Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие пептидил-пролил цис/транс измераз Arabidopsis Thaliana во взаимодействии растения-хозяина с патогеном
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Участие пептидил-пролил цис/транс измераз Arabidopsis Thaliana во взаимодействии растения-хозяина с патогеном"

На правах рукописи

МОКРЯКОВА Мария Владимировна

УЧАСТИЕ ПЕПТИДИЛ-ПРОЛИЛ ЦИС/ТРАНС ИЗОМЕРАЗ ЛЕАВЮОРЯГБ ТНАІІАШ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА С ПАТОГЕНОМ

(специальность 03.02.07 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Москва 2013

005539411

005539411

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

БРУСКИН Сергей Александрович, зав. лаб. функциональной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ДЕЙНЕКО Елена Викторовна, зав. лаб. биоинженерии растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

доктор биологических наук, доцент ОДИНЦОВА Татьяна Игоревна, зав. лаб. молекулярно-генетических основ иммунитета растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, г. Москва

Защита состоится «12» декабря 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.002.214.01 в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, 3. Тел. (499)135-62-13, факс: (499)132-89-62, e-mail: aspirantura@,vigg.ru, адрес в Интернете: www.vigg.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института.

Автореферат разослан « гР » ноября 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета, /)

кандидат биологических наук / V Синелыцикова Т.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертационной работы. Бактериальные болезни растений наносят огромный экономический ущерб, поражая ценные породы плодовых, эфиромасличных, технических и овощных культур. По данным FAO (продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН) ежегодные потери урожая от бактериальных заболеваний в сельском хозяйстве составляют примерно 30% от общих потерь урожая по всему миру, причем бактериозы могут поражать растения на огромных площадях.

Важную роль в предотвращении заражения растения патогенами играет врожденный иммунитет растения, который включает в себя три барьера. Первый из них - структурный: многие патогены не способны преодолеть внешние поверхности растения. Второй - основывается на трансмембранных рецепторах, расположенных на поверхности клеток, которые распознают консервативные патоген-ассоциированные молекулы и индуцируют основной иммунный ответ растения. Третий барьер базируется на внутриклеточных R-белках (от англ. resistance - устойчивость) и направлен против патогенов, способных преодолеть второй барьер. Такой иммунитет получил название индуцируемого. Фитопатогенные бактерии способны подавлять как основной, так и индуцированный иммунитет за счет секреции факторов вирулентности внутрь растительной клетки. Механизм такого подавления начал изучаться сравнительно недавно и до сих пор точно не определен. Однако одним из главных инструментов патогенеза грамотрицательных бактерий являются белки-эффекторы, секретируемые при помощи транспортной системы третьего типа (ТЗСС) в клетки растения-хозяина. Белки-эффекторы важны для патогенности бактерий Pseudomonas, Xanthomonas, Ralstortia и Erwinia, колонизирующих апопласт растений и способных вызывать гибель растительной клетки, таких как. Проникновение в клетку хозяина через ТЗСС сопряжено с полным или частичным разворачиванием белковой молекулы, что предполагает ее взаимодействие с шаперонами хозяина для восстановления структурной конформации и активации глобулы. В качестве таких шаперонов могут выступать пептидил-пролил цис/транс изомеразы клетки растения.

Пептидил-пролил цис/транс изомеразы (peptidyl-prolyl cis/trans isomerases, PPIase, иммунофилины) - большое семейство высококонсервативных белков, присутствующих у про- и эукариот, которые обеспечивают цис/транс изомеризацию полипептидной связи, предшествующей остатку пролина. Впервые они были обнаруженные у млекопитающих, как рецепторы иммуносупрессирующего препарата циклоспорина А. В дальнейшем PPIase были идентифицированы у бактерий, грибов и высших растений. Осуществляя цис/транс-изомеризацию связи, они участвуют тем самым в различных клеточных процессах, в том числе, в фолдинге белков. Кроме того, было показано участие иммунофилинов в контроле термотолерантности, солевом и оксидативном стрессах. Несмотря на то, что в ряде работ отмечают участие отдельных PPIase млекопитающих,

з Г

бактерий и грибов в иммунных процессах, участие PPIase растений в защитных процессах остается слабо исследованным. Кроме того, ряд патогенов - вирусов и бактерий - используют PPIase хозяина для обеспечения конформационных изменений полипептидных молекул, секретируемых внутрь клетки хозяина. Основываясь на имеющихся данных, было предположено, что PPIase если не играют ключевую роль, то, по крайней мере, являются одними из важных элементов защитных процессов растения. В качестве объекта исследования нами были выбраны PPIase растения Arabidopsis thaliana, поскольку это модельное растение с полностью известной последовательностью генома. В геноме А. thaliana представлено 55 генов PPIase, для большинства из которых выполняемые функции остаются неизвестными.

Цель работы - изучение роли пептидил-пролил цис/транс изомераз растения Arabidopsis thaliana при взаимодействии с бактериями (Xanthomonas и Pseudomonas), в патогенезе которых участвуют белки-эффекторы, секретируемые транспортной системой третьего типа.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отобрать пептидил-пролил цис/транс изомеразы, вовлеченные в защитный ответ А. thaliana при биотических стрессовых воздействиях, и оценить их роль в иммунном ответе на развития фитопатогенной бактериальной инфекции (Xanthomonas и Pseudomonas)',

2. Проанализировать изменение уровня экспрессии отобранных генов пептидил-пролил ifiic/mpanc изомераз и установить активацию промоторных областей в норме и при заражении, а так же локализацию их белковых продуктов в клетке растения;

3. Определить механизм влияния изучаемых пептидил-пролил цис/транс изомераз на изменение устойчивости растений Л. thaliana к инвазии патогена;

4. Выявить закономерности между составом генов, кодирующих белки-эффекторы, и физиологическими признаками бактериальных штаммов (расой, патовариантом и реакцией на них растений с известными генами резистентности) в естественной популяции бактерий рода Xanthomonas.

Научная новизна работы. Впервые были получены экспериментальные данные, указывающие на непосредственное вовлечение в ответ на инвазию патогена иммунофилинов А. thaliana At2gl6600, At4g33060 и At5g48570. В работе показано не только изменение их экспрессии при стрессовых воздействиях, но и непосредственная активация данных иммунофилинов в защитном ответе, продемонстрирована клеточная локализация трех исследованных PPIase. Кроме того, изучено влияние данных PPIase на изменение устойчивости растения к бактериальной инвазии. Впервые показано, что снижение чувствительности к фитопатогенам трансгенных растений с повышенной экспрессией исследованных PPIase связано с активацией в их тканях таких метаболических процессов, как накопление

активных форм кислорода и каллозы, а также с активацией каскадов салициловой кислоты, i Впервые определена корреляция между составом генов-эффекторов

фитопатогенных бактерий рода Xanthomoncis и возможной симптоматикой, расоспецифичностью бактерий, что не проводилось ранее. Был показан высокий уровень генетической изменчивости состава генов-эффекторов в пределах одного вида и его патовариантов, а также выявлена связь ряда генов-эффекторов с основными расами X. campestrís. У ряда штаммов были обнаружены гены-эффекторы несвойственные типовым штаммам этого вида. Для двух штаммов X. campestrís pv. campestrís (В-94 и Eruka-1) показано, что один из таких гомологичных генов (ХорАА), присутствуя в геноме, полностью сохраняет свою последовательность, промоторную область и сигнальные домены, необходимые для секреции с помощью ТЗСС.

Декларация личного участия автора. Автор принимал личное участие на всех этапах выполнения работы, а именно: биоинформационном анализе данных, отборе гомозиготных линий инсерционных мутатов A. thaliana, подготовке векторных конструкций, получении трансгенных растений А. thaliana, проведении агробактериальной инфильтрации и заражения растений фитопатогенами, анализе растительного материала и распределения генов-эффекторов в популяции бактерий рода Xanthomonas.

Коллекцию штаммов Xanthomonas, принадлежащих к разным видам, расам и патовариантам, предоставила лаборатория бактериальных болезней ВНИИ фитопатологии РАСХН. Анализ видо- и расопринадлежности штаммов Xanthomonas и поиск корреляций между составом генов-эффекторов и физиологическими признаками бактерий проводился совместно с д.б.н. Игнатовым А.Н. ( Центр «Биоинженерия» РАН, ВНИИ 4 фитопатологии РАСХН). Автор лично проводила статистическую обработку

полученных результатов и оформляла результаты в виде тезисов и докладов для научных конференций.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены: на International Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120Ul anniversary of N.I. Vavilov (Киев, Украина, 2007); The 22nd Nordic PhD Course in Plant Pathology (Hyytiälä, Финляндия, 2008); 8lh Internetional Conference on Pseudomonas syringae and related pathogens (Оксфорд, Великобритания, 2010); 2-ой Международной школе-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" (Москва, Звенигород, Россия, 2011); XV International Congress IS-MPMI (Киото, Япония, 2012); на заседание профильного объединенного научного семинара по генетике растений Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 страницах, содержит 39 рисунков, 12 таблиц и состоит из следующих

разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы, включающего 171 цитируемых источника.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 16.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования:

Бактериальные штаммы: 53 штамма Xanthomonas из коллекции лаборатории бактериальных болезней ВНИИ фитопатологии РАСХН, принадлежащих к разным видам, расам и патовариантам. Штамм Pseudomonas sxringae pv. sxringae DC3000. Кроме того, были использованы штамм XLIBlu Е .coli (recA 1, endAl, gyrA96, thi-1, lisdR 17(rk-, rnk+), supE44, re/Al, lac, [V,proAB+, lac Г2ДМ15, ::TnlO(Tetr)]) ("Stratagene", США) и C58 A. tumefaciens (Rif1*, несет помощник Ti плазмиды pMP90RK, KmR) (Koncz et al., 1984).

Растения Arabidopsis thalíana экотип Col-O, а также инсерционные мутанты экотипа Col-0 по генам иммунофилинов At5g48570 (SAIL_355_A02), At2gl6600 (SALK_063724) и At4g33060 (SAIL_621_H11), полученные из коллекции ABRC, а так же растения Nicotiana bentamiana.

Анализ видо- и расопринадлежности исследованных штаммов Xanthomonas проводился с помощью MLSA анализа и по реакции растений-дифференциаторов.

Биоинформативный анализ генов-эффекторов Xanthomonas проводился с использованием программного алгоритма BLAST базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), и программных пакетов CLUSTALW v.1.75 (Thompson et al, 1997), BioEdit v.7 (Hall, 1999) и Oligo v.6.01 («Premier Biosoft International», США).

Анализ инсерционных мутантов A. thaliana на гомозиготность проводился методом «ТА1Ь»-ПЦР.

Трансформацию растений А. thaliana осуществляли на незрелых бутонах взрослых растений методом вакуумной инфильтрации (Logemann et ai, 2006).

В работе использованы стандартные процедуры молекулярного клонирования, которые проводились согласно методическому руководству Sambrook and Russell, 2001. Выделение геномной ДНК из Xanthomonas проводили по модифицированной методике SDS-CTAB из растительного материала с использованием цетилтриметиламмоний бромида по методике Stewart and Via , 1993. РНК из растительного материала выделяли набором RNeasy Plant Kit фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией.

Бактериальная инфильтрация растений проводилась в случае А. tumefaciens по методике Lee and Yang, 2006. Заражение растения

фитопатогенами осуществляли по методике Swanson et al., 1988, с последующим подсчетом КОЕ на единицу площади листовой пластины.

Растительный материал анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, по гистохимическому окрашиванию продуктов гена GUS, а также методом полуколичественного ПЦР в реальном времени.

Определение нуклеотидной последовательности гена ХорАА осуществляли методом инвертированного ПЦР и методом «прогулки по хромосоме».

Статистическую обработку данных осуществляли в программе «Statistica 6.0» (StatSoft, США) с помощью дискриминантного анализа и анализа по t-критерию Стьюдента. Данные в таблицах и на диаграммах представляют средние арифметические величины и стандартные ошибки, количество повторений указано для каждого случая отдельно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение роли пептндил-пролил цис/шранс-изомераз Arabidopsis thaliana в защитной реакции на бактериальное заражение

Первоначальный отбор PPIase, вовлеченных в иммунный ответ А. thaliana, осуществлялся с помощью биоинформатического анализа изменения их экспрессии при биотических воздействиях. С помощью программных средств Genevestigator V3 (https://www.genevestigator.ethz.ch) и общедоступных баз данных были проанализированы все 55 предполагаемых генов иммунофилинов A. thaliana в 201 независимом эксперименте с использованием микрочипов. Эти эксперименты включали изменения в экспрессии генов как при биотических, так и при абиотических воздействиях. В результате было установлено, что 32 гена иммунофилинов Arabidopsis изменяли свою экспрессию в 2 и более раза (наиболее широко применимый порог изменения экспрессии в экспериментах по систематическому ответу). Таким образом, значительная доля иммунофилинов растения вовлечена в ответ на биотические и абиотические воздействия.

Для исследования функций PPIase растений, непосредственно связанных с защитой против растительных патогенов, наибольший интерес представляют гены, существенно увеличившие свою экспрессию в ответ на контакт с патогеном, что может свидетельствовать о запуске механизма защитного ответа растения, в котором иммуннофилины являются компонентами защитной системы. В ходе биоинформативного анализа были отобраны три гена PPIase А. thaliana, экспрессия которых сильнее всего увеличивалась в ответ на взаимодействие с бактериями, в патогенезе которых участвуют белки-эффекторы ТЗСС: • у гена At5g48570 (пептидил-пролил-цг/с/транс изомераза FKBP типа) в ответ на воздействие бактериями P. syringae, несущими гены avrRpml и avrRps4, экспрессия увеличивается в 9,16 и 4,52 раза соответственно;

• у гена At2gl6600 (циклофилин ROC3) экспрессия увеличивается в 2,94 раза при воздействии Р. syringae',

• у гена At4g33060 (циклофилин) при взаимодействии с Р. syringae (iavrRpml) экспрессия возрастает в 5,64 раза.

Для подтверждения данных, полученных при анализе in silico, было проведено измерение изменения экспрессии отобранных генов иммунофилинов при заражении растений А. thaliana фитопатогенными бактериями Xanthomonas campestris pv. campestris LMG8004 и Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 с концентрацией 10fi колониеобразующие единицы на миллилитр (кое/мл). Полученные результаты подтвердили активацию экспрессии исследованных генов в 2-5 раз по сравнению с контролем через 1-4 дня после инфильтрации фитопатогенами X. campestris и Р. syringae (рисунок 1).

Рис. 1. Относительное изменение уровня экспрессии отобранных генов иммунофилинов при воздействии X. campestris pv. campestris LMG8004 (Хсс) и Р. syringae pv. tomato DC3000 (Pss) через 3 часа, 1 день и 4 дня после заражения. Данные нормализованы на изменение экспрессии гена домашнего хозяйства Act2. Представлены значения уровня экспрессии относительно значений, полученных для контрольных растений (Со1-0), подвергавшихся воздействию буферного раствора

Дальнейшее изучение возможного участия отобранных генов PPIase At2gl6600, At4g33060 и At5g48570 в защитном ответе проводилось на гомозиготных линиях инсерционных мутантов. Была проведена их инокуляция бактериями Xanthomonas campestris pv. campestris LMG8004 (Хсс) и Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pss) с последующей оценкой скорости развития популяции патогена. Полученные результаты приведены на рисунке 2.

Отсутствие существенных различий в развитии инфекции между мутантными линиями и растениями дикого типа в течение первых суток после инокуляции объясняется постепенным увеличением массы бактериальных клеток за счет заселения апопласта и внедрением в клетку хозяина только при достижении определенной плотности популяции. Как видно из рисунка 2 растения, лишенные генов PPIase, более чувствительны к фитопатогенам X. campestris и Р. syringae.

a Col О nAt2g16600 П АНдЗЗОбО MAt5g48570

Рис. 2. Рост численности популяции бактериальных клеток P. syringae pv. tomato DC3000 и X. campestris pv. campestris LMG8004 в листьях гомозиготных линий инсерционных мутантов Arabidopsis по генам PPIase At2gl6600, At4g33060 и At5g48570 по сравнению с контрольными растениями экотипа Col-0 через определенные временные интервалы после инокуляции. На диаграмме отражены средние значения и стандартные отклонения. Для статистической обработки использован критерий Стьюдента, п=3; Р<0,05

Далее определялась степень влияния повышенной экспрессии отобранных генов PPIase на устойчивость к бактериальному заражению. Для этого была проведена инфильтрация фитопатогенов X. campestris pv. campestris LMG8004 и P. syringae pv. tomato DC3000 в листовые пластины N. benthamiana совместно с коэкспрессией отобранных генов PPIase под контролем сильного конститутивного промотора 35S CaMV (векторные конструкции представлены на рисунке 3 А).

p35S

At2g!6600

pNOS

> I шч

p35S

At2gl6600

pNOS BaR

t

В

промотор At2el6600

pNOS BaR

t

Рис. 3. Схема Т-ДНК трех типов векторных конструкций для трансформации растений на примере гена At2gl6600: А - конструкция с сильной конститутивной экспрессией гена PPIase; Б - конструкция, в которой гены PPIase объединены в рамке считывания с геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белк (GFP): В - конструкция с экспрессией гена ß-глюкоронидазы (GUS) под контролем промотора PPIase. p35S -тетрамер промотора 35S вируса мозаики цветной капусты; tOS - терминатор октапинсинтазы Agrobacterium; pNOS - промотор нопалинсинтазы Agrobacterium; BaR -ген устойчивости к гербициду Баста

В ходе эксперимента отмечалось сниженное количество бактериальных клеток X. campestris при коинфильтрации с конструкциями, обеспечивающими повышенную экспрессию генов At2gl6600 и At4g33060, в то время как повышенная экспрессия гена At5g48570 не оказала воздействия на развитие X. campestris. В то же время на развитие бактериальной инфекции, вызванной P. syringae, не оказывали воздействия коэкспрессия с геном At4g33060. Коинфильтрация с конструкциями, обеспечивающими повышенную экспрессию генов At2gl6600 и At5g48570, приводила к достоверному снижению численности популяции P. syringae по сравнению с развитием на контрольных растениях. Интересно также отметить, что через 3 дня после инфильтрации бактериальной суспензией на участках, не показывавших снижение концентрации клеток фитопатогенов в присутствии иммунофилинов, развивались значительные подверженные некрозу области, сопоставимые с симптомами, развивающимися на контрольных растениях (рисунке 4).

1А 1Б 1В 1Г 2А 2Б 2В 2Г

Xanthomonas campestris pv. campestris LMG8004 Pseudomonas syringaepv tomato DC3000

Рис. 4. Развитие симптомов на листьях N. benthamiana с повышенной экспрессией генов PPIase At2gl6600 (A), At4g33060 (Б), At5g48570 (В) при инфильтрации бактериальными клетками Xanthomonas campestris pv. campestris LMG8004(\) и Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (2). В качестве контроля использовалась векторная конструкция без целевых генов (Г). Инфильтрация бактериальной суспензией с концентрацией клеток 10М04кое\мл, 3-й день после инокуляции

Поскольку не было установлено снижения плотности популяции Р. syringae и X. campestris при коэкспрессии с генами At4g33060 и At5g48570, соответственно, можно предположить, что белковые продукты данных генов не вовлечены непосредственно в защитный ответ хозяина, а увеличение их экспрессии при биотическом стрессе связано с вторичными изменениями, происходящими в ответ на внедрение патогена.

Для доказательства непосредственного участия исследуемых PPIase в ответе на инвазию патогена была оценена экспрессия репортерного гена ß-глюкоронидазы (GUS) под контролем эндогенных промоторов генов At2gl6600, At4g33060 и At5g48570 (рисунок 5). Для этого проводили инфильтрацию фитопатогенов X. campestris pv. campestris LMG8004 и P. syringae pv. tomato DC3000 в листовые пластины N. benthamiana с транзиентной экспрессией векторных конструкций, в которых ген GUS находился под контролем эндогенных промоторов исследуемых генов (рисунок 3 В).

1 23 45 . 6 7 8 /

ч ✓ Ч ' N X \ /

\ 9 11

Ш т Щ W Щ W Щ Ш 4

Рис. 5. Активация экспрессии гена Ci/S под контролем промоторных областей At2gl6600 (1 и 5), At4g33060 (2 и 6) и At5g48570 (3 и 7) в листовых пластинах растений N. bentamiana, с временной экспрессией соответствующих конструкций, после локальной инфильтрации Xanthomonas campestris pv. campestris LMG8004 (1, 2, 3) и Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (5, 6, 7). Контрольные точки: 4 и 8 инфильтрации X. campestris (4) и P. syringae (8) в лист N. bentamiana без предварительной инфильтрации клетками клеток A.tumefaciens', 9,10.11 - инфильтрация культурой клеток Л. tumefaciens, несущих ген GUS под контролем промоторов At2g 16600 (9), At4g33060 (10) и At5g48570 (11) без последующего заражения фи гопатогеном

В ходе эксперимента было определено, что при заражении как X. campestris, так и P. syringae в течение первых 24 часов после инвазии происходит активация промоторных областей генов At2gl6600. At4g33060 и At5g48570. Таким образом, в ответ на бактериальную инвазию происходит активация всех трех исследованных генов, что подтверждает их непосредственное вовлечение в защитный ответ растения хозяина.

Для определения локализации в клетке растения белковых продуктов трех отобранных генов PPIase (At2gl6600, At4g33060 и At5g48570) проводилась инфильтрация листьев N. bentamiana векторными конструкциями, в которых ген иммунофилина был объединен в рамке считывания с геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP) так, что последний находился на С-терминальном конце химерного полипептида (рисунок 3 Б). Полученные данные представлены на рисунке 6.

А1 А2 A3

В1 В2 ВЗ .

С1 С2 • сз

Рис. 6. Локализация At2gl6600(А), At4g33060(B) и At5g48570(С), объединенных в рамке считывания с зеленым флуоресцентным белком (ОИР), в клетках N. Ьета>тапа. 1-свечение СРР;2-свечение клеточных ядер, окраска ОАР1;3-наложение 1 и 2

В ходе проведенного анализа было установлено, что белковый продукт гена At2gl6600 локализован в цитоплазме, что согласуется с ожидаемой локализацией этого белка, предположенной на основе его доменной организации, а именно на наличии в его структуре только региона характерного для циклофилинов (Не et al., 2004) (рисунок 6 А1-3). Данные, полученные нами при определении клеточной локализации белковых продуктов гена At4g33060, также согласуются с его доменной организацией. Этот белок, помимо домена, характерного для циклофилинов, также содержит богатый аминокислотными остатками ArgVLys регион, включающий два сайта ядерной локализации. Как видно на рисунке 6 ( Б1-3), химерный белок был локализован как в цитоплазме, так и в ядре клеток. Что касается белкового продукта гена At5g48570, то, поскольку в его структуре присутствуют 3 FKBP домена, 3 тетратрикопептидных домена, кальмодулиновый мотив, ранее предполагалось, что данный пептид локализуется в клеточной цитоплазме и мембране (Не et al., 2004). В ходе нашего эксперимента было обнаружено, что белковый продукт гена At5g48570 локализован преимущественно в ядре клеток (рисунок 6 В1-3). Известна только одна работа, в которой отмечалось присутствие белка At5g48570 в клеточных ядрах A. thaliana, однако это наблюдалось при тепловом шоке (Meiri et al., 2010). Поскольку данный пептид лишен сигналов ядерной локализации, то возможно предположить, что его перемещение в ядро, связано с образованием белковых комплексов за счет тетратрикопептидных и кальмодулиновых мотивов. Возможно, что такие комплексы образуются при стрессовых воздействиях и направлены на изменение экспрессии генов, вовлеченных в защитную реакцию клетки хозяина.

Для объяснения механизма влияния отобранных PPIase на защитные функции растения и поиск возможных взаимодействий, вызывающих повышение устойчивости растений к фитопатогенам, были получены трансгенные растения A. thaliana с повышенной экспрессией отобранных генов. Все полученные линии обладали повышенной экспрессией, соответствующих генов PPIase и фенотипически не отличались от дикого типа A. thaliana Col-0. Для оценки устойчивости полученных трансгенных растений к инвазии фитопатогена было проведено их заражение бактериями P. syringae pv. tomato DC3000. Уже через три дня после инокуляции отмечалось достоверное снижение численности бактериальной популяции по сравнению с контрольными растениями во всех трансгенных линиях. Поскольку снижение численности бактериальной популяции в растении может наблюдаться как в результате специфической защитной реакции на инвазию патогена, так и за счет неспецифического усиления иммунитета нами был проведен анализ накопления каллозы и пероксида водорода в трансгенных растениях с повышенной экспрессией отобранных генов PPIase. Полученные данные приведены на рисунке 7.

Col-0 Растения с повышенной экспрессией Col-Ü Растения с повышенной экспрессией

At2g16600 At4g33060 Al5g48570 At2gl6600 Al4g33060 Al5g48570

Рис. 7. Накопление H2O2 (А) и каллозы (Б) в растениях A. thaliana дикого типа Со1-0 и трансгенных растениях с повышенной экспрессией генов At2gl6600, At4g33060 и At5g48570

Было обнаружено, что в трансгенных растениях с повышенной экспрессией гена At2gl6600 не происходило накопления каллозы, но наблюдалась значительная аккумуляция в тканях Н2О2. В растениях же с повышенной экспрессией генов At4g33060 и At5g48570 наблюдалось повышенное накопление каллозы по сравнению с контролем. Накопление вторичных метаболитов, а именно каллозы, связывают с поздним защитным ответом растения. В связи с этим было определено, происходит ли в полученных трансгенных растениях активация основных компонентов известных сигнальных каскадов MAP киназ, а именно: МЕКК1 (MAPK/ERK kinase kinase AI); PAD4 (PHYTOALEXIN DEFICIENT 4); EDS1 (ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1); PR1 (PATHOGEN RELATED 1); WRKY33 (WRKY DNA-BINDING PROTEIN 33) и bG2 (ß-GLUCANASE 2). Полученные результаты приведены на рисунке 8.

25

s 20 к

° 1 С

о 15 и

О.

R Ю

МЕКК1 PAD4

EDS 1

PR] WRKY33 bG2

■ Col 0

О 35S::At2gl6600

□ 35S::At4g33060

□ 35S::At5g48570

Рис. 8. Относительный уровень экспрессии генов МЕКК1, PAD4. EDS 1, PR1. WRKY33 и bG2, в трансгенных растениях А. thaliana с повышенной экспрессией генов PPIase (At2gl6600, At4g33060 и At5g48570). Определение проводили методом qPCR. данные нормализованы на изменение экспрессии гена домашнего хозяйства Act2. Представлены значения уровня экспрессии относительно значений, полученных для контрольных растений (А. thaliana)

Как оказалось, в трансгенных растениях с конститутивной повышенной экспрессией гена At2gl6600 происходит увеличение уровня экспрессии МЕКК1 в 7,6 раз, в то время как экспрессия других исследованных генов оставалась сопоставимой с данными для дикого типа. Известно, что киназа МЕКК1 играет ключевую роль в каскаде MAP киназ и непосредственно вовлечена в регуляцию раннего защитного механизма растения, в основе

13

которого лежит развитие окислительного взрыва (Nakagami et al., 2006). Таким образом, полученные данные подтвердили наше предположение о непосредственном участии At2gl6600 в процессах накопления в клетках активных форм кислорода.

В трансгенных растениях в повышенной конститутивной экспрессией гена At4g33060 отмечалось увеличение уровня экспрессии генов PAD4, PR1, WRKY33 и bG2 соответственно в 21, 6, 6 и 15 раз по сравнению с растениями дикого типа. Наблюдаемые изменения интересны тем, что комплекс EDS1+PAD4 вовлечен в защитный каскад, приводящий к накоплению салициловой кислоты (Zhu et al, 2011). В то же время PR1 считают маркером активации защитного каскада салициловой кислоты (Ahmad et al., 2011). Поскольку повышенная экспресиия At4g33060 не влияла на EDS1, было предположено, что действие этой PPIase направленно на PAD4. Активация же WRKY и bG2 может быть объяснена изменениями, характерными для защитного ответа, происходящими в ответ на салициловую кислоту (Zhang and Liu, 2001).

В трансгенных растениях с повышенной экспрессией гена At5g48570 было установлено увеличение уровня экспрессии WRKY33 и bG2, что, как и в случае с At4g33060, согласуется с полученными данными о накоплении каллозы в листьях. Поскольку при определении внутриклеточной локализации белкового продукта At5g48570 была определена его преимущественно ядерная локализации, то возможно предположить, что данный белок за счет образования белкового комплекса перемещается в ядро, где оказывает воздействие на факторы транскрипции, отвечающие за процесс накопления каллозы.

Полученные результаты и предположения о возможном участии исследованных PPIase в защитных процессах представлены схематически на рисунке 9.

РАМР/МАМР

Рис. 9. Возможная схема участия PPIase At2g¡6600, At4g33060 и At5g48570 в иммунных процессах растения. ROS — активные формы кислорода; SA - салициловая кислота

Таким образом, нами впервые были получены экспериментальные данные, указывающие на непосредственное вовлечение в ответ на инвазию патогена иммунофилинов Ага£>гсЛ?/ии МаИапа \t2gl6600, \t4g33060 и At5g48570. Показано не только изменение их экспрессии при стрессовых воздействиях, но и непосредственная активация данных иммунофилинов в защитном ответе. Кроме того, нами отмечено влияние данных пептидил-пролил 1]ис/транс изомераз на изменение устойчивости растения к бактериальной инвазии. В ходе проведенного исследования впервые были получены экспериментальные, а не теоретически предположенные, данные о клеточной локализации трех исследованных иммунофилинов: белковый продукт гена А12§16600 локализуется в цитоплазме, гена At5g48570 — в преимущественно в ядре, гена At4g33060 - в как в цитоплазме, так и в ядре.

Было установлено, что снижение чувствительности к фитопатогенам трансгенных растений с повышенной экспрессией исследованных РР1аБе объясняется активацией в их тканях таких метаболических процессов, как накопление активных форм кислорода и каллозы, а так же активации каскадов салициловой кислоты. Было показано, что вызывает

активацию сигнального пути, приводящего к накоплению активных форм кислорода в отсутствии патогена, в то время как At4g33060 и At5g48570 обеспечивали накопление каллозы в ходе активации процессов зависимых и независимых от салициловой кислоты соответственно.

2. Изучение генов-эффекторов в естественной популяции ХаМкотопах

Изучение генетического разнообразия генов-эффекторов в популяции ХапМютопах

С целью изучения генетического разнообразия генов-эффекторов была выбрана популяция Хаш1ютопа$, включающая в себя 34 штамма X. сатре51т ру. (группа «кампестрис»), и 18 штаммов (группа

«другие виды»), относящихся как к другим патовариантам вида X. сатрезгпз, так и к ряду основных видов ХашИотопах, представленных в России. Такой подбор был не случаен. Известно, что до 40% генов в геномах ксантомонад, вероятно, горизонтально привнесены в этот род из других таксонов (([Мап ег а/., 2005), кроме того, у бактерий распространен обмен генами вирулентности среди штаммов одного рода.

На момент проведения данной работы были известны полные нуклеотидные последовательности восьми геномов Хсинкотопах (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/). Для оценки генетического разнообразия был проведен поиск гомологов всех известных генов-эффекторов и отобраны только те гены, которые имели гомологов (схожесть аминокислотной последовательности более 80%) более, чем в двух различных геномах. Таким образом, были отобраны 19 генов-эффекторов -ттВ.уЗ, спгХасЕ!, сптХасЕ2, а\'гХс:сА2, тгХссС, а\гВз1, аугВ$1.1, тгХссЕ1, тгХссВ, АугЯху, ЛугРхо!, НорРюН, хорАА, хорВ, хорС, хорй, хорЗ, хор Р2, и хорО.

В ходе исследования, проведенного совместно с д.б.н. Игнатовым А.Н. (Центр «Биоинженерия» РАН, ВНИИ фитопатологии РАСХН), была обнаружена различная частота встречаемости изучаемых генов-эффекторов как во всей исследованной популяции, так и внутри групп «кампестрис» и «другие виды». Как видно из рисунка 10, исследуемые гены-эффекторы можно разделить на три группы по частоте встречаемости у представителей патоварианта X. сатреьШз ру. саиг/?е^?га (группа «кампестрис»):

1. гены, присутствующие с высокой частотой (более 40%) у всех проанализированных штаммов популяции как в группе «кампестрис», так и в группе «другие виды» (хорй, а\гХссЕ1, НорРТоН);

2. гены, присутствующие во всех штаммах, относящихся к группе «кампестрис», с частотой более 50% и практически не встречающиеся (частота менее 10%) у других видов (тгХссС, а\>гВ$1, аугВ$1.1, аугХссВ, аугХссА2)\

3. гены, ранее не аннотированные в геноме X. сатревшв ру. сятреЛга, присутствующие только у ряда штаммов и, возможно, связанные с проявлением специфической вирулентности или характером симптомов. Вероятно, эти гены были горизонтально привнесены в геномы исследуемых штаммов (аугВяЗ, avrXa.cE!, ахгХасЕ2, хорС, ХорЕ2, хорАА).

*—Вся популяция ■--- Группа "кампестрис" * - - Группа "другие виды"

Рис. 10. Частоты встречаемости консервативных фрагментов специфичных для исследуемых генов-эффекторов в анализируемой популяции ксантомонад: во всей популяции, только в группе «кампестрис», только в группе «другие виды»

Кроме того, необходимо отметить ряд закономерностей для отдельных генов-эффекторов. Так, у 85% штаммов исследуемой популяции присутствовал ген хорИ, причем его высокая частота встречаемости отмечалась как среди X. сатреьШь ру. сагарейт (более чем у 90% штаммов), так и у других видов (50% штаммов) ксантомонад. Это может свидетельствовать о возможной существенной значимости белка ХорО для патогенеза Хашкотопаз. Важно отметить наличие и другого гена-эффектора с известными функциями - дугАу;?, - который был представлен у 30% штаммов популяции. Ранее никем не отмечалось присутствие представителей семейства АугВвЗ у X. сатрезтз ру. сатреяГга-, хотя у другого патоварианта

X. campestris pv. armoraciae они и присутствовали (Kay et al., 2005). Известно, что белки этого семейства имитируют эукариотические факторы транскрипции хозяина (Lahaye and Bonas, 2001). Зачастую такое проявление способствует предотвращению развития некрозов и избыточному разрастанию тканей. А для штамма X. campestris pv. campestris было предположено наличие связи присутствия белков семейства avrBs3 с проявлением симптомов листовой пятнистости.

В работе отмечено, что, практически, у всех штаммов X. campestris pv. campestris присутствовали гены avrBsl.l, avrBsl и avrXccC. При этом ген avrXccC в исследованной популяции встречался только у штаммов X. campestris pv. campestris, и поэтому может служить маркером для рас 1-5 этого патоварианта.

Кроме того, нами было обнаружено присутствие у ряда штаммов X. campestris pv. campestris консервативных фрагментов генов-эффекторов, ранее не ассоциированых с этим видом. Так, консервативные фрагменты генов avrXacEl и avrXacE2 присутствовали у ряда штаммов X. campestris pv. campestris, хотя ранее были аннотированы только у X. campestris pv. vesicatoria str. 85-10 и карантинного объекта X. citri str. 306. В ходе проведенного исследования было определено присутствие у X. campestris pv. campestris консервативных фрагментов некоторых представителей группы генов, ранее ассоциированных с группой видов «X. axonopodis» (X. citri, X. phaseoli, X. euvesicatoria). Нами были найдены штаммы X. campestris pv. campestris, у которых присутствовали консервативные фрагменты ХорС, XopF2, ХорВ, ХорАА (HolPsyAE). Так как указанные гены отсутствуют в полностью секвенированных геномах X. campestris pv. campestris, было предположено, что их наличие в некоторых изученных штаммах, вероятнее всего, связано с горизонтальным переносом из других видов бактерий.

В ходе исследования был проведен статистический анализ корреляции распределения генов-эффекторов, представленных у исследованных штаммов, с известной ранее реакцией на эти штаммы растений-дифференциаторов рода Brassica , несущих три основных гена устойчивости Rxccl, Rxcc3, Rxcc4. Нам не удалось обнаружить строгого соответствия между реакцией растений-дифференциаторов и составом генов-эффекторов у отдельных штаммов, что может быть связано с необходимостью учитывать различия в аллельном составе и уровень экспрессии генов, которые невозможно обнаружить с помощью обычного ПЦР анализа. Однако были найдены статистически достоверные закономерности между присутствием ряда генов-эффекторов у проанализированных штаммов и их реакцией с растениями-дифференциаторами. Было обнаружено достоверное соответствие между авирулентностью к гену Rxccl и наличием генов avrXccC, avrXacEl и отсутствием гена ХорВ (дискриминантный анализ), а также наличием генов avrXccC и HopPtoH (анализ по t-критерию). Также было показано достоверное соответствие между вирулентностью к гену Rxcc3 и наличием гена avrXccC и отсутствием генов avrXccEl, avrXacEl и

ХорВ (анализ по ^критерию), аугХссЕ! и ХорВ (дискриминантный анализ). Авирулентность к гену Яхсс4 достоверно коррелировала с наличием генов дугй.?/./, аугХссВ, а\тХссЛ2 (анализ по С-критерию) и с генами а\>гХссА2, аугХасЕ2, хорС (дискриминантный анализ).

Таким образом, на данном этапе работы нами был проведен поиск генов-эффекторов, обнаруженных при помощи анализа полных геномов бактерий рода ХапШотопаз, в коллекции штаммов X. сатрезшя ру. сатре^пз и некоторых родственных ксантомонад, и был показан высокий уровень генетической изменчивости состава генов-эффекторов в пределах одного вида и его патовариантов. У ряда штаммов X. сатре$1ш ру. сатре$1п$ были обнаружены гены-эффекторы, не свойственные типовым штаммам этого вида, и высказано предположение о связи ряда генов с симптомами вызываемых поражений на растении-хозяине, а также показана связь числа генов-эффекторов с основными расами патогена. Ряд генов, присутствующих у X. сатре$1ш ру. сатреь^гЬ, возможно, связаны с горизонтальным переносом из бактерий других видов и даже родов. Полученные результаты были использованы нами для дальнейшего изучения роли отдельных бактериальных генов во взаимоотношении патогена с растением-хозяином.

Горизонтальный перенос гена-эффектора ТЗСС хорАА в геном ХапОютопая сатреяМв.

В ходе анализа разнообразия генов-эффекторов в естественной популяции ХашИотопаз сатреьтх было обнаружено у некоторых штаммов патоварианта ХамИотопая сатренг15 ру. сатрезтя присутствие консервативных фрагментов генов-эффекторов (аугВяЗ, аугХасЕ!, а\>гХасЕ2, хорС, ХорР2, хорАА), ранее у него не аннотированных. Анализируя эти данные, было предположено возможный горизонтальный перенос указанных генов.

Для подтверждения гипотезы о возможном горизонтальном переносе хорАА был проведен анализ, направленный на определение полной нуклеотидной последовательности данного гена у двух штаммов X. сатренпв ру. сатреИг'и (В-94, Егика-1) с использованием адаптеров и специфичных праймеров на консервативный регион, выявленный при оценке разнообразия генов-эффекторов.

В ходе проведенного анализа были определены как последовательности, гомологичные ранее аннотированным последовательностям хорАА, так и пограничные участки. Стоит отметить, что фрагменты, граничащие непосредственно с геном, обладали высокой степенью гомологии с соответствующими участками у X. огугае (около 300 п.о., предшествующих гену, и порядка 50 п.о. после гена). Это имеет важное значение, поскольку предполагает сохранение промоторной и терминаторной областей. Области же, расположенные на большем расстоянии от гена, были гомологичны транспозазам как X. огучае, так и X. сатреятз. Было определено, что исследуемый ген у штаммов X. сатре.Иг1.^ ру. сатрезгт (В-94 и Егика-1) был на 98% гомологичен генам из X. огучае ру. огугае. В полученных

18

последовательностях отсутствовали инсерции или делении как отдельных нуклеотидов, так и значительных участков, которые могли бы вызывать сдвиги рамки считывания, то есть предполагаемая аминокислотная последовательность, обнаруженных гомологов, сохранена полностью. Кроме того, анализ предположительных аминокислотных последовательностей гомологов ХорАА у штаммов В-94 и Eruka-1 показал, что в них сохранены домены, необходимые для транспорта через ТЗСС.

Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей гомологов хорАА показал, что они образуют довольно тесную группу менее чем с 20 аминокислотными заменами на 100 а.о., что может указывать на высокую консервативность функций, выполняемых гомологами белка-эффектора ХорАА (рисунок 11).

_г Putative HolPsyAE X.c.pv.musacearum

Putative HolPsyAE X.c.pv.vasculorum ^ Early chlorosis factor X. euvcsicaioria _ HolPsyAE like effector XCC Eruka 1 I HolPsyAE like effector XCC B-94

_ I HolPsyAE XOO КАСС 10331

' Early chlorosis factor XOO PX099A --L XopAA XOO В LS 256

[-XopX X.c. pv. musacearum

__-XopX XCV sir. 85-10

^-Hypothetical protein xccblOO 055 XCC str. 11100

____г HopAEl P.s.pv.aesculi

HopAE 1 P.s.pv.phascolicola

Type III effector protein X. arboricola

!_! pv. juglandis

0.2

Puc. 11. Филогенетическая дендрограмма на основе данных сравнительного анализа аминокислотных последовательностей гомологов хорАА, построенная с использованием алгоритма "метод объединения соседей" (Neighbor-joining method). Масштаб соответствует 20 заменам на 100 аминокислот (эволюционное расстояние)

Таким образом, было показано, что в геноме двух штаммов X. campestris pv. campestris (В-94 и Eruka-1) присутствуют последовательности с высокой степенью гомологии к гену ХорАА, которые сохраняют свою промоторную область, аминокислотную последовательность и сигнальные домены, необходимые для секреции с помощью ТЗСС. Эти данные в совокупности с данными о присутствии мобильных элементов в пограничных с данными гомологами областях подтверждают нашу гипотезу о горизонтальном переносе последовательностей, гомологичных ХорАА в геном двух штаммов X. campestris pv. campestris (В-94 и Eruka-1).

Заключение

Проведенное исследование позволило выявить гены пептидил-пролил цис/транс изомераз АгаЫс1орх1х ¡1'гаНапа, участвующие в защитном ответе на биотические стрессовые воздействия, вызванные бактериями, в патотогенезе которых существенная роль отводится белкам-эффекторам, секретируемым через третью транспортную систему секреции. Впервые было проведено исследование роли генов РР1а$е А. ¡¡гаНапа \t2gi6600, At4g33060 и At5g48570 и показано не только изменение их экспрессии при стрессовых воздействиях, но и непосредственное участие данных иммунофилинов в защитном ответе. Кроме того, нами отмечено влияние изменения экспрессии изученных генов на устойчивость растения к бактериальному заражению фитопатогенными бактериями X. сатре51ш и Р. зуп^ае, а именно: растения, лишенные исследованных генов РР1аче сильнее подвергались бактериальному заражению, в то время как повышенная экспрессия данных генов вызывала достоверное снижение численности бактериальной популяции. В ходе проведенного исследования впервые были получены экспериментальные, а не теоретические данные о внутриклеточной локализации трех исследованных иммунофилинов. Они были локализованы в различных компартментах - один белок (продукт гена At5g48570) локализовался в ядре клеток, другой (белковый продукт гена At2gl6600) - в цитоплазме, а третий (белковый продукт гена At4g33060) - как в ядре, так и в цитоплазме. Данные, полученные при изучении функций растительных PPIa.se, позволили установить роль данных ферментов в развитии защитных реакций растения в ответ на бактериальные заражения. Было установлено, что снижение чувствительности к фитопатогенам трансгенных растений с повышенной экспрессией исследованных РР1а$е объясняется активацией в их тканях таких метаболических процессов, как накопление активных форм кислорода {At2gl6600) и каллозы (At5g48570), а также активации каскадов салициловой кислоты (At4g33060). Изучение механизмов иммунной системы растений, а также молекул патогенов, на которые она отвечает, позволяет понять принципы распознавания патогенов и процессы, происходящие при патогенезе. Таким образом, полученные знания могут быть использованы в получении сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к бактериальным инфекциям.

Проведенный анализ естественной популяции бактерий X. сатрея^я показал высокую генетическую изменчивость состава генов-эффекторов в пределах одного вида и его патовариантов. Были выявлены достоверные соответствие между реакцией растений-дифференциаторов с локусами устойчивости (Ихсс1, ЯхссЗ, Яхсс4) и присутствием отдельных генов-эффекторов у штаммов Хашкотопав сатревть. Впервые у ряда штаммов X. сатрехтх ру. сатре$Ш$ были обнаружены гены-эффекторы, несвойственные типовым штаммам этого вида, и сделано предположение о связи данного явления с горизонтальным переносом из бактерий других видов и даже родов. Анализ выявленных последовательностей, обладающих высокой

20

степенью гомологии к гену ХорАА из Х.огугае р\>. огугае, показал не только полное подобие нуклеотидной последовательности с сохранением промоторной и терминаторной областей, аминокислотной последовательности и сигнальных доменов, необходимых для секреции с помощью ТЗСС, но и соседство обнаруженных последовательностей с мобильными элементами. Полученные данные подтверждают гипотезу о вероятном горизонтальном переносе гена-эффектора ХорАА.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены гены пептидил-пролил цис/транс изомсраз АгаЫс1ор.ч1.ч гИаИапа (At2gl6600, At4g33060 и At5g48570), вовлеченные в защитный ответ клетки на биотические стрессовые воздействия. Установлено, что At2gl6600 вызывает активацию сигнального пути, приводящего к накоплению активных форм кислорода, в то время как At4g33060 и At5g48570 обеспечивали накопление каллозы в ходе активации процессов зависимых и независимых от салициловой кислоты соответственно.

2. Установлено, что растения, лишенные генов пептидил-пролил цис/транс изомераз At2gl6600, At4g33060 и At5g48570, проявляют повышенную чувствительность к инвазии фитопатогенов X. сатревтз и Р. хуги^ае. При этом повышенная экспрессия данных генов вызывала достоверное снижение роста численности популяции Р. зуп^ае по сравнению с контролем. Снижение же темпов роста численности популяции X. сатре$1пя вызывала повышенная экспрессия генов At2gl6600 и А(4§33060.

3. Впервые показана активация промоторных областей исследованных генов At2gl6600, At4g33060 и At5g48570 в ответ на заражение растения фитопатогенными бактериями X. сатрехтх и Р. яугищае.

4. Определена клеточная локализация белковых продуктов исследованных генов РИаве: белок At2gl6600 локализуется в цитоплазме, At5g48570 -опреимущественно в ядре, а At4g33060 — как в цитоплазме, так и в ядре.

5. Показан высокий уровень генетической изменчивости состава генов-эффекторов в пределах вида и патоварианта X. сатрезтя р\'. сатре.^Тг1.ч, а также достоверные соответствия между реакцией растений-дифференциаторов с локусами устойчивости (Яхсс1, ЯхссЗ, Рхсс4) и присутствием отдельных генов-эффекторов у штаммов X. сатреяЫз.

6. Выявлены гены-эффекторы (аггХасЕ!, аугХасЕ2, ХорС, ХорП, ХорВ и ХорАА), ранее не аннотированные у типовых штаммов X. сатрезтя р\\ сатреяГпз. Показан возможный горизонтальный перенос гена ХорАА в геномы двух штаммов X. сатре$гш р\\ сатрех!г1х (В-94, Ешка 1).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК

1.Абдеева, И. А. Экспериментальные модели трансгенных растений, перспективных для новейших биотехнологий. [Текст] / И.А. Абдеева, И.В.Голденкова-Павлова, М.В. Мокрякова, JI.B. Волкова, В.Г.Богуш, К.В.Сидорук, Н.О. Юрьева, В. Г.Дебабов, Э.С.Пирузян. // Цитология и генетика. - 2007. - № 3. - С. 55-61.

2. Мокрякова, М. В. Разнообразие генов-эффекторов у бактерий рода Xantomonas [Текст] / М. В. Мокрякова, И. А. Абдеева, Э. С. Пирузян, Н. В. Шаад, А. Н. Игнатов // Микробиология. - 2010. - том 79. - № 1. - С. 63-71

Тезисов докладов и материалов конференций

1. Мокрякова. М.В. Состав генов эффекторов III транспортной системы в популяции фитопатогенных бактерий Xanthomonas campestris (Pam.) Dow. [Текст] / Мокрякова, М.В.. Кромина, К.А., Абдеева, И.А., Пирузян, Э.С., Игнатов, А.Н. // 11-ая Международная пущинская школа - конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века», 28 октября - 2 ноября 2007, Пущино, с. 101.

2. Kromina, К.А. The repertoire of PPI-ases in genomes of plant pathogenic bacteria. [Текст] / Kromina, K.A., Ignatov, A.N., Abdeeva, I.A., Mokrvakova. M.V.. Volkova, L.V., Piruzian.E.S. // International Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of N.I. Vavilov, 20 - 22 September 2007, Kyiv, Ukraine, p. 24.

3. Mokrvakova, M.V. Diversity of III transport system effectors in population of plant pathogenic bacterium Xanthomonas campestris (Pam.) Dow. [Текст] / Mokrvakova. M.V.. Kromina, K.A., Abdeeva, I.A., Piruzian, E.S., Ignatov, A.N. // The 6th Plant Genomics European Meeting, 3-6 October 2007, Tenerife, Canary Islands, Spain, p. 176.

4. Мокрякова. М.В. Локусное и аллельное разнообразие генов белков-эффекторов среди бактерий рода Xanthomonas. [Текст] / Мокрякова. М.В., Абдеева, И.А., Пирузян, Э.С., Игнатов, А.Н. // Международная научная школа-конференция молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Звенигород, 7-12 декабря, 2008, с. 50.

5. Mokrvakova. M.V. Characterisation of effector repertoire in population of pathogenic bacterium Xanthomonas campestris (Pam.) Dow. [Текст] / Mokrvakova, M.V., Kromina, K.A., Abdeeva, I.A., Piruzian, E.S., Ignatov, A.N. // The 22nd Nordic PhD Course in Plant Pathology, 4-11 May 2008, Hyytiala, Finland, p.43.

6. Abdeeva, I. The Development of Vector Systems for Expression of Defensin Gene from Helianthus annuus in Plants. [Текст] / Abdeeva, I., Mokrvakova. M.. Mirakhorli, N., Piruzian, E. // XX International Congress of Genetics "Genetics - Understanding living systems" Berlin, Germany, 12-17 July 2008, p. 86.

7. Mokrvakova. M.V. Design of plant systems for modified defensin gene from sunflower. [Текст] / Mokrvakova, M.V., Kromina, K.A., Mirakhorli, N., Abdeeva, I.A., Piruzian, E.S. // Abstract book 33rd FEBS Congress and lllh IUBMB Conference Biochemistry of Cell Regulation, 28 June - 3 July 2008, Athens, Greece, p. 32.

8. Игнатов, Л.Н. Основные направления развития методов диагностики фитопато генных микроорганизмов [Текст] / Игнатов, А.Н., Корнев, К.П., Пунина, H.D., Мокрякова. М.В.. Мазурин, Е.С., Карлов, А.Н. // Док-лады ТСХА. 2009. Вып.281. С.22 - 24.

9. Pogorelko, G.V. Human genes in plants-vvhat do they do there? [Текст] / Pogorelko, G.V., Mokryakova,M.V.. Abdeeva, I.A., Piruzian, E.S. // Abstract of International Conference "Overcoming distance in signaling networks", Maale Hachamisha, Jerusalem Hills, Israel, 15 - 19 March 2009, p.85.

10. Pogorelko, G. The role of plant immunophilins in host-pathogen interactions. [Текст] / Pogorelko, G., Mokrvakova M.. Abdeeva I., Abdeev R., Piruzian E. // Abstract book 22ndNew Phytologist Symposium Effectors in plant-microbe interactions, Paris, France 13-16 September 2009, p.60

11. Mokrvakova. M.V. Probability of horizontal transgenesis of effector genes among bacterium genus Xanthomonas. [Текст] / Mokrvakova M.V.. Ignatov A.N., Piruzian E.S. // Abstract book 8111 Intcrnetional Conference on Pseudomonas syringae and related pathogens, Oxford, UK 31 august - 3 September 2010, p.47

12. Мокрякова. M.B. Анализ генов-эффекторов третей транспортной системы при взаимодействии патоген-хозяин. [Текст] / Мокрякова. М.В., Брускин С. А., Пирузян Э.С. // Материалы Четвертой Международной школы молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» — Звенигород, 29 ноября — 3 декабря 2010г.

13. Мокрякова. М.В. Роль пептидил-пролил нис/транс-изомераз во взаимодействии растение хозяин-патоген. [Текст] / Мокрякова М.В.. Погорелко Г.В., Абдеева И.А., Пирузян Э.С. // Материалы первых международных Беккеровских чтений (научно-практической конференции) - Волгоград, 27 - 29 мая 2010 г.

14. Мокрякова. М.В. Трансгенные растения Arabidopsis thaliana с повышенной экспрессией генов пептидил-пролил цис-транс изомераз более устойчивы к фитопатогенам. [Текст] / Мокрякова М.В.. Погорелко Г.В. , Брускин С.А. // Трансгенпые Материалы 2-ой Международной школы-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" - Москва, Звенигород, 5-10 декабря 2011г.

15. Mokrvakova. M.V. HORIZONTAL TRANSFER OF holPsyAE TTSS EFFECTOR GENE IN Xanthomonas campestris STRAINS [Текст] / Mokrvakova. M.V.. Ignatov A.N., Bruskin S.A. // Program and abstracts IS-MPMI 2012 XV International Congress, Kyoto, Japan 29 July - 2 August 2012, p.216 - 217.

16. Мокрякова. М.В. Иммунофилипы и их роль в защитном ответе растения [Текст] / Мокрякова . М.В.. Погорелко Г.В. // Материалы международной научной конференции "Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы", Минск, 2012, с.88.

Подписано в печать: 08.11.2013

Заказ № 9041 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мокрякова, Мария Владимировна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ. Н.И. ВАВИЛОВА _РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК_

На правах рукописи

04201365693

МОКРЯЕСОВА Мария Владимировна

УЧАСТИЕ ПЕПТИДИЛ-ПРОЛИЛ ЦИС/ТРАНС ИЗОМЕР АЗ АЯАВЮОРБК ТНАПАЫА ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА С ПАТОГЕНОМ.

03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук БРУСКИН Сергей Александрович

МОСКВА, 2013

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................4

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................8

1.1. Иммунная система растений...............................................................................8

1.1.1 Основной иммунитет растений................................................................10

1.1.2 Индуцируемый иммунитет.......................................................................16

1.2. Пептидил-пролил цис/транс изомеразы (РР1азе) и их участие в патогенезе 19

1.2.1 Характеристика пептидил-пролил цис/транс изомераз........................19

1.2.2 Функции пептидил-пролил цис/транс изомераз в патогенезе...............24

1.3. Система секреции третьего типа и секретируемые ею белки-эффекторы... 30

1.3.1 Система секреции третьего типа (ТЗСС)................................................31

1.3.2. Эффекторы третьей транспортной системы..........................................37

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................46

2.1. Объекты исследования......................................................................................46

2.2. Анализ видо- и расопринадлежности исследованных штаммов ХаЫкотопаз...............................................................................................................49

2.3. Биоинформационный анализ генов-эффекторов............................................50

2.4. Получение гомозиготных линий инсерционных мутантов

МаИапа.......................................................................................................................52

2.5. Агробактериальная трансформация А МаИапа..............................................54

2.6. Процедуры молекулярного клонирования. Векторные конструкции..........55

2.7. Бактериальная инфильтрация растений..........................................................59

2.8. Анализ растительного материала.....................................................................60

2.9. Определение нуклеотидной последовательности гена ХорАА......................63

2.10. Статистическая обработка данных.................................................................66

РАЗДЕЛ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ....................................................67

3.1. Определение пептидил-пролил цис/транс-изомераз, вовлеченных в иммунный ответ АгаЫ^рБгБ ШаНапа.....................................................................67

3.2. Изучение генов-эффекторов в естественной популяции ХаШкотопаз........87

3.2.1 Изучение генетического разнообразия генов-эффекторов в популяции ХаЫкотопав.........................................................................................................88

3.2.2 Горизонтальный перенос гена-эффектора ТЗСС хорАА в геном ХаЫ1потопа$ сатреяМз......................................................................................97

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................103

ВЫВОДЫ....................................................................................................................105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.......................................................107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................109

Приложения.................................................................................................................123

ВВЕДЕНИЕ

Бактериальные болезни растений наносят огромный экономический ущерб, поражая ценные породы плодовых, эфиромасличных, технических и овощных культур. По данным FAO (продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН) ежегодные потери урожая от бактериальных заболеваний в сельском хозяйстве составляют примерно 30% от общих потерь урожая по всему миру, причем бактериозы могут поражать растения на огромных площадях.

Важную роль в предотвращении заражения растения патогенами играет врожденный иммунитет растения, который включает в себя три барьера. Первый из них - структурный: многие патогены не способны преодолеть внешние поверхности растения. Второй - основывается на трансмембранных рецепторах, расположенных на поверхности клеток, которые распознают консервативные патоген-ассоциированные молекулы и индуцируют основной иммунный ответ растения. Третий барьер базируется на внутриклеточных R-белках (от англ. resistance - устойчивость) и направлен против патогенов, способных преодолеть второй барьер. Такой иммунитет получил название индуцируемого. Фитопатогенные бактерии способны подавлять как основной, так и индуцированный иммунитет за счет секреции факторов вирулентности внутрь растительной клетки. Механизм такого подавления начал изучаться сравнительно недавно и до сих пор точно не определен. Однако одним из главных инструментов патогенеза грамотрицательных бактерий являются белки-эффекторы, секретируемые при помощи транспортной системы третьего типа (ТЗСС) в клетки растения-хозяина. Белки-эффекторы важны для патогенности Pseudomonas, Xanthomonas, Ralstonia и Erwinia - бактерий, колонизирующих апопласт растений и способных вызывать гибель растительной клетки. Проникновение в клетку хозяина через ТЗСС сопряжено с полным или частичным разворачиванием белковой молекулы, что предполагает ее взаимодействие с шаперонами хозяина для восстановления структурной

конформации и активации глобулы. В качестве таких шаперонов могут выступать пептидил-пролил цис/транс изомеразы (PPIase, иммунофилины) клетки растения, которые обеспечивают цис/транс изомеризацию полипептидной связи, предшествующей остатку пролина.

PPIase широко распространены среди различных групп организмов. Открытые первоначально у млекопитающих как мишени циклоспорина А, они в дальнейшем были идентифицированы у бактерий, грибов и высших растений. PPIase вовлечены в различные процессы, происходящие в клетке и направленные на модифицирование белковых молекул (синтез и фолдинг, посттрансляционные модификации белковых молекул, восстановление денатурированных белков при стрессовых воздействиях). Несмотря на то, что в ряде работ отмечают участие отдельных PPIase млекопитающих, бактерий и грибов в иммунных процессах, участие PPIase растений в защитных процессах остается слабо исследованным. Кроме того, ряд патогенов - вирусов и бактерий - используют PPIase хозяина для обеспечения конформационных изменений полипептидных молекул, секретируемых внутрь клетки хозяина. Основываясь на имеющихся данных, было предположено, что PPIase, если не играют ключевую роль, то, по крайней мере, являются одними из важных элементов защитных процессов растения. В качестве объекта исследования нами были выбраны PPIase растения Arabidopsis thaliana, поскольку это модельное растение с полностью известной последовательностью генома. В геноме А. thaliana представлено 55 генов PPIase, для большинства из которых выполняемые функции остаются неизвестными.

Цель работы - изучение роли пептидил-пролил цис/транс изомераз растения Arabidopsis thaliana при взаимодействии с бактериями (Xanthomonas и Pseudomonas), в патогенезе которых участвуют белки-эффекторы, секретируемые транспортной системой третьего типа.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отобрать пептидил-пролил цис/транс изомеразы, вовлеченные в защитный ответ А. МаПапа при биотических стрессовых воздействиях, и оценить их роль в иммунном ответе на развития фитопатогенной бактериальной инфекции (ХаШкотопаБ и Рзеис1отопаБ)\

2. Проанализировать изменение уровня экспрессии отобранных генов пептидил-пролил цис/транс изомераз и установить активацию промоторных областей в норме и при заражении, а так же локализацию их белковых продуктов в клетке растения;

3. Определить механизм влияния изучаемых пептидил-пролил цис/транс изомераз на изменение устойчивости растений А. МаНапа к инвазии патогена;

4. Выявить закономерности между составом генов, кодирующих белки-эффекторы, и физиологическими признаками бактериальных штаммов (расой, патовариантом и реакцией на них растений с известными генами резистентности) в естественной популяции бактерий рода ХапЖотопаз. Научная новизна работы.

Впервые были получены экспериментальные данные, указывающие на непосредственное вовлечение в ответ на инвазию патогена иммунофилинов А. МаИапа At2gl6600, At4g33060 и At5g48570. В работе показано изменение их экспрессии при стрессовых воздействиях, активация данных иммунофилинов в защитном ответе и продемонстрирована клеточная локализация белковых продуктов трех исследованных РР1азе. Кроме того, изучено влияние данных РР1аБе на изменение устойчивости растения к бактериальной инвазии. Впервые показано, что снижение чувствительности к фитопатогенам трансгенных растений с повышенной экспрессией исследованных РР1аБе связано с активацией в их тканях таких метаболических процессов, как накопление активных форм кислорода и каллозы, а также с активацией каскадов салициловой кислоты.

Впервые определена корреляция между составом генов-эффекторов фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas и возможной симптоматикой, расоспецифичностью бактерий, что не проводилось ранее. Был показан высокий уровень генетической изменчивости состава генов-эффекторов в пределах одного вида и его патовариантов, а также выявлена связь ряда генов-эффекторов с основными расами X. campes tris. У ряда штаммов были обнаружены гены-эффекторы несвойственные типовым штаммам этого вида. Для двух штаммов X. campestris pv. campestris (В-94 и Eruka-1) показано, что один из таких гомологичных генов (ХорАА), присутствуя в геноме, полностью сохраняет свою последовательность, промоторную область и сигнальные домены, необходимые для секреции с помощью ТЗСС.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены:

на International Conference for young scientists, PhD students and students on

th

molecular biology and genetics, dedicated to 120 anniversary of N.I. Vavilov (Киев, Украина, 2007); The 22nd Nordic PhD Course in Plant Pathology (Hyytiälä, Финляндия, 2008); 8th Internetional Conference on Pseudomonas syringae and related pathogens (Оксфорд, Великобритания, 2010); 2-ой Международной школе-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" (Москва, Звенигород, Россия, 2011); XV International Congress IS-MPMI (Киото, Япония, 2012); на заседание профильного объединенного научного семинара по генетике растений Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Иммунная система растений

Механизмы заражения растений в значительной степени отличаются у разных групп фитопатогенов. Фитопатогенные бактерии заселяют межклеточное пространство (апопласт) после проникновения через воздушные или водные поры (устьица и гидатоды) или через раневую поверхность; нематоды и тли вводят стилет непосредственно в клетку растения; грибы могут напрямую проникать под эпидермальные клетки растения или внедрять гифы между или напрямую в клетки растения. Для развития инфекции патоген должен преодолеть три барьера растительной клетки. Первый из них - структурный. Многие патогены не способны преодолеть внешние поверхности растения, поэтому развитие таких инфекций связано с проникновением через естественные отверстия или раневую поверхность. Второй - обусловлен способностью растений узнавать определенные молекулы, присутствующие на поверхности патогена (PAMPs - pathogen associated molecular patterns, MAMPs - microbe associated molecular patterns), такие как: липополисахаряды^-флагеллинт-белки холодового шока и т.д. В ответ на узнавание этих молекул специфичными рецепторами клетки (PRR - pattern recognition receptor) происходит запуск каскада реакций защитного ответа, так называемый основной иммунитет. Проявление основного иммунитета практически всегда выражается в накоплении антимикробных соединений, повышении экспрессии генов фенилпропаноидного пути и других генов, участвующих в ответе, а также в уплотнении стенок клетки за счет увеличения синтеза каллозы (Gomez-Gomez et al., 1999). Но в процессе эволюции патогены смогли преодолеть основной иммунитет растения за счет секреции внутрь растительной клетки факторов вирулентности (Avr белков или белков-эффекторов) (Chisholm et al., 2006), взаимодействие которых с генами резистентности (R гены), их продуктами и белками сигнальных каскадов обеспечивает вирулентность (таблица 1). Однако система защиты растения также

не остановилась в своем развитии. Молекулярное распознавание Avr-белков защищает окружающие ткани растения от проникновения инфекции. Такой, более специализированный, защитный ответ получил название индуцированного иммунитета (effector-triggered immunity) (Alfano and Collmer, 2004). Его проявление всегда более локально и представляет собой быстрое запрограммированное отмирание зараженных клеток (реакция гиперчувствительности), ограничивающее распространение возбудителей и приводящее к их последующей гибели.

Таблица 1. Некоторые из известных Avr/R-nap при взаимодействии хозяин-патоген (Chisholm et al., 2006)

Растение R-ген Патоген Avr-ген

Solanum Pto Pseudomonas syringae pv. tomato AvrPto

lycopersicum Cf-2 Clodosporium fulvum Avr2

Cf-4 C. fulvum Avr4

Cf-5 C. fulvum Avr5

Cf-9 C. fulvum Avr9

Arabidopsis RPW8 Erysiphe spp. AvrRPW8

thaliana RPM1 P.syringae pv.maculicola AvrRpml, avrB

RPP8 Peronosporaparasitica_ -AvrRpp8--

-RFS2 P. syringae pv. tomato AvrRpt2

RPS4 P. syringae pv. pisi AvrRps4

RPS5 P. syringae pv. tomato AvrPphB

RPP5 P. parasitica AvrRPP5

Solanum Rx Potato virus X Viral coat protein

tuberosum

Hordeum Mla6 Blumeria graminis Avr-Ml6

vulgare

Oryza sativa Pi-ta Magnaporte grisea AvrPita

Xa21 Xanthomonas oryzae pv. oryzae AvrXa21

Linum L6 Melampsora lini AvrL6

usitatissimum M M. lini AvrM

Nicotiana N Tobacco mosaic virus Replicase

tabacum

Впервые целостную концепцию взаимодействий между хозяином и патогеном предложил Flor H.H. (Flor, 1971). Она получила название взаимодействие по типу «ген-на-ген». Суть ее заключается в том, что ген устойчивости растения взаимодействует прямо или косвенно с геном авирулентности патогена (авирулентность - неспособность отдельных штаммов патогенных видов микроорганизмов вызывать заболевание). В дальнейшем эта модель претерпела ряд изменений и уточнений, но основные ее принципы остались неизменны.

1.1.1 Основной иммунитет растений

Первой защитной линией на пути патогенов, способных преодолеть структурные барьеры хозяина, является основной иммунитет. Его задача -распознать консервативные молекулы, ассоциированные с широким кругом патогенов. Впервые термин РАМР (молекулы, ассоциированные с патогеном) был предложен в исследованиях, посвященных изучению иммунного ответа млекопитающих в ответ на воздействие патогена. В дальнейшем было установлено, что непатогенные микроорганизмы тоже сласобны—вызывать иммунную реакцию, и термин был преобразован в МАМР (молекулы, ассоциированные с микроорганизмами). МАМР - это, в первую очередь молекулы, расположенные на поверхности бактериальной клетки. Они обладают высокой степенью постоянства в своей структуре и функционально необходимы для жизни широкого круга патогенов, кроме того, они обычно несвойственны клеткам растения (Nürnberger et al., 2004). Наиболее известные примеры МАМР - бактериальные липополисахариды (LPS) и гликолипидный компонент внешней мембраны грамотрицательных бактерий, а также флагеллин, как основной структурный компонент бактериального жгутика; хитин и эргостерол, основные компоненты клеточной стенки и мембраны грибов (Zipfel and Felix, 2005).

LPS представляет собой длинную полисахаридную цепь, значительно варьирующуюся на своем протяжении по составу, длине и ответвлениям своих

карбогидратных субъединиц (Рисунок 1, А). Такая вариабельная часть LPS получила название О-антигена, и она зачастую служит для определения внутри-и межвидовых различий бактериальных штаммов. В отличие от поверхностной части, коровое олигосахаридное ядро LPS и липид А отличаются высокой консервативностью у различных микроорганизмов. Именно эта часть является основной мишенью поверхностных рецепторов у клеток животных (Miyake et al., 2000). В ряде работ отмечается, что растения также способны узнавать консервативную часть LPS (Desaki et al., 2006; Erbs et al., 2010).

A LPS Б Мономер флагеллина

Рисунок 1. Схематическая структура липополисахарида и флагеллина (Zipfel and Felix, 2005)

Флагеллин - это белковая субъединица, которая является основным компонентом жгутика (флагеллы) бактериальной клетки. Терминальные области этого полипептида образуют внутреннее ядро флагеллы, а центральный участок, отличающийся высокой вариабельностью, расположен на поверхности, причем в качестве МАМР выступает консервативный фрагмент, расположенный внутри жгутика. Необходимо отметить, что рецепторы млекопитающих узнают домен D1 в коровой части флагеллина (Smith et al., 2003), в то время как большинство видов растений распознают участок 22 а.о., представляющий собой выступ («шип») полипептидной цепи (рисунок 1, Б) (Felix et al., 1999).

Хитин - основной общий компонент клеточной стенки и мембраны грибов, распознаваемый защитной системой хозяина при поражении. Во время инвазии

систем} растения рецептор FLS2

Антиген, распознаваемый имымшой системой

патогена клетки растения секретируют хитиназы, разрушающие хитин на фрагменты (N-ацетилолигосахариды и олигомеры хитина), которые распознаются клеточными рецептора�