Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое излучение кортиколиберина человека с использованием моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое излучение кортиколиберина человека с использованием моноклональных антител"

6 0..

дПР 1Ь-

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

На правах рукописи УДК 615.357.37.

КРАВЧЕНКО Ирина Валерьевна

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРТИКОЛИБЕРИНА ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.04 — биохимия

А в тор е фер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Рабога выполнена во Всероссийском Научном Центре молекулярной диагностики и лечения МЗ РФ.

Научные руководители: член-корреспондент РАН, профессор Северин Е. С., доктор биологических наук Свешников П. Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гусев Н. Б. кандидат биологических наук Чередникова Т. В.

Ведущая организация: Московская Государственная Академия Тонкой Химической Технологии им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится ЙМ^е/*^ 1994 г.

в 10 час. на заседании Специализированного Совета К 002. 96.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН (117071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, кор. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, г.Москва, Ленинский проспект, 33, кор. 1).

Автореферат разослан 1994 г

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор биологических наук М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Изучения механизмов действия нейропептипов, выделяемых гипоталамусам и регулирующих деятельность периферических желез внутренней секреции через гилоталгяо — гмпофизарну» систему, являются одной из наиболее актуальных задач современной Виохимии. Кортикотропин - ре лизинг - «зктор заслуживает в этой связи осоВо пристального внимания, поскольку он, регулируя уровень адренокортикотропгного гормона, окззыг-ает определяющее влияние на секреии» глюкокартикоидов — клшчевых гормонов стресса, вызывающих целый ряд негативных иэмэиений в различных Функциональных системах организма, в том числе в иммунной системе, в условиях длительного стресса.

Весьна актуальной является проблема установления взаимосвязи мсггду структурными особенностями пептидных гормочов и их »ункииональными характеристиками. О отношении кортиколиБерина имеется значительный прогресс в изучении его структурных характеристик, тогда как установление

Функциональной роли выявленных структурных особенностей оотается гтока малоисследованным.

Весьма удоНным инструментом для решения вышеуказанных задач яэлявтоя использование моноклональных антител. Моноклональные антитела огшцифически связываются о определенным эпитопом на молекуле пзпгила, позволял идентифицировать »тот эпитоп. Сопоставлен*"!» Виологичяоких эффектов моноклональных антител о их оп«ии*;:чноотью к определенным антигяиним детерминантам позволяют поЕчтьоя оущиствегниого лрогрегооа как в изучении механизма действия данного белка, так и в изучении его структурно - вун кциочаяьиык характеристик.

Моноклинальный антитела позволяют успешно решать и другую важную проблему, возникающую при изучении Зиопогически активных пептидов, действующих в чрезвычайно малых концентрациях! они дают возможность создания

высокочувствительных иммуно»ерментных тест - сиотем, позволяющих точно определять концентрации данного гормона в биологических образцах.

Цель и задачи исследования.

Целы« настоящей работы являлось! <а) — получение клонов гибридом, секретирующих моноклональные внтнгеяа к различным эпитопам на молекуле человеческого кортиколи2ерина; <В> -сооздание высокочувствительной иммуноверментмой тест — сиотеми для определения концентрации человеческого кортикояиберини; <в) — хграктеризация антигенных детерминант полученных мак о клон а льн их антител; <г> - исоледозамие тигтоэ клеток, секретирующих кортикалиЭэрнн, и определение' еакторо», стимулирующих его секрецию, о помощью разработанной тест — системы. В соответствии о »тим в план работы входило! гибридизаций соматических клеток с цгльк получения гибридом, оптимизация условий иммуно®ерментного диагностирования человеческого кортикэлиберина, химическая модификация аминокислотных остатков кортиколи5еринв, измерение

концентрации данного пептида в культуральных гидкостяк перьичных и перевиваемых культур в ответ на различные стимуляторы.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Были получены ноноклональные антитела к кортиколиВерину человека, определен характер антигенних детерминант и константы связывании для двух клоное< внтитол и показано отсутствие конкуренции меяву ними за участки связывания о антигеном. Впервые Было обнаружено, что опосьбноотью оекретировать кертиколиберин обладают В — и Т - лимфоциты человека, но не макрофаги и не гргиулсимты. Впервые выло показано, что сакрецию кортиколиберима стимулируют на только активаторы пролиферации лимфоцитов, но и «акторы клеточного стресса. .

Практическая ценность работы состоит а том, что впервые была создана иимуно$ерментная тест — систем« для опрзделения кортиколнберииа на основе моноклональных антител, позволяющая определять антиген в концентрациях до 50 пг/нл. Поскольку изменения концентрации кертиколиберина я&ляются характерным признаком таких патологий, как синдромы Кашинга и Нельсона, Волезкь йддиссна, то данная тест - система является ценным инструментом для их ранней диагностики.

Апробация работы.

Материала диссертации Выли доложены на международной

конференции "Структура и функции регулятарных пептидов" < Москва 1972 ) и на лабораторном семинаре департамента биотехнологии ВНЦ МДЛ МЗ России < декабрь 1993 >.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа содержит следующие разделы I введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы, изложена на 103 страницах машинописного текста и включает 25 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 151 источник, из них 3 русских и 148 иностранных Источника.

Список сокращений.

CRF - кортикотропин - релизинг - «актор, PBS - заВу»еренный физиологический раствор, PBS-AT - PBS о 0,5 V. Бычьим сывороточным альВумином и О, ОЗУ. Tween-20, ИФА -иммуно#ермвнтный анализ, П — оптическая плотнооть.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОПЫ.

Дпя получения гибридом использовали мышиную мнелону Sp2/0 и клетки селезенки мышей линии Balb/c. Слияний клеток провопили гтолиэтилнгликолем о добавкой димитилсуль»оксида < Borrebalck С. et.al., 1981 ). Полученные клоны гиВридом реклонировали дважды в полужидком агаре, после чего замораживали в криозашитнпй среде, содержащей 107. диметилауль«оксида, понижая температуру оо с коросты« 1 г-радуо в минуту. Пля получения асцитичеоких жидкостей мышей линии Balb/c сеноиВилизировали внутрибрюшиннын введением приотана и через недели вводили по Ю^клеток гибридом внутрибрмшинно. Асцитичеокие жидкости брали через 10-16 дней.

Иммуноглобулины из асцитичеоких жидкоотей выделяли с помощь» ионооВменной хроматографии ( Брок й.,1987 ).

Все варианты иммуно«ерментиого анализа проводили на 96-луночных планшетах из поЛивииилхлорида по описанной ранее методике < Во л кто в П. В. о coasr., 19S4 >. В качеотве субстрата ДЛ* пероксидазы использовали ДЕГГС или орто*еиилендиамин. Пероксидаэные кон-ывгаты мен о к локальных антител готовили пе-риодатным методом < Tijssen P., Kurstak Е., 1984 ).

Константы связывания коноклокальных интител о кортиколиВерином определяли с помощью иммуноферментиого анализа t Friqvet В. et al., 1985 , Stevens F., 1987 > используя формулы Скэтчарда.

КортикоЛиберии модифицировали цитраконовым ангидридом <Fredman N., 1970 ) и диэтилпирокарбонатом (Grillo F.G., Aronson P.S., 1936 >.

Выделение лимфоцитов из кропи здоровых доноров проводили стандартным методом а использованием гредиэнта «икал - гипак ( Клауо П., 1990 ). Разделяли лимфоциты на Т- и В- клеточные Фракции о использованием иайлоноаых волокон ( ФрицаЛь Г.,1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Получение моноклональных антител.

Для иммунизации было взято 7 мышей линии Balb/c весом 16—1В г. Пля получения гибридом была взята мышь о наибольшим титром антител в сыворотка t титр антител определялся методой ИФА ).

После удаления эритроцитов суспензия клеток селезенки

9 7

содержала 10 клеток. Их олили о 10 клеток миеяаны Бр2/0.

После двухнедельного культивирования в селективной среде,

содержащей аминоптерин, гипоксантин и тимидин, провели

иммуноферментный анализ появившихся клонов и отойр^ли 2 клона,

даваших наибольший ответ при наименьшем количестве клеток. Из

них отобрали по 10^ клеток и реклонировали в 0,32-ном агпрс.

50—70V. вторичных колоний продуцировали монокломальныа антитела

к кортиколиЕ&рину человека. При последующем реклонировании

выход специфических клонов составлял ЮО'/.. Асцитическиа

жидкости, взятые у мышей на 10—16 день после введения клеток,

очищали о помощью центрифугирования при 1000g 10 мин. Псале

трехкратного высаливания сульфатом аммония до 40У. насыщения и

ионообменной хроматографии на ПЭАЭ - трисакриле M получили

Фракции монокленальных антител, содержащую по даннь>м

электрофореза о додецилсульфате натрия только иммуноглобулины

G, выход моноклонвльных антител составлял 2 нг из каждого мл

асцитической жидкости.

2. Определение констант связывания о антигеном.

Для определения конотант связывании в комплексах антиген -антитело пользовались метопом, включающим инкубацию различных аликвот антигена о постоянным количеством антител в гомогенной фазе до установления равновесия и последующее определение концентрации свободных антител, не связавшихся в комплекс, методцм ИФА. Согласно процедуре, использованной авторами данного метода, оптическая плотнооть в реакционной смеси пересчитываете* непосредственно в концентрацию свободных антител пооле установления равновесия. Однако, поскольку с сорбированным на твердой «азе антигеном связываются как свободные антитела, так и антитела, имеющие свободным лишь один сайт < второй связался а антигеном при инкубации до установления равновесия >, то рассчитанные концентрации "свободных" антител не являются истинными концентрациями свободой* сайтов связывания. Ф.Стивено разработал метод, ттоэволйюямй преодолеть это ограничение пыишупомянутого метода И рассчитывать истинные константы связывания. Типичный график Скэтчарда, построенный о учетом поправки Стивенса, приведен на риоун ке 1.

Рассчитанные методами Стивенев и Фригвета конотанты диссоциации предотавпенм г* таблица 1.

ТвОл.1. Хорактгриатики полученных моноклональных антител к кортиколиВерину' человека.

Клон ПС'П"ЛПОО Константа диссоциации, М

метод Фригэета метод Стивеноа

4Н9 В1 -9 2x10 * —9 1x10

5Д5 £31 3,3х10~8 1,3х10-а

3. Определение взаимной конкуренции антител и разработка

тест—системы для измерения концентрации кортиколиберина.

Для исследования взаимодействия антител о их конъюгатами

проводился конкурентный анализ ( рис 2 >.

Антитела 4Н9 не конкурировали о антителами ЗДЗ,а антитела 5Ц5

- с 4И9, но пероксицазние кон-ывгаты антител каждого клона

B/F

1,0 '

0,5

3,3 4?2 4, б' В, н!'

Рис.1. Кривая связывания моАТ 4Н9 а нативным CRF-

по данным непрямого ИФА в координатах Скэтчарда о использованием метопа Фригвета. Концентрация моАТ 4Н9 равна 0,7 мкг/мл. F—концентрация свободного CRF, B-концентрация связанного CRF.

конкурировали о некониогированными антителами того же самого клона. Отсутствие конкуренции между антителами, продуцируемыми двумя кланами гийридом, показывает, что антитела направлены к двум различным антигенным детерминантам.

Высокая аффинность антител, а также отсутствие конкуренции между ними за связывание с антигеном позволили создать тест' .,— систему на основе иммуноферментного сэндвич аврианта VTOft. Из двух испытанных вариантов тест - системы на основе сэндвич варианта наилучшим оказалось сочетание моноклональных антител 4Н9 в качестве сорбента и антител клона 5Д5 для приготовления кон-ы«гата. Этот вариант давал достоверное отличие сигнала от ♦она при концентрации кортиколи5ерина 50 пикограмм в миллилитре < рис.3 ).

4.Локализация антигенных детерминант моноклональных антител.

■О—Я-

3 б 9 12 25 50 3 б 9 12 25 50 Концентрация немеченых антител, мкг/мл

Рии.2, Конкуренции парокгатпязных кон vera tod моЛТ 5Д5 (А) и моАТ Ш> о намеченными исАТ 4Н9 и ЗПЗ tso

• евлзизанка а икмоПилизоавкньм когпикояиВкринпм. ОВаяначения« «t - 4НЭ, CJ - ÍSR5.

Рио.3.

30 90 150 210 300

Концентрация норгинолиберина, иг/мл^

Кпт<5ро»очмь.-й график сгфодоявиия концентрациям кортииоикОерииа рдаухсгйтиь.-м сэипвич-вгригнтом ИФА. Сорвгнт—иоДТ 4Н9 СЮ мкг/мл> , хон-ы»гат-меПТ 5П5 (1 мкг/мл).

При ичкуЕшиии ксрти».олиВирина о митраконехнм амгидрияом (лег.'.'.гииирс^а.тоя един отгонный яиаимоэый еогаток -Lya3&.

Антитела клона АН 9 практически не оаязыв<«отоп о модифицированным по лиэииовому остатку кор1икоЛиберииом С рио ) , что однозначно свидетельствует в пользу предположи:чин о присутствии санного остатка в антигенной детерминанте, узнаваемой антителами данного клона.

Рис.4.

>■5- Í4I4

1.0 _

0.5 -

0

а

чН9 505

Вли сине лизиновай модификации на свя зывание CRF о антителами. Кон-ыог-ат иикубироввлся Без CRF ( Ш > , о модифицированным CRF в концентрации 5 мкг/мл .( ЕЗ )» о натипным CRF в тайки концентрации ( ц)

В пользу этого предположения говорят также данные о влиянии кортиколиВарин - связывающего белка на взаимодействие антигена о антителами этого клона. Как видно из рис.5 норпальнап человеческая сыворотка полностью подавляет связывание CRF о аитителами клена 4Н9.

Для более точного определения компонента человеческой сыворотки, тормозящего связывание картиколиберина с антителами , была проведана гель - фияьтргцин сыворотки нй сефадексе G—200 о последующим анализом отдельных фракций на способность ингиб^ро&ать взаимодействие С Г: г а антителами. Такой способностью обладала фракций с молекулярным всэсом около 40 кД < рис. 6 ).

Кпк Было показано рянрэ, участок аминокислотной поолядовптапьиоати 34-41 является определяющим для сзвимоЯЕЙатиия кортикояиИсгрина о сывороточным белком, именно тем и локализован Воя совокупность описанных выше

данных подтверждает предположение о том, что лизиновый остаток входит а ооотаа антиг«»нисй дотерминвнты моноклональных антител 4Н?, следовательно, эти антитела направлены к С—концевому участку молекулы картикалиЗерина.

Рио.5.

1.5 —

1.0.

0.5 —

^414

№

11

4Н9 505

Влияние нормальней че леваческой емзоротки на оэязыванисэ антител о СИГ. ' Плпчиэты оорЕировали ЕСА, спа льБунин ом, инсулином, гормоном роота ( Ш и, ¡3) или натизным кортиколмЗермном <ГЙ ■ и, □ ) и затем оБркбатывали чеяовочиокой оиэпроткой ( Я >, 0,25Х желатином ( Ш > или РВЗ-АТ оо всех других олучаях.

Исолэясэвнив антиг-онной детерминанты клона ЗПЗ проводилось с испольяооанием таких модификаторов как цитриконовый ангидрид и дпэгиллирокврВонвг. Поолв инкубации кортиколиберина • о цитрьконояым ангидридом саязыванив антитил клона ЗД5 заметно ухудшилось , причем отсутствии конкуренции »тих антител о мок о к леи а »чн ыми антителами 4Н9 позволяет исключить учпетиз лизинопух остатков » оаязывакии антител клона 5ЦЗ о антигеном. При модификации пиэтилпирокарВонатсэм связывание

450 650 . 850 1050 V,ыл

Рио.6. Инг-иВирсгаание различиями фракциями

нормальней человеческой оыооротки авнзыяания антител о CRF. Обозначения! я - моАТ 5ПЗ, о-- маАТ 4Н9. А — профиль *лнции, Б - процент ин<-иВировимия овязывани» антител о СРГ различными фракциями сыворотки.

кортиколибврина о данными антителами возросло. Использование матояа Ск»тчарда позволило определить константу связывания антител а модифицированным , диэтилпирокорВонатом

кортиколиВерином и сравнить ее с константой, полученной для нвтионого релизииг - ©актора. Оказалось, что антитела 5Д5 оаязыэавт кортикоттиБзрин о модифицированными гиотипинсвыми оотатками о большей константой ( табл 2 ) . Это вполне согласуется о ране модификация гиотининое кон»орнациониов ооотоянис Белковой глобулы. Перечислнннью выи:е нсОлиясиия, а также сызываемоо коргиколиЭсрии - ооязиваялим Сайком Блокирование в 3,3 разя связывания антител ЕД5 о антигеном позволяет предположить что антигенная дитерминвнта

полученными

LI- 13

особенно Hiв ,

ванными, впимот

что

на

антител клона ЗДЗ яэлятоя коноормациониой.

Табл. 2. Изменения кочотант связывания коноклснзльных антигэл посла мопиОиквиии кортиколиПсрина дичтилпирркэрбонатом.

Клон Константа диссоциации, N

метод СригветЕ мэтод Стивенов

■"И? 1,1х10~9 —V 2,3x10

5С5 -9 2x10 3,9xlo""7

5. Сокргция кортиколиберин^ клотксми «ммуннсй системы.

Разработка вышеописаннего матопп определения концемтреичи кертиколиберииа пезэолила вплотную подойти к проЗлгмя определения тилеэ клиток, с « vp е тир у : < данный nenn-тц при различных иммусологичгоких неакцмях. 3 первую очередь была исследована сггрссЯносГ!. voKpeтрогать KOpTHKOwSepnti суммарной фракцией лейкоцитов паридьричяской кроаи человека, а тл>№.» нворакционирсваиными сплоноцигами миши э птват на кс»:сйнаьалч;5 А и липополионхарид клеточных отенок E.coli аопнгсгно с пекотрЕнсульоатсм. Кпк видно из рисунка 7 ойа агента ьиэывакт секреци,") кортикотропин - релизинг — »актера как лейкоцитами крсии чегагака, так и опленоцитзми мыши.

Из обоих клеточных суг.^-пг?ий легче всего отделить макрофаги и моноциты по их способности к адгаэии на пластиковые чайки Петри. Удаленно макрофагов из обоих клеточных суспензий никак нг? влияло нп синтез кортиколиберина. оставшимися клетками. Сами макрофаги и моноциты не секретироэалн данный релизинг - «актор ни и отгеет на вышеупомянутые стимулы, ни в ответ на ФорБопопый зйир! как сам по себе, так и совместно с кальциевым ионогером Д12307.

После разделения лимфоцитов и гранулоцитоэ как о градиенте "лимфопрэпа", так и а грздиснт(? перкола получаются сходные результаты] лимфоциты < хзк сагзмсстнса о макрофагами, так ч Btsrs лих ) аегкротируют кертикатронин — porv-гаинг — Сгяктор rt ответ но оЕп вышеупомянутых отимулп, тогда как гранулоциты н»2 оЗгопают

0 X 91 « 1 a 0 a ■c — a 0 в » в -t

в в S 1 i •4 £ » « S D X a 0

г • 0 a J 2 t) ц u X

■0 ч 5 Cl « в S и n ï s a n ' 0

б 3 ■ Э a X 0 H * n 0 Я e "0 я Si

-4 U 0 с s a a С 0. в s S'

5 .2 т a 0 s X 0 D! n s ■4 ^ 0 С

■в -6 J S • •o - в а X » H X 0 й

0 0 0 0 0 a С •< с 0 ■а : e 3

V » в • e в • 5 ■ 0 g < D

* 9 a> к s 0 0 О 0 £ a s D

■4 5 •о « -i a 0 а а В 0 0 ■i 0

? i в Ö 0 r а » 9 J: s Ч a а

» а s • X » » t t S" X X

с 0 Ci X 3 и a y a 0

X S 5 я * а С 0 V в s 0 с

« « а e н H X 3 e* ТЭ -í

о 0 a s X r 0 0 « и CI tr

а « • 0 В 1 If H 3 -i g X u s

5 s t X •t 4 а с V с 2Г X •

* а s « V 4 с a 0 в V s s с

о 0 0 в s a 0 a e X y. Q

s H -4 0 0 X s 0 0 s

í"fl < X ' 0 n ¡ 0 ч s d fc»

а 0 ■о 0 x a a Д CI о С S D a a «■ e s 3 ï? с G

"0 0 В 0 X в a m £

S s Z g я 0 X 0 ï E H -1

s < а a Ъ 0 С D p 0 ч 0 V X X

a № £ e S -i -I » e 0 T X , 0 0

в H 3 X л т 9 r a w 2 я 0 2 w

s и я S S s X № 3 3

s ф -< г ¡; p X- S rj IB

4 ■e В 0 ' X в 0 0 ТЭ £ ■4

в e о В e 0 x « я S e

•ч * X X D 0 я ■а о 15 £J 3 X С

9 ■i а a ■о ■ n S.! ч С К 1 i

EJ 0 •« S в s -4 i s

-) ч u S ' e « £

0 s f -4 ' s ■а » s a e X W

а a « К 0 У г> и а •п а е -i s: s в S 3 s

£ I» 1 •4 > 8 s н а 0 a

» S! 0 i ч tí с -t о S a ч ■9

Ы S s 2 с 0 1 -4 у г s 1 s 0 0 a H 0 s

ч я V ï 0 X <e

о (S » в m D 0 s c " Cl

а 1 в 0 X) w s X & X s

□ a X H iä H »

" 0 X X s s J ef X

• s s a Е e X 0 ^ 0 0

я S о a X £> ta С с с s X •4

•4 0 ■Ц в a •< s ■а E X s

3 s •4 CK £ ■о X s о ^ ч fil 3

V S « s E G » z e F e X 4

в £ -t тз 3 S SI X» •i a E a

1 g 1 ? t 8 х 8 a и s s en f! » S Ö ss X

С s ï с r о 0 я 0

S X S T a h* 0 "D

g. 3 л 0 a T Y V s t- я X В

концентрация кортиколкберина, 'Пг/ял / ItP клеток

f-f м

42 Ul t-н

Ol О о

i-t

го

w

СП

J3 X г 0 о H т з п •и *0 01 Cl

к! ~< в a >31 и s rp 13 13

* 0 ■а X a а a и a 7,

X я 0 a s 0 0 ч V S 0 ■а

а и -j и X ч ч ra à u 0 U

Z 0 ГЭ -< га a 3 Г s ч ц

0 g г a 13 и a a ч X 3 s

-- I а H 13 У а T 0 ■а б

a □ 3 « 0 ч 2 ч T; 0 у ч

ч т ■< a 33 s 0 s 0 Q »

X 0 X i я и та с t u s ч о

р D X X s и ■а Ü

э a £ о X и 1 И 2 X ?

X о Si X га -D а О 0

-4 '1 H £ X X я a к п

э Г 1 D X □ т X ^

т i X a S X а ч ■о £

Т1 .g О a <r 0 3 IS 0 X 5 ч

а X О □ * ■О 0 о 0 X) 4 0

в 4 □ т ч- <» x о в 0 5

0 S' 0 S s О О X

X 2 Si ^ и X и Si •о о

р а a 2 а W 3 0 ■а

"О з: T О ч -а ч n X a i

ч ñ •< s X Т5 X 0 ü s S

X ч 0 3 0 0 0 и * ^

X " 0 □ 0 s Я & Я и 0 s

0 ö ч 3 d X S о X X Ч !

■si Р •а s с 1 0 и ■о V

С и Si n 0 и 4 0 □ 0

0 s 0 G ra а s 0 ч 0 g

'j О x ч п s ' (Г 4 s

s Si s в TJ т ч a т. ч

X * 2 m 0 га a 1 Si i

Я a п TJ 2 S s w ■а

ы a s 0 0 I 3 3. ID П

m а ч » о 0 s E 0

s: ч и H a X 1 ч X ■3

а 0 ra * a 0 a 3 n

ч X tr 0 H п ■a U 4 о сл

ч U Cl я О 3 ч a 0 X a

s ^ ■a и и т □ 41 V ■ у

0 3 т a я a u i u х г Ö a » X a 0 X X в- Г) a Si

s SI 0 Г 0 ® I E s

X X "i 0 ® X р X X ч

"J г: г т а О 0 и

Л 0 i' 4 П a s s •а •о

ч 2» [Г ■а г Е 3 S ч . -<

т П 0 * S a ^ S

ií г; л х О » a Г s X 0 0

0 г X •о ч а SI 3

а jî з z. S' а га ra ч 3 ч ■3

у 0 а XI a ■а 0 ■■а а

4 ч 9 3 ч 0 a X s a 0 D с

Г а S □ s o Di CI 3 •< 3 ч а

a ч т. X 1 ч 3 X а X

t n a ■о 0 У г 2 X TJ

tí ' -- ч я S 2 0 о

a 0 3 с X X ч

э 3 а 0 £ s 5 5 а с Z сг

1 ч * * s Ii ji Si 1 о

И » X TJ

а » t J D s

X с- я a 0

п H Q

н i о m m

TI ■о ID

к мох

X a a m

0 0

•< X К

a •a S

ir a 2 n

о 3 S ,3

ч í •û

а r, a 15

S С

К X

» к

u M о

о 3 ç

i

те M fi

т w S

ч £

3 •J

a 1

u Q з;

V a §

и л Q

Я 4

M О a Й 'S ¥

J* s

F 2 ¿

о y

n X

4

■3

s 13

i a il

3 '3

□ 4 JÍ

.— -J ^

1 'ï • E

о 3 S

0

13 X

X —

X ■J -J

1 'J r.

X u

0 TJ

u

.1 a

о

конце»;

трация корткколиберинс

пг/мл / 2x10 клеток

•in о

О О

СО i

M

о

лимфоциты, е регулирующим »ту секрсиии отимулам Будет служить кортикотропин - рсли^инг — «гктор. Он Будет выявляться как Т— лииасцитами, так и Е- лимфоцитами в ответ на специфическую стимуляция данного типа хлаток, и Еупат отимуяировать сахрецим адрсноксртнкатропного гормона о первом онучиа по паракринному механизму < за счет тесного контакта Т—хеллеров о В-«ии«оцитс.ми >, ч во втором — го аутохрилному механизму ( В-яитацит озм сакретирует ко^гиколиборин и иэм несет рецаптср к нему ).

Выдвинутав гипотеза предполагает, что иммунная система может служить альтернати»сй гипоталпко - гипофиаарной, секретиру* кортиколмБории а откят на рпзличныя Отимулы клоточнаго отресаЕц г1 а кжтгки им.чунисй сиатемы.

Поокальку эти клетки широко ^вапроотрснекы по пэриверичйоким тканям, стимул, вызывании*! локальный клзточный стресс, Благодаря предполагаемому мвхамизму мог См вызывать откат в виде оВчего «иэиояогического огрссоа, что й.ллэ Бы затруднительна сданать., иопользуя только гияотоламп -гигто«изарну» систему. Таким образом, можно ожидать, что Т— и В- лимфоциты будут оекротироеать кортикопиВермн о отьот на различные факторы клеточного стрёсоа. В ход» раВеты Оыюэ показано, что как оум!&рна« фрккцчч лейкоцитов периферической крови чесозакг. •< рис.7 > и сгсяекаистов мыь.и, так и мг :г.окныв т- VI В— лимфоциты чепоь«!кя < ряю.С ), но ив »»кроааги и . но граиуяоциты, оОлацьмт оиооаБнсотьи оегротировзть кортикстропии - релизияг - диктор с огввг ча гиг.креолотичиость оируыг.ядай с? оды и на гипертермии, что яажюто* хорошим поитвг-'рмявниам предлагаемой гилотшзгы.

П&пьнвйииа исследования п:э ;;с<*у акции опкреции иослидусмсго пэптиде зкачмт(г»ьнс увовнве? проводить ип кпатачнмх пиниях, поскольку они оОладагст Бесгкоигчнь'м потенциалом делании и оВаспвчиг^ют Валящую стпндартипецки полученных результатов. Одявко иэосотно, что р»ог(роотрг,ясгн!:а« мияяомная линия 6р2/0 »ыраОатыьасзт аутокринньш «актеры роота, опоооОствукщис са проливврьции, и ьти «акторы могут олукить а ктиг^тср ьми оекрвцик кортикопиВеримв. Лини« Ср2/0 оЗлкнавт высокой ¿заяьиой актигнооть» продукции ксртикотрсяин — реливинг — «актора, тегде как макроваггэдъывя «иниь РЗШ Ц1 липам а

опособнооти овкретировать этот пептид как спонтанно, так и в ответ на различные стимулы. Эти наблюдения служат дополнительным подтверждением приведенных выше данных, полученных на овсжевыделенных лимфоцитах м оггленоцита.ч.

В результата провгденимх исоледований Выли получены клоны гиВрипом, секретирукшио монсклональные антитела к

кортиколибррииу человека. Они прошли несколько рекламирований в полужидком агаре, обеспечивающих моноклональнооть полученных колоний, причем выход специфичных колоний на последних этапах реклонированин составлял 100%. Подтверждением монокланальности секрвтируемых гиВридомоми антител является их- опосоБнооть реагировать только о кортикоЛиберииом в иммуноферментном анализе. В пользу предположения 0д моноклонгльнооти говорит также тот факт, что в выделенном препарате антител определяется о помощью специфических антиоывероток лишь один подкласс иммуноглобулинов. Наконец, еще одним доказательством моноклональнооти полученных антител является линейность г-ра сиког> Скэтч арпл, пг^троеных для определения констант связывания антител о чвлв!?вчеякин кортиколиВзрином! отсутствие перегибе» на этих графиках свяпизания антитела о антигеном означает наличие антител только о очной константой связывания.

Вышеописанные моиокленогьные онтитэла узнавали различные внтигенньяэ детерминанты на молекуле антигена. Таким образом, впервые была получена пара клонов гибридом, секретирующих антитела к разным эпитспам на молекуле кортиколиберимл. Константы связывания этих антител о кортиколиВерином оказались весьма высокими, что открывало возможность создания теот -системы для определения концентрации антигена сэндвич — вариантом ИФА. 05а клона гиБрияом секретировали антитела подклаоса '

Созданная на основе полученных антител имиуноферментная тест — сиотема позволяла определять кортиколиВерин а концентрации до ЗО пг/мл. Применение сэндвич-мотода ИФА позволило оЗойтиоь без использования меченного

ксртиколиБерина, что было неизбежно во всех созданных ранее теот — системах, так как все полученные по сих пор

моноклинальные антитела к кортиколиберину узнавали лишь одну антигенную детерминанту■

С помощью модификации лизиновь:х и гиотидиновых остатков остатков молекулы антигена, а также? экспериментов о блокировкой кортиколиберин — связьдвантим белком нормальной человеческой сыьпротки аз аиг-ю действии ентигена с антителом, было установлено, что антигенная детерминанта клина 4Н9 имеет оеквенациоиный характер и локализована Ни С—конце пептида, а клона 5П5 конеормационный характер.

Благодаря использовании! созданной теот — системы впервые Выло показано, что человеческие Т— и В— лимфоциты, ио не макроваги и не гранулоциты, обладают способность» оекретировать кортиколиОерин о откат на такив «акторы клеточного стресса, как гипертермии и гипероомотичнпоть среды, а такие на различные митогвнные отнмулы. Аналогичной способностью обладают мышиные опленоциты и клеточная линия БР2/0, но не РЗОЗД1. В качестве оЗ-тонания »того пзлдния выдвинута гипотеза, предполагающая параллельного

Функционирование иммунной и гипоталвмо — гипофизарной системы в секреции адрекокортиклтропиогс гормона: воли гиногакомо — гиповизарная система , в основном, отвечает на «изиологичеокий отреос, то иммунная — на клеточный.

выводи. •

1. Получено два клона мышиных гибридом, продуцируккцых моноклинальные антитала к кортиколиберину чкливекв! 4Н9 и ВДЗ.

2. Константа диссоциации моноклональных илтител 4Н9 с

—о

кортиколиберином ооотавляют 1x10 И; а антител 5ЕЗ — 1,5x10 8М. Оба клона антител принадлежат к попклассу 51.

3. На основа полученных моноклонвпьных антител разработана диагностическая иммуноегриентная теот — система для определения кортиколиберин» о чувствительность» 50 пг/мл.

4. Определена структура антигенных детерминант моноккональных антител на молекуле человеческого кортикоямОерина! для антител клони 4Н9 »то секвенационная детерминанта а локализацией на С-конце пептида, для антител ЗЯ5 — кон»орпациенная

детерминанта.

S. Обнаружена спосоВмооть человеческих Т— и В— лимфоцитов, а также спленоцитов мыши ов «ротировать кортиколийории в ответ на отимуляторы пролиферации и на «акторы клеточного отресса и предложена гипотеза, объясняющая функциональную роль обнаруженного явления.

Список раСст, опубликованных пгс теме диссертации. Î.V.A.Furàlyov, I.V.Kravchenko. The monoclonal antibodies to human corticoliberin and their prcporties. Symposium "Structure & function oi pegulator-y polypeptide's", M, 1992, Abstracts, p.19.

2.I.V.Kravchenko, V.A.Furolyov. Monoclonal antibodies directed against two different eorticotropin-releaeing -factor determinants.-Hybridoma, iWi, v. 13, No 1, p.59-64.

Подписало в лежать X,S, tX. 199Îr. Формат 60X81/16 Бум. офс. Пгчать офс.

Тираж too Заказ /Zt

МП «ПЕТИТ»

107564, Москва, Богатырский мост, !7. корп. 5