Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуногенные и иммуноадъювантные свойства вирусов гриппа с удаленным NS1 геном

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммуногенные и иммуноадъювантные свойства вирусов гриппа с удаленным NS1 геном"

На правах рукописи

ШУРЫГИНА Анна-Полина Сергеевна

ИММУНОГЕННЫЕ И ИММУНОАДЪЮВАНТНЫЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ ГРИППА С УДАЛЕННЫМ NS1 ГЕНОМ

(03.02.02 - Вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Л Г - - ^ ^

Санкт-Петербург - 2012

005016878

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, ведущий

научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития РФ Егоров Андрей Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, зам. директора по

научной работе, руководитель лаборатории гриппозных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития РФ Цыбалова Людмила Марковна

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела вирусологии им. акад. A.A. Смородинцева ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН Дешева Юлия Андреевна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский

государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «29» мая 2012 года в//час Р^мин. на заседании Диссертационного совета Д.001.043.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития России (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательского института гриппа» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «ж» апреля 2012 г.

Ученый секретарь ^ / кандидат медицинских наук Диссертационного совета_¿//^^_Суховецкая Вера Федотовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Грипп - одна из значимых причин заболеваемости и смертности у людей. Несмотря на наличие разнообразных противогриппозных вакцин, проблема предотвращения ежегодных эпидемий и пандемий гриппа остается нерешенной.

Эффективность вакцинации во многом определяется формированием полноценного иммунного ответа, обеспечивающего защиту от широкого спектра дрейф-вариантов вируса. Живые гриппозные вакцины (ЖГВ), вводимые интраназально, обладают более высокой профилактической эффективностью по сравнению с инактивированными вакцинами, так как наряду с выработкой сывороточных антител, обеспечивают формирование специфического клеточно-опосредованного ответа и стимуляцию продукции перекрестно-реагирующих секреторных иммуноглобулинов A (Gustin K.M. et al., 2011; Belshe R.B. et al., 2007). Однако используемые в настоящее время ЖГВ имеют ограничения в применении, связанные со способностью вакцинных штаммов к репликации в клетках носового эпителия (Mallory R.M., 2011).

Новым направлением в создании живых противогриппозных вакцин является разработка вакцинных препаратов на основе дефектных по репликации штаммов вируса гриппа с удаленной генетической последовательностью, кодирующей NS1 белок (ANSI). Многофункциональный NS1 белок - основной антагонист системы интерферонов I и III типов (ИФН-a/ß,X) - подавляет синтез мРНК клетки хозяина, блокирует активацию факторов транскрипции цитокинов, противодействует апоптозу зараженных клеток хозяина, способствуя полноценной вирусной репликации в ходе гриппозной инфекции (Hale В.G. et al., 2008).

Удаление гена NS1 приводит к неспособности вируса реплицироваться в ИФН-компетентных клетках и организмах (Egorov A. et al.,1998). В то же время, несмотря на отсутствие репликации, вакцинные ANS 1 штаммы вирусов гриппа достаточно иммуногенны и не требуют дополнительного использования адъювантов для достижения протективного иммунного ответа. ANSI вирусы гриппа активно распознаются рецепторами системы врожденного иммунитета (TLR, RLR, NLR) и вызывают повышенную продукцию цитокинов в месте аппликации вакцины («самоадьювантный эффект»). Кроме того, вирусы с удаленным NS1 геном, стимулируя продукцию биологически активного ИЛ-1 через активацию каспазы 1, могут способствовать образованию перекрестно-реагирующих иммуноглобулинов класса A (Stasakova J. et al. 2005; Ichinohe T., et al. 2009).

Данные, полученные в ходе доклинических исследований, показали, что при интраназальном введении ANSI вирусы гриппа А подтипа H INI вызывают локальную выработку широкого спектра провоспалительных цитокинов, хемокинов и интерферонов I типа и приводят к развитию выраженного гуморального и клеточного иммунного ответа (Ferko В. et. al., 2004). Безопасность и высокая иммуногенная активность дефектной по репликации вакцины на основе ANSI штамма вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99

(H1N1) были продемонстрированы при проведении первой фазы клинических исследований (Wacheck V. et al., 2010).

Настоящая работа направлена на получение экспериментальных и клинических данных, подтверждающих цитокиногенное действие и высокий иммуногенный потенциал ANS 1 вакцин на основе штаммов вирусов гриппа А и В. Проведена оценка иммуноадъювантных свойств ANSI штаммов вируса гриппа А при их сочетанном использовании с рекомбинантными белками стрептококков группы В.

Цель исследования состояла в изучении иммуногенных и иммуноадъювантных свойств штаммов вирусов гриппа А и В с удаленным NS1 геном.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать способность штаммов вирусов гриппа A (H5N1) и В с удаленным и интактным геном NS1 стимулировать продукцию цитокинов in vitro (в первичных культурах клеток носового эпителия и макрофагов человека).

2. Охарактеризовать репликативную активность и локальный цитокиновый ответ на вакцинацию штаммом вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном на модели макак-резус.

3. Оценить способность иммуннокомпетентных клеток (мононуклеаров периферической крови) людей различных возрастных групп вырабатывать провоспалительные цитокины в ответ на стимуляцию вирусом гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном.

4. Изучить иммунный ответ у здоровых добровольцев в возрасте 18-50 лет после двукратной интраназальной иммунизации кандидатом в вакцинные штаммы ANS1-H5N1 (А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном).

5. Изучить иммуноадъювантные свойства вирусов гриппа А с удаленным NS1 геном при сочетанной интраназальной вакцинации с рекомбинантными белками стрептококков группы В на модели мышей.

Научная новизна работы. Впервые дана оценка влияния удаления NS1 гена на способность штаммов вирусов гриппа А подтипа H5N1 и вирусов гриппа В вызывать продукцию провоспалительных цитокинов иммунокомпетентыми клетками и клетками носового эпителия человека. Охарактеризован местный ответ цитокинов на вакцинацию препаратом на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) на модели резус макак. Впервые проведен анализ способности мутантных вирусов гриппа с удаленным NS1 геном на примере штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) индуцировать выработку провоспалительных цитокинов иммунокомпетентными клетками новорожденных и пожилых людей. В рамках клинического исследования фазы I вакцинного препарата на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном, показано, что данный препарат индуцировал формирование противовирусного ответа, за счет активации факторов, как врожденного, так и адаптивного иммунитета при интраназальной вакцинации без применения адъювантов. Показана возможность применения штаммов вирусов гриппа с удаленным NS1 геном в качестве иммуноадъюванта при

интраназальной вакцинации рекомбинантными белками стрептококков группы В (СГВ).

Практическая значимость работы. Дана характеристика влияния делеций С-терминального домена NS1 гена вируса гриппа В на способность вируса ингибировать выработку провоспалительных цитокинов. Показана возможность комбинированной интраназальной вакцинации рекомбинантными белками стрептококков группы В (СГВ) и штаммами вирусов гриппа с удаленным NS1 геном для профилактики гриппа и заболеваний, вызываемых СГВ. Результаты, полученные в ходе проведенных доклинических исследований, использованы для проведения клинического исследования I фазы вакцинного препарата VN1203ANSI на основе штамма вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1). Основные положения, выносимые на защиту

1. Рекомбинантные штаммы вируса гриппа A(H5N1) с удаленным NS1 геном и вирусы гриппа В с различным уровнем делеций С-терминального домена белка NS1 не способны к репликации, но стимулируют выработку широкого спектра провоспалительных цитокинов в ИФН-компетентных системах in vitro, что подтверждает аттенуированный фенотип таких штаммов и определяет их «самоадъювантные» свойства.

2. Реализация «самоадъювантных» свойств вирусов гриппа с удаленным NS1 геном осуществляется за счет неспособности таких вирусов ингибировать локальную выработку провоспалительных цитокинов в месте аппликации. В ответ на однократное интраназальное введение макакам-резус вакцинного штамма вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) ANSI наблюдалось достоверное повышение уровней ИЛ-lß, ИФН-у, ФНО-а и ГМКСФ в носовых смывах животных.

3. Продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови (МПК), индуцированная вирусом гриппа с удаленным NS1 геном, имеет возрастные различия. МПК, выделенные из пуповинной крови, в ответ на стимуляцию ANS 1 вирусом вырабатывали ИФН-а и другие провоспалительные цитокины на уровне с МПК взрослых здоровых доноров, в то время как продукция цитокинов клетками пожилых людей была снижена.

4. При интраназальном введении здоровым взрослым добровольцам пандемическая вакцина ANS1-H5N1 способствует формированию, как местного, так и системного (гуморального и клеточно-опосредованного) иммунного ответа без применения адъювантов. Наибольший уровень иммунологической эффективности достигался при двукратном введении вакцины.

5. Вирусы гриппа с удаленным NS1 геном обладали иммуноадъювантными свойствами и способствовали развитию более выраженного и продолжительного иммунного ответа к белкам стрептококка группы В при сочетанной интраназальной иммунизации у мышей.

Личный вклад автора состоит в активном участии в планировании и самостоятельном проведении лабораторных исследований, статистической обработки и анализе полученных результатов. Клиническое исследование I

фазы проведено на базе ФГБУ «НИИ Гриппа» Минздравсоцразвития России совместно с AVIR Green Hills Biotechnology (Вена, Австрия) на основании Разрешения на проведение клинических исследований № 546 от 19 ноября 2008 г. Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Ряд исследований выполнен при участии сотрудников ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России и сотрудников лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН. Исследование на приматах проведено на базе Biotest Ltd (Чехия).

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на Ежегодной отчетной конференции по международному европейскому проекту «Fluvacc» (Вена, 2008 г.), на Международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения» (Санкт-Петербург, 2009 г), на VI Ежегодном Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 тезисов докладов. Принята к печати 1 статья в журнале, входящем в список ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 24 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 245 источников на русском и английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клетки и вирусы. В работе использовали культуру клеток Vero, адаптированную к росту в бессывороточной среде (Европейская Коллекция Клеточных Культур (ЕККК), получены из компании AVIR Green Hills Biotechnology, Австрия). В качестве модели ИФН-компетентных клеток были использованы первичные культуры носового эпителия (HNEC; Провитро), мононуклеарных клеток периферической крови (МПК), макрофагов человека и перевиваемая культура клеток А549 (ЕККК). МПК выделяли из цельной крови стандартным методом центрифугирования на фиколл-градиенте, либо с помощью сепарационных пробирок (BD Vacutainer СРТ). Изоляция CD14+ клеток осуществлялась методом иммуносорбции на колонках VARIOMACS (Mitenyi BiotecGmbH), согласно инструкции производителя. Вакцинные штаммы и реассортантные вирусы гриппа с интактным геном NS1, использованные в работе (таблица 1), были получены путем трансфекции клеток Vero из двунаправленных экспрессионных плазмид, кодирующих заданные геномные сегменты вируса гриппа (Pleshka S. et al., 1996; Hoffmann В. et al., 2000).

Рекомбинантные белки стрептококков группы В (СГВ). Рекомбинантные пептиды СГВ Р6, SSpBl, ScaAB и РВЗа были клонированы в системе

экспрессионных векторов pQE (QIAGEN, USA) с последующей очисткой с помощью аффинной хроматографии на Ni-сефарозе.

Инфекционную активность вирусов определяли методом предельных разведений. Титрование вируссодержащего материала проводили в культуре клеток Vero, титр вирусов рассчитывали по методу Рида и Менча (1938) и выражали в ^ТИД50 в мл. Титр бактерий в образцах легких и селезенок определяли, высевая десятикратные разведения тканевых гомогенатов на 5% кровяной агар. Расчет титра производили по методу Рида и Менча и выражали в КОЕ в мл.

Стимуляция клеток. Для анализа продукции цитокинов исследуемые вирусы вносили в первичные клеточные культуры (1*106 клеток/мл) с множественностью инфекции (т.о.i) 2. Супернатанты с клеток отбирались через 24 часа инкубации при 37°С и 5% С02. Для контроля вирусной репликации в макрофагах человека клетки (1*106/мл) заражали указанными вирусами (m.o.i 0,001- 0,0001) с добавлением трипсина (2 мкг/мл). Титр вирусов определяли в супернатантах клеток, собранных через 6, 24, 48, 72 часа после заражения путем титрования на клеточной культуре Vero.

Лабораторные животные. Исследования выполнены согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.2003). В работе были использованы самки мышей линии Balb/c в возрасте 6-8 недель (Питомник лабораторных животных «Столбовая», Московская область) и самцы и самки Резус макак (Macaca mulatto) в возрасте 2,5-4 года (Biotest Ltd., Чехия).

Иммунологические методы. Наличие антигемагглютинирующих антител в образцах сывороток крови определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием 0,5% куриных или 1% лошадиных эритроцитов. Иммуноферментный анализ (ИФА) применялся для выявления вирус-специфических антител классов IgG и IgA и антител к белкам СГВ в образцах сывороток и носовых секретов. Для выявления Н5-специфических антител использовали рекомбинантный гемагтлютинин вируса А/Вьетнам/1203/04 H5N1 (0,5 мкг/мл) и вторичные антитела козы к IgG или IgA человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Zymed). Антитела к белкам СГВ, в зависимости от эксперимента, выявляли с помощью антител козы к IgG, IgGl, IgG2a (Invitrogen) или IgA (Sigma) мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена. Клеточно-опосредованный иммунный ответ оценивался в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Для этого свежевыделенные МПК (5*105 клеток/мл) стимулировали вакцинным вирусом (m.o.i 1) при 37°С, 5%С02 в течение 5 дней. В качестве положительного контроля использовали фитогемагглютинин (ФГА 25 мкг/мл). За 24 часа до конца инкубации в клетки вносили радиоактивную метку (ЗН-тимидин). Захват ЗН-тимидина измеряли с помощью счетчика радиоактивных частиц MicroBeta TriLux 1450 (Perkin-Elmer).

Специфическую активность цитотоксических лимфоцитов оценивали с помощью определения ИФН-у и Гранзим B-продуцирующих CD8+ Т-клеток

методом иммуноферментного бляшкообразования (ELISPOT). Планшеты покрывали антителами к ИФН-у человека 5мкг/мл клон md-1; BioLegend) или антителами к Гранзиму В человека (15 мкг/мл, клон GB10; MabTech). Для стимуляции клеток использовался синтетический пептид GILGFVFTL (10 мкМ; ThinkPeptides), соответствующий MHC/HLA классу I А02-ограниченного иммунодоминантного эпитопа цитотоксических Т-лимфоцитов консервативного участка Ml белка вируса гриппа A (Ml 59-67). В качестве позитивного контроля клетки стимулировали ФГА (0.5 мкг/мл; Sigma). В качестве негативного контроля использовали неродственный вирусу гриппа А02 -ограниченный эпитоп ILKEPVHGV HIV-1 RT белка (ЮмкМ; ThinkPeptides), а также культуральную среду. Учет «бляшек» был произведен с помощью препаровальной лупы. Определение MHC/HLA класса осуществлялось методом проточной цитометрии. Для этого клетки инкубировали 1 ч при 4°С с РЕ-меченными антителами (Anti-HLA-DR, BD). Анализ результатов проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD). Анализ продукции цитокинов в клеточных супернатантах и назальных секретах осуществляли посредством использования стандартных тест систем ИФА и мульти-плекс систем (Luminex, Bio-Rad или Beadlyte), согласно инструкции производителя.

Таблица 1

Состав генома вирусных реассортантов, использованных в исследовании

Вирус НА hNA РВ1 М РВ2,РА, NP, NS

IVR-116 А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) А/Техас/1/77 (H3N2) А/Пуэрто-Рико/8/34 А/Пуэрто-Рико/8/34

А/Вьетнам/1203/04 (6:2) А/Вьетнам/1203/ 04 А/Техас/1/77 (H3N2) А/Пуэрто-Рико/8/34 А/Пуэрто-Рико/8/34

А/Вьетнам/1203/04 А/Вьетнам/1203/ А/Техас/1/77 А/Вьетнам/1203 А/Пуэрто-

(5:3) 04 (H3N2) /04 Рико/8/34

А/Гонконг/156/03 А/Гонконг/156/03 А/Техас/1/77 (H3N2) А/Пуэрто-Рико/8/34 А/Пуэрто-Рико/8/34

А/Гонконг/213/03 А/Гонконг/213/03 А/Техас/1/77 (H3N2) А/Пуэрто-Рико/8/34 А/Пуэрто-Рико/8/34

В/Тюрингия/02/06 (6:2) В/Тюрингия/02/06 В/Вена/33/06 В/Вена/33/06 В/Вена/33/0 6

А/курица/Курган/5/0 5 (6:2) А/курица/Курган/ 5/05 А/Техас/1/77 (H3N2) А/Пуэрто-Рико/8/34 А/Пуэрто-Рико/8/34

Статистическую обработку данных проводили с помощью тестов непараметрических критериев Манна-Уитни, парного t-теста, точного критерия Фишера с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5.0 для Windows. Для представления полученных данных использовали такие показатели описательной статистики, как среднегеометрические титры (СГТ) и ошибка среднего (О.С.).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Роль NS1 белка вирусов гриппа в развитии цитокинового ответа in vitro и in vivo

1.1 Индукция цитокинового ответа и репликативная активность вирусов гриппа А подтипа H5N1 с удаленным и полноразмерным геном NS1

Ранее на модели вируса гриппа А/Пуэрто-Рико/8/34 (PR8) было показано, что вирусы гриппа А подтипа H1N1 подавляют выработку интерферонов за счет функции NS1 белка (Egorov et al., 1998; Garcia-Sastre et al., 1998). Удаление геномной последовательности, кодирующей данный белок, приводит аттенуации вирусов. Показано, что ANSI вирусы гриппа не только теряют способность противодействовать первичному противовирусному ответу хозяина, но также являются мощными индукторами ИФН и других провоспалительных цитокинов (Stasakova et al., 2005). В связи с тем, что функции NS1 белка во многом типо- и штаммо- специфичны (Haie et al. 2008), требуется экспериментальное изучение последствий удаления гена NS1 для различных штаммов вируса гриппа. Отдельный интерес представляет изучение влияния удаления NS1 гена на свойства штаммов вируса гриппа подтипа H5N1, известных своей способностью вызывать высокую летальность у людей за счет развития в нижних отделах респираторного тракта, так называемого, «цитокинового шторма» на фоне повышенной устойчивости к действию противовирусных цитокинов (Cheung et al., 2002).

В качестве модельных вирусов были выбраны высоко патогенные вирусы гриппа птиц подтипа H5N1 А/Вьетнам/1203/04, А/Гонконг/156/03 и А/Гонконг/213/03, выделенные от человека. На основе данных штаммов и вакцинного штамма IVR-116 с помощью методов обратной генетики были сконструированы вирусы с интактным (wtNS) и удаленным геном NSl(ANSl) (таблица 1). Дополнительным фактором аттенуации в исследуемых штаммах являлась замена полиосновного сайта расщепления НА RERRRKKR/GLF, характерного для высокопатогенных вирусов гриппа птиц H5N1, на трипсинозависимую последовательность TETR/GLF, типичную для непатогенных Н5 вирусов (Horimoto et al., 2006).

Показано, что уровни ИФН-а и других провоспалительных цитокинов, которые индуцировал штамм VN1203wtNS в первичной культуре макрофагов человека, были сравнимы с уровнем цитокинов, вырабатываемых в ответ на стимуляцию вакцинным вирусом IVR-116 (H1N1) (рис. 1). При этом, оба вируса были способны реплицироваться в макрофагах, достигая титров до 10б ТИД50/мл.

Вирус VN1203ANS1 не обладал способностью к росту в культуре макрофагов человека и при этом вызывал продукцию значительно более высоких уровней цитокинов, чем вирус с интактным геном NS1 (VN1203wtNSl): кратность прироста ИФН-а, ФНО-а, ИЛ-1р и ИЛ-6 составила 7,6, 7,9, 7,3 и 2,5 соответственно (рис.1).

Аналогичные результаты были получены и для двух других вирусных реассортантов, созданных на основе штаммов вируса гриппа птиц А/Гонконг/156/03 и А/Гонконг/213/03. Удаление последовательности,

кодирующей NS1 белок, приводило к неспособности данных вирусов размножаться в ИФН-компетентых системах при высоком цитокиногенном потенциале (таблица 2). Представленные данные подтверждают атгенуированный фенотип ANSI вирусов гриппа подтипа H5N1 и их способность индуцировать факторы врожденного иммунитета в культуре ИФН-компетентных клеток.

ИФН-а

120 100

■I 60 -j

m п

IVR-116 VN1203 wt NSI VN1203 ANSI

ил-ip

120 100 -80

4 so ¡é

C 40

20

IVR-116 VN1203 wt NSI VN1203 4NS1

ФНО-а

2000

1500

■§ 1000

500 0

ИЛ-6

1000 800 600 400 200 0

IVR-116 VN1203 wt NSI VN1203 ANSI

IVR-116 VN1203 wt NSI VN1203 ÛNS1

Рис.1. Индукция цитокинового ответа в первичной культуре макрофагов человека вирусами гриппа А подтипа H1N1 и H5N1. Продукция цитокинов макрофагами человека в ответ на вирусную стимуляцию (по данным ИФА (ИФН- а) и мульти-плекс системы Beadlyte Human Multi-Cytokine Detection System (ИЛ-ip, ИФН-у и ФНО-а)). Эксперимент был проведен в грех повторах, на рисунке представлены результаты одного репрезентативного эксперимента. (Данные представлены как среднее трех измерений концентрации цитокинов в пкг/мл за вычетом базовой продукции ± О.С.);

В отдельном эксперименте исследовали способность высоко патогенного вируса гриппа А/курица/Курган/5/05 (H5N1) индуцировать выработку ИФН-а в первичной культуре мононуклеаров периферической крови (МПК) человека. Обнаружено, что вирус гриппа А/курица/Курган/5/05 «дикого» типа не ингибировал выработку ИФН-а, при этом удаление гена NS1 не приводило к увеличению продукции клетками данного цитокина. Уровень индуцируемого ИФН-а оставался высоким и в случае стимуляции клеток рекомбинантым штаммом (6:2 реассортант), в котором НА с удаленным полиосновным сайтом расщепления и NA были унаследованы от вируса гриппа

А/курица/Курган/5/05, а остальные гены - от вакцинного штамма вируса

гриппа AIVR-116, независимо от наличия или отсутствия гена NS1 (таблица 2). Несмотря на фенотипические особенности вируса гриппа А/курицаУКурган/5/05 «дикого» типа, его ÀNS1 6:2 реассортант, сконструированный на основе штамма IVR-116, дефектен по репликации в ИФН-компетентных системах и может быть использован в качестве вакцинного штамма (Романовская-Романько, 2011).

Анализ выработки ИФН-а иммунокомпетентными клетками человека в ответ на стимуляцию различными штаммами вируса гриппа A/H5N1 показал, что поверхностные гликопротеины вируса могут играть определенную роль в индукции цитокинового ответа.

Таблица 2

Индукция №N-0 и репликация вирусов гриппа в первичной культуре иммунокомпетентных клеток человека.

Состав генома * NS1 ИФН-а (пкг/мл)** Кратность прироста*** Рост в культуре макрофагов LgCnmSO/M)" »*

Вирусы гриппа А H1N1 А/Пуэрто-Рико/8/34 f wtNsi : , 17 : ; - ■■■'.-■ 4.3S

- ANSI 205 12,1 < 1,5

IVR-116f 6:2 wlNSI 16 ' . 6.0

6:2 ANS! 153 9,5 < 1,5

H5N1 А/Вьетнам/1203/04 f 6:2 wlNSl 16 » ^ ■ 5,8

6:2 ANSI 109 6,8 < 1,5

5:3 ANSI 121 7,6 < 1,5

H5N1 А/Гонконг/156/03 t 6:2 wlNSI i 21 5.0 ;

6:2 ANSI 139 6,6 < 1,5

А/Гонконг/213/03 t 6:2 wlNSi 15 4.5 .

6:2 ANSI 124 8,3 < 1,5

H5N1 Л/курица'Курган/5/05 tt . . - wtNSI 156 - ^ . н . 'о

- ANSI 150 1,0 н/о

6:2 wlNSl 135 0,9 н/о

6:2 ANSI 131 0,8 н/о

Вирусы гриппа В - В/Тюрингия/02/061 6:2 wtNSt 35 - : ■ 6,0

6:2 A14NS) 436 12,5 < 1,5

6:2 A38NS1 348 9,9 < 1,5

6:2 A80NS1 390 11,1 <1,5

В таблице представлены данные четырех независимых экспериментов, каждый эксперимент проведен в трех повторах. Для каждого эксперимента приведены данные одного репрезентативного опыта. * см. Таблицу 1

** По данным ИФА. Данные представлены как среднее трех измерений ИФН-а (пкг/мл) *** х-кратный прирост рассчитывался по отношению к исходному вирусу с интактным NSI геном в каждом эксперименте отдельно (отмечено серым)

**** По данным титрования методом предельных разведений (ТИД50) в культуре клеток Vero. Титры вирусов выражены как lg ТИДы'мл; Предел титрования 1,5 lg ТИД50/Ш f- эксперимент выполнен в первичной культуре макрофагов человека ff -эксперимент выполнен на мононуклеарных клетках периферической крови человека н/о- не определяли

Неспособность высоко патогенных вирусов гриппа А подтипа H5N1 ингибировать факторы врожденного иммунитета в клетках человека независимо от наличия или отсутствия гена NS1, показанная нами для вируса

гриппа А/курица/Курган/5/05 «дикого» типа, вероятно, может являться одной из причин, ограничивающих трансмиссивность вирусов гриппа данного подтипа в человеческой популяции.

1.2 Удаление функциональных доменов карбоксильной части белка NS1 вируса гриппа В ассоциируется с потерей способности вируса подавлять противовирусный цитокиновый ответ

Основной функцией NS1 белка вирусов гриппа В, так же как у вирусов гриппа А, является антагонизм противовирусному ответу клетки-хозяина, однако конкретные механизмы его действия неизвестны.

Рис. 2. Индукция цитокинового ответа в первичной культуре макрофагов (■) и первичной культуре носового эпителия человека (□) вирусами гриппа В с различной длинной гена NS1 (по данным ИФА (ИФН- а (макрофаги) и ИФН-Р (HNEC)) и мульти-плекс системы Beadlyte Human Multi-Cytokine Detection System (ИЛ-1(3, ИФН-у и ФНО-а)). Эксперимент был проведен в трех повторах, на рисунке представлены результаты одного репрезентативного эксперимента. Данные представлены как среднее трех измерений концентрации цитокинов в пкг/мл за вычетом базовой продукции ± О.С.

Для того, чтобы определить роль белка NS1 вирусов гриппа В в регуляции противовирусного цитокинового ответа, в данной работе изучалась способность рекомбинантных вирусов гриппа В индуцировать выработку ИФН-а/р, a также таких провоспалительных цитокинов как ФНО-а, ИЛ-1-p и ИЛ-6 в культуре семидневных макрофагов и первичной культуре клеток носового эпителия человека. В качестве модельного вируса использовали штамм вируса

гриппа В/Тюрингия/02/06 с различным уровнем делеций гена NS1 (Thür А80, Thür A3 8 и Thür А14) или полноразмерным NS1 геном (Thür wtNS).

Исследуемый вирус гриппа В с полноразмерным геном NS1 в значительной степени ингибировал выработку ИФН-a/ß, равно как и выработку ФНО-а, ИЛ-1-ß и ИЛ-6, в то время как все вирусы с укороченным геном NS1 индуцировали высокий уровень продукции цитокинов как в культуре макрофагов, так и в клетках носового эпителия (рис.2).

Несмотря на то, что вирус Thür Д80 частично сохранял способность к репликации в ИФН-компетентных клетках (А549), было показано, что первые 80 ак белка NS1 не способны блокировать активацию ИФН и других провоспалительных цитокинов. Таким образом, можно заключить, что делеции С-терминального домена белка NS1 вируса гриппа В приводят к потере его способности ингибировать продукцию ИФН и других провоспалительных цитокинов в культуре макрофагов и первичной культуре клеток носового эпителия человека.

Представленные данные дают основание полагать, что NS1 белок вирусов гриппа В, также как и вирусов гриппа А человека, подавляет факторы врожденного иммунитета. Таким образом, аттенуация вирусов гриппа за счет удаления гена NS1 применима и для вирусов гриппа типа В.

1.3 Локальный цитокиновый ответ на вакцинацию рекомбинантным вирусом гриппа с удаленным геном NS1 на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) (VN1203ANSI) на модели макак-резус

Оценка локального цитокинового ответа на вакцинацию рекомбинантным вирусом гриппа с удаленным геном NS1 на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) (VN1203ANS1) in vivo была проведена на модели резус макак (Macaca mulatto), поскольку известно, что низшие приматы являются адекватной моделью для изучения патогенеза вируса гриппа A/H5N1 (Rimmelzwaati et al., 2001; Fan et al., 2009).

Мы показали, что однократная иммунизация штаммом вируса гриппа VN1203ANSI не приводит к развитию у макак-резус каких-либо клинических симптомов, лихорадки, респираторных и/или неврологических расстройств. Отсутствие вирусовыделения вакцинного штамма VN1203ANSI из назальных смывов на 48 и 96 часов после иммунизации подтверждает аттенуированный фенотип исследуемого вируса. Несмотря на то, что вирусной репликации не наблюдалось, вакцинный вирус был способен индуцировать повышенный уровень ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-4, ИЛ-12р70, ИФН-у, ФНО-а и ГМ КСФ, в назальных секретах, собранных на 48 ч после иммунизации. При этом, для ИЛ-lß (р=0,05), ИФН-у (р=0,03), ФНО-а (р=0,049), и ГМ КСФ (р=0,02) данное повышение было статистически значимым (рис. 3). Спектр цитокинов, вырабатываемый у макак в месте аппликации вакцины, указывает на то, что в противовирусный иммунный ответ на вирус гриппа с удаленным геном NS1 вовлечены как клетки носового эпителия, так и иммунокомпетентные клетки. Следует отметить, что локальный цитокиновый ответ у макак-резус на вирус VN1203ANSI имеет значительное сходство с локальным цитокиновым ответом на инфекцию вирусом гриппа «дикого» типа у людей (Hayden, F. G. et al., 1998).

200- Г 9,0342 р=0 0215 40- О

150- Д О 30- о

лкг/мл 100- р=0,04Э6 О А д д ♦ О я □ пкг/мл 20- t р=0,05 | О Д Aär о а ■ □ о о

50- • ® о А А д ♦♦♦ о па а 10- • о »— о А д А ♦ О _ о □ □ д о

до после ФНО^а до после ИФНтГ до после ПМКСФ до после ШЬВ До После До После До После До После До После До После ИП-1р И1ЬЙ ИЛ-12р70 ИП-2 ИЯ-4 ШЫО

Рис. 3. Уровни цитокинов в носовых смывах макак-резус (по данным мультиплекс системы Beadlyte Human Multi-Cytokine Detection System 2). Черными символами обозначены индивидуальные концентрации цитокинов до иммунизации, индивидуальные концентрации цитокинов через 48 часов после иммунизации представлены белыми символами. Горизонтальные линии обозначают среднее значение для группы из 4-х животных, р < 0,05 (парный критерий Стьюдента).

2. Вирус-индуцированная продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови, полученными от людей различных возрастных групп

Для оценки способности иммунокомпетентных клеток, полученных от доноров различных возрастных групп, реагировать на стимуляцию рекомбинантными вирусами гриппа с удаленным NS1 геном была проанализирована продукция ИФН-а, a также ИФН-у, ИЛ-lß и ФНО-а мононуклеарами периферической крови (МПК) в ответ на стимуляцию вакцинным штаммом VN1203ANSI. Уровень цитокинов оценивали в супернатантах клеток, собранных через 24 ч после стимуляции с использованием ИФА (ИФН-а) либо мульти-плекс тест системы (ИФН-у, ИЛ-lß и ФНО-а). Согласно полученным результатам, клетки доноров всех возрастных групп были способны вырабатывать ИФН-а в ответ на стимуляцию вирусом VN1203ANS1. При этом, во всех группах наблюдалась значительная вариабельность ИФН-а ответа, что может быть связано с индивидуальными особенностями (конституцией) донора (Katschinski, Neustock et al. 1994). Несмотря на данные о функциональной незрелости иммунокомпетентных клеток новорожденных (Neustock, Kruse et al. 1993; Danis, George et al. 2008), наши наблюдения показали, что мононуклеары, выделенные из пуповинной крови, при стимуляции вирусом VN1203ANSI синтезируют ИФН-а и другие провоспалительные цитокины на уровне, сравнимом с клетками взрослых [р=0,23(ИФН-а), р=0,95 (ИЛ-lß) р=0,33 (ИФН-у) и р=0,51 (ФНО-а) достоверное различие при р<0,05]. ИФН-а ответ МПК пожилых людей в данном случае также не был значительно ниже ИФН-а ответа взрослых доноров (р=0,54), в то время как продукция ИФН-у, ИЛ-lß и ФНО-а, мононуклеарами пожилых доноров была достоверно снижена по сравнению с клетками взрослых [р=0,0003 (ИЛ-lß) р=0,0003 (ИФН-у) и р=0,022 (ФНО-а) достоверное различие при р<0,05] (рис. 4).

Вопрос о том, насколько данная тенденция к пониженной продукции провоспалительных цитокинов в ответ на иммунизацию вакцинным вирусом ANS1 у пожилых будет оказывать влияние на развитие адаптивного иммунного ответа, требует дальнейшего изучения. В то же время, способность клеток пуповинной крови новорожденных к полноценной продукции ИФН-а и других провоспалительных цитокинов создает теоретическую предпосылку безопасного применения вакцинных препаратов на основе ANSI штаммов вирусов гриппа у детей, в том числе раннего возраста.

1000-

800-

1 600- • • •

400- L

С

200- • • •

ИФН-а

, р=0,54

23-35 г 65 Возраст, лет

250200150100' 500'

ИФН-у

р=0,0003

S

lik

О 23-35 г 65 к Возраст, лет

2000-

ФНО-а

р-0,0022,

г-

23-35 г 65 к Возраст, лет

4000-1 3000-

"I 2000-

х с

1000-о-

илир

О 23-35 г 65 к Возраст, лет

Рис. 4. Индукция ИФН-а, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-1 в ответ на стимуляцию мононуклеаров периферической крови в различных возрастных группах (по данным ИФА (ИФН- а) и мульти-плекс системы Beadlyte Human Multi-Cytokine Detection System (ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-1(3)). Индивидуальные концентрации, выраженные в пкг/мл, представлены отдельными символами; горизонтальные линии обозначают среднее ± ошибка среднего для каждой группы. Р< 0,05 (критерий Манна-Уитни). К- базовый уровень продукции ИФН-а в клетках без стимуляции.

3. Вакцинный препарат на основе штамма вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным геном NS1 безопасен при интраназальном введении здоровым взрослым добровольцам и способствует образованию противовирусного иммунного ответа без применения адъювантов

Согласно протоколу исследования (двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование 1 фазы) 36 здоровых добровольцев мужского и

женского пола, в возрасте от 18 до 50 лет с титрами специфических антител к вирусам гриппа A/H5N1 и A/H1N1 <1:10 были рандомизированы в соотношении 2:1 в группы, получивших вакцину (два уровня дозы: 6.8 lg и 7.5 lg ТИДзо/доза) или плацебо двукратно с интервалом 28 дней.

3.1 Безопасность. В ходе исследования отмечена хорошая переносимость вакцинного препарата на основе рекомбинантного вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным геном NSI (ANS1-H5N1) при двукратном интраназальном введении. Важным аспектом безопасности живых гриппозных вакцин является их потенциальная способность к репродукции в респираторном тракте вакцинированных с последующим вирусовыделением и трансмиссией. В данном исследовании вирусовыделения ни на одном сроке (2-й, 3-й и 4-й день исследования) после вакцинации отмечено не было, что подтверждает дефектный по репродукции фенотип вакцины и ее безопасность.

3.2 Иммуногенность. У всех привитых добровольцев было отмечено формирование местного и системного иммунного ответа. Местное цитокиногенное действие дефектного по репликации вакцинного штамма ANS1-H5N1 оценивалось в образцах назальных секретов в группе, получившей низкую дозу вакцины в сравнении с группой, получившей плацебо, путем измерения концентраций ИЛ-lß в динамике (до иммунизации и через 12, 24 и 48 часов) (рис.5).

Рис. 5. Уровни ИЛ-lß в назальных секретах добровольцев (по данным мультиплекс системы (Luminex, Bio-Rad)). Индивидуальные концентрации ИЛ-lß в группе плацебо представлены отдельными белыми символами, в исследуемой группе (ANS1-H5N1)- черными. Горизонтальные линии обозначают среднее значение. р< 0,05 (критерий Манна-Уитни).

В образцах назальных секретов в группе, получившей вакцину, наблюдался подъем уровня ИЛ-1(3 как по сравнению с базовым уровнем до вакцинации (ДК81-Н5Ш 0: среднее 223,6 пкг/мл, медиана 125,4 пкг/мл), так и по сравнению с группой плацебо. Через 12 часов после вакцинации в группе плацебо отмечался незначительный подъем уровня ИЛ-1Р (Плацебо 12: среднее 284,2 пкг/мл, медиана 351,8 пкг/мл), но уже к 24 часам после вакцинации снижался до исходного уровня (Плацебо 24: среднее 144,3 пкг/мл, медиана 133,5 пкг/мл; Плацебо 0: среднее 160,0 пкг/мл, медиана 129,7 пкг/мл). Максимальные концентрации ИЛ-1(3 в группе, получивших вакцину, отмечались через 12 (ДЫ81-Н5Ш 12: среднее 449,6 пкг/мл, медиана 369,2 пкг/мл) и 24 (Д^1-Н5Ш 24: среднее 394,4 пкг/мл, медиана 387,5 пкг/мл) часов

1500-, и лир

р=0,0062

«0.0379

пкг/мл •

500- О -о к —

0 12 24 Плацебо 48 0 12 24 ANS-H5N1 48

после иммунизации с постепенным снижением к 48 (ДЫ81-Н5М1 48: среднее 278,2 пкг/мл, медиана 240,4 пкг/мл) часам.

Согласно данным доклинических экспериментов, повышение уровня ИЛ-1(3 в ответ на аппликацию вакцинного вируса коррелировало с повышением уровня других провоспалительных цитокинов, что позволило считать ИЛ-1(3 репрезентативным цитокином для демонстрации цитокинового ответа на вакцинацию исследуемым препаратом. Кроме того, известно, что продукция биологически активного ИЛ-1(3 способствует образованию секреторных 1§Д (¡сЫпоЬе Т., с! а1. 2009). Однако, в ходе данного исследования, прямой корреляции между повышением уровня ИЛ-1(3 в назальных секретах после вакцинации и образованием секреторных 1§А, отмечено не было.

Таблица 3

Уровень сероконверсий после однократной и двукратной вакцинации пандемической Н5Ж ДЫЭ гриппозной вакцины.

Доза РТГА Секреторные Сывороточные Иммунный ответ,

вакцинного % зарегистрированный

препарата (ИФА), % (ИФА),% хотя бы в одном

(кол-во исследовании

лиц) 29-й 57-й 29-й 57-й 29-й 57-й 29-й 57-й

день день день день день день день день

6,8 18

ТИД50/мл 41,7* 91,7* 0,0 45,5* 0,0 60,0* 66,7* 100,0*

(п=12)

7,5 \%

ТИД50/МЛ 75,0* 91,7* 18,2 45,5* 20,0 50,0* 91,7* 100,0*

(п=12)

Плацебо 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

(п=12)

*р<0,05 при сравнении с группой плацебо (точный критерий Фишера).

После однократного введения ДЫ81-Н5Ш вакцины по данным РТГА в группе низкой дозы (6,8 1% ТИД50/доза) наблюдался 2-х кратный прирост СГТ антител, а в группе вакцинированных высокой дозой (7.5 ^ ТИД50/доза) был отмечен 5-кратный прирост. После двух иммунизаций кратность нарастания антител составила 8 и 9,5 в группе низкого и высокого уровня дозы, соответственно. Процент лиц в группе высокой дозы вакцины с защитным титром > 40 (серопротекция) составил 75% после первой и 83% после второй вакцинации. В группе низкой дозы вакцины серопротективные титры антител были достигнуты только после второй вакцинации и наблюдались у 75% привитых. К 57 дню исследования (после второй вакцинации) уровень сероконверсий достиг 92% в обеих группах (таблица 3). Уровень сероконверсий секреторных был выше при двукратной вакцинации (46% для каждой дозы), чем после однократной вакцинации (0% при введении низкой дозы, 18% при введении высокой дозы).

Оценка вирус-специфического клеточно-опосредованного иммунного ответа в группе низкой дозы проводилось в реакции басттрансформации

лимфоцитов (РБТЛ); в группе высокой дозы у МНС/НЬА класс I А02 аллель позитивных добровольцев измеряли активность ИФН-у и Гранзим-В (Огапгуте В) продуцирующих СБ8+ Т-клеток методом иммуноферментного бляшкообразования (ЕЫВРОТ).

Рис. 6. Клеточно-опосредованный иммунный ответ на иммунизацию

А 15-1 ,_риктл_| \NS1-H5N1 вакциной. (А)

° Пролиферативная активность Т-

5 клеток добровольцев исследуемой

| 10-

I о группы, получившем низкую дозу

| °0 °0о вакцины (по данным РБТЛ) выражена

о о ° через индексы стимуляции (И С).

| —— _° Индивидуальные ИС представлены

8? о . о0° о отдельными символами.

о ^ 0 Од °0° 8 °

о-1—°--г-2,-?— Горизонтальные линии обозначают

До День 7 День 29 День 35 День 57

среднее. Р < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

(Б) ИФН-у и Гранзим В Б ИФН-у Гранзим в продуцирующие СЭ8+ Т-клетки

104 • добровольцев исследуемой группы,

получившей высокую дозу вакцины

1 —(по данным ЕЬКРОТ). Данные

II _ выражены через ^ кратности

|| 0о".°о° прироста ИФН-у/Гранзим В-

ц —г~ "г- * секретирующих Т-клеток/ 1x106

£с оо • -_- __• г

3' о мононуклеаров периферической крови

Ш X ООО •

3 .о по сравнению с базовым уровнем.

Индивидуальные значения кратности „,1 прироста в группе плацебо

"Г^Г 57 ™?57 " представлены отдельными белыми

символами, в контрольной группе (ДЫ81-Н5Ш) - черными. Горизонтальные линии обозначают _ среднее.

По данным РБТЛ (рис. 6А), средний уровень индексов стимуляции (ИС) повысился по сравнению с исходным (1,5) до 4,0 после первой иммунизации (день 29), и до 5,5 после второй иммунизации (день 57). В отличие от группы, получившей вакцину, в группе плацебо на протяжении всего исследования повышения ИС по сравнению с исходным уровнем отмечено не было.

ЕЫБРОТ анализ включал в себя результаты, полученные для 5 добровольцев исследуемой группы и 4-х добровольцев из группы плацебо. У трех из пяти добровольцев, получивших высокую дозу вакцины, через 4 недели после вакцинации (день 29) наблюдалось > 3- кратное повышение Гранзим В-секретирующих СЭ8+ Т-клеток/ 1х106 МПК по сравнению с базовым уровнем. Повышение количества Гранзим В-секретирующих С08+ Т-клеток сохранялось и после второй вакцинации (день 57), в то время как увеличения количества

А 15- р =0,0279

О

О О

10- О

О О

Е 1 5- О ° оо° °о о°

оо° 0

-Аг Ла» о по О о

До День 7 День 29 День 35 День 57

Б I т 1 10- ИФН-у Гранзим В /

11 о • о о • ° о°

° ОО *• - °

Ш X о ООО •

• о

День 29 День 57 День 29 День 57 Плацебо ДЫ$1-Н5Ж День 29 День 57 День 29 День 57 Плацебо Д№1-Н5№

IFN"7 секретирующих CD8+ Т-клеток отмечено не было ни после первой, ни после второй вакцинации (рис. 6Б).

Таким образом, данные, полученные в ходе клинического исследования, указывают на то, что вакцинный вирус на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном при интраназальном введении здоровым взрослым добровольцам безопасен, не вызывает образования вирусного потомства и способствует формированию как местного, так и системного (гуморального и клеточно-опосредованного) противовирусного иммунного ответа без применения адъювантов.

4. Иммуноадъювантные свойства вирусов с удаленным NS1 геном

Способность вирусов с удаленным NS1 геном провоцировать локальную выработку широкого спектра цитокинов и хемокинов определяет их иммуноадъювантные свойства. В настоящей работе мы изучили адъювантные свойства вакцинного штамма гриппа A (H1N1) с удаленным геном NS1 при сочетанном интраназальном введении с белками СГВ.

Животным, 10 мышей/группа, двукратно (день 0, день 21) под легким эфирным наркозом интраназально в объеме 0,05 мкл вводилась либо полипептиды СГВ, либо ANS1-H1N1 вакцина (6,0 lg ТИД50/мл/животное) отдельно, либо их комбинация. Контрольной группе животных вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Образцы сывороток крови собирали из нижнечелюстной вены на 21 день (до второй иммунизации) и на 35 и 42 день исследования. Сывороточные антитела к белкам СГВ определяли методом ИФА. На 43 день все животные были заражены сублетальной дозой контрольного вируса гриппа (В/Тюрингия 6:2 wt 5,0 lg ТИД50/мл/животное), а через 24 часа (день 44), всем животным интраназально были введены СГВ (I Ьс серотип) в дозе 8,3 lg КОЕ/животное. Через 5 и 24 часа после бактериального заражения производили забор легких и селезенок. Вирусную нагрузку определяли в 10% (w/V) гомогенатах легких методом предельных разведений на клетках Vero. Титр бактерий в легких и селезенках определяли, высевая десятикратные разведения тканевых гомогенатов на 5% кровяной агар.

4.1 Комбинированное введение рекомбинантных полипептидов СГВ и живой противогриппозной вакцины с удаленным NS1 геном усиливает иммунный ответ к белкам СГЬ

В ходе исследования было показано, что наиболее высокие титры иммуноглобулинов G (IgG) в ИФА наблюдались к белку Р6. Даже после первой иммунизации (день 21) в группе, получившей отдельно полипептиды СГВ, средний геометрический титр (СГТ) анти-Рб IgG составил 3668 (2000-8000) и значительно возрос после повторной иммунизации (день 35; СГТ 43069 (8000256000)) с тенденцией к дальнейшему увеличению (день 42; СГТ 95104 (32000128000)). Для других белков повышение титров сывороточных антител выше базового уровня удалось достичь только после повторной иммунизации (день 35). СГТ к ScaAB составил 14254 (4000-32000); к SspB: 11314 (2000-16000); и к РЬЗа 16000(4000-32000).

Совместное интраназальное введение белков СГВ и живой противогриппозной вакцины с удаленным NS1 геном приводило к увеличению уровня сывороточных антител ко всем белкам СГВ вакцины. Наиболее выраженный адъювантный эффект ANS1 вакцины наблюдался для белка Р6. При этом СГТ антител в группе Strepto+ANSl по сравнению с группой, иммунизированной белками СГВ отдельно (Strepto) вырос в 3 раза на 21день, в 15 раз на 35день и в 7 на 42 день. Для белков ScaAB и SspBl комбинированное введение препаратов также обеспечило более высокий и продолжительный IgG ответ. Примечательно, что уровень IgG к этим белкам при использовании СГВ полипептидов отдельно достиг своего максимума на 35-й день и не имел тенденции к дальнейшему увеличению, а в случае ScaAB даже несколько снижался к 42 дню исследования. В то же время в группе, получившей оба препарата, наблюдался значимый прирост сывороточных AT к 35 и 42 дню исследования, а разница СГТ антител между группами достигла статистической значимости (тест Манна-Уитни р<0,05).

Рб

1000000

10000

1000

День 21 День 35 День 42

SspBl

40000 35000 30000 25000 -t 20000 15000 10000

5000 □

День 21 День 35 День 42

ScaAB

40000 35000

зоооо

25000 -t 20000 15000 -10000 -5000 -0

День 21 День 35 День 42

РЬЗа

25000 20000 15000 -10000 5000 0

День 21 День 35 День 42

Рис. 7. Динамика содержания бактериоспецифических антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных бактериальным и вирус-бактериальным препаратами

(по данным ИФА). Титры антител представлены как СГТ. Белые символы - группа, иммунизированная белками СГВ. Черные символы - группа, белками СГВ в комбинации с живой противогриппозной вакциной с удаленным NS1 геном. Р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

Наиболее кратковременная выработка сывороточных антител и наименее выраженный адъювантный эффект вакцины был отмечен для РЬЗА белка.

Несмотря на то, что на 35 день в группе Strcpto+ANSl имело место некоторое повышение СГТ IgG (23776 (16000-32000)), по сравнению с группой, получившей СГВ белки отдельно (СГТ 16000 (4000-32000)), к 42 дню исследования уровень сывороточных AT по отношению к белку РЬЗА в обеих группах снижался до базового уровня (рис. 7). В группе контроля и в группе, получившей только ANS1-H1N1 вакцину, IgG ответа к белкам СГВ не наблюдалось.

4.2 Комбинированное интраназальное введение рекомбинантных полипептидов СГВ и ANS1-H1N1 вакцины усиливает протективную эффективность в отношении СГВ

Для оценки эффективности комбинированной вакцинации мыши, получившие две дозы исследуемых препаратов, были подвергнуты сочетанному вирус-бактериальному заражению. Поскольку иммунизация проводилась вирусом гриппа A (H1N1), то для провокации бактериальной пневмонии на фоне гриппозной инфекции, был использован вирус гриппа В. Это позволило исключить возможность реализации защитного потенциала специфического противовирусного иммунитета, обусловленного вакциной подтипа H1N1. Через 48 часов после контрольного заражения вирус гриппа В определялся в легких животных всех исследуемых групп без значительного различия в титрах.

Через 5 часов после бактериального заражения наименьшее содержание СГВ наблюдалось в группе Strcpto+ANSl (2,98 lg КОЕ/мл). В группах, где животные были иммунизированны отдельно полипептидами СГВ (Strepto) или ANSI вакциной и группе контроля средний титр СГВ составил 5,5, 5,61 и 5,13 lg КОЕ/мл, соответственно. Через 24 часа после бактериального заражения СГВ обнаруживали только в группе контроля и группе, получившей одну ANSI вакцину. В обеих группах, получивших полипептиды СГВ, как отдельно (Strepto), так и в комбинации с ANSI вакциной (Strepto+ANSl), стрептококк присутствовал только в легких. В контрольной группе и группе, вакцинированной ANS1-H1N1, СГВ обнаруживался также и в селезенке, что свидетельствовало о бактериемии.

Полученные результаты позволяют заключить, что комбинированное применение рекомбинантных белков СГВ и живой противогриппозной вакцины с удаленным NS1 геном приводит к повышению иммуногенности бактериального препарата и усилению его защитных свойств в отношении СГВ инфекции, развивающейся на фоне гриппа. Сочетанное использование вакцинного препарата на основе рекомбинантных белков СГВ и ANSI противогриппозной вакцины может являться средством профилактики не только заболеваний, вызванных СГВ, но и усиливать защитный эффект гриппозной вакцины за счет профилактики бактериальных осложнений гриппа.

ВЫВОДЫ

1. Удаление геномной последовательности, кодирующей белок NS1, в сочетании с модификацией сайта расщепления НА и реассортацией генов, кодирующих внутренние белки, приводит к аттенуации высоко патогенных вирусов гриппа птиц подтипа A/H5N1. Вирусы с удаленным геном NS1 не способны к репродукции в ИФН-компетентных системах, но обладают высоким цитокиногенным потенциалом.

2. Делеции функциональных доменов в карбоксильной части белка NS1 вирусов гриппа В ассоциируются с потерей способности таких вирусов подавлять противовирусный цитокиновый ответ, и определяют их аттенуированый фенотип в ИФН-компетентных системах. Таким образом, технология создания вакцинных штаммов за счет удаления NS1 гена применима и для вирусов гриппа В.

3. В ответ на однократное интраназальное введение макакам-резус вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) в носовых смывах животных наблюдалось достоверное повышение уровней ИЛ-1)3 (р=0,05), ИФН-у (р=0,03), ФНО-а (р=0,049) и ГМ КСФ (р=0,02). Реализация «самоадъювантных» свойств вакцинного штамма VN1203ANSI осуществляется посредством способности данного вируса индуцировать локальную выработку широкого спектра цитокинов в месте введения вакцины.

4. Продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови, индуцированная вирусом гриппа с удаленным NS1 геном, имеет возрастные различия. Мононуклеары, выделенные из пуповинной крови, в ответ на стимуляцию ANSI вирусом вырабатывают ИФН и другие провоспапительные цитокины на уровне с МПК взрослых здоровых доноров, в то время как продукция цитокинов МПК пожилых людей снижена.

5. В клиническом исследовании показана безопасность и низкая реактогенность вакцинного препарата на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном. Неспособность к репродукции вакцинного вируса в носоглотке привитых является дополнительной гарантией безвредности применения подобных штаммов у людей. Локальное цитокиногенное действие вакцинного вируса обуславливает его «самоадъювантные» свойства. При интраназальном введении здоровым взрослым добровольцам вакцина ANS1-H5N1 способствует формированию как местного, так и системного иммунного ответа без применения адьювантов. Наибольший уровень иммуногенной активности достигается при двукратном введении вакцины.

6. Иммунноадъювантные свойства вирусов гриппа с удаленным геном NS1 могут быть использованы для повышения иммуногенности рекомбинантных белковых препаратов. ANSI вакцина способствует развитию более выраженного и продолжительного иммунного ответа к белкам стрептококка группы В при совместной интраназальной иммунизации мышей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Romanova J. Preclinical Evaluation of a Replication-deficient Intranasal ANSI H5N1 Influenza Vaccine / J. Romanova, В. M. Krenn, M. Wolschek, B. Ferko, E. Romanovskaja-Romanko, A. Morokutti, A.-P. Shurygina. S. Nakowitsch, T. Ruthsatz, B. Kiefmann, U. Konig, M. Bergmann, M. Sachet, S. Balasingam, A. Mann, J. Oxford, M. Slais, O. Kiselev, T. Muster, and A. Egorov // PLoS One.-2009 June 19.-4(6).-e 5984.

2. . Wressnigg N. Influenza В mutant viruses with truncated NS1 proteins grow efficiently in Vero cells and are immunogenic in mice /N. Wressnigg, A.- P. Shurygina. T. Wolff, M. Redlberger-Fritz, T. Popow-Kraupp, T. Muster, A. Egorov and C. Kittel //Journal of General Virology.- 2009.-90,- P.366-374.

3. Плотникова M. А. Олигонуклеотидный биочип для определения профиля экспрессии генов цитокинов человека / М.А. Плотникова, А.В. Васин, Е.Ю. Марочкина, С. А. Клотченко, Е.А. Романовская-Романько, А.-П.С. Шурыгина. В.В. Егоров, О.И. Киселев // Цитокины и воспаление. -2011,Т. 10. № 2.- С.5-9.

Тезисы:

1. Egorov A. Replication deficient intranasal delNSl H5N1 influenza vaccine / A.Egorov, J. Romanova, B.Ferco, M.Wolschek, B.Krenn, E.Maurer, A.Morokutti, T.Ruthsatz, E. Romanovskaya-Romanko, A.Shurigina, O.Kiselev, T.Muster // Abstract book of International Conference: Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook, St.-Petersburg, March 15-17, 2007.- P. 109-110.

2. Krenn B.M. Preclinical Evaluation of Replication-deficient Intranasal ANSI H5N1 Influenza Vaccine / В. M. Krenn, J. Romanova, M. Wolschek, B. Ferko, E. Romanovskaja-Romanko, A. Morokutti, A.-P. Shurygina. S. Nakowitsch, T. Ruthsatz, M. Bergmann, S. Balasingam, A. Mann, J. Oxford, M. Slais, O. Kiselev, T. Muster, and A. Egorov // International Conference Retroscreen: «Medical, Scientific and Historical Lessons from the Great Avian (H1N1) "Spanish" Influenza Pandemic of 1918: The 90th Anniversary», London, November 10, 2008,- P.278.

3. Стукова М.А. Клиническое исследование I фазы пандемической H5N1 DELNS1 гриппозной вакцины: оценка безопасности и эффективности / М.А. Стукова, А.-П.С. Шурыгина. А.Ю. Егоров, О.И. Киселев [и др.] // Материалы международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения». Санкт-Петербург - 28-29 Октября, 2009.- С.52.

4. Шурыгина А.С. Вакцины нового поколения: клиническое исследование пандемической H5N1 delNSl гриппозной вакцины / Шурыгина А.С., М.А. Стукова, А. С. Шурыгина, М.А. Стукова, А.Ю. Егоров, О.И. Киселев [и др.]// Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Том V.-Москва- 2010.- С.71.

5. Шурыгина А.-П.С. Гриппозная delNSl вакцина повышает эффективность рекомбинантной полипептидной вакцины против СГВ / А.-П. С. Шурыгина, Г.Ф. Леонтьева, К.Б. Грабовская [и др.] // Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Москва. 26-28 Марта 2012.-. С.433.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.к. Аминокислота

ВАК Высшая аттестационная комиссия

ГМ КСФ Гранулоцитарно-макрофагальный колонестимулирующий фактор

ИЛ Интерлейкин

ИНФ Интерферон

КОЕ Колониеобразующая единица

ТИД50 Тканевая инфекционная доза 50%

N1.11 Домен олигомеризации нуклеотидов (ЫОО)-подобные рецепторы

НА Гемагглютинин

гп.ол Множественность инфекции

ЫА Нейраминидаза

N51 Неструктурный белок 1

РИЛ Патогенраспознающие рецепторы

ЩЛ Индуцируемый ретиноловой кислотой ген I (ККЫ)- подобные рецепторы

ТЬИ. ТоП-подобные рецепторы

БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает глубокую благодарность и признательность своему научному руководителю - доктору биологических наук Егорову Андрею Юрьевичу за предложенную интересную тему и внимательное отношение на всех этапах работы. Автор благодарит заведующего лабораторией к.б.н. Грудиннна М.П., к.м.н. Стукову М.А. и сотрудников лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии, а также других подразделений ФГБУ «НИИ Гриппа» Минздравсоцразвития России за всестороннюю помощь при выполнении работы. Автор выражает искреннюю благодарность Юлии Романовой, Борису Ферко, Бригите Кренн, Кристину Киттелю, Монике Сахет, Нине Вресснигг, профессору Томасу Мюстеру (Green Hills Biotechnology, Вена, Австрия) а также Леонтьевой Г. Ф., Суворову А. Н. (ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН) и Петрову А.В. (ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России) за сотрудничество в проведении исследований. Особую благодарность автор выражает директору ФГБУ «НИИ Гриппа» Минздравсоцразвития России, академику, д.б.н., профессору Киселеву О.И. за всестороннюю поддержку работы.

Подписано в печать 20.04.12 Формат 60х84'/1б Цифровая Печ. л. 1.31 Тираж 100 Заказ 22/04 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)