Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индуцированный морфогенез и микроразмножение in vitro зизифуса индийского (Zizyphus mauritiana Lam.) и китайского (Zizyphus jujuba Mill.)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Индуцированный морфогенез и микроразмножение in vitro зизифуса индийского (Zizyphus mauritiana Lam.) и китайского (Zizyphus jujuba Mill.)"

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НИКИТСКИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД

На правах рукописи

П Г г

УДК 582.782:581.143.6 1 0

13 ш

к,;..:.'

ПАНДЕЙ Джайдпп Кумар

ИНДУЦИРОВАННЫЙ МОРФОГЕНЕЗ И МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO ЗИЗИФУСА ИНДИЙСКОГО (ZIZYPHUS MAUMTIANA LAM.) И КИТАЙСКОГО (ZIZYPHUS JUJUBA MILL.)

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ялта 1996

Диссертационная работа выполнена в отделе биотехнологии Государственного Никитского ботанического сада УААН.

Научные руководителя - доктор биологических наук

О. В. Митрофанова,

член-корреспондент НАНУ, член-корреспондент УААН, доктор биологических наук В. А. Сидоров

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

В. Д. Работягов,

доктор биологических наук,

профессор

С. С. Малюта

Ведущая организация - Симферопольский государственный

университет имени М. Ф. Фрунзе

в -/О час на заседании специализированного совета Д 32.01.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Никитском ботаническом саде по адресу: 334267, Республика Крым, г. Ялта, Государственный Никитский ботанический сад.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного Никитского ботанического сада.

Отзывы на автореферат просьба присылать я двух экземплярах по адресу специализированного совета.

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

Защита диссертации состоится О!Л_1996 г.

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди большой группы полезных растений, возделываемых в садовой культуре, тропические и субтропические плодовые занимают особое место. Их отличает от других плодовых растений повышенное требование к теплу. Поэтому большинство из них распространено в субтропическом и тропическом поясах земного шара. Весьма перспективна для юга Украины субтропическая плодовая культура зизифус' (Zizyphus jujuba Mill.). Плоды ее, как и представителя другого вида семейства lihamn&ceae - Zizyphus m&uritiena Lam., произрастающего в Индии, богаты углеводами, белками, микроэлементами, фосфором, кальцием, биологически активными веществами. В их состав также входят витамины С (241-1725 мг%), Р и А. Помимо плодов, витамины С и Р находятся в листьях, цветках и корнях. Плоды используют как в свежем, так и сушеном, засахаренном виде. Кроме того, отвары и настои из плодов зизифуса используют при болезнях печени, почек, желудка, неврастении, простуде, сердечно-сосудистых заболеваниях. Существующие в настоящее время традиционные способы вегетативного размножения зизифуса в силу биологических особенностей культуры трудоемки. При семенном способе размножения наблюдается большое варьирование признаков у сеянцев и ухудшается качество плодов (Ядров и др., 1990).

Достижения последних лет в области культуры тканей и клеток растений продемонстрировали огромный потенциал клеточных технологий по размножению и генетическому улучшению растений. Имеющиеся успехи по использованию метода культуры органов, тканей и клеток для многих травянистых растений показывают возможность применения его и для древесных пород. Однако в этом случае возникает ряд трудностей, таких как отсутствие четких, хорошо воспроизводимых методик, получение асептической культуры, укоренение in vitro, адаптация in vivo и самое главное - недостаточные знания морфогенетических потенций растений и способов управления ими в культуре ткани. Наряду с этим, метод позволяет получать за короткий срок большое количество однородного суперэлитного посадочного материала, сокращать длительность ювенильной фазы, ускорять селекционный процесс, освобождать растения от патоген-

ных микроорганизмов, в том числе и от вирусов (Калинин и др., 1992; Woody Plant Biotechnology, 1991).

Цель я задачи исследования. Основной целью работы являлось сравнительное изучение морфогенетических потенций различных органов и тканей взрослых растений Z. jujuba и Z. mauritiana в зависимости от гормональных, трофических и физических факторов выращивания, а также необходимость более полного раскрытия путей морфогенеза проростка Z. jujuba в условиях in vitro.

В работе необходимо было решить следующие задачи:

- получить хорошо растущую асептическую культуру;

=~изучить~морфогенетйческие потенции эксплантов взрослых растений зизнфуса в условиях in vitro в зависимости от их видовой принадлежности;

- изучить влияние трофических, гормональных и физических факторов на процесс морфогенеза;

- изучить каллусообразование из листа и междоузлия;

- определить пути реализации морфогенетического потенциала зиго-тического зародыша и различных частей проростка Z. jujuba',

- определить условия укоренения микропобегов in vitro и адаптации растений in vivo двух видов зизифуса;

- разработать лабораторный способ микроразмножения Z. mauritiana и Z. jujuba из вегетативных почек в культуре in vitro.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение морфогенетических потенций тканей и органов индийского (Zizyphus mauritiana Lam.) и китайского (Zizyphus jixjuba Mili.) эизифусов в культуре in vitro. Показаны различия реакции растений этих видов на одни и те же факторы (трофические, гормональные и физические), регулирующие морфогенез. При этом выявилась следующая закономерность: Z. mauritiana обладает большей пластичностью, легче адаптируется к новым условиям культивирования по сравнению с видом Z. jujuba.

Изучены пути морфогенеза in vitro зиготических зародышей и отдельных частей проростка Z. jujuba.

Определены условия укоренения микропобегов in vitro и адаптации

in vivo растений Z. mauritiana и Z. jujuba.

Практическое значение работы. Полученные данные имеют научное и практическое значение в расширении представления о морфогенетических потенциях тканей и органов Z. mauritiana и Z. jujuba. Предложен способ микроразмножения двух видов зизифуса из вегетативных почек в условиях in vitro, что позволит ускорить селекционный процесс, и получить элитный посадочный материал.

Результаты исследований могут быть использованы в высших учебных заведениях при чтении спецкурсов "Клеточная инженерия растений" и "Нетрадиционные методы селекции и размножения древесных растений".

На защиту выносятся следующие основные положения:

- особенности морфогенеза двух видов зизифуса в культуре in vitro;

- сравнительная характеристика морфогенетических потенций органов и тканей Z. mauritiana и Z. jujuba в зависимости от трофических, гормональных и физических факторов культивирования;

- способ микроразмноження Z. mauritiana и Z. jujuba.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на двух международных конференциях молодых ученых по проблемам дендрологии, садоводства и цветоводства (Ялта, 1994; Ялта, 1995).

Структура в объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и перечня цитируемой литературы. Работа изложена на 178 страницах и содержит 54 рисунка, 16 таблиц. Перечень ссылок включает 238 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили вегетативные почки двух видов зизифуса: Ziz)T)hu5 mauritiana и Zizyphus jujuba, представленные сортами среднего срока созревания - Умран и Китайский 2А соответственно. Их вводили в условия in vitro в различные фазы вегетации растений. Для изучения морфогенетических потенций частей проростка, зародыш Z. jujuba

вычленяли из плодов трех сортов зиаифуса: Я-цэао - мелкоплодный, Китайский 2А - среднеплодный и Та-ян-цзао - крупноплодный, собранных в период их окрашивания.

Стерилизацию сегментов побега с почкой проводили в несколько этапов, последовательно погружая в растворы 1%-ного Thimerosal (15 мин.), 70%-ного С2Н5ОН (1 мин.) и 0,8%-ного AgNOs (5 мин.), с последующей промывкой трижды в стерильной дистиллированной воде. Для стерилизации плодов применяли 90-95% -ный этиловый спирт. В работе придерживались принятых в отделе биотехнологии ГНБС принципов стерилизации питательных сред, инструментов и посуды. Работу со стерильным мате-риаломпроводилн-в-ламинарных-боксах-маркиЕа1гапЫ-и-БП-4-004.-

В экспериментах по регенерации побегов из почек взрослых растений Z. mauritiana и Z. jujuba было исследовано несколько питательных сред: Мугасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962), 1/2 MC, В5 (Gamborg, Eveleigh, 1968), Хеллера (Heller, 1953), Пирика (Pierik, 1976), WPM (Lloyd, McCown, 1981) и QL (Quoirin, Lepoivre, 1977).

Изучая влияние фитогормонов на побегообразование зизифуса, использовали БАЛ (0,88-8,90 мкМ), зеатин (0,91-9,12 мкМ), кинетин (0,939,30 мкМ), НУК (0,53-2,68 мкМ) и ИМК (0,98-2,46 мкМ).

Исследуя возможности каллусогенеза из листьев и междоузлий индийского и китайского зизифусов, в питательную среду MC добавляли 2,4-Д (2,26-9,05 мкМ) и НУК (2,68-10,74 мкМ).

Пробирки, колбы, банки и чашки Петри выставляли в культураль-ную комнату с заданным режимом температуры и освещения, фотопериодом 16 часов и относительной влажностью воздуха 70% или помещали в термостат.

В экспериментах по изучению влияния физических факторов выращивания на регенерацию побегов , почки зизифуса культивировали: а) на агаризованной (агар 0,7%) и жидкой (на фильтровальных мостиках) питательных средах; б) на агаризованной среде с различным pH (4,2-7,2); в) при температуре 20-30°С; г) под воздействием интенсивности освещения 500-6000 лк.

Для получения проростков из зиготических зародышей Z. jujuba использовали питательную среду Монье (Monnier, 1973). Зародыши культивировали первоначально в темноте при температуре 5±1°С в течение 30-и суток, а затем при температуре 25±1°С, 1в-и часовом фотопериоде, освещенности 2000-3000 лк и относительной влажности воздуха 70%. Изучая морфогенетические потенции проростка, сегмент побега, семядоли, корень, лист и гипокотиль помещали на питательную среду МС, дополненную углеводами и фитогормонами: 0,117 М сахарозы, 0,055-0,276 М глюкозы, 0,90-13,57 мкМ 2,4-Д и 1,07-16,11 мкМ НУК. Соматические зародыши зизифуса получали из семядолей в три этапа. На первом этапе использовали питательную среду 1/2 МС, содержащую 0,90-13,57 мкМ 2,4-Д и 0,029-0,460 М сахарозы. Исследуемый материал находился в термостате (26°С). Второй этап протекал на среде МС без фитогормонов при температуре 2б°С, интенсивности освещения 2000-3000 лк и 16-часовом фотопериоде. На третьем этапе сформировавшиеся эмбриоиды помещали на среду ГГВ. Анатомическое изучение процесса образования почек de novo и соматических зародышей проводили на постоянных препаратах на микроскопе "Jenaval" (Германия). Микрофотографии срезов были сделаны с помощью £отонасадки для микроскопа мфн-11. Для индукции побегообразования шекс проростка и сегмент побега с почкой культивировали на среде МС, дополненной 0,88-8,90 мкМ БАЛ, 0,53-2,68 мкМ НУК и 0,98-2,46 мкМ

амк.

Для изучения особенностей корнеобразования эксплантов двух видов гизифуса были проведены две серии опытов. В первом - для укоренения мпользовали 1, 6, 18, 24 и 48-и часовую обработку раствором ИМК 98,42-984,2 мкМ). Во втором - микропобеги укореняли на среде 1/2 МС, [ополненной 2,46-24,60 мкМ ИМК, 2,85-28,54 мкМ И УК и 2,68-26,85 «кМ НУК. Экспланты в пробирках и банках помещали в культуральную сомнату с температурой 23±1°С, фотопериодом 16 часов и освещенностью 000-2000 лк.

Субкультивирование эксплантов проводили через 3 недели. Каждую ерию опытов выполняли трижды с десятикратной повторностью. В таб-1ицах представлены арифметические средние и их стандартные ошибки.

Для учета роста каллуса определяли увеличение сырого веса. Математическая обработка результатов исследования проводилась с помощью методов математической статистики, изложенных в книге Б. Ф. Доспехова "Методика полевого опыта" (1985).

Миниатюрные растения пикировали в горшочки (9x9 см) с различным субстратом: а) перлит; б) торф и перлит (1:1, 1:3, 3:1). Растения находились на СУВРе при температуре 25±1°С, освещенности 5000 лк и 16-часовом фотопериоде. Через 4 месяца адаптированные растения высаживали в теплицу.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА Z1ZYPHUS JTJJUBA MILL. И Z1ZYPHUS MAURITIANA LAM. В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Введение эксплантов Zizyphus jujuba н Zizyphus maurítíana в культуру in vitro. Развитие и пролиферация вегетативных почек двух видов зизифуса в условиях in vitro зависели от времени года, на протяжении которого отбирался первичный эксплант (см. рис. 1). Из почек, взятых в

IV V VI VII VIII IX X Время отбора экспланта, мес

BZ. jujubaDZ. mauritianaj

Рисунок 1

- Зависимость развития почек двух видов зизифуса в условиях in vitro от времени отбора первичного экспланта

период с ноября по март, не удалось индуцировать побегообразование. Июль оказался наиболее благоприятным месяцем для отбора первичного экспланта 2 /щиЬа, при этом интенсивность побегообразования составила 85%. Из почек таигШапа, введенных в культуру в августе, было получено максимальное количество побегов.

Изучение влияния различных питательных сред па развитие почек Ъ. }и]*иЬа и Ъ шаигШапа. В процессе изучения морфогенетических потенций вегетативных почек двух видов зизифуса нами были испытаны различные питательные среды, содержащие минеральные соли по Мурасиге и Скугу, 1/2 МС, В5, Хеллеру, Пирику, \¥РМ и <}Ь, дополненные 4,44 мкМ БАЛ и 0,49 мкМ ИМК. Было установлено, что в течение первых двух недель на всех испытуемых средах почки оставались зелеными. Однако на 3-ей и 4-ой неделях большая часть почек 2. ]щиЬа покоричиевели и погибли на средах 1/2 МС, Хеллера и ($1.. В это время у эксплантов ¿Г. таигШапа наблюдали аналогичные изменения на средах Хеллера, В5, Пирика и С}!.. Рост побегов ¿7. /щиЬа средней интенсивности отмечали на среде В5, при этом в течение месяца из почки образовывался только один побег длиной 0,4-0,6 см. Культивирование почек этого вида на средах МС и ^ЛФМ не привело к желаемым результатам. В этом случае количество развивающихся почек достигало 23-28%. Почки ¿Г. таигШапа достаточно хорошо развивались на средах \УРМ и 1/2 МС, однако активной пролиферации побегов не наблюдали. Наилучшими для регенерации побегов ¿7. таигШапа и И. }и}иЪа оказались среда МС и модифицированная среда Пирика соответственно. Эти среды были приняты за основу и использовались в последующих экспериментах.

Применение экзогенных фитогормонов для регулирования процессов морфогенеза Z. ¡щиЬа и 2. таигШапа. При культивировании вегетативных почек ¿7. таигШапа на среде МС, содержащей БАП (0,88-8,90 мкМ), кинетин (0,93-9,30 мкМ) и зеатин (0,91-9,12 мкМ), были отмечены различия в количестве развившихся почек, среднем количестве побегов /почку, средней длине побегов и окраске побега (см. табл. 1). Так на среде МС, дополненной 2,22-4,44 мкМ БАП, через 6 недель выращивания побеги достигали длины 2-3 см. Повышение или понижение концентрации БАЛ вызывало развитие единичных укороченных побегов. Добавление в среду

Таблица 1 - Влияние БАП, кинетина и зеатина на развитие почек и рост побегов ¿Г. таигШапа и ¿Г. ¡щиЬа

Концентрация ци-токинина, мкМ Количество развившихся почек, % Среднее количество побегов на одну почку, шт. Средняя длина побегов, см Окраска побега Каллусо-образование в основании экс-планта1'

1 2 3 4 5 6

.г?. таигШапа

0 50±2,0 1,6+0,2 1,9±0,1 зел. +

БАП

и,оо 2,22 45±3,4 65±5,8 1,2±0,1 2,3+0,4 0^7±0,1 3,1±0,6 —зел. зел. ---Н- +

4,44 85±6,2 3,3+0,9 3,5±0,3 тем.-зел. +

8,90 30±5,0 1,0±0 0,9±0,3 зел. +++

Кинетин 0,93 2,33 15±1,7 20±5,5 1,0±0 0,7±0,1 св.-зел. ++ +++

4,65 35=4,8 - - - ++

9,30 10±2,0 - - - ++

Зеатин 0,91 2,28 25±4,0 40±5,2 1,0±0 1,7±0,1 0,5+0,1 0,8+0,2 св.-зел. зел. ++ -Г+

4,56 70±5,0 2,5±0,4 1,8±0,1 тем.-зел. ++

9,12 15±4,8 1,0±0 0,9±0,2 зел. ++Т

}1циЬа

0 20±5,0 0,8±0,1 0,5=0,1 зел. +

БАП 0,88 2,22 56±3,0 38±4,4 2,9+1,3 2,4±0,8 2,1+0,5 . 1,2+0,3 тем.-зел. тем.-зел. -1-++

4,44 24+5,0 1,в±0,7 0,8+0,2 зел. ++

8,90 12±4,2 0,7 ±0,1 0,5±0,1 св.-зел. ■■ +++

Кинетин 0,93 2,33 21±2,8 16x2,0 1,2±0,4 1,0±0 0,1+0,1 0,1±0 св.-зел. св.-зел. -гт +-ГТ-

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4 5 6

4,65 - - - - -

9,30 - - - -

Зеатин

0,91 21+7,3 0,9+0,1 0,7±0,2 зел.

2,28 42±5,0 1,3+0,4 0,5±0,1 зел. а-о.

4,56 - - - - -

9,12 - - - - -

V ~ - минимальное; ++ - среднее; тг+ - максимальное.

кинетина способствовало активному каллусообразованию в основании экс-плантов. Зеатин оказывал стимулирующее действие на развитие почек и рост побегов. Наряду с этим во всех вариантах с зеатином отмечали значительное нарастание каллуса в базальной части экспланта, что приводило к замедленному росту побегов. Активную пролиферацию побегов Z. jujuba наблюдали на питательной среде ПВ, содержащей 0,88 мкМ БАП). В этом случае количество развившихся почек составило 56%, среднее количество побегов на эксплант достигало 2,9 шт. при длине побега 2,1 см. Повышение концентрации БАП до 8,90 мкМ способствовало развитию побегов с различными морфологическими отклонениями. Кинетин, как и в случае с почками Z. mauritiana, не стимулировал развитие почек и рост побегов. Использование зеатина в концентрации 2,28 мкМ активизировало развитие почек китайского зизифуса, однако у образующихся побегов отмечали медленный рост.

Полученные в условиях in vitro микропобеги двух видов зизифуса черенковали и сегменты с 3-4-мя междоузлиями высаживали на питательную среда' МС, содержащую различные концентрации НУК, ИМК, ИУК и БАП. Концентрации БАП 4,44 мкМ и НУК 0,53 мкМ оказались оптимальными для активации пазушных почек Z. mauritiana. Присутствие ИМК в питательной среде снижало количество активизирующихся пазушных меристем индийского зизифуса, кроме того, вызывало формирование

каллуса в баэальной части экспланта. Культивирование микрочеренков Z. jujuba выявило то, что максимальное количество пазушных почек (3,2 шт.) развивалось на среде, дополненной только одним ауксином - ИМК (0,98 мкМ). Применение НУК не способствовало регенерации побегов. Использование ИУК при культивировании почек обоих видов зизифуса не оказывало стимулирующего эффекта на их развитие.

Влияние 2,4-Д н НУК на каллусогенез Z. mauritiana и Z. jujuba. Изучение влияния 2,4-Д и НУК на способность к каллусообразованию листьев и междоузлий микропобегов, полученных в условиях in vitro из -рдияк_яярпслизс растений /тух видов зизифуса. показало, что через 60 сут культивирования нарастание каллуса на листьях происходило неодинаково (см. рис. 2). На контрольной среде без фитогормонов сырой вес каллуса не превышал 40 мг и 10 мг у Z. mauritiana и Z. jujuba соответственно. Лучшие результаты были получены на среде МС, дополненной 4,52 мкМ 2,4-Д (210 мг - Z. mauritiana, 185 мг - Z. jujuba). Использование в качестве индуктора каллусообразования НУК снижало эффект в 2-3 раза. Культивирование междоузлий на среде с 2,4-Д, как и в случае с эксплантами листа, стимулировало каллусогенез. В присутствии 4,52 мкМ 2,4-Д максимальный сырой вес каллуса достигал 60 мг и 40 мг у Z. mauritiana и Z. jujuba соответственно. Каллусообразование на среде с 2,68-10,74 мкМ НУК у обоих видов зизифуса протекало с низкой частотой.

Сравнивая полученные результаты культивирования двух видов зизифуса, можно отметить, что размах варьирования сырого веса каллуса при оптимальной концентрации 2,4-Д (4,52 мкМ) больше у Z. mauritiana (ai— 0,103), чем у Z. jujuba (со— 0,052). Листья реализовали свой морфоге-нетнческий потенциал более активно, чем междоузлия.

Выявлена зависимость интенсивности каллусогенеза от последовательности расположения листьев на микропобегах. На первом листе от верхушки побега в присутствии 4,52 мкМ 2,4-Д у обоих видов зизифуса образовывалось максимальное количество каллуса (204 мг у индийского и 182 мг у китайского зизифусов). Полученные результаты свидетельствуют о том, что вариабельность каллусообразования обусловлена в одинаковой степени гетерогенностью по физиологическому состоянию экспланта и различием концентраций 2,4-Д в питательной среде.

-лист 7,.

таигШапа

--мождоузлио

1. шиигШапа - - - лист '¿. ^]и!>а

мождоузлио 2. JuJцЪа

2,20 4,62 6,79 9,ОБ Концентрация 2,1-Д, мкМ

2,68 6,37 8,06 10,74 Концентрация ПУК, мкМ

Рисунок 2 - Зииисимость каллусоганоаа аизифуса от концентрации 2,4-Д, 11У1С и типа экспланта чороз 60 суток культивирования

и

Регенерация побегов из вегетативных почек Ъ. таигШапа н 2. доиЬа н фнзнческне факторы выращнвапня. Проведено сравнительное изучение влияния консистенции, рН среды, температуры и освещения на побегообразование индийского и китайского зизифусов. С этой целью вегетативные почки культивировали на среде МС, содержащей 4,44 мкМ БАЛ, 0,53 мкМ НУК (2. таигШапа) и 0,98 мкМ ИМК (И. ]щиЬа). Полученные результаты показывают, что незначительное количество почек развивалось на жидкой среде. Это значение не превышало 40% у индийского и 25% у китайского зизифусов. Культивирование почек на агаризованной среде способствовало их активному развитию. За 8 недель образовывалось в

среднем 4,0 микропобега на эксплант у 2. таигШапа. За такой же период из одной почки 2. ]и}иЬа формировалось в среднем 3,6 микропобега. Таким образом, агариэованная среда была принята за основную.

В процессе проведения исследования по определению значения рН для развития почек и роста побегов зизифуса, установили, что оно различно у обоих видов (см. табл. 2). Так максимальное количество развившихся почек таигШапа (98%) было получено через 8 недель культивирования при рН 5,6. Наиболее благоприятная рН среды, при которой 93% почек 2. }щ'иЬа образовывало побеги, равнялась 5,2.

Изучение зависимости частоты побегообразования от воздействия широкого спектра температур показало, что виды зизифуса по-разному реагируют на изменение температуры (см. рис. 3). Высокую регенерацион-ную способность почек 2. ]щиЬа и 2. таигШапа отмечали в пределах температур 25-26°С и 25-28°С соответственно. Температурный оптимум культивирования почек обоих видов совпадал (26°С).

Способность почек зизифуса к побегообразованию в значительной степени определялась интенсивностью освещения (см. рис. 4). Сравнительное изучение морфогенетических потенций почек индийского и китайского зизифусов показало, что лучшие результаты побегообразования были получены у первого вида при освещенности 2000-4000 лк, а у второго вида - 1000-3000 лк. Наряду с этим установлено, что при оптимальных значениях освещенности 3000 лк и 2000 лк развивалось максимальное количество почек и регенерировало максимальное количество микропобегов

Таблица 2 - Индукция развития почек и регенерация побегов индийского и китайского зизифусов на питательной среде с различной рН

Z. таигШало. ¿Г. ]щиЬа

рН количество развившихся почек,% количество побегов на одну почку, шт. количество развившихся почек, % количество побегов на одну почку, шт.

4,2 21,0=3,1 - 30,0±2,0 1,0±0,1

4,7 39,0±2,9 1,6±0,2 46,0±2,0 1,0±0,2

5,2 73,0±4,6 3,0±0,3 93,0±3,5 3,5+1,2

5,6 98,0±4,9 4,0±1,1 8б,0±3,0 2,8±0,7

6,0 62,0±3,2 2,6±0,1 45,0±2,4 0,7±0,0

6,6 27,0±3,2 1,0±0,1 20,0±1,5 -

7,2 15,0+1,5 - 12,0±1,7 -

20 22 24 26 28 30 Температура, °С

Рисунок 3 - Зависимость регенерационной способности почек от температурного фактора

Е. таигШапа и И. }и}иЬа. соответственно.

Пути реализации морфогенетнческого потенциала зпготическнх зародышей Ъ. ¿и^иЬа. Для индукции каллусогенеза и соматического эмбриогенеза части проростка (сегменты побегов, листья, корни, гипокотиль

500 1000 2000 3000 4000 5000 6000 'Интенсивность освещения, лк

к-во

.......к-во развившихся почек №иЬа

----к-во образовавшихся побегов Ъ. таигШапа

------к-во образовавшихся побегов Ъ. ]щиЬа

Рисунок 4 - Зависимость развития почек и регенерации побегов таигШапа и Е. Уи}иЬа от интенсивности освещения

и семядоли), полученных из зиготических зародышей, культивировали на модифицированной среде 1/2 МС, содержащей различные концентрации 2,4-Д, НУК, сахарозы и глюкозы. Присутствие в среде 2,4-Д в концентрации 2,26-13,57 мкМ способствовало каллусообразованию на сегментах побега, корне, гипокотиле и высечках листа. При этом была установлена зависимость частоты каллусообразования от типа экспланта и концентрации 2,4-Д в среде. Более чем 75% эксплантов листа и сегмента побега были способны к активному каллусообразованию на среде, содержащей 4,52 мкМ 2,4-Д. На среде 1/2 МС, дополненной НУК, интенсивность каллусо-генеза была ниже, чем в опытах с 2,4-Д. Для увеличения частоты каллусо-генеза в питательную среду вводили глюкозу в различных концентрациях (0,055-0,276 М). Присутствие глюкозы в концентрациях от 0,166 до 0,276 М в среде увеличивало количество эксплантов, образующих каллус, по сравнению с контролем (концентрация сахарозы 0,058 М). Максимальное количество сегментов гипокотиля было способно к каллусогенезу в присутствии 0,221 М глюкозы. При субкультивировании каллуса на среду,

дополненную 6,66 мкМ БАП, наблюдали формирование меристематиче-ских зон. Анатомические исследования каллуса показали, что зона активно делящихся клеток - эмбриональный клеточный комплекс (ЭКК) - располагалась на периферии исследуемого каллуса. Клетки ЭКК давали начало развитию вегетативной почки (геммогенез). Продолжительность развития почки составила 30-35 суток. На листовых пластинках, помещенных на среду, дополненную 2,68-5,37 мкМ НУК, параллельно с каллусообразо-ванием, по краю экспланта происходил процесс ризогенеза.

Введение в среду 2,4-Д стимулировало процесс соматического эмбриогенеза у эксплантов семядолей. Питательная среда 1/2 МС, дополненная 2,26 мкМ 2,4-Д, оказалась наилучшей для формирования большого количества соматических зародышей. Для увеличения эффективности образования соматических зародышей в питательную среду вводили сахарозу в различных концентрациях. Оказалось, что повышение концентрации до 0,117 М увеличивало количество проэмбрио в 1,5 раза (см. рис. 5). Наряду

24

§ *

х 3

3 = в

в а о

0,029 0,058 0,088 0,117 Концентрация сахарозы, М

0,146

■Китайский 2А----Ягцзао......Та-ян-цзао

Рисунок 5 - Зависимость частоты соматического эмбриогенеза

¿7. /цгиба от концентрации сахарозы в питательной среде

с этим, у всех трех сортов в присутствии 0,029-0,058 М сахарозы чаще формировались эмбриоподобные структуры (неоморфы) или листообразные

структуры с апексом побега. В дальнейшем из этих образований растения не развивались.

Сформировавшиеся соматические зародыши последовательно суб-культивировали на среду без фитогормонов, а затем на модифицированную среду Пирика (ПВ). Анатомические исследования показали, что развившийся соматический зародыш представлял собой биполярную структуру и имел четкий эпидермальный слой, почечку, семядоли и корешок.

Культивирование семядолей на среде МС, дополненной НУК, в концентрации 10,74 мкМ, вызывало интенсивный рост каллуса на большей части эксплантов. Низкие концентрации НУК не способствовали процессу каллусогенеза.

Изучение регенерационной способности апекса проростка и сегмента побега показало, что наилучшее развитие почек и рост побегов происходили на среде с 0,98 мкМ ИМК. В среднем 92% почек образовывало побеги, которые через 6 недель культивирования достигали длины 4,4 см. На среде с 4,44 мкМ БАЛ и 0,98 мкМ ИМК также наблюдали развитие большей части почек (90%). Наряду с этим, частота побегообразования была достаточно высокой в вариантах с 2,22 мкМ БАЛ и 0,98 мкМ ИМК, 2,22 мкМ БАЛ и 2,46 мкМ ИМК, 4,44 мкМ БАЛ и 2,46 мкМ ИМК и составила 86%, 78% и 84% соответственно. Присутствие НУК в среде не оказывало стимулирующего воздействия на регенерацию побегов в сравнении с ИМК. В этом случае максимальное количество развившихся почек (52%) было получено на среде, содержащей 4,44 мкМ БАЛ и 0,53 мкМ НУК.

Таким образом, различные органы и ткани проростка зизифуса обладают разнообразными морфогенетическими потенциями (см. рис. 6). Так из апекса проростка и сегмента побега с почкой удалось регенерировать побеги. Из корней был получен каллус, а также наблюдали вторичный ри-зогенез. Образование каллуса отмечали на гипок.отиле, листьях и сегментах побега. Морфогенетический потенциал семядолей реализовался тремя путями: а) каллусогенезом; б) прямым соматическим эмбриогенезом; в) непрямым соматическим эмбриогенезом.

Укоренение микропобегов Z. mauritiana и Z. jujuba в условиях in vitro и адаптация растений in vivo. Как показали наши исследования,

Рисунок 6 - Пути роолиоации морфогонотичоского потенциала зародыша Z. jujuba н услопиих in vitro

ризогенез зизифуса зависел от ряда факторов: а) типа экспланта; б) видовых особенностей родительских растений; в) типа используемого ауксина и его концентрации. Применение концентрированного раствора ИМК для обработки базальной части микропобегов длиной 2,0-2,5 см и адвентивных или пазушных побегов длиной 0,6-1,0 см вызывало образование каллуса. Использование же микрочеренков приводило в 50-60% случаев к укоренению. Несмотря на то, что микрочеренки обладали большей способностью к укоренению по сравнению с микропобегами, их использование для последнего этапа получения регенерантов не эффективно из-за низкой приживаемости в условиях in vivo. В связи с этим были определены оптимальные условия укоренения микропобегов зизифуса. Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что микропобеги Z. jujuba укоренялись быстрее, чем Z. mauritiana. Тем не менее количество побегов, образующих корни, у китайского зизифуса не превышало 60%. Частота ризогенеза у Z. mauritiana. достигала 80%. Наряду с этим, проявлялись различия в количестве образовавшихся корней на один микропобег. Наилучшие результаты по ризогенезу были получены на питательной среде, содержащей 9,S4 мкМ ИМК и 5,71 мкМ И УК. В этом случае начало корнеобразования зизифуса отмечали на 9-12 сутки культивирования. Через 6 недель на данной среде формировалось максимальное количество корней у обоих видов. Повышение концентрации ауксинов снижало частоту ризогенеза и в основании микропобегов формировался каллус, угнетающий рост и развитие экспланта.

Выращенные растения в культуральных сосудах выставляли на недельную преадаптацию на СУВР. Затем миниатюрные растения по одному пикировали в горшочки с различными субстратами. Полученные результаты свидетельствуют о том, что лучшим субстратом для адаптации был перлит. Выращивание в нем растений обоих видов приводило к 100%-ной приживаемости. Применение торфа или увеличение его весовой части значительно снижало адаптацию растений зизифуса. Растения, полученные из зародышей, лучше адаптировались к условиям in vivo. Регенеранты находились на СУВРе в течение 4-х месяцев, после чего дальнейшее доращива-ние их проводилось в теплице. В условиях закрытого грунта растения Z.

Таблица 3 - Влияние ауксинов на корнеобразование микропобегов ¿Г. таипй'ааа и ¡и}иЬа.

Концентрация ИМК -г ИУК, мкМ Начало кор-необразова-ния,сут Количество укоренившихся побегов, % Среднее количество образовавшихся корней/побег, шт. Длина побега1^

г. тяигШапа

0 + 2,85 - 0 - -г

2,46 + 0 50 10 1,1±0,1 +

2,46 -г 2,85 20 20 1,7±0,4 +

4,92 + 5,71 26 50 3,1±0,2 +т

9,84 -г 5,71 12 80 6,5±0,2 +++

4,92 + 11,42 28 30 1,6±0,2 +-г

9,84 т 11,42 40 20 1,2±0,3 т

24,60 + 0 60 10 1,5±0,5 +

0 + 28,54 50 10 1,0±0 +

2. )и]иЬа

0 + 2,85 28 10 2,0±1,2 т

2,46 + 0 14 30 3,5±0,2 +т

2,46 + 2,85 20 30 2,4±0,7 +

4,92 -г 5,71 25 40 3,0±0,7 +-Г

9,84 + 5,71 9 60 4,8±0,2 гтт

4,92 + 11,42 30 40 1,5±0,3 +

9,84 -г 11,42 45 10 1,0±0,2 -г

24,60 + 0 60 20 1,2±0,1 +

0 -г 28,54 - 0 - +

15 Среднее значение из 3-х повторностей + (3,5 см); +т (4,5 см); тт+ (5,5 см).

таигШапа развивались активнее, чем 2. ¿щ'иЬа.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны представленные на рисунке 7 способы регенерации растений 2. таигШапа и 2. ¿щиЬа из изолированных почек взрослых растений при микрочеренковании проростков 2. ]щиЬ&, обеспечивающие размножение существующих сортов, а также новых форм и гибридов.

ВЕГЕТАТИВНАЯ ПОЧКА ВЗРОСЛОГО РАСТЕНИЯ

ПРОРОСТОК (АПЕКС, СЕГМЕНТ ПОБЕГА С ПОЧКОЙ)

2. таигШапа

МС+4,44 мкМ БАП+0,53 мкМ НУК

2. )щиЪа

ПВ+0,83 мкМ БАП+0,05 мкМ И

_VI

¿ициЬа С+0,98 мкМ ИМК

МИКРОПОБЕГ

¿Г. таигШапа МС+4,44 мкМ БАП+0,53 мкМ НУК 2. )щиЪ& МС+0,98 мкМ ИМК

СОБСТВЕННО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ

2. таигШапа у/ 2. )и]иЬа 1/2 МС+9,84 мкМ ИМК+5,71 мкМ ИУК

перлит

УКОРЕНЕНИЕ МИКРОПОБЕГОВ АДАПТАЦИЯ

Рисунок 7 - Схема регенерации растений двух видов зизифуса (2. таигШапа и 2. )щиЬа)

выводы

1. Впервые проведено сравнительное изучение морфогенетического потенциала тканей и органов Zizyphus mauritiana Lam. и Zizyphus jujuba Mill, в условиях in vitro. При этом выявлена зависимость морфогенеза от различных факторов культивирования.

2. Показано влияние генотипа на морфогенетический потенциал почек зизифуса на этапах введения in vitro и собственно микроразмножения, проявляющееся в активном развитии почек и образовании побегов Z. mauritiana.

3. Определены составы питательных сред для индукции развития почек и побегообразования двух видов зизифуса. Успешная регенерация индийского и китайского зизифусов отмечена на среде Мурасиге и Скуга (1962), дополненной 4,44 мкМ БАП, 0,53 мкМ НУК и 0,98 мкМ ИМК соответственно. Повышение концентраций фитогормонов в среде резко снижало морфогенетические потенции эксплантов.

4. Установлена зависимость каллусообразования эксплантов листа и междоузлия от генотипа, концентрации ауксина в питательной среде и расположения листьев на микропобеге. Показано, что экспланты Z. mauritiana активнее образуют каллус. Оптимальная концентрация 2,4-Д составила 4,52 мкМ.

5. Изучено влияние физических факторов культивирования на реге-нерационную способность зизифуса. Определены условия пролиферации побегов для Z. mauritiana (агаризованная среда, рН 5,6, температура 25-28°С, интенсивность освещения 2000-4000 лк) и Z. jujuba (агаризованная среда, рН 5,2, температура 25-26°С, интенсивность освещения 1000-3000 лк).

6. Показано существование различных путей морфогенеза in vitro зиготических зародышей и частей проростка зизифуса: а) образование проростков; б) формирование каллуса; в) адвентивное побегообразование; г) прямой и непрямой соматический эмбриогенез; д) корнеобразование; е) развитие пазушных побегов.

7. Определены условия укоренения микропобегов in vitro и адаптации in vivo растений Z. mauritiana и Z. jujuba. При. содержании в пита-

тельной среде МС половинного состава минеральных солей, 9,84 мкМ ИМК и 5,71 мкМ ИУК частота ризогенеза достигала 60-80%. Использование перлита в качестве субстрата обеспечивало 100%-ную приживаемость растений, полученных из эксплантов ювенильной и взрослой культуры зизифуса.

8. Разработан способ микроразмножения растений из вегетативных почек ¿Г. таигШапа и Я. /щ'иЬа, который найдет широкое применение в селекции и позволит получить высококачественный посадочный материал.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Митрофанова И. В., Пандей Д. К. Влияние физических факторов на регенерационную способность вегетативных почек Zizyphus jujuba Mill. И Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Международная конф. молодых ученых, г. Ялта. 24-26 октября 1994 г.: Тез. докл. - Ялта, 1994. - С. 64.

2. Митрофанова И. В., Пандей Д. К. Влияние консистенции и рН среды на регенерационную способность вегетативных почек зизифуса (Zizyphus jujuba Mill.) в условиях in vitro // Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Международная конф. молодых ученых, г. Ялта,

24-26 октября 1994 г.: Материалы. - Ялта, 1994. - С. 77-80.

3. Пандей Д. К., Митрофанова И. В., Митрофанова О. В. Эффективность применения ИМК и ИУК для регуляции ризогенеза зизифуса (Zizyphus jujuba Mill.) в условиях in vitro // Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Ме;кдународная конф. молодых ученых, г. Ялта,

25-27 сентября 1995 г.: Тез. докл. - Ялта, 1995. - С. 112.

4. Пандей Д. К., Митрофанова О. В. Сравнительное изучение морфо-генетических потенций вегетативных почек Zizyphus jujuba Mill, и Z. mauritiana Lam. в условиях in vitro // Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Международная конф. молодых ученых, г. Ялта, 25-27 сентября 1995 г.: Тез. докл. - Ялта, 1995. - 1995. - С. 113.

5. Пандей Д. К., Митрофанова О. В. Индуцированный морфогенез вегетативных почек Zizyphus jujuba Mill, и Zizyphus mauritiana Lam. в условиях in vitro.-Деп. в НИЛ "ДЕНАСТ" ИЗАН Беларуси,199о.-Л» "08.-9с

ABSTRACT

Pandey Jaydeep Кшпаг. Induced morphogenesis and micropropagation in in vitro of Zizyphus mauritiana Lam. and Zizyphus jujuba Mill.

The thesis submitted for a candidate's degree (Ph. D.) on speciality 03.00.23 - biotechnology, State Nikita Botanical Garden UAAS, Yalta, 1996.

A comparative study of morphogenetic potential of tissues and organs of Zizyphus mauritiana Lam. and Zizyphus jujuba Mill, has been made for the first time. The reactions to the basic factors of cultivation in vitro of different genotypes of above mentioned species are shown. The ways of morphogenesis in in vitro of zygotic embryos and different parts of sprout of Zizyphus jujuba are determined. A method of micropropagation of two species of Zizyphus from vegetative buds in in vitro has been worked out.

Key words: Zizyphus mauritiana, Zizyphus jujuba, embryo, sprout, vegetative buds, leaf, morphogenesis, in vitro, in vivo, micropropagation.

АНОТАЦШ

Панден Джайдш Кумар. 1ндуктований морфогенез та мп:ророзмно-ження in vitro 3131фуса шдшського (Zizyphus mauritiana Lam.) i ки-гайського (Zizyphus jujuba Mill.).

Днсертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бтлопчних наук з спещальност! 03.00.23 - бштехнолопя, Державний Шкггський бо-гашчний сад УААН, Ялта, 1996.

Вперше проведено пор1вняльне вивчення морфогенетнчних потенщй гканин i opraniB Zizyphus mauritiana Lam. та Zizyphus jujuba Mill, в куль-rypi in vitro i показаш вЦмшносп реакцп генотишв цих внд1в на осноеш Ьактори культивування. Визначеш шляхи морфогенеза in vitro змчэтичних ¡ародглв та окрбмих частин проростка Z. jujuba. Розробленнй cnocio гпкророзмноження двох вгодв aiaiфyca з вегетатнвиих бруньок з умовах in ,'itro.

Ключов1 слова: Zizyphus mauritiana, Zizyphus jujuba, зародок, про юсток, вегетативна бруньиа, лист, морфогенез, in vitro, in vivo, мпгг^-юзмножения.