вг а1., 2004)

В качестве белка-ассистента фолдинга gpSLyD* был выбран благодаря тому, что обладает свойствами шаперона (\Уетп^ег е1 а1., 2009).

Для клонирования в составе химерных конструкций нами были выбраны участки гена g37, кодирующие С-концевые фрагменты gp37, различающиеся по длине полипептидных цепей и количеству копий структурного мотива - Ш5-Х-Ь-Кб (табл. 1). Выбор осуществлялся таким образом, чтобы самый длинный фрагмент gp37 ^р37ТОР, выделен рамкой) включал в себя три последних структурных домена длинной хвостовой фибриллы фага -09-011 ( рис. 2) (СеггкеШ е! а!., 1996).

Таблица 1. Фрагменты gp37 (Фрагменты названы по первым трем Ы-концевым аминокислотам последовательности).

Фрагменты gp37 Длина полипептидной цепи (количество Ак.) Количество копий His-X-His мотива

gp37NTN 68 4

gp37KGT 126 6

gp37VPA 206 7

gp37GNF 236 7

gp37TGP 275 7

Рисунок 2. Бактериофаг Т4 до (А) и после (В) сокращения хвоста, и его длинная хвостовая фибрилла - §р37х3 (С), дистальная часть которой состоит из доменов Б1-Ш1 (ВаПиаІ гі аі. 2010)

Выбранные фрагменты g37 были синтезированы методом ПЦР, и далее клонированы в конструкции, содержащие g5HENS и gSLyD*.

Конструкции с g5HENS

Для клонирования фрагментов g37 с белком-ассистентом фолдинга 5HENS нами была сконструирована плазмида p5HENS на основе вектора рЕТ23а (Novagen, USA), несущая под контролем промотора Т7 ген, кодирующий полипептид следующего строения: 10xHis-tag, С-концевой домен белка gp5 бактериофага Т4, полилинкер вектора рЕТ23а (рис. 3). Все фрагменты g37 были клонированы по сайтам BamHI и Notl.

.Vofl

ori

Рисунок 3. Карта плазмиды p5HENS-37*

Конструкции с gSLyD*

Для клонирования фрагментов g37 с белком-ассистентом фолдинга SLyD* была сконструирована плазмида pESL на основе вектора рЕТ28а (Novagen, USA), несущая под контролем промотора Т7 ген, кодирующий полипептид следующего строения: 6xHis- tag, минимальный функциональный вариант пептидил-пролил-изомеразы SLyD*, линкер (аминокислотная

последовательность QLGGSGGSGGSGGSGGSGG) для снятия конформационных напряжений между белком-носителем и целевым белком, сайт узнавания TEV-протеазы (аминокислотная последовательность ENLYFQG), и полилинкер вектора рЕТ28а (рис. 4). Все фрагменты g37 были клонированы по сайтам BamHI и Notl.

Рисунок 4. Карта плазмиды pESL-37*

Дальнейшую экспрессию целевых белков осуществляли в бактериях Е. coli. Перед трансформацией в экспрессионные штаммы все полученные плазмиды проверяли на наличие целевой вставки методами гидролиза эндонуклеазами рестрикции и секвенирования.

Экспрессия и очистка химерных рекомбинантных белков

Экспрессия gp5HENS

При экспрессии фрагментов g37 в составе плазмиды-химеры gp5HENS при 20°С большая часть рекомбинантного белка находилась в растворимой форме. При этом нами была выявлена зависимость растворимости химерного белка от длины клонированного фрагмента g37. Так, самый короткий фрагмент gpNTN практически полностью находился в растворимой форме, а gpTGP, наоборот, в

Кап

ori

составе тел включения (рис. 5, табл. 2). Растворимым считался белок, который обнаруживался в жидкой (растворимой) фракции после ультразвукового разрушения клеточной суспензии Е. coli. и последующего ультрацентрифугирования полученного лизата.

Таблица 2. Степень растворимости рекомбинантных белков на базе gp5HENS.

С-концевые фрагменты gp37 Длина полипептидной цепи (количество AK) Молекулярная масса химер, кДа Относительное количество белка в растворимой форме, %

gp5HENS37NTN 224 22 90

gp5HENS37KGT 282 27 80

gp5HENS37VPA 362 38 50

gp5HENS37GNF 382 41 15

gp5HENS3 7TGP 431 47 5-7

Рисунок 5. ПААГ-электрофорез белковых препаратов (стрелками отмечены олигомерные формы белков). Гель содержит 12,5% АА. 1 - ер5НЕМ837ЫТМ (нераств. фракция); 2 - ер511ЕЫ837Ы'ПМ (раств. фракция); 4 - gp5HENS37KGT (раств. фракция); 5 - §р5НЕЫ837КОТ (нераств. фракция); 7 - gp5HENS37VPA (раств. фракция); 9 - §р5НЕШ37УРА (нераств. фракция); 10 - gp5HENS37GNF (раств. фракция); 11 - §р5НЕШ370№ (нераств. фракция); 13 - gp5HENS37TGP (раств. фракция); 15 - вр5НЕК837ТОР (нераств. фракция); 3, 6, 8, 12, 14 - стандарты молекулярных масс (кДа)

Нами было показано, что (3-спиральный домен-ассистент §р5, как и химерные белки на его основе, обладают характерным физико-химическим свойством - устойчивостью к 8Б8 при электрофоретическом разделении (рис. 3). Белки считались 8Б8-устойчивыми в случае сохранения ими олигомерной организации, обнаруживаемой при электрофорезе по методу Лэммли после кипячения образцов на водяной бане в течении 10 минут в буферном растворе, содержащем 2% БВБ. Данная особенность может указывать, что полученные химерные белки обладают тримерным строением, соответствующим ожидаемой нативной организации.

Экспрессия ^БЬуБ

Наличие в химерном белке последовательности БЬуБ кардинально изменило эффективность экспрессии целевых белков. Независимо от размера вставки, химерные белки нарабатывались в растворимой форме в большом количестве при 37°С (рис. 6). У полученных химер при электрофоретическом разделении были выявлены олигомерные состояния, как и у белков, содержащих (3-спираль белка gp5, что свидетельствует о принятии химерными белками правильной конформации. Ввиду того, что БЬуБ не является олигомерным фибриллярным белком, 808-устойчивость химерных белков на его основе была существенно ниже по сравнению с §р5-белками (данные не приводятся).

Рисунок 6. ПААГ-электрофорез белковых препаратов (стрелками отмечены олигомерные формы белков). Гель содержит 12,5% АА

1 - ёр5НЕМ837К™; 3 - 8р5ННЫ837КОТ; 5 - ёр5НЕЫ837УРА; 7 -§р5НЕК8370№; 9 - gp5HENS37TGP; 2, 4, 6, 8, 10 - стандарты молекулярных масс (кДа)

Очистка gpSHENS и gpSLyD белков

Пилотные эксперименты показали, что максимальная чистота рекомбинантных химерных белков достигается при двухстадийной хроматографической очистке с предварительным высаливанием сульфатом аммония белков, содержащихся в растворимой фракции клеточных экстрактов.

Химерные белки на основе 5HENS высаливали при концентрации (NH4)2S04 в диапазоне относительного насыщения 21-23% при 20°С, на основе SLyD - в диапазоне 27-28%, 20°С. Какой-либо зависимости практически определяемого значения точки высаливания от размера белка зафиксировано не было. После ресуспендирования полученного при высаливании осадка в буферном растворе (10 mM TrisHCl рН 8.0, 200 тМ NaCl), доля целевого белка в растворе приблизительно составляла 20% для 5HENS37VPA, и 25-30% для всех белков на основе SLyD от общего количества белка.

На следующем этапе ресуспендированный осадок наносили на ионообменную колонку, заполненную Q-сефарозой (Pharmacia, USA). При элюции белков с колонки линейным градиентом буфера В (10 шМ TrisHCl рН 8.0, 1 М NaCl, 10-100%, 20 объемов колонки), целевые белки сходили пиком, широкое основание которого свидетельствовало о внутренней гетерогенности белков, предположительно по состоянию фолдинга. Повидимому, в растворе одновременно присутствует несколько олигомерных форм белка, отличающиеся сродством к ионообменному сорбенту. После первого этапа очистки на выходе доля целевого белка была примерно 80-85%.

На втором этапе белки очищали с использованием аффинной хроматографии. Для этого соответствующую белковую фракцию наносили на колонку, заполненную'NiNTA-сефарозой (Pharmacia, USA). Элюцию проводили ступенчатым градиентом раствора имидазола, 90-160-200 мМ для химер на базе gp5HENS, и 100-150-200 мМ для химер на базе gpSLyD. На выходе доля целевого белка составляла приблизительно 95%. Хроматограммы очистки рекомбинантных белков представлены на рисунке 7.

1.0

§ 0.5

50 100

Объем, мл

150

50 100

150

Объем, мл

1.0

50 И

Объем, мл

100

150

50 100

Объем, мл

150

Рисунок 7. Хроматограммы очистки §р5НЕ^37\/РА §рЯЬУ037ТСР А - Ионообменная хроматограмма очистки gp5HENS37VPA; Б - Металло-аффинная хроматограмма очистки gp5HENS37VPA; В - Ионообменная хроматограмма очистки gpSLYD37TGP; Г - Металло-аффинная хроматограмма очистки ёр8ЬУВ37ТСР

По совокупности свойств, а именно наличию всех копий Шв-Х-Шв мотива в химерном белке и уровню экспрессии, для дальнейших физико-химических исследований были выбраны белки gp5HENS37VPA и gpSLYD37TGP. Для этого необходимые количества препаратов белка были экспрессированы и очищены по описанной выше схеме.

Исследование физико-химических и биологических свойств полученных рекомбинантных белков

Спектры кругового дихроизма химерных белков были сняты в оптимальных по концентрации условиях, используя фосфатный буферный раствор (15тМ, рН 7.4). На рисунке 8 представлены полученные нами спектры для gp5HENS37VPA и gpSLYD37TGP. Концентрация белка в пробах составляла 0.5 мг/мл.

А Б

Рисунок 8. А - КД-спектр §р5НЕШ37УРА; Б - КД-спектр 8р8ЬУ037ТСР

По форме спектра кругового дихроизма для gp5HENS37VPA можно сказать о преимущественном содержании Р-структур в белке (рис. 7А). Обработка данных с помощью двух альтернативных программ, использующих различные алгоритмы обработки данных - СБввй- и СопйпЬЬ, подтверждает это (табл. 3) [Бгеегата е1 а1. 1993; Уепуаттоу й а1. 1993]. Такое перераспределение элементов вторичной структуры, по сравнению с практически полностью Р-структурированным белком-ассистентом gp5, соответствует оценке, рассчитанной ранее при помощи программы ЗВ-РББЫ, и предположенной на основе исследования целых длинных хвостовых фибрилл фага ].

Таблица 3. Расчет содержания вторичных структур на основании КД-спектра gp5HENS37VPA программами ОБввЫ и СогПтЬЬ.

Программа а-спираль Р-СЛОЙ поворот неупорядоченная

СОэвй- 24 53 18 5

Соп1шЬЬ 23 51 20 6

В случае белка gpSLYD37TGP по форме спектра можно сказать, что в его структуре преобладает параллельный Р-лист, характерный для нативного белка (рис. 7 Б) (СеггИеШ е1 а1. 1996; ВагШа1 е1 а1. 2010). Расчёт содержания элементов вторичной структуры в программах СОввй- и СогШпЬЬ также даёт совпадающие результаты (табл. 4).

Таблица 4. Расчет содержания вторичных структур на основании КД-спектра §р8ЬУБ37ТСР программами СОббй- и СотйтЬЬ.

Программа а-спираль Р-СЛОЙ поворот неупорядоченная

CDsstr 13 51 24 12

ContinLL 14 51 22 13

Определение олигомерности белков, гель-фильтрация

Для определения олигомерного состояния химерных белков очищенные и сконцентрированные препараты gp5HENS37VPA и gpSLYD37TGP были нанесены на предварительно откалиброванную гель-фильтрационную колонку с сорбентом Toyopearl HW-55. Белки элюировались с колонки в виде симметричных пиков с объемом элюции, соответствующим 115 кДа для gp5HENS37VPA, и 150 кДа для gpSLYD37TGP. Это говорит о том, что химерные белки в растворе находятся в компактной тримерной форме (рис. 9). Также на обеих хроматограммах наблюдается дополнительный пик, соответствующий агрегированным формам белка (рис. 9). В случае gpSLYD37TGP, доля агрегатов значительно меньше, чем доля тримеров (рис. 9 Б).

1.0

S 0.5

1.0

0.5

50 100

Объем, мл

50 100

Объем, мл

Рисунок 9. Гель-фильтрационная хроматограмма gp5HENS37VPA (А) и gpSLYD37TGP (Б)

1 - Фракция, содержащая агрегированные формы белка; 2 - фракция, содержащая целевые белки в тримерной форме

Фракцию, содержащую только тримерную форму gpSLYD37TGP, далее использовали для определения формы молекулы этого белка методом малоуглового рассеивания (МУР)

Изучение структуры gpSLYD37TGP методом малоуглового рассеяния

Для изучения белков методом малоуглового рассеяния пробы белка должны соответствовать определенным требованиям, наиболее важными из которых являются монодисперсность и концентрация. Для дальнейших исследований нами был выбран белок gpSLYD37TGP, так как его очищенный препарат соответствовал требованиям, предъявляемым методом МУР, а именно: он легко концентрировался до 12 мг/мл, и в таком виде оставался стабильным при 4°С, то есть не агрегировал и не выпадал в осадок.

Для исследования методом МУР фракцию тримеров gpSLYD37TGP после гель-фильтрационного выделения концентрировали до 10 мг/мл. Перед снятием кривой МУР проводилась дополнительная проверка олигомерного состояния gpSLYD37TGP методом ультрацентрифугирования в градиенте СбС1, которая подтвердила монодисперсность пробы белка. Кривая малоуглового рентгеновского рассеяния gpSLYD37TGP представлена на рисунке 10.

Рисунок 10. Кривая МУР gpSLYD37TGP: 1-Экспериментальные точки МУР раствором белка gpSLYD37TGP, С = 10 мг/мл; 2-сглаженная по РМНК кривая 1 с аппроксимацией в нулевой угол рассеяния; 3-экспериментальные точки МУР раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA), С = 1 мг/мл; 4-сглаженная с использованием регуляризованного алгоритма наименьших квадратов (РМНК) кривая 3 с аппроксимацией в нулевой угол рассеяния

В дальнейшем на основании полученной кривой МУР мы осуществляли моделирование структуры белка.

Моделирование молекулярной структуры низкого разрешения по данным малоуглового рассеяния

Пространственная модель структуры частицы описывается функцией плотности рассеяния Р(г), которая в случае рентгеновского излучения пропорциональна разности электронной плотности молекулы и растворителя (контрасту). Непосредственное восстановление функции структуры Р(г) по экспериментальным данным с помощью обратного Фурье-преобразования невозможно. Однако, можно рассчитать интенсивность рассеяния I(s) от любой трехмерной модельной структуры, вычислить разность между интенсивностью рассеяния от модели и экспериментальными данными и, минимизируя эту разность путем варьирования параметров модели методом нелинейной оптимизации, восстановить пространственное распределение рассеивающей плотности (Амарантов, 2009).

Для решения задачи восстановления формы молекулы gpSLYD37TGP по экспериментальной кривой МУР, использовались три алгоритма моделирования формы: метод функции оболочки, метод шаров и метод моделирования аминокислотными остатками (Амарантов, 2009).

Метод функции оболочки

Этот метод позволяет найти характерную форму молекулы с рассеивающей плотностью Р(г) в однородном приближении как суперпозицию сферических гармоник (Амарантов, 2009). Полученная этим методом форма для gpSLYD37TGP представлена на рисунке 11.

Рисунок 11. Модель молекулы §р8ЬУБ37ТСР, решенная методом функции оболочки

Метод шаров

Метод основан на представлении структуры с помощью набора небольших шариков, определенным образом расположенных в пространстве. Основным преимуществом данного подхода является практическое отсутствие ограничений на сложность строения молекулы.

При компьютерном моделировании формы белка gpSLYD37TGP использовался форм-фактор шара. Результат моделирования этим методом для кривой МУР gpSLYD37TGP со стартовой областью - шар диаметром Отах=175А представлен на рисунке 12.

Рисунок 12. Шариковая модель белка gpSLyD37TGP, стартовая область поиска -шар диаметром Огаах=175 А (2529 атомов, 0=2.3А)

Метод моделирования аминокислотными остатками

Подобную модель можно получить, если заменить шарики заранее известными аминокислотными остатками исследуемой молекулы. В методе моделирования аминокислотными остатками в качестве подгоночной кривой выступает не сама кривая рассеяния, как в методе шаров, а функция парных

-ЗОА

расстояний (РегоикЪоу е{ а]., 2003; Амарантов, 2009). Решенная этим методом модель представлена на рисунке 13.

Рисунок 13. Модель белка gpSLyD37TGP, полученная методом моделирования аминокислотными остатками

Сравнительно недавно методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) была разрешена структура С-делетированного варианта SLYD (Protein Data Bank number: 2k8i, the BioMag-ResBank database: 15950). Это, в свою очередь, позволило нам точно локализовать молекулы gpSLYD на модели gpSLyD37TGP, ранее полученной методом малоуглового рассеяния (рис. 14). Для этого модель МУР gpSLYD37TGP была преобразована в электронную плотность, в которую методом докинга белков была встроена структура молекулы SlyD, разрешенная методом ЯМР. Встраивание белков осуществлялось в автоматическом режиме методом кросскорреляционного докинга при низком разрешении в программном комплексе SITUS (метод colores) (Wriggers, 2010).

в? *

Рисунок 14. Встраивание экспериментально установленной структуры молекулы БЬуБ в МУР модель §р8ЬУВ37ТСР. Молекулы 8ЬуБ выделены цветом

На полученной комбинированной модели видно, что три отстоящие друг от друга молекулы БЬуЭ плавно переходят в тримерную часть gp37TGP, а утолщения соответствуют доменам Г39 - 010 и началу В11. По линейным параметрам модель gpSLYD37TGP удалось совместить с полноразмерной молекулой белка gp37 (рис. 15). Таким образом, модель gpSLYD37TGP, полученная методом МУР, подтверждает, что полученный нами рекомбинантный фрагмент gp37 имеет третичную и четвертичную структуру, характерную ожидаемому нативному состоянию.

К сожалению, методом МУР не удалось однозначно локализовать домен 011 (игла) длинной хвостовой фибриллы. Повидимому, это связано с описанным ранее в литературе полиморфизмом конформаций данного домена, то есть его структурной лабильностью (СеггкеШ е1 а1., 1996; ВагШа! е1 а1., 2010).

Рисунок 15. Электронная фотография ДХФ бактериофага Т4 [Cerritelli et al. 1996].

Для окончательного подтверждения принятия рекомбинантными белками нативной структуры необходимо было подтвердить наличие у данных белков биологической активности. Для этого нами дополнительно были проведены эксперименты по конкурентному связыванию рекомбинантных химерных белков с поверхностными рецепторами Е. coli в присутствии бактериофага Т4.

Определение биологической активности

Тестирование активности рекомбинантных беков проводилось in vivo, в присутствии бактериофага Т4 дикого типа в трех повторностях. В экспериментах по конкурентному связыванию наблюдалось заметное ингибирование процесса инфекции клеток Е. coli бактериофагом Т4 в присутствии белков gp5HENS37VPA и gpSLYD37TGP (рис. 16). Это свидетельствует о том, что значительное уменьшение числа актов инфекции клеток фагом Т4 обусловлено связыванием с соответствующими поверхностными рецепторами Е. Coli белков gp5HENS37VPA и gpSLYD37TGP, что в свою очередь затрудняет связывание бактериофагов с ними.

Эксперименты по конкурентному связыванию с бактериофагом Т4 дикого типа выявили наличие биологической активности у полученных нами химерных белков, подтверждая тем самым принятие данными белками нативной структуры.

А Б

Рисунок 16. А - инфекционность бактериофага Т4 на клетках Е. coli В/Е1 без добавления белка (1, 4), в присутствии белка gp5HENS-37VPA в концентрации 0.3 мг/мл (5) и 2 мг/мл (б), в присутствии бычьего сывороточного альбумина (В SA) в качестве отрицательного контроля в тех же концентрациях (2 и 5 соответственно). Б - инфекционность бактериофага Т4 на клетках Е. coli В/Е1 без добавления белка (1, 4), в присутствии белка gpSLYD37TGP в концентрации 0.3 мг/мл (5) и 2 мг/мл (6), в присутствии бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве контроля в тех же концентрациях (2 и 5 соответственно)

По совокупности проведенных экспериментов можно утверждать, что использование бета-спирального домена белка базальной пластинки фага Т4 — gp5 и белка «теплового шока» E.coli пептидил-пролил-изомеразы SLyD -перспективное направление белковой инженерии, позволяющее синтез "трудных" рекомбинантных белков, которые по той или иной причине не способны самостоятельно принять биологически активную конформацию в организме-продуценте.

Как уже упоминалось ранее, получение в рекомбинантном виде олигомерных белков, сохраняющих нативную структуру, является актуальной задачей. Разработанная нами система экспрессии и очистки позволяет достаточно легко нарабатывать в больших количествах рекомбинантные олигомерные белки, такие, например, как адгезины бактериофагов, которые можно использовать - в модельных экспериментах по изучению фаговой инфекции, для разработки биосенсоров и тест-систем для типирования и детекции бактерий.

Выводы

- Использование в генной инженерии тримеризационных доменов фагового происхождения способствует корректному фолдингу тримерных рекомбинантных белков.

- Получены биологически активные препараты нативных рекомбинантных фаговых белков, что подтверждается различными биохимическими и физико-химическими методами.

- Посредством физико-химических методов и компьютерного моделирования, подтверждена ожидаемая конформация экспрессируемых в Escherichia coli целевых белков.

- Отработанная система экспрессии и очистки белков перспективна для непосредственного использования в биотехнологии.

Список публикаций с основными результатами работы:

1. Р. Н. Чупров-Неточин, Н. М. Файзуллина, Н. Н. Сыкилинда, М. Н. Симакова, В. В. Месянжинов, К. А. Мирошников; «Бета-спиральный домен бактериофага Т4 управляет укладкой фрагмента длинных хвостовых фибрилл в составе химерного белка» // Биоорганическая химия. - 2010. -том 36, № 2. - с. 1-7 (доля личного участия - 60%).

2. R. N. Chuprov-Netochin, S. V. Amarantov, М. М. Shneider, N. N. Sykilinda, М. V. Filchikov, М. А. Ivanova, V. V. Mesyanzhinov, К. А. Miroshnikov; «Peptidyl-prolyl isomerase SLyD controls the recombinant folding of bacteriophage T4 long tail fiber fragments» // Russ J Biopharm. - 2011. - vol. 3, № 1. - P. 30-36 (доля личного участия - 60%).

3. Чупров-Неточин Р. Н., Чертков О. В., Легоцкий С. В., Сыкилинда Н. Н., Шнейдер М. М., Иванова М. А., Плетенева Е. А., Шабурова О. В., Буркалыдева М. Б., Кострюкова Е. С., Лазарев В. Н., Клячко Н. Л., Мирошников К. А.; «Свойства пептидогликанлизирующего фермента бактериофага pmgl Pseudomonas aeruginosa» // Биоорганическая химия; 2011.- том 37, №6.- с. 807-814 (доля личного участия - 40%).

4. Chuprov-Netochin RN, Timofeev, VI, Samigina VR, Bezuglov W, Miroshnikov KA, Kuranova IP.; «X-ray investigation of gene-engineered human insulin crystallized from a solution containing polysialic acid» // Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. - 2010 Mar 1. - 66 (Pt 3) . - P. 259-63 (доля личного участия - 40%).

5. Чупров-Неточин Р.Н., Мирошников К.А., Чертков О.В., Месянжинов В.В. «Применение пептидогликан-лизирующих ферментов бактериофагов Pseudomonas aeruginosa для обнаружения и контроля патогена» // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, IIIS мая 2008 г., С. 678. (доля личного участия не разделяется).

6. Р.Н. Чупров-Неточин, М.М. Шнейдер, Н.Н. Сыкилинда, К.А. Мирошников. «Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения биологически активного рекомбинантного gp37 бактериофага Т4» // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 23 - 27 июня 2009 г., С. 311. (доля личного участия не разделяется).

7. Чупров-Неточин Р.Н., Шнейдер М.М., Сыкилинда Н.Н., Мирошников К.А. «Бета-спиральный домен бактериофага Т4 и пептидил-пролил изомераза управляют укладкой фрагмента длинных хвостовых фибрилл в составе химерного белка» // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, Москва-Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 г., С. 411. (доля личного участия не разделяется).

8. Чупров-Неточин Р.Н., Иванова М.А., Семенов A.M., Шнейдер М.М., Мирошников КА. «Белковая инженерия на основе пептидил-пролил изомеразы SLyD для получения биологически активных рекомбинантных рецепторных белков бактериофага Pseudomonas aeruginosa» // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, Москва-Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 г., С. 221. (доля личного участия не разделяется).

9. Чупров-Неточин Р.Н., Шнейдер М.М., Сыкилинда Н.Н., Месянжинов В.В., Мирошников КА. «Использование белковой фьюжн-инженерии для получения биологически активного рекомбинантного gp37 бактериофага Т4» // Современные проблемы генетики, Казань, 7-9 октября 2011 г. С. 55. (доля личного участия не разделяется).

10. R.Chuprov-Netochin, K.Miroshnikov, O.Chertkov, V.Mesyanzhinov. «Peptidoglycan-lysing enzymes of Pseudomonas aeruginosa bacteriophages as potential antibacterials» // Polish-Russian seminar on bacteriophages, Warsaw, 9 September 2008 г. (доля личного участия не разделяется).

11. R. N. Chuprov-Netochin, М. М. Shneider, V. V. Mesyanzhinov and К. А. Miroshnikov. «Bacteriophage Т4 beta-helical domain and peptidyl-prolyl isomerase drives the folding of the long tail fiber fragment into a functional chimeric protein» // Protein folds in infectious and neurodegenerative diseases, Aussois, April 4-8, 2009, P. 87. (доля личного участия не разделяется).

12. R.N. Chuprov-Netochin, М.М. Shneider, N.N.Sykilinda, V.V. Mesyanzhinov and K.A. Miroshnikov. «Active recombinant bacteriophage T4 gp37 produced by protein fusion engineering» // Phages in interaction III, Leuven, 18-21 December, P. 5. (доля личного участия не разделяется).

Подписано к печати 15.11.2012 Объем 1,5 пл. Заказ № 48 Тираж 100 экз.

ГУТ.МПГУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чупров-Неточин, Роман Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гетерологическая экспрессия белков в системе е. coli

1.1. Оптимизация экспрессии без изменения последовательности гена

1.2. Оптимизация экспрессии с изменением последовательности гена

1.2.1. Пептидил-пролил-цис/транс-изомераза E.coli (SLyD)

1.2.2. ß-спиральный С-концевой домен белка gp5 фага Т4 (5HENS)

2. Структурная организация и общий путь сборки бактериофага Т

2.1. Базальная пластинка бактериофага Т

2.2. Процесс инфицирования фагом клетки-хозяина

2.3. Характеристика белкового комплекса длинных хвостовых 26 фибрилл

2.3.1. Структурная характеристика белков длинных хвостовых 28 фибрилл

2.3.2. Структурная характеристика gp37 31 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Среды для выращивания бактерий и бактериофагов

2.3. Векторы для клонирования. Плазмиды

2.3.1. Векторы для клонирования и экспрессии

2.3.2. Плазмиды с фрагментами ДНК, полученные автором в ходе 35 исследований

2.4. Ферменты

2.5. Полимеразная цепная реакция

2.6. Выделение и очистка ДНК

2.6.1. Очистка фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР

2.6.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.7. Количественные определения препаратов ДНК

2.8. Секвенирование ДНК

2.9. Приготовление компетентных клеток

2.10. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК

2.11. Селекция клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды

2.12. Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli BL21(DE3)

2.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.14. Выделение белков

2.15. Очистка белков

2.15. Спекггр кругового дихроизма

2.16. Ультрацентрифугирование

2.17. Подбор условий кристаллизации

2.18. Малоугловое рентгеновское рассеяние

2.19. Эксперименты по определению биологической активности 44 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Создание генетических конструкций

3.2. Экспрессия генетических конструкций

3.3. Очистка белков

3.4. Исследование физико-химических, структурных и биологических 52 свойств полученных рекомбинантных белков

3.4.1. Круговой дихроизм

3.4.2. Определение олигомерности белков, гель-фильтрация

3.4.3. Структурная характеристика gpSLYD37TGP

3.4.4. Моделирование молекулярной структуры gpSLYD37TGP 58 низкого разрешения по данным малоуглового рассеяния.

3.4.5. Определение биологической активности gpSLYD37TGP 63 ВЫВОДЫ 65 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотный остаток БСА - раствор бычьего альбумина ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДХФ - длинная хвостовая фибрилла ИПТГ - изопропил-1-тио-Р-0-галактозид кДа - килодальтон КД - круговой дихроизм КЭМ - криоэлектронная микроскопия МУР - малоугловое рассеяние ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия ЯМР - ядерный магнитный резонанс E.coli — Escherichia coli gp — продукт гена

PDB - Protein Data Bank, www.pdb.org

STEM - сканирующая электронная трансмиссионная микроскопия SDS - додецилсульфат натрия ts - чувствительный к температуре (temperature-sensitive)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4"

Актуальность проблемы

Для гетерологической продукции рекомбинантных белков в научных, медицинских и промышленных целях применяется отработанная система экспрессии в энтеробактерии Escherichia coli. При этом исследователи зачастую сталкиваются с проблемой образования нерастворимых белковых агрегатов - тел включения. Эта проблема особенно актуальна в случае фибриллярных белков, так как помимо принятия белками правильной третичной структуры они должны иметь и нативную четвертичную структуру. Такие белки, кроме того, обычно склонны к агрегации в силу периодичности последовательности полипептида. Разработка эффективной стратегии получения олигомерных фибриллярных белков в рекомбинантном виде является важной практической задачей.

Интерес исследователей к фибриллярным белкам, механизмам их сворачивания и олигомеризации обусловлен рядом причин. Так, например, в медицине актуальную проблему представляют собой иейродегенеративные болезни, вызванные накоплением в нейронах агрегатов белка - амилоидных фибрилл. Изучение данных фибрилл in vitro, посредством получения их в рекомбинантном виде, несомненно, позволит приблизиться к пониманию процессов их образования. При решении пространственных структур фибриллярных белков исследователями зачастую обнаруживаются ранее не описанные структурные домены - фолды, тем самым вносится вклад в структурную биологию. В процессе эволюции фаги выработали способность специфически при помощи фибриллярных белков распознавать и связываться с различными структурами па поверхности бактериальной клетки. Эти свойства находят применение в создании новых реагентов и различных сорбентов с требуемыми характеристиками связывания.

Чтобы избежать образования тел включения при гетерологической экспрессии, применяют различные стратегии: рефолдинг нерастворимого агрегированного белка из тел включения, подбор штаммов E.coli и условий экспрессии, улучшающих фолдинг, делециопиый мутагенез, совместную экспрессию с шаперонами и разные другие белково-инжепериые подходы. Одним из современных методов преодоления образования тел включения и агрегации рекомбинантных белков, синтезируемых E.coli, является технология создания химерных белков (fusion technology). В основе метода лежит конструирование плазмиды, экспрессирующей в непрерывной рамке считывания ген, состоящий из двух частей. Одна часть химерного гена кодирует целевой белок, а другая - "белок-ассистент", который способствует корректной укладке целевого белка, увеличивает его растворимость и повышает уровень экспрессии и выход рекомбинантного продукта.

Цель и задачи исследования

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- Экспрессия и очистка химерных рекомбинантных фаговых белков

- Исследование физико-химических и биологических свойств полученных белковых продуктов

Научная новизна и практическая значимость работы

В рамках данной работы нами впервые была показана возможность использования тримерного бета-спирального С-концевого домена белка базальной пластинки бактериофага Т4 - gp5 для управления сворачиванием и олигомеризацией фибриллярных белков. Таким образом, нами был обнаружен и описан новый эффективный белковый домен - ассистент фолдинга.

Впервые описана способность пептндил-пролил-изомеразы SLyD E.coli эффективно направлять фолдинг фибриллярных белков, что значительно расширяет существующие границы использования SLyD в качестве белка-ассистеша фолдинга.

В качестве целевого белка - модели нами был выбран фибриллярный адгезии бактериофага Т4 - белок gp37, играющий ключевую роль на начальной стадии фаговой инфекции. Он узнает специфические белковые рецепторы на поверхности внешней мембраны кишечной палочки E.coli. Исследование функционально важного участка gp37, определение его структуры и механизма взаимодействия с рецепторами E.coli представляет несомненный интерес как с фундаментальной точки зрения - для более глубокого понимания процесса фаговой инфекции, так и с практической -например, для разработки тест-систем для типирования и детекции бактерий, а также биосенсоров.

Для контроля биологической функциональности получаемых продуктов экспрессии нами была разработана новая методика оценки нативности рекомбинантных адгезинов бактериофагов in vivo, на примере белка-адгезина фага Т4 gp37.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гстерологнческая экспрессия белков в системе E.coli

Для гетерологической продукции рекомбинантных белков в научных, медицинских и промышленных целях применяется отработанная система экспрессии в энтеробактерии Escherichia coli. Благодаря высокому выходу продукции, невысокой стоимости и хорошо отлаженным технологиям экспрессии в экспрессионной системе E.coli было получено множество рекомбинантных белков [1-4]. Однако, исследователи зачастую сталкиваются с проблемой образования нерастворимых белковых агрегатов - тел включения. Для проявления биологической активности рекомбинангные белки должны принять свою специфическую нативную трехмерную конформацию (фолд), обусловленную первичной и вторичной структурами белка. Фолдинг белка - спонтанный процесс, движимый разницей в энергии Гиббса между нативпым и развернутым (денатурированным) состояниями белка. Фолдинг белка может быть очень эффективным процессом, и некоторые белки могут принимать нативную конформацию в течение миллисекунд, то есть фактически быстрее, чем происходит биосинтез на рибосоме. Обычно, впрочем, фолдинг происходит намного медленнее в связи с тем, что включает в себя и медленные этапы, например, изомеризацию пролина [2]. В действительности реакция изомеризации пролина ферментами клетки может длиться от нескольких минут до нескольких часов, так как она включает вращение вокруг частично двойной связи [5, 6]. В цитозоле E.coli рекомбинангные белки, в том числе и бактериальной природы, нередко не могут достаточно быстро принять нужный фолд, и образуют тела включения или нерастворимые агрегаты [2]. Образование тел включения in vivo происходит в силу того, что в гетерологической среде полипептидные цепи синтезируются постоянно и агрегируют из-за неспецифических взаимодействий между частично уложенными интермедиатами рекомбинантных белков и белков клетки-хозяина [7]. Фибриллярные белки, в силу периодичности последовательности полипептида, особенно склонны к агрегации [2, 4].

В литературе описано множество подходов к получению рекомбинантных белков в растворимом виде, основные из которых представлены на рисунке 1. Их можно разделить на две группы: рефолдинг целевых белков из тел включения, и модификация экспрессиониой стратегии.

Последовательность

ДНК \

Тела включения

Рефолдинг

Модификация экспрессиониой стратегии

Без изменения последовательности гена:

• варьирование температуры экслроссии

• варьирование экспрессионных штаммов варьирование экспроссиамных сред

• регулирование уровня транскрипции < совместная экспрессия с шалоромзми

• включений тРНК комплементарных плаз мид

С изменением последовательности гена:

• экспрессия фрагментов гена

• создание химерных конструкций

• стабилизации мРНК

• скрининг растворимых вариантов

• альтернативные технологии

Рисунок 1. Основные подходы получения растворимых рекомбинантных белков при экспрессии в E.coli.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чупров-Неточин, Роман Николаевич

выводы

- Посредством физико-химических методов и компьютерного моделирования, подтверждена ожидаемая конформация экспрессируемых в Escherichia coli целевых фибриллярных белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чупров-Неточин, Роман Николаевич, Москва

1. Sorensen, H.P. and K.K. Mortensen, Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology, 2005. 115(2): p. 113-128.

2. Baneyx, F. and M. Mujacic, Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat Biotechnol, 2004. 22(11): p. 1399-408.

3. Eiteman, M.A. and E. Altman, Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations. Trends in Biotechnology, 2006. 24(11): p. 530-536.

4. De Bernárdez Clark, E., et al., Oxidative renaturation of hen egg-white lysozyme. Folding vs aggregation. Biotechnol Prog, 1998. 14(1): p. 47-54.

5. Schmid, F.X., Prolyl isomerases. Advan. Protein Chem., 2002. 59: p. 243-282.

6. Schmid, F.X., et al., Prolyl isomerases: role in protein folding. Advan. Protein Chem., 1993.44: p. 25-66.

7. Young, J.C., et al., Pathways of chaperone-mediated protein folding in the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004. 5(10): p. 781-91.

8. Schein, C.H., Production of soluble recombinant proteins in bacteria. Nature Biotechnology, 1989. 7(11): p. 1141-1149.

9. Vasina, J.A. and F. Baneyx, Expression of Aggregation-Prone Recombinant Proteins at Low Temperatures: A Comparative Study of theEscherichia coli cspAandtacPromoter Systems. Protein Expression and Purification, 1997. 9(2): p. 211-218.

10. Kiefhaber, T., et al., Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. Nature Biotechnology, 1991. 9(9): p. 825-829.

11. Chesshyre, J.A. and A.R. Hipkiss, Low temperatures stabilize interferon a-2 against proteolysis in Methylophilus methylotrophus and Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology, 1989.31(2): p. 158-162.

12. Mogk, A., M.P. Mayer, and E. Deuerling, Mechanisms of protein folding: molecular chaperones and their application in biotechnology. Chembiochem, 2002. 3(9): p. 807814.

13. Ferrer, M., et al., Chaperonins govern growth of Escherichia coli at low temperatures. Nature Biotechnology, 2003. 21(11): p. 1266.

14. Ferrer, M., et al., Expression of a temperature-sensitive esterase in a novel chaperone-based Escherichia coli strain. Applied and environmental microbiology, 2004. 70(8): p. 4499-4504.

15. Miroux, B. and J.E. Walker, Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of molecular biology, 1996. 260(3): p. 289-298.

16. Steinfels, E., et al., Highly efficient over-production in E. coli ofYvcC, a multidrug-like ATP-binding cassette transporter from Bacillus subtilis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2002.1565(1): p. 1-5.

17. Smith, V.R. and J.E. Walker, Purification and folding of recombinant bovine oxoglutarate/malate carrier by immobilized metal-ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification, 2003. 29(2): p. 209-216.

18. Arechaga, I., et al., Over-expression of Escherichia coli FIFo-ATPase subunit a is inhibited by instability of the uncB gene transcript. FEBS Letters, 2003. 547(1-3): p. 97100.

19. Lehmann, K., et al., High-yield expression in Escherichia coli, purification, and characterization of properly folded major peanut allergen Ara h 2. Protein Expression and Purification, 2003. 31(2): p. 250-259.

20. Premkumar, L., et al., An unusual halotolerant a-type carbonic anhydrase from the alga Dunaliella salina functionally expressed in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 2003. 28(1): p. 151-157.

21. Bessette, P.H., et al., Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999. 96(24): p. 13703.

22. Weickert, M.J., et al., A mutation that improves soluble recombinant hemoglobin accumulation in Escherichia coli in heme excess. Applied and environmental microbiology, 1999. 65(2): p. 640-647.

23. Deucrling, E., et al., Trigger factor and DnaK possess overlapping substrate pools and binding specificities. Molecular microbiology, 2003. 47(5): p. 1317-1328.

24. Schlieker, C., B. Bukau, and A. Mogk, Prevention and reversion of protein aggregation by molecular chaperones in the< i> E. coli</i> cytosol: implications for their applicability in biotechnology. Journal of Biotechnology, 2002. 96(1): p. 13-21.

25. Kuczynska-Wisnik, D., et al., The Escherichia coli small heat-shock proteins IbpA and IbpB prevent the aggregation of endogenous proteins denatured in vivo during extreme heat shock. Microbiology, 2002. 148(6): p. 1757-1765.

26. Kitagawa, M., et al., Escherichia coli small heat shock proteins, IbpA and IbpB, protect enzymes from inactivation by heat and oxidants. European Journal of Biochemistry, 2002. 269(12): p. 2907-2917.

27. Ikura, K., et al., Co-overexpression of folding modulators improves the solubility of the recombinant guinea pig liver transglutaminase expressed in Escherichia coli. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2002. 32(2): p. 189-205.

28. Nishihara, K., et al., Overexpression of trigger factor prevents aggregation of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied and environmental microbiology, 2000. 66(3): p. 884-889.

29. Sorensen, H.P. and K.K. Mortensen, Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microbial cell factories, 2005. 4(1): p. 1.

30. Dale, G.E., et al., Improving protein solubility through rationally designed amino acid replacements: solubilization of the trimethoprim-resistant type SI dihydrofolate reductase. Protein engineering, 1994. 7(7): p. 933-939.

31. Farinas, E.T., T. Bulter, and F.H. Arnold, Directed enzyme evolution. Current Opinion in Biotechnology, 2001. 12(6): p. 545-551.

32. Jacquet, A., et al., Expression of a Recombinant Toxoplasma gondii ROP2 Fragment as a Fusion Protein in Bacteria Circumvents Insolubility and Proteolytic Degradation. Protein Expression and Purification, 1999.17(3): p. 392-400.

33. Davis, G.D., et al., New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 1999. 65(4): p. 382-8.

34. Kapust, R.B. and D.S. Waugh, Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility ofpolypeptides to which it is fused. Protein Sei, 1999. 8(8): p. 1668-74.

35. Sorensen, H.P., H.U. Sperling-Petersen, and K.K. Mortensen, A favorable solubility partner for the recombinant expression of streptavidin. Protein Expression and Purification, 2003. 32(2): p. 252-259.

36. Waldo, G.S., et al., Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 1999. 17(7): p. 691-5.

37. Baneyx, F., Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology, 1999.10(5): p. 411-421.

38. Stevens, R.C., Design of high-throughput methods of protein production for structural biology. Structure, 2000. 8(9): p. R177-R185.

39. Smith, D.B. and K.S. Johnson, Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 1988. 67(1): p. 31-40.

40. LaVallie, E.R., et al., A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y), 1993. 11(2): p. 187-193.

41. Eliseev, R., A. Alexandrov, and T. Gunter, High-yield expression and purification of p!8 form of Bax as an MBP-fusion protein. Protein Expression and Purification, 2004. 35(2): p. 206-209.

42. Smyth, D.R., et al., Crystal structures offusion proteins with large-affinity tags. Protein science, 2003.12(7): p. 1313-1322.

43. Goh, L.L., et al., Soluble expression of a functionally active Plasmodium falciparum falcipain-2 fused to maltose-binding protein in Escherichia coll Protein Expression and Purification, 2003. 32(2): p. 194-201.

44. Pedelacq, J.D., et al., Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2006. 24(1): p. 79-88.

45. Tdcno, A., et al., Expression of foreign proteins in Escherichia coli by fusing with an archaeal FK506 binding protein. Applied microbiology and biotechnology, 2004. 64(1): p. 99-105.

46. Scholz, С., et al., Functional Solubilization of Aggregation-prone HIV Envelope Proteins by Covalent Fusion with Chaperone Modules. Journal of Molecular Biology, 2005. 345(5): p. 1229-1241.

47. Han, K.Y., et al., Solubilization of aggregation-prone heterologous proteins by covalent fusion of stress-responsive Escherichia coli protein, SlyD. Protein Eng Des Sei, 2007. 20(11): p. 543-9.

48. Scholz, С., et al., SlyD proteins from different species exhibit high prolyl isomerase and chaperone activities. Biochemistry, 2006. 45(1): p. 20-33.

49. Bhardwaj, A., et al., Foldon-guided self-assembly of ultra-stable protein fibers. Protein Sei, 2008. 17(9): p. 1475-85.

50. Tao, Y., et al., Structure of bacteriophage T4 fibritin: a segmented coiled coil and the role of the C-terminal domain. Structure, 1997. 5(6): p. 789-98.

51. Летаров, A.B., et al., Карбоксиконцевой домен инициирует тримеризацию и фолдинг фибритина бактериофага Т4. Биохимия, 1999. 64: р. 817-823.

52. Boudko, S.P., et al., Domain organization, folding and stability of bacteriophage T4 fibritin, a segmented coiled-coilprotein. Eur J Biochem, 2002. 269(3): p. 833-41.

53. Miroshnikov, K.A., et al., Engineering trimeric fibrous proteins based on bacteriophage T4 adhesins. Protein Eng, 1998. 11(4): p. 329-32.

54. Мирошников, K.A., et al., Трансформация beta-структурного фрагмента адгезина бактериофага Т4 в а1рНа-спиральный стабильный /пример. Биохимия, 2000. 65: р. 1600-1606.

55. Frank, S., et al., Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. Journal of Molecular Biology, 2001. 308(5): p. 1081-1089.

56. Stetefeld, J., et al., Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro) 1 Ofoldon. Structure, 2003. 11(3): p. 339-46.

57. Yang, X., et al., Highly stable trimers formed by human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoproteins fused with the trimeric motif of T4 bacteriophage fibritin. J Virol, 2002. 76(9): p. 4634-42.

58. Sissoeff, L., et al., Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. J Gen Virol, 2005. 86(Pt 9): p. 2543-52.

59. Papanikolopoulou, K., et al., Formation of highly stable chimeric trimers by fusion of an adenovirus fiber shaft fragment with the foldon domain of bacteriophage t4 fibritin. J Biol Chem, 2004. 279(10): p. 8991-8.

60. Papanikolopoulou, K., et al., Adenovirus Fibre Shaft Sequences Fold into the Native Triple Beta-Spiral Fold when N-terminally Fused to the Bacteriophage T4 Fibritin Foldon Trimerisation Motif. Journal of Molecular Biology, 2004. 342(1): p. 219-227.

61. Papanikolopoulou, K., M.J. Raaij, and A. Mitraki, Creation of Hybrid Nanorods From Sequences of Natural Trimeric Fibrous Proteins Using the Fibritin Trimerization Motif2008. p. 15-33.

62. Seo, H.-S., et al., Functional fusion mutant of Candida antarctica lipase B (CalB) expressed in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Proteins & Proteomics, 2009. 1794(3): p. 519-525.

63. Weininger, U., et al., NMR Solution Structure of SlyD from Escherichia coli: Spatial Separation of Prolyl Isomerase and Chaperone Function. Journal of Molecular Biology,2009. 387(2): p. 295-305.

64. Roof, W.D. and R. Young, Phi XI74 lysis requires slyD, a host gene which is related to the FKBP family of peptidyl-prolyl cis-trans isomerases. FEMS Microbiol Rev, 1995. 17(1-2): p. 213-8.

65. Roof, W.D., et al., Mutational analysis of slyD, an Escherichia coli gene encoding a protein of the FKBP immunophilin family. Mol Microbiol, 1997. 25(6): p. 1031-46.

66. Bernhardt, T.G., W.D. Roof, and R. Young, The Escherichia coli FKBP-type PPIase SlyD is required for the stabilization of the E lysis protein of bacteriophage phi XI74. Mol Microbiol, 2002. 45(1): p. 99-108.

67. Mendel, S., et al., Interaction of the transmembrane domain of lysis protein E from bacteriophage phiXl 74 with bacterial translocase MraY and peptidyl-prolyl isomerase SlyD. Microbiology, 2006. 152(Pt 10): p. 2959-67.

68. Roof, W.D., et al., slyD, a host gene required for phi X174 lysis, is related to the FK506-binding protein family of peptidyl-prolyl cis-trans-isomerases. J Biol Chem, 1994. 269(4): p. 2902-10.

69. Martino, L., et al., The interaction of the Escherichia coli protein SlyD with nickel ions illuminates the mechanism of regulation of its peptidyl-prolyl isomerase activity. FEBS J, 2009.276(16): p. 4529-44.

70. Mitterauer, T., et al., Metal-dependent nucleotide binding to the Escherichia coli rotamase SlyD. Biochem J, 1999. 342 ( Pt 1): p. 33-9.

71. Hottenrott, S., et al., The Escherichia coli SlyD is a metal ion-regulated peptidyl-prolyl cis/trans-isomerase. J Biol Chem, 1997. 272(25): p. 15697-701.

72. Zhang, J.W., et al., A role for SlyD in the Escherichia coli hydrogenase biosynthetic pathway. J Biol Chem, 2005. 280(6): p. 4360-6.

73. Hesterkamp, T., et al., Escherichia coli trigger factor is a prolyl isomerase that associates with nascent polypeptide chains. Proc Natl Acad Sei USA, 1996. 93(9): p. 4437-41.

74. Patzelt, H., et al., Binding specificity of Escherichia coli trigger factor. Proc Natl Acad Sei U S A, 2001. 98(25): p. 14244-9.

75. Leach, M.R., J.W. Zhang, and D.B. Zamble, The role of complex formation between the Escherichia coli hydrogenase accessory factors HypB and SlyD. J Biol Chem, 2007. 282(22): p. 16177-86.

76. Mukherjee, S., A. Shukla, and P. Guptasarma, Single-step purification of a protein-folding catalyst, the SlyD peptidyl prolyl isomerase (PPI), from cytoplasmic extracts of Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem, 2003. 37(Pt 2): p. 183-6.

77. Wülfing, C., J. Lombardero, and A. Pluckthun, An Escherichia coli protein consisting of a domain homologous to FK506-binding proteins (FKBP) and a new metal binding motif. J Biol Chem, 1994. 269(4): p. 2895-901.

78. Knappe, T.A., et al., Insertion of a Chaperone Domain Converts FKBP12 into a Powerful Catalyst of Protein Folding. Journal of Molecular Biology, 2007. 368(5): p. 1458-1468.

79. Graubner, W., A. Schierhorn, and T. Bruser, DnaKplays a pivotal role in Tat targeting of CueO and functions beside SlyD as a general Tat signal binding chaperone. J Biol Chem, 2007. 282(10): p. 7116-24.

80. Kanamaru, S., et al., Structure of the cell-puncturing device of bacteriophage T4. Nature, 2002. 415(6871): p. 553-7.

81. Nakagawa, II., F. Arisaka, and S. Ishii, Isolation and characterization of the bacteriophage T4 tail-associated lysozyme. J Virol, 1985. 54(2): p. 460-6.

82. Rossmann, M.G., et al., The bacteriophage T4 DNA injection machine. Curr Opin Struct Biol, 2004.14(2): p. 171-80.

83. Leiman, P.G., et al., Three-dimensional rearrangement of proteins in the tail of bacteriophage T4 on infection of its host. Cell, 2004. 118(4): p. 419-29.

84. Wood, W.B., Undelivered summary remarks for the 1974 Squaw Valley meeting on assembly mechanisms. J Supramol Struct, 1974. 2(2-4): p. 512-4.

85. Hohn, B., et al., Phage lambda DNA packaging, in vitro. J Supramol Struct, 1974. 2(2-4): p. 302-17.

86. Kaiser, D., M. Syvanen, and T. Masuda, Processing and assembly of the head of bacteriophage lambda. J Supramol Struct, 1974. 2(2-4): p. 318-28.

87. Kikuchi, Y. and J. King, Genetic control of bacteriophage T4 baseplate morphogenesis. I. Sequental assambly of the major precursor, in vivo and in vitro. J. Mol. Biol., 1975. 99: p. 645-672.

88. Eisrling, F.A. and L.W. Black, Pathway in T4 morphogenesis in Molecular biology of bacteriophage T4 (eel. J. Karam). American Society for Microbiology. Washington, D.C., 1994: p. 209-212.

89. Kutter, E., G. Mosig, and . Genomic maps of bacteriophage T4 in Genetic Maps. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1993: p. 1-27.

90. Bradley, D.E., The structure ofcoliphages. J. Gen. Microbiol., 1963. 31: p. 435-445.

91. Edgar, R.S. and I. Liclausis, Temperature-sensitive mutants of bacteriophage T4D: their isoltion and genetic characterization. Genetics, 1964. 52: p. 649-660.

92. Epstein, R.H., et al., Physiological studies of conditional lethal mutants of bacteriophage T4D. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1964. 28: p. 375-392.

93. Kellenberger, E., et al., Functiones and properties related to the tail fibers of bacteriophage T4. Virology, 1965. 26: p. 419-440.

94. Yanagida, M. and C. Ahmad-Zadeh, Determination of gene product positions in bacteriophage T4 by specific antibody association. J Mol Biol., 1970. 51: p. 411-21.

95. Cummins, D.J., V.A. Chapman, and S.S. De Long, Disruption ofT-even bacteripohage by dimeilsulfoxid. J. Virol., 1968. 2: p. 610-617.

96. Van Vunakis, II., W.K. Baker, and K. Brown, Structural studies on the protein of bacteriophages. I. Alkaline dissociation of the protein coat "ghost" of bacteriophage T2. Virology, 1958: p. 327-332.

97. Williams, R.C. and D. Fraser, Structural and functional differentiation in T2 bacteripohage. Virology, 1956. 2: p. 289-297.

98. Edgar, R.S. and W.B. Wood, Morphogenesis of bacteriophage T4 in extracts of mutant-infected cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1966. 55: p. 498-505.

99. Wood, W.B., Bacteriophage T4 morphogenesis as a model for assembly of subcellular structure. Q. Rev. Biol., 1980. 55: p. 353-367.

100. Edgar, R.S. and I. Lielausis, Some steps in the assambly of bacteriophage T4. J. Mol. Biol., 1968. 32: p. 263-271.

101. King, J., Bacteriophage T4 tail assembly: four steps in core formation. J. Mol. Biol., 1971. 58: p. 693-709.

102. Wood, W.B., Bacteriophage T4 assambly and the morphogenesis of subcellular structure. Harvey Lect., 1979. 73: p. 203-223.

103. Laemmli, U.K., J.R. Paulson, and J. Hitchins, Maturation of the head of bacteriophage T4. J. Supramol. Struct, 1974. 2: p. 276-301.

104. Black, L.W., M.K. Shovve, and A.C. Steven, Morphogenesis of the T4 head in Molecular biology of bacteriophage T4 (ed. J. Karam). American Society for Microbiology. Washington, D.C., 1994: p. 218-258.

105. Kellenberger, E., Studies on the morphogenesis of the head of phage T-even. V. The components of the T4 capsid and of other, capsid-related structures. Virology, 1968. 34: p. 549-61.

106. Kikuchi, Y. and J. King, Genetic control of bacteriophage T4 baseplate morphogenesis. II. Mutants unable to form the central part of the baseplate. J. Mol. Biol., 1975. 99: p. 673-694.

107. Kikuchi, Y. and J. King, Genetic control of bacteriophage T4 baseplate morphogenesis. III. Formation of the central plug and overall assembly pathway. J. Mol. Biol., 1975.99: p. 695-716.

108. Meezan, E. and W.B. Wood, The sequence of gene product interaction in bacteriophage T4 tail core assembly. J. Mol. Biol., 1971. 58: p. 685-692.

109. King, J., Assembly of the tail of bacteriophage T4. J. Mol. Biol., 1968. 32: p. 231-262.

110. King, J. and N. Mykolajewycz, Bacteriophage T4 tail assembly: proteins of the sheath, core and baseplate. J. Mol. Biol., 1973. 75: p. 339-358.

111. Kostyuchenko, V.A., et al., Three-dimensional structure of bacteriophage T4 baseplate. Nat Struct Biol, 2003. 10(9): p. 688-93.

112. Crowther, R.A., et al., Molecular reorganization in the hexagon to star transition of the baseplate of bacteriophage T4. J Mol Biol, 1977. 116(3): p. 489-523.

113. Liljas, L., Virus assembly. Curr Opin Struct Biol, 1999. 9(1): p. 129-34.

114. Thomassen, E., et al., The structure of the receptor-binding domain of the bacteriophage T4 short tail fibre reveals a knitted trimeric metal-binding fold. J Mol Biol, 2003.331(2): p. 361-73.

115. Crowther, R.A., Mutants of bacteriophage T4 that produce infective fibreless particles. J Mol Biol, 1980.137(2): p. 159-74.

116. Kostyuchenko, V.A., et al., The structure of bacteriophage T4 gene product 9: the trigger for tail contraction. Structure, 1999. 7(10): p. 1213-22.

117. Yamamoto, M. and H. Uchida, Organizaton and function of the tail of bacteriophage T4. Structural control of the tail contraction. J. Mol. Biol., 1973. 92: p. 207 223.

118. Yamamoto, M. and H. Uchida, Organization and function of bacteriophage T4 tail. Isolation of heat-sensitive mutations. Virology 1973. 52: p. 234-245.

119. Simon, L.D., J.G. Swan, and J.E. Flatgaart, Functional defects in T4 bacteriophage lacking the gene 11 and 12 products. Virology, 1970. 41: p. 77-90.

120. Crawford, J.T. and E.B. Goldberg, The effect of baseplate mutation on the requirement for tail-fiber binding for irreversible adsorption on bacteriophage T4. J. Mol. Biol.,1977. Ill: p. 305 -313.

121. Beckendorf, S.K., Structure of bacteriophage T4 genes 37 and 38. J.Mol.Biol., 1973. 73: p. 17-35.

122. Dawes, J., Characterization of bacteriophage T4 receptor site. Nature, 1975. 256: p. 332-338.

123. Brenner, F., G. Stuisiunger, and R.W. Hoene, Structural components of bacteriophage T4. J.Mol.Biol., 1959. 1: p. 281-292.

124. Голицына, H.JI., et al., Выделение биологически активных половинок длинных хвостовых фибрилл и бакенбард бактериофага Т4. Биол. Науки, 1983. 114: р. 2732.

125. Селиванов, Н.А., et al., Структура и регуляция сборки фибриллярных белков бактериофага Т4. Выделение и спектральные свойства длинных хвостовых фибрил. Молек. биология, 1987. 21: р. 1258 1267.

126. Wood, W.B., F.A. Eiserling, and R.A. Crowther, Long tail fibers: genes, proteins, structure, and assembly" in Bacteriophage T4 (Karam J.D., ed.). American society for microbiology, Washington D.C., 1994: p. 282-290.

127. Earnshaw, W.G., E.B. Goldberg, and E.A. Crowther, The distal half of the tail fiber of the bacteriophage T4. Rigidly linked domains and cross b - structure. J. Mol. Biol., 1979. 132: p. 101-131.

128. Oliver, D.B. and R.A. Crowther, DNA sequence of the tail fibre genes 36 and 37 of bacteriophage T4. J. Mol. Biol., 1989. 153: p. 545 568.

129. Dickson, R.C., Assembly of bacteriophage T4. J.Mol. Biol., 1970. 53: p. 633-647.

130. Laemmli, U.K., Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227: p. 680 685.

131. King, J. and U.K. Laemmli, Polypeptide of the tail fibres of bacteriophage T4. J. Mol. Biol., 1971. 62: p. 465-477.

132. Cerritelli, M.E., et al., Stoichiometry and domainal organization of the long tail-fiber of bacteriophage T4: a hinged viral adhes in. J. Mol. Biol., 1996. 260: p. 767-780.

133. Ward, S. and R.C. Dickson, Assembly of bacteriophage T4 tail fibers. Genetic control of the major tail fiber polypeptides. J. Mol. Biol., 1971. 62: p. 479 492.

134. Makhov, A.M., et al., Filamentous hemagluttinin of Bordetella pertussis: A bacterial adhesin formed as a 50-nm monomeric rigid rod based on a 19-residue repeat motif rich in beta-strands and turns. J.Mol.Biol., 1994. 241: p. 110-124.

135. Steinbacher, S., et al., Crystal structure ofP22 tailspike protein: inter digitated subunits in a thermostable trimer. Science, 1994. 265: p. 383-386.

136. Stouten, P.F.W., et al., New triple-helical model for the shaft of the adenovirus fibre. J. Mol. Biol., 1992. 226: p. 1073-1084.

137. Makhov, A.M., et al., The short tail fiber of bacteriophage T4: Molecular structure and a mechanism for its conformational transition. Virology, 1993. 194: p. 117- 127.

138. Michel, C.J., et al., A remarkable amino acid sequence homology between a phage T4 tail fibre protein and ORF314 of phage lambda located in the tail operon. Genetics, 1986. 44: p. 147- 150.

139. Bartual, S.G., et al., Structure of the bacteriophage T4 long tail fiber receptor-binding tip. Proc Natl Acad Sei USA, 2010.107(47): p. 20287-92.

140. Montag, D., H. Schwarz, and U. Henning, Receptor-recognizing proteins T-even type bacteriophages. Constant and hypervariable regions and an unusual case of evolution. J. Mol. Biol., 1987.196: p. 165 174.

141. Tetart, F., et al., Bacteriophage T4 host range is expanded by duplications of a small domain of the tail fiber adhesin. J. Mol. Biol., 1996. 258: p. 726 731.

142. Trojet, S.N., et al., The gp38 Adhesins of the T4 Superfamily: A Complex Modular Determinant of the Phage's Host Specificity. Genome biology and evolution, 2011. 3: p. 674.

143. Sambrook, R. and D.W. Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001.

144. Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual/J. Sambrook, EF Fritsch, T. Maniatis 1989: New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

145. William Studier, F., et al., 6. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods in enzymology, 1990. 185: p. 60-89.

146. Cleveland, D.W., et al., Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis. Journal of Biological Chemistry, 1977. 252(3): p. 1102.

147. Provencher, S.W. and J. Glockner, Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. Biochemistry, 1981. 20(1): p. 33-7.

148. Venyaminov, S.Y., et al., Circular dichroic analysis of denatured proteins: inclusion of denatured proteins in the reference set. Analytical biochemistry, 1993. 214(1): p. 1724.

149. Sreerama, N. and R.W. Woody, A self-consistent method for the analysis of protein secondary structure from circular dichroism. Analytical biochemistry, 1993. 209(1): p. 32-44.

150. Lebowitz, J., M.S. Lewis, and P. Schuck, Modem analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein science, 2002. 11(9): p. 2067-2079.

151. Timofeev, V., et al., X-ray investigation of gene-engineered human insulin crystallized from a solution containing polysialic acid. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2010. 66(3): p. 259-263.

152. Svergun, D., A. Semenyuk, and L. Feigin, Small-angle-scattering-data treatment by the regularization method. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography, 1988. 44(3): p. 244-250.

153. Chertkov, O., et al., Properties of the peptidoglycan-degrading enzyme of the Pseudomonas aeruginosa UPMG1 bacteriophage. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2011. 37(6): p. 732-738.

154. Kelley, L.A., R.M. MacCallum, and M.J.E. Sternberg, Enhanced genome annotation using structural profiles in the program 3D-PSSM. Journal of molecular biology, 2000. 299(2): p. 501-522.

155. Амарантов, С.В., Восстановление формы наночастгщы по решению прямой и обратной задач малоуглового рассеяния для единичного потенциала ограниченного в объеме тора. Журнал экспериментальной и теоретической физики, 2009. 135(4): р. 721-737.

156. Svergun, D.I., et al., New developments in direct shape determination from small-angle scattering 2. Uniqueness. Acta Crystallogr., 1996. 52: p. 419-426.

157. Svergun, D.I., Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophys J, 1999. 76(6): p. 2879-86.

158. Petoukhov, M.V. and D.I. Svergun, New methods for domain structure determination ofproteins from solution scattering data. Journal of applied crystallography, 2003. 36(3): p. 540-544.

159. Wriggers, W., Using Situs for the integration of multi-resolution structures. Biophysical reviews, 2010. 2(1): p. 21-27.

Информация о работе

Чупров-Неточин, Роман Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы