Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибирующее действие природных соединений из иглокожих и губок на Na+, K+-АТФазу

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ингибирующее действие природных соединений из иглокожих и губок на Na+, K+-АТФазу"

ПРЕЗИДИУМ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ АН СССР

На правах рукописи

ГОНПКОВА Ирина Альбертоьна

УДК 577.352.45:577.151.042

ИНГИБИРУЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ ИГЛОКОЖИХ И ГУБОК НА На+ Д+-АТЙаэу

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 1988

Работа выполнена в Тихоокеанском .институте биоорганической химии Дальневосточного отделения АН СССР.

Научный руководитель: кандидат химических наук

В.А. Стоник

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

З.У. Бекмухаметова кандидат биологических наук О .Д. Лопина

Ведущее предприятие: Институт биологии моря ДВО АН СССР,

Защита состоится " апреля 1988 г. в час, на заседании Специализированного совета ¡. 002.06.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Президиуме Дальневосточного отделения АН СССР по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДВО АН СССР (г. Вдадивосток-22, проспект 100-летия Владивостока, 159, ДВГИ)

Автореферат разослан " марлгд, 1988 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

г. Владивосток

кандидат химических наук

Аутуальнсс!"> псобяош. Изучение хехакизга действия пряссдных биорегуляторов -открывает перспективы иохгсльзоЕания этих соодиг.о-ний, а качестве инструментов для биохимических исследований или как лекарственных препаратов. Шорстске природное соединения отли-чоятся болълим разнообразием химической структур!: и высокой <5ко-логаческой актизиозть'о (РаиХкаег, 19СС; в-Ьоп!«:, 1?ЗЬ }. Однако, еслл химическое строение : тогах морских природных еоедккеиаД изучено достаточно хороно, то огиеоние биологической актиснссти наше псего сводится к констатации шяйбактеряалького, йитегрибково-го, цитотоксического или гемолитического эффектов, связанных о вдилниек на мембранную проницаемость, Б»>1ор модели, которая бы позволила обрисовать Солее подробную картину действия природных соединений ка биологические системы представляемся весьма г&тльм.

На+,Х+ -АТС-аза (АТ^ фес-фзги.дреллоа, '¿С 3.6,1.3.) ярл.тзто.ч интегральным мембранным белком. Активность этого ¡рзрмонта зависит от состояния липидкого иифоокружения. Поскольку влияние биорегуляторов на кекбраьниЯ фермент мохет быть прямьи.; (вза!шодейсазие с белком) к опосредорачнда (из.неценно физических сиойсто липлдного ;/.атр;:кса), именно эту тест-систему мо:шо рзссматри^атч как од::у пз удобных и информативных моделей для изучения действия морских природных соединений на баокекбраиу.

Тритерпеновне гликозиды голотурий лслжтся сильниг.-н гемелити-ками и фунгицидами. Их гемолитический и антигрибкозый с-^фекты, а ттсгсе взаимодействие с пскусетзекныкл лиг.идньоли ;.;еибранш'П и биологическая роль в организме-прэдуцекте достаточно хорошо и полно охарактеризованы з работах группы Анненкова М.М. (Тихоокеанский институт биоорганической химии Д2У АН СССР). Сульфаты стероидных пол иолов, выделенные ил губок се.м. Ка11еЬоп±г5.1айэ , нролгляит сильный гемолитический и антибактериальный а&екти, лнляготся сп-л;н].и~ чнпми ингибиторами некоторых глкканаз. Бромирозаннке производите тирозина из губок сем. Ар1уаЛп1аае проявляет ьысокий пнтостати-ческий з^'ект по отношения к опухолезшл клеткам.

Однако, влияние всех этих соединений на активность ф-р.че.ч: оз плазматических мембран изучено не было. 3 то у.", вро::я,необходимость всестороннего изучения свойств отих морских крирод(шх с<лдиис.!;1!: диктуется их визможннм примененном в качестве лекарственных средств, Так, у:«е начаты расширенные предклинкческие испитання трптернено-ш« гликезидов.

Цель рнботн. Целью нас:ож-pro исследования является: I) изучение влияния на 1<а+ ,К+ -АТ£>азу тоитерпенопиг. гликозидоу i'.-j голотурий ( тип L'cliinodermata ), сульфатов стероидов ;» губ о;; сом. Halichoiidriiuae , бронированных производных тирозина из гусю к сем. Aplyainidae ; к) ыятдеаке фрагментов хт-.ической структуры соединений, отвечающих за проявление их действия; 3) устаноилеж-б характера взаимодействия веществ с мембраносьязанной Ка+,К+ -A'i-j-азой; 4) определение возможности их взаимодействия с дигиталис-рецептором фермента.

Научная новизна и практическая ценность. Вперите были поучены особенности иигибирующего действия на Иа+д+ -яТ^аоу трптерленових гликозидов из голотурии, сульфатов стероидов и Орс-миро.<ашц« Метаболитов из губок. Быявлени различия в ингхбирущвм эффекте этих веществ как в отношении взаимосвязи структура-активность для каждой группы соединений, так и мевду представителя'.".'! разных групп. Установлено, что взаимодействие тритерпеиовкх глшгозидок с холестерином мембраны приводиг к изменению свойств лшцкнэго бислоя и функциональных свойств Ка+,К+ -АТ£азы.

Полное пнгибирование фермента сульфатен стероадов, в отличие от широкораспространенных детергентов - додецшюуд-фата натрия и дезоксихолата натрия, тлеющих черты структурного сходства с природа- г«;! соединениями, наблюдается до разрушения ими кембранного иатрикса.

Бронированные производное тирозина избирательно изшшодейству-ют с сульфгидрнльньыи группами Кв+,К+ -АТФазы, являются ослее сильными ингибиторами, чем классический реагент на суль4пууждг.-ные группы - N-этилмалеимид.

Поскольку все исследованные нами вещества являются высокоактивном и ингибиторами фермента и изменяют либо свойства липидко/о мат-рикса, либо самого белка, они могут быть применены в качестве инструментов и для исследования других биохимических систем.

Изучение взаимосвязи структура-активность позволило выявить фрагменты химической структуры, определяющие .¡•изислогическуи активность изученных веществ.

Сравнительно простая структура бро.мированнцх соединений из губок сем. AplyeinAdae , возможность их синтеза, высокая ингибиру-щая активность и изоирательноеть позволяй рекомендовать оти соединения для использования з качестве биопрепаратов, ¡¡осле опуб-ликсгания и.формации о дие.-юле Ь как ингиситори 1.а+,К*-A'i¿siau.

взаимодействующем с сульфгцдрильнюси группами феривнта, в отдел внедрения Тихоокеанского Ki^rmyra биооргаикческой химии поступили заявки на этот препарат из ряда научно-исследорйтьльскю: уч-роздений •

Цубявкгчг.ии. По темо диссертации опубликовало 7 работ.

работы. Диссертация изложена на 145 страницах магйкго-пксиосо текста, состоит кз зводекия, обзора литература, описания юториалоа и методов исследования, излогения результатов п их об-сугдеикя, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация содержит 35 рисунков и 11 таблиц. Список счткровашюП литературы склюодет 223 наименования.

Ра+,к+ -ДТтазу >п коря.! больших полушарии ;;оога крыс выделяли по методу Кгодос и созвт. СSXodos с; al'., 1975 ) или по методу Свидпер ( Gwsadiior ,1978 ). Специфическая активность фермента составляла 130-170 мкмоль РнД:г белка а час и 350-450 мкмоль Р,/мг белка а час, соответственно. f.'s2+ -АТйазная активность отсутствовала. Б том случае, если фермент выделяли без применения тио-цнаната натрия, активность Ма+,К+-АКазы составляла 30-110 мкмоль Рн/мг белка в час, а Mg2+-ATia3ti - 25-30 мкмоль Рн/кг белка в час. -f>'a+,K+ -ATv-'ioa из почек свиньи била ¡¡гделена по методу Чет-верина и соавт. (1979) в Институте биохиг.пк АН УзССР при участии д.б.н. ¡¿ирсалиховоП ü.M. Активность этого препарата составляла 600-800 (лсмоль Р,,/мг белка в час. Кз^+~АТЛаэнал активность, кото-рун определяли в присутствии Ю М уабанна, в препарате отсутствовала.

Пнгнбирование проводили следующим образом. Фермент (50-100 мкг/мл) проинкубировали с соответствующими*ингибиторами в течение 1-60 мим при 37°С в 30 t.;M трис-h'GI или э 30 кМ имндазол-HCI (pH 7,4). Затем аликвоты переносили в пробирки со сталдартной инкубационной средой, содержащей 130 мМ НаС1, 20 мМ KCl, 3 мМ KgClg, I iia^ATi и 30 >:!.{ трис-KCI (pH 7,4). Реакцию проводили в течение 5-10 кич при 37°С и останавливали добавлением холодной 27% ТХУ.

При проведении экспериментов по кнгибировалию в присутствии солей. Ali и сульргидр'лл-содержаа.их реагентов от избытка зтих ве-сестп ссзсболтд/н/съ. •/.егюльзуг. гель-фильтрация ка колонка с сефа-дексон G-ilv, ураг -..w вечной ос :•!! три.е-г.О! (pii 7,-'0.

э

- О -

Эксперименты по связыванию [ HJ-уабслна с Ка+,£+-АТк?азой проводили двумя способами: I) ферментативный препарат инкубировали е 0,3 jiM ["%]-уабаина (33-37 Ci/;-<,>.оль) с среде, содеряацей 150 м,\1 КаСХ , 2 «il мзсх2 , 2 м-'.i ATÔ, 10 имидазол-HCI (рН 7,4) и бычьего сывороточного альбумина,в течение 15-20 мин при 37°С.После этого препарат отделяли от нес&язавхегося уг-бакна центрифугированием при 75000g з течение 20 мин; 2) реакционный раствор после инкубации с меченым уабаинш фильтровали через фильтры Владипор MsA-',iA 3 и промывали 10-кратным объемом бидистилировашой воды. Неспецифическое связывание определяли в присутствии немече-

ного уабаина и око составляло 0,1-0,52.

Связывание ["Н]-А3& с Еа*,К+-АТ®азой проводиди следующим образок. '¿ермент инкубировали с 0,1 jin [^н]~АТй> (55,6 Ci/ммоль) в течение 15 мин при 0°С в 30 кМ тркс-ЗДТА (рН 7,4). Затем фильтровали через фильтры GF/C (Kbatnan ) и промывали холодным раствором 30 трнс-ЭДТА (рН 7,4). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 5 мМ АТ2 и оно составляло 15-18$.

Неорганический фосфат (Р ) определяли по метода- Ратбуна и Езт-лаха (• ЕаШЪиа, Eetlacb, 19^9 ). Белок определяли по методу Лоури и соавт.С Lovry et al., 1951), кепольауя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. Количество сульфгидрильных групп определяли по методу Бойера (Воуег, 1954 ).Количество холестерина в препарате ка^к* -АТФазы определяли с помоцью ферментативного теста на биохимическом автоанализаторе ContrifiChen-400 в лаборатории биохимии к автоанализа НИИ £ДШ МЗ PCSCP (Москва). Качественный к количественный состав фосфолипидов в мембранном препарате был определен на кафедре физико-химической биологии ДБГУ (Владивосток).

У^-спектры снимали на спектрофотометре Specord ОТ VIS. Спектры флуоресценции тркптофанилоз и пирона снимали на спектро$лу-ориметре Hitachi 650. H ffilP спектры снимали на Bruker WM-250. Рентгенограммы получали при съемке на рентгеновской камере RK-W (Сий-иолу.шние, фильтрованное îli ). Радиоактивность измеряли на сиинтилляционнсм счетчике Kaxk-Ill.

ф

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕШ

Взаимодействие тритерпеновых гликозидоч из голотурия с мембраяосвязанной Ка*,К"*"-ЛТйазой уозга к;л-:с

Физиологические эффекты тритсрпэнових гликозидов, выделенных из голотурий, сеязываит со способностью этих соединений образовывать комплексы с холестерином (ШцгеШ, оако-кзка, 1960} Аниси-нов и соапт.,1974; Но вгооГ, НагаЬавМ, 1976; Попов, 1984).

- В -

Аргументы в пользу этой точки зрения основывается ¡1а экспериментах по нейтрализации гемолитического и антигрибкового эффектов гликозидов предварительной инкубацией с холестерином, ь результате чего происходит образование неактивного комплекса глккоаид-хо-лестерин, а также на экспериментах с использованием модельных ли-пидных мембран. При введении в состав последних холестерина гли-козиды вызывают резкое увеличение проницаемости отих мембран. Однако прямых доказательств взаимодействия морских гликозидов с холестерином биологической мембраны до сих пор представлено не било.

Активность Ка+,К+-АТ&азы, фермента, осуществляющего активный транспорт ионов Ка+и К+через плазматическую мембрану, зависит от липидного микроокрукения и сохраняется при соотношении ли-пид-белок, составляющем не менее 0,19 (мг/мг) (¿"огсапаеп, 1932; Болдырев, 1985; Еваапп, 1984- ). Содержание лилидов в используемом нами препарате составляло 2,0-2,5 мг/мг белка. Щ них на долю нейтральных липидов приходилось 12-18/6, а на дол» фосфоли-пидов - около 82-80$. Фракция нейтральных липидов была представлена в основном холестерином (95$). фракция фосфолипцдов содер-мала фосфатидилхолин (32$), фосфатидилэтаноламин (25$), фосфати-дилсерин (13$), сфингомиелин (9$) и фосфатидглпнозит (5$). ¿ели принять во внимание способность тритериеновых гликозадов из голотурии взаимодействовать со свободным холестерином, можно было ожидать образования такого комплекса и с холестерином мембранного препарата.

Действительно, рентгенографические исследования комплекса тритерпеновых глш:озидов с холестерином показали, что происходит молекулярное взаимодействие этих соединений. Причем рефлекс« на рентгенограммах мембранного препарата, обработанного гликозидолш, идентична рофлекса,м модельного комплекса глнкозцд-холеетернн и характерны для каядого исследуемого гликозида (рис.1). Этот окспе-рю'ент наглядно показывает, что морские гликозиды взаимодействуют именно с мембранном холестерином.

Образование этого комплекса оказывает, очевидно, влияние на такие свойства биологической мембраны, как вязкость, структурные перестройки липидов, лип;1д-белковые и белок-белковые взаимоотношения, функционирование мембранных ферментов.

Как показано нам;!, действительно, морские гликозиды ингиби-рувт гидролиз АТй Ка^Д^-АТСазой (рис.2). Йкгибирование зависит

от концентрации гликозидоз, времени преинкубации фермента с ингибиторами. Максимальный ингибируюциП эффект наблюдается в течение nepnirx минут и достигает постоянного значения через 15-30 дан. 7л-доаеиия свойств мембранного матрикса, ведущие к ингкбированш ферментативной активности, необратимы, так как после'трехкратного отмывания мембранного препарата не происходит восстановления актив-

VII VIII

Рис. 2. Рентгенограммы-схемы модельных комплексов глн-козид-холестерин и мембранных образцов, обработанных тритер-пеновьми гликозг.дами. (I),холестерин; (II).голотурии Agjdll)-, астихопозид С; (1У), мембранный препарат Ка+,К+ -АТЗазн; (У), мембранный препарат с 1,0хЮ"^М голотурина Agí (Л), мембранный препарат с I.OxKT4.'.' астихопсзнда С: СУП), модельный ко -глекс голотурии А2~холестерин (молярное соотношение в растворе 1:3); (ЛИ), модельный комплекс астихопозид С-холеотерп.ч (молярное соотношение в растворе 1:5).

Благодаря наличию большой группы природных соединений с близкими структурами, причем среди тестируемых гликозидов некоторые имели одинаковое строение агликона и вариабельную углеводную цепь жги наоборот, :лы установили, что ингибируюдая способность тритер-пеновых гликозидов зависит от их структуры б целом. Значительную роль в проявлении ингибирукацего аффекта играет наличие хиновозн в первом биозидном звене углеводной цепи и степень окисления боковой цепи агликока. Аналогичная зависимость структура-активность показана нами.и'при изучении действия морских гликозвдов на проницаемость мембран эритроцитов, оцениваемую по выходу ионов К*. Мальцев и ооазт.(1935) установили необходимость хгаювозы в углеводной цепи стихопозидов для проявления ими сильной антигрибкозой активности. Корреляция физиологической активности стихопозодоз на различных модельных системах предполагает наличие ооцаго механизма действия или общей биологической мишени.

Мы установили, что количество связанного стихопозидами холестерина в мембранном препарате Ка+,К+ -АТФазы сопоставимо с инги-р^ии-ей активностью соединений. При 50% ингибировании Я а. ,к+-АТ£>-зн стихопозидом С 52Й холестерина образует с гликозидом комплекс, ¡.'•.»доступный действию холестермноксидазы. Сткхопозид В связывает только К"о холестерина I мембранном препарате, а его ингибир^ткций о'/'ент составляет 20$. Таким образом, структурные особенности стк-чеч^луоа, а именно нал;;"-в хиноиози, влияют нь. взаимодействие с холестерином.

ингибирования Иа+,К+ -АТШазы от концентрации тритерпенових гликозидов. бохадшиозед А; (-«-), стихопозид С.

Рис. 2. Зависимость

..^«^псоит.,» Но+ 1Г+ _

п _6-5 1Б(Ы)

концентрация ингибиторов •

Далее мы попытались выяснить, как образование комплекса гли-козид-холестерин сказывается на липид-белковшс к белск-белкозч-х г;эаимодейетвиях в мембране. Иззестно, что график температурной зависимости начальной скорости гидролиза АТ& Ка^н^-АТСазой имеет нелинейный вид, что отражает характер лилид-белковыг Езаимо-отношений (Болдырев, 1985). Для прзпарата, который использозали мы, точка перегиба находится в области 18,9^'2°С, В присутствии тритерпеновых гликозидов график Аррониуса принимает линейный эид (рис.3).

Рис. 3. Температурная зависимость активности На+,£+-АТ<5азы в присутствии тритерпеновых гликозидов. V - начальная скорость гидролиза АК>, Т - абсолютная температура. С-®—),

т

ы

2,0

1,0 -

_i_I

3,3 3,| (1/Т)хЮ"

-4;,

контроль; {-*-), 1, 0x10' астихолоэвда С; {-о—}) I.OxIO^M о'охадшиозида А.

Линеаризация графика Арренйуса Na ,1С -АТФазы может быть вызвана рядом причин. Такой эффект наблюдается при гиперхольотерине-шш, сопровождающейся увеличением микровязкости бислоя (Болдырев, IS85), а при обработке мембраны растительным гликозадом дигито-нином, который также, как и морские гликозиды, избирательно взаимодействует с холестерином (Щеглова и соавт., 19<Ш. й последнем случае микровязкость бислоя мембранного препарата Нгт,К+ -АгЛазк мозга быка снижается. Это было показано с покощьв спин-меченьк жирных кислот.Микровяэкость мембраны зависит от такого фактора, как соотношение холестерин/фосфолипиды, в частности,холестерин/ фосфатидилхолин (Ли и соавт., 1932). При взаимодействии с мембраной морские гликозиды как бы "оттягивают" на себя холестерин, который в нативной мембране обладает большим сродством к фосфати-дилхолину. Это может привести к появлению в менбране участков с пониженной микровязкостью. Однако вряд ли следует сводить дейст-

вие тритерпеновых гликозидов на мембрану однозначно только к понижению микровязкости.

Влияние гликозидов на свойства липидов мембранного препарата Иа+,К+ -АТФази било изучено нами также с помощью ШР спектроскопии высокого разрешения. Показано, что полуширина сигналов N -метильных протонов фосфатидилхолина практически не изменяется в присутствии астихопозида С в интервале температур от Ю°С до 35°С, что свидетельствует об отсутствии эффекта тритерпеновых гликозидов на подвижность И -метильных групп .

Для оценки изменений, происходящих в мембране при аппликации тритерпеновых гликозидов, мы использовали гидрофобный флуоресцентный зонд пирен. Образование эксимеров пирена является диф-фузионно-контролируемым процессом и зависит от микровязкости би-слоя и гидрофобного объема (Владимиров, Дсбрецов, 1960). Нами показано, что незначительное увеличение степени эксимеризации пирена наблюдается при концентрации гликозида 1,0хЮ-<:>М, вызывающей 30% ингибирование ферментативной активности, при возбуждении пирена светом с длиной волны «336 нм. Затем,при увеличении кон-

Сл

центрации бохадшиозида А до 1,0x10 М, образования эксимеров не происходит как при возбуждении зонда светом с длиной волны 336 нм (суммарный гшрен), так и при возбуждении светом с длиной волны Лех=2б0 нм (возбуждение пирена за счет переноса энергии с остатков триптофанилов). Пирен не образует эксимеров, если расстояние мезду белками в мембране меньше 20-40 А (Владимиров, Добрецов, 1580). Вероятно, гликозиды' вызывают такое изменение расположения мембранных белков. Мы показали такке, что интенсивность собственной флуоресценции триптофанилов мембранного препарата Ка+,К+ -АКаэы в присутствии бохадшиозида А увеличивается на 15-

что может быть связано с увеличением гидрофобности окружения триптофанилов и (или) изменением конформации белковых молекул. Следует отметить, что при возбуждении пирена светом с длиной волны Лех=2е0 нм происходит значительное увеличение интен- • сивности флуоресценции мономеров пирена в присутствии бохадшиозида А. Этот гф£ект может быть связан с двумя факторами: I) увеличением. интенсивности флуоресценции остатков триптофана; '¿) увеличением числа молекул пирена, контактирующих с белком в пределах радиуса ¿ерстера. Все это свидетельствует о том, что глико-эиди не только изменяют микровязкость бислоя, но и конформацион-

ные свойства мембранных белков.

Тритерпеновые гликоэиды вызывают изменение и белок-белковых взаимодействий в мембране. Так, коэффициент Хилла в присутствии бохадшиозида А уменьшается от 1,5-1,6 до 0,9-1,0, что свидетельствует об изменении взаимодействия протомеров На+,К'|'-АК'азы. Возможно, это связано с расхождением протомеров фермента.

Мы рассмотрели также некоторые особенности ингибирования Na ,К -АТФазы тритерпеновыми гликозидами и показали, что бохад-шиозид А и стихопозид С вызывают увеличение концентрации ионов Na+ , необходимой для полумаксимальной активации На+,К+-АТФазы от 40 мМ до 60 мМ, не изменяя при этом активирующей концентрации ионов К*". К*-фосфатазная активность Ка+,К+ -АТФазы менее чувствительна к действию тритерпеновых гликоэидов из голотурий. Так, при 50$ ингибировании Na ,К -АТФазы бохадшиозидом А и стихопоэидом С активность К^п-нитрофенилфосфатазы тормозится лишь на 10-15$. Тритерпеновые гликоэиды в интервале концентраций от IQ~4l до Ю~% не оказывают влияния на связывание специфического ингибитора Ма+,К+-АТФазы - [%] -уабаина с ферментом в условиях Независимого фосфорилирования.

Таким образом, рассматривая особенности взаимодействия тритерпеновых гликоэидов с Ма+,К+-АТФазой, можно отметить значительное сходство с действием на этот фермент дигитонина (Щеглова и соавт., 1981, Winter, 1972} Hobinson, 1980 ). Однако тритерпеновые гликоэиды являются более сильными ингибиторами ферментативной активности (50$ ингибирование наблюдается при весовом соотношении гли-козид-белок равном 5:1 для дигитонина и 1:1 для бохадшиозида А). Морские гликоэиды хорошо растворяются в воде и могут быть эффективными заменителями дигитонина в биохимических и биомедицинских исследованиях.

2. Ингибирование Ка*,К*-АТФазы мозга крыс сульфатами стероидов, выделенных из губок сем. HalichcndriidaQ

Сульфаты стероидов из губок сем» Halichondriidae халистанол сульфат (6) и сокотрастерин сульфат (?) - обладают сильным гемолитическим эффектом и антимикробным flettCTBueuiFusetazil et al., 1981; Makarieva et al., 1S63 ). Но в отличие от тритерпековых гликозндоз голотурий, сульфаты стероидов не образуют'комплексоу

с холестерином is vitro , не нарушают проницаемости лилосом, сформирован:-!^ из фосфатидилхолина, холестерина и сфшгомпелина. Гемолитический эффект сульфатов стероидов блокируется добавлением альбууина (Горшкова, %бина, 1986).

✓а

Е*

KaSO^O

KaS07&'

халистанол сульфат (б)

ЕЬ -^ЧЛх

Р сокотрастерин

« ^ х сульфат

I (?)

Оба этих соединения необратимо ингибируют Еа+,К+ -АТЗазу, причем халистанол сульфат'является более сильным ингибитором (рис.4). Значение (полумаксикапьное ингибирование) для (6) находится в области концентраций 0,9-2,0х1СГ5М, а для (7) - 1,8-4<йгЮ~5М.

Рис. 4. Зависимость ингибирования На+,К+_ АТ&азы от концентрации ингибиторов. (-*-),халистанол сульфат; (-о-), сокотрастерин сульфат;

моносульфат ха-листанола; (-&—), де-зоксихолат натрия; (-л-), додецилсульфат натрия.

(----), ингибирование К+-

п-нитрофенилфосфатааы.

0-6 -5 -4 lg(K)

концентрация ингибиторов

Такие,как и тритерпеновые гликозиды, сульфаты стероидов инги-бирувт фермент в течение первых минут, через 15 мин торможение достирает постоянного значения.

бъ'ло показан,о нами,при модификации природных соединений ч;<ы;::.хо/;;:;- изменение ингпбнрующей активности. Так, уменьшение би-'уилгнсо', и со^:к|.'е;1Ик за счет окисления боковой цепи приводит к дхучгпдьноглу пздеако иггиОируклчего ефпектг. (1г.д равна 1,0x10 *М).

и^ильн' :ти за счет присоединения остатка жирной

кислоты приближает ингибирующее действие модифицированного производного к действию природных соединений (IgQ равна 3,2xI0~^iM).

Поскольку сульфаты стероидов являются поверхностно-активными соединениями, мы сравнили их действие с действием известных детергентов (табл. I).

Таблица I

Ингибирование ферментатизной активности и экстракция белка из мембранного препарата На+,К+ -АТФазы. Фермент (100 мкг/ил) преинкубнровалц с ингибиторами в течение 15 мин при комнатной температуре, затем отбирали аликвоты раствора для определения активности, центрифугировали и определяли количество белка в супернатанте.

Соединение

% инги-бйрова-ния

Ъ экстрагированного белка

Соединение

% инги-бирова-ния

% экстрагированного белка

Халистанол сульфат

1,5ХЮ-5М

5,0хКГ5М

I.OxIG"4;«!

2,5х10Л<

б.ОхЮ-4 м

40-1 67±3 Ю0±0 Ю0±0 1С0±0

Додецилсульфат

2,5x10

7,0x10 1,0x10'

0 0 0

17±2 29*1

Г% 0 0

I^M 24-2 14-2

42±1 36±3

г?м 80-3 71±1

Г3М 100-0 100±0

Дезоксихолат

2,5x10' 2,5x10' 5,0x10 1,0x10' 2,5x10'

Ю±1 0

гЧ 42±0 0

Г5М 47±1 0

51±1 9±1

55±1 18±1

Г3М 60±2 23ÍI

Г3М 92Í2 32Í3

Из таблицы I видно, что халистанол сульфат полностью кнгиСиру-ет Na+,£4"-AТ^азу, не приведя к солюбилизацик мембранных бзлкоз.

Влияние сульфатов стероидов из губок на мембраносвязаннуто Иа+,К+-АТйозу, таким образом,отличается от действия детергентов, имеющих черты структурного сходства с природными соединениями.

Сульфаты стерокдсл увеличивают концентрации ионов Еа+ и К*, необходимые для полумаксимальной активации фермента (от 20 мМ до 60 мМ для ионов Ка+ и от 1,0 мЫ до 3,0 мМ для ионов К*). ¿^-п-нит-рофенилфосфатазная активность тормозится в такой же степени, как и Ка+,5£4'-АТ&азная (рис.4). Степень эксимериэации гидрофобного флуоресцентного зонда пирона уменьшается в присутствии халиста-нол сульфата, но при 10% иягибировании ферментативной активности способность пирена образовывать эксимеры сохраняется. Специфическое связывание [ % ] -уабаина в условиях На+ -зависимого фос-форилирования не изменяется в присутствии сульфатов стероидов. Следовательно, как и тритерпеновые гликозиды, сульфаты стероидов не препятствуют образованию фссфорилированного интермедиата.

3. Икгибирование Ка^К* -АТФазы мозга крыс и почек свиньи бромированными производными тирозина, выделенными из губок сем.

АтЛувапЫао

Бронированные производные тирозина из губок сем. Ар1уа1п1<1а1з проявляют цитотоксическуа (Стоник и соеьт., 1960)' и антибиотическую (ги1шог еЪ а1., 1970 ) активности. Нами показано, что эти соединения ингибируют Ь'а+,К+ -АТ'Зазу мозга крыс. Наиболее активными ингибиторами являются соединения, обладающие фрагментом <*,/>-непредельного кетона или гомоаннулярной диеновой системой (8-10), их составляет 1,0-3,0x10""%. Тогда как кеталь (II) в концентрации 1,25x10""% тормозит активность гГа+,К+ -АТФазы всего на 20£. Следует отметить, что (+)-азроплизиник-1 (8) и его рацемическая форма более эффективны, чем (-)-аэроплизинин-1.

о Н^СО оон^

N Вг ВхО^ХЛг

><г

^С0Ж2Н0ГИУ%:2СО:Ш2

(ЮГ

ГОГГ' ю -1

дйеной Ъ

Это говорит о том, что для взаимодействия ингибитороз с фгрментом большое значение имеет пространственное строение этих веществ.

Ингибирование зависит от времени преинкубации фермента с ингибиторами и концентрации веществ (рис.Ь.О).

Рис. 5. Зависимость кнгчбирования АТФазы диеноном 3 от времени. (~г~), На+Д+-

АТиаза мозга крыс: (+ +

На -АТ^аза почек свиньи.

мин

Можно отметить двухфазное действие диенона 3 (10) на фермент из мозга крыс: быстрое уменьшение активности фермента в течение 10 мин и медленное, достигающее постоянного значения по истечении 40-60 мин. Константы модификации (¡с' ), рассчитанные длг первых 10 мин реакции взаимодействия ферментов с ингибитором, составляют 2,8 мин'^мМ"^ и 0,30 мин^мЫ* для На+,К+ -АТбазы мозга крыс и почек свиньи, соответственно. Фермент, выделенный из почек свиньи, менее чувствителен к действии диэ.чока 3. чем фермент из мозга крыс (рис. 5,6). Такой же эффект был отмечен ранее для сердечных гликозидов и сульфгидрилвчых реагентов ( £т?евопег, '1973'. игауаша, Макао, 1979 ). ото обусловлено присутствием в мозговой ткани о((+)-изофермектноЙ формы Иа"1",^1"-А'Казь!.

Ингибирование обоих ферментов диенонами А а Ь (9,10) зависит от значения рН среды. Максимальное дейстзие ин»-иб/.торов лролэпя-ется при значениях рН от 7,0 до 8,5-9,0. при значениях рг. от 6,0 до 6,5 наблюдается незначительный ингибирую:!;ий эффект.

Ингибирующее дейстзие диенона А обратимо. /1иенон В ингибируьт Ка+,К+ - АТ^азу необратимом образом. 5то было показано при отмывании или разбавлении фермент-ингибиторного комплекса, а такке

с помогью гель-фильтрации на колонке с сефадексом э-йб.

Обратимый характер ингибирования фермента из мозга крыс диеноном А позволил провести кинетический анализ. Показано, что ди~ енон А ингибирует фермент конкурентно по отношению к АТ£> (К составляет О.бхЮ^М). По отношению к ионам Ка+и К* ингибирование неит смешанный характер равна 1,7хЮ~ЬМ, равна 2,7x10"% для ионов Иа+; 1(1 равна 6,4х10~61.1, к[ равна ¡.ОхЮ^М для ионов К ). Диенон А ингибирует К^-п-нитрофенилфосфатазную активность Иа+,К+ -АТФазы в той же степени, что и общую реакции. Ингибирование носит смешанный характер как по отношению к п-нитрофенилфос-фату (К1 и К± составляют 1,0хЮ~5М и 1,45x10""%, соответственно), так и по отношению к ионам К*" (значения % и К/ равны

Рис. 6. Зависимость ингибирования На+,К+ -АТйазы .диеноном В от концентрации ингибитора, (-о-), На+,К+-А'Шаза мозга крыс; (-»-), На+,К+ -АТйаза почек свиньи.

концзнтрация и.чгибитора

Преинкубация фермента с диеноном В в присутствии АТУ; приводит к уменьшению ингибирувщего действия. Причем Ка+,К+ -АТФаза мозга крыс более чувствительна к защищающему действию субстрата (таОл.2). Следует отметить, что.преинкубация фермента с ингибитором в условиях Ка+-зависимого фосфорилирования не изменяет степень ингибирования. Полученные данные, а именно: конкурентное ингибирование Иа+,К+-АТ^азы диеноном А по отношению к АТ4, защитный эффект АТй против действия диенона В, позволили предположить, что диеноны взаимодействуют с ферментом по АТ^-связывающему участку или в непосредственной близости от него. Таким образом, торможение ферментативной активности может быть обусловлено тем, что

7,4x10 М и 1,4x10 М, соответственно). 100

1Е(М)

диэноны препятствуют связыванию АТФ с активным центром Ка+,К+-АТФазы. Действительно, мы показали, что диенон В ингибирует взаимодействие [Зн] -АТФ с ферментом из мозга крыс (рис.?).

Таблица 2

Влияние АТО на иигибирование Ка+,К+-ЛТФазы мозга крыс и почек сзиньи диеноном В

Условия эксперимента

активность \% к контролю)

На+,К+-АТФаэа мозга крыс 3,0хЮ~6М диенона В 3,0x10""% диенона В + 100jthl трис-АТФ 3,0хЮ~% диенона В + 100jxli трис-ATá + 100 мМ HaCl + I мМ ЩС12

20±1 84±3

18-3

Ка+,К+-АТФаза почек свиньи 3,0x10"% диенона В 3,0х10~% диенона В + 100 мМ трнс-АТФ 3,0x10"% диенона В + 100juM трио-ATS + 100 мМ Had + I мМ KSci2

15-1 5I±I

I7±I

Уис. 7. Иигибирование связывания [ %] -АТФ и активности ..НГа+,К+-ЛТФазы мозга крыс диеноном В. (-о-), связывание [3н]-АТЗ; актив-

ность На+,К+ -АТФазы.

0-6 -5 -Ч- lgO'O

концентрация ингибитора

Сульфгидрил-содержацие соединения - цисте .т :: дитиотреитол, добавленные в преиниубацпонную среду перед добавлением диенонов А и Б, укег&саог кнгибпруй^ее действие соединений. При молярном соотношении диенон-цистеи.ч равном 1:2 тормокения активности фермента не наблюдается.

Способность днеяонов А и 3 вступать в реакцию с сульфгидр;кь-ньгми группами была подтверждена нами при измерении ультрафиолетовых (Уй) спектров д'/.еконов в присутствии дитпотреитола, цистеика, а так.ме некоторых других аминокислот. Исчезновение полосы поглощения при Л ».263 к?.!, характерно;'; для ди-нономогс хромофора, наблюдается только в присутствии сульфгвдрил-соде^гаагг/: соединений. Аминокислоты, имекцле и;.;кдазольнух>, гуаллдинс'-уа гздроксильную группе!, а также дополнительную карбоксильную группу не измендаг ш-:тек- . сивности и максимума поглощения дианонов..Взаимодействие диеноноь с сульфгздрил-содержацими соединениями зависит от значения рН среды. При рН 6,5 реакция идет медленно, тогда как при рН 7,4 и 6,5 проходит быстро и полностью.

Известно, что Ка+,К+ -АТ£аза относите- к числу тиоловых ферментов (Зкои, Ш.1Ъ0Г2,19555 ЗсЬооЪ еЪ а1.,1977;1978; Евтшш, 1932 ). Исходя из вышесказанного, мы предположили, что дкеноны взаимодействуют с сульфгидрмльными группами фермента.

На рис. 8 представлены данные регрессионного анализа зависимости количества 'реакционноспособных сульфгидрильных групп На+,К+ -АТиазъ: и активности фермента в присутствии различных концентраций диенскоз А к В. Можно отметитъ хорошую линейную корреляцию данных (коэффициент корреляции г=0,9?6, 0,936 и 0,979 для диенона А и На -А'Казь; мозга крыс и для диенона Ь и На+,К+ -АТФазы мозга крыс и почек свиньи, соответственно).

Бронированные диеноны ингибируют связывание [%] -уабаина с -АВДазсй, особенно сильное торможение наблюдается в усло-у/.г.: Фосфорплирования фермента и при активации связывания меченого зердочнсго гликозида А1Ф (табл.3).

?а''сг г./.до;.: исследователей.высказывались предположения о лгчкч одьс-й .си дьух сульфгкцрильных групп в АТй-сБязывающем цал-лк" ,7.' -Лг'^азы ч?&?зг1«-Ъ'овсг1ег к!., 1975; Ра%2вИ:-

?С1,(.я!гг, 1931; СсЬб1аег-ВоЫб, БсЬоаэг, 1935 ) и сдксЛ

•'.;'. л;.г'-,гн,".:•./.■);: груп:;и :. у.15анн-свя?мв^':.г,ем участке (з£1г1еу а!.,

К; с ). 'л->а. гчлуиег.'Ж члмп при • умении к<ггк5ируюс;его

Л к ^вндог^'.ьп'^^от г соль ну ¡крзо.'о кгюуллокзк/я.

Хотя нельзя исключить вероятности того, что пнгибпрование сш-зрмь-ниг [ ^ху-АТ$ вызвано изменение:.! конформации фермента при взаимодействии диенона В с сульфгидрильными группа:/.!:.

Рис. 0. Ьзаммэсазк-симость иннибироьчшиЯ Ка+Д+ -АТ1ази диеночами А и Б и количества реак-ционноспособных сулъф-гидрильнкх групп фермента. взаимодействие фермента из мозга с диеноном А;

), взаимодействие фермента из мозга с ди-енонсм В; (-<>-), взаимодействие фермента по ".СО почек с диеноном Б.

чстивность (%)

Таблица

Влияние диенона В на связывание [%] -уа баина с :!а+,К+ -АТФазой мозга крыс

Концентрация диенона 3 активность фео-кунта 1%'к контроля) % связывания [^н]-уабаина с ферментом

Условия онсп^римента

1:сс12 ] к5с12-атз

9,0хЮ~61,! 2о±2 '/.ОхКГ6!.; Зб±4

1В±1 1£±1 61^1 гь±г 70-5 39±1

3~1

Максимальное включение меченого уабаина в ферментативной препарат происходит в условиях образования фосфорилированнюс ин-термедиатов (Е^Р и Е^Р) ( БоЬ-лаггг ег а1., 1975 )-

Как уже отмечалось ранее, диенон В препятствует связыванию [3н]-АТО с Na+,K+ -АТйазой. Следовательно, образования фосфорнли-рованной формы фермента не происходит. В соответствии с этим мы и наблюдали значительное снижение способности уабаина связываться с Ка+,К-АТФазой. Если бы ингибирование включения меченого уабаина было обусловлено только наличием сульфгидрильной группы в дигиталис-рецепторе, диенон В тормозил бы в одинаковой степени связывание сердечного гликозида в условиях фосфорилирования, в присутствии KgClg и АТФ и только KgCl2.

По своему действии на Еа+,К+-А'К»азу диеноны похожи на н-отил-малеимид (характер кнгибирования в присутствии Iig012 , HaCl , КСХ , рН-зависимость ингибирования, защитный эффект АТ£) ( School; et al., 1977; 1978 ), но являются более сильными ингибиторами фермента. Так, к' для диенона В на порядок выше к'для н-этилмале-имида как по отношению к На+,К+ -А'Шазе мозга крыс, так и по отношению к ферменту из почечной ткани ( Urayaaa, Hakao,1979).

Таким образом, вследствие своей высокой ингибирующей активности диеноны А и В могут найти широкое применение как новые эффективные ингибиторы ферментов, взаимодействующие с сульфгидрильны-ми группами.

вывода

1. Установлено, что тритерпеновые гликозиды из голотурий, сульфаты стероидов из губок сем. ilalichondriidae , бронированные производные тирозина из губок сем. Aplyslnidaa является ингибиторами iia+,K+ -АКазы мозга крыс и почек свиньи,

2. Показано, что ингибируюцее действие исследуемых соединении существенно зависит от их структуры. Среди тритерпеновых гликозидов наиболее активны соединения, содержание хиновозу в углеводной цепи (I^g составляет 1,0x10"^.!). Среди сульфатов стероидов наиболее активны трисульфаты, имеющие гидрофобную боковую " цепь (It.Q составляет 1,0-4,0x10"°;.!). Среди бронированна производных тирззина наиболее активны соединения, имеющие фрагмент

а -ненасыщенного кетона или гомоаннулярную диеновую систему (1=л составляет I,0-3,0xI0"°;.i).

т

3. С помощью методов Н ЯМР спектроскопии высокого разрешения и дифракции рентгеновских лучей показано, что тритерпеновые гликозиды не влияют на подвижность Н-ызтильных групп фосфатидил-холина мембранного препарата и образуют комплекс с холестерином биологической мембраны. Взаимодействие тритерпеношх гликозидов

с мембраной приводит к изменению функциональных свойств Иа+,К+-АТФазы.

4. Установлено, что сульфаты стероидов из губок являются более сильными ингибиторами 1Га+,к;+-АТ0азы, чем широкораспространенные детергенты - дезоксихолат натрия и додецилсульфат натрия, имеющие черты структурного сходства а природными соединениями. Полное торможение активности мембраносвязанной На+Д+-АТ^азы сульфатами стероидов не сопровождается солюбилизацией мембранных белков.

5. Показано, что бронированные диеноны ингибируют связывание [0Н]-АТ5 с Иа+,К+-АТФазой. В своя очередь,АТФ защищает фермент от действия ингибиторов. Взаимодействие диенонов с ферментом осуществляется по сульфгидрильным группам.

6. Установлено, что из всех исследуемых соединений только бронированные диеноны ингибируют включение [%]-уабаина в препарат На+,К+-АТ®азы. Особенно сильное торможение наблюдается в условиях фосфорилирования и при активации связывания сердечного гликозида АТФ.

Осовное содержание диссертации изложено и следующих работах:

1. Gorshkov В.А., Gorshkova I.A., Stonik V.A., Elyakov G.B. Effect of marine glycosides on ATPase activity // Фох1ссп.-1982.-Vol.20, H 3.-P.655-65S.

2. Gornhlcov B.A., Gorshkova I.A., Kakarieva Т.Н., Stonik V.A. Inhibitory effect of cytotoxic Бг-containing conpounda froa sponges (Aplysinidae) on Ha+,K;+-ATPase activity // To3cicon.-1982.-Vol.20, H 5.-P.1092-1094.

3. Горшкова ША. Особенности ингибирующего действия 3,5-дибро-ко-1-гидроксп-4-оксо~2,5-циклогексадиен-1-ацетамида на Ка'1",^ -АТФазу // УШ мол. конф. по синтезу и исследов. биол. акт. сое-дин.: Тез. докл. Рига, 1964.С.34

4. C-0rsb.'Ä0v Б.A,, Gorshkova I.A., läakarieva Т.К. Iriiiibitory charcc vörisiics оt 3,5—c;r.~1f--oxo-'¡-ace^oaitriio, a seaisynttetic derivative of aeroplysii.an-'} fr ом cpoiyeo (¿plysiaidae) oa Na+,К+-ЛН?азо // Toxicoa.-1984.-Vol,22, ü 3.-P.W1-W9.

Ь. iорлкова И.А. Особенности ингибирухх^его действия тритер-неновых. глпкозидов из голотурии на На+,£+ -я?£асу мозга крыс // У III мол. конф. по еинт. и прпр. физиол. акт. соедин.: Тез. доил, ¿реваи, I£ü5.C.5I-bÜ.

6. ¡.'.акарьева Т.п., Горгкоеа /I.A., Горшкоз Б.Л., КадшювсккЛ

А.И., Стоник В.А. Стероидные соединения губок. УН. Получений производных сокотрастерин к халистакэл сульфатов и взаимосвязь структура-активность в p.i^y зтих соединений // Химия природ», со-един. -I9Ö5. 4. -С. 441-445.

7. Горакова U.A. Пзлпонспстероиди из губок сем. Iialiehoii'jrii-üüo - ингибиторы 1;а+,К+-А'К/азы мозга крке // УН респ. конф, мод. ученых по биоорг. п орг. химии : Тез. дом. Таллин, 19-37.

Ч, I.C.83.

Соискатель

iоракова И..А.