Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства фракций коклюшного диализатного антигена, конъюгированных и неконъюгированных с синтетическими носителями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства фракций коклюшного диализатного антигена, конъюгированных и неконъюгированных с синтетическими носителями"

ргб од

министерство здравоохранйц« и вдщщюкой ПРШШЕШШИ

Ростовский государственный медицинский университет

ишуновиояогичес№в свойства фракций кошшшого дшизатного айтигш, конъюгированш : и неконыгированных с свдпжшш4и носигшши

03.00.07 - микробиология

диссв

российской федерации

На правах рукописи

БАЛАХНОВА Вероника Зккюровна

1'оотов-на-Дону 1994

Работа выполнена в Ростовском государственном модицинском университета. •'

Научный руководитель: . доктор медицинских наук, профессор М0ШЛШК0.£.П.

Сфицйельные оппоненты: . ,

, доктор медицинских наук, юедулдой научный сотрудник ТШЮВОИАЯ Ji.lL

доктор медицинскихчнаук, ведущий научный

сотрудник • ТЕРЕНТЬЕВ А.Н.

Зедущая организация: Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии

Защита состоится г. в часов /

на заседании диссертационного совета Д 064.53.01 при Ростовском

государственном мг ".ицинском университете (344022, г.Ростов-на-Дону,Нахичеванский пер.,29).

Автореферат разослан " ¿йИТЛ^/Ь. 1994 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Учений секретарь специализированного совета, доцент

Н. л. ШТАНОВ

ОскДАЯ ХАРАККРШЖЛ РАБОТА:

Актуальность темн^ Плановая вакцинэяро^ллактчка коклюша, введенная в СССР в 1959 гаду, редко снизила лаболепаемость этой инфекцией (Захарова ¿I.С.,1987; wiraetn Jl.A.tI98f\ Но прнмснло-мая корпускулярная вакцина, характеризуется повышенной рчякто-генностью, проявляющейся разнообразными системными и локальными поствакщнальнымн озловдунйями (Брагинская ¿.П.,1990; hewlett, I98Ü). Оаказ от иротивококлвшкой идаушз&цни нз являзтея оправданным, так как снижение удельксго ьооа популяции закаилтрован-нкх детей припело к подьему заболеваемости коклюшем (Сухарева М.Е., 1990} líoxou ,IÜ9C). В связи с этим е последние годы во многих лабораториях мира вэдугея интенсивные разработки по созданий Сссклеточаих ареактэгенких коклюшных- вакцин. Бее предложенное бесклегочкыэ сакцгшы создаются на. основе ;-:оюшшнзго токсина с включением'в их состав и других токсических и антигенных субстанц«й B.partucni3 , таких как филаментознкй гемштлюти-нин4 агглитиногены* липополисахарйд, едешглатцикдаза, прчтеин внешней мембраны с молекулярной массой 69 цД (sato ,1967;.

Savaga ,1990), Но способы изготозления этой закцинк достаточно сложны и трудоемки» Разработка более простого метода получения бесдлеточного препарата остается актуальной до настоящего времени*

Е.П.Москаленко с соьатД 1975). был разработан легкодоступный к в то же' время эффективный способ получестя растворимого . коюгошшго антигена .(¡-ДА./ ^утем диализа черва поры целлофана взвеси бактерий, обработанной ультразвуком. Коклюшный диализат-(шй антиген является сяоанш по составу препаратом и сидержит гекагглатпнин, лиыфодатозстазулиг/щий комплекс, агглвтиногены (Москаленко К,П., Ямвкина B.B.,IS8ó). Проведение фракционирования коклашного диализатного антигена позволило tía освободить яратентивные фракции , от других компонентов

Новш перспективным направлением в конструировании вакцин является создание препаратов на основе синтетических полгаэрлых ч"осителей, что обеспечивается химическим создинэякея гцделекгак i3 возбудителей инфзкциоиных заболеваний структур с молекулами, жазыващиыи адъювактное или яыыукэс'гимулирувцзе действие (Пет-303 Р.Б.» Хаитов P.M.,I9S6). Конюгированке лсиуч ных фракций соклшного диализагного антигена с синтетическим носителем отк-зывает перспективу создания нового беекдетечнего коклюшного >тра-tapata,..

Широкие возможности для изучения отруюурко-?функциональ-ных особенностей микроорганизмов, отбора прстективных антиген- • них детерминант создает гибркдошая технология (Петров Р.В. , 1932; Новохатский А.С.,19вЗ). Получение гибрццом, синтезирующих меноклональные антитела к коклюшному диализатному антигену позволит изучить и выделить в его состава протективш.е антигенные детерминанты для создания ващщньвс препаратов принципиально нового типа.

1^ель_работы. Изучение иммунобиологических свойств фракций кошшшогс диализатаого антйгена, нежигьйгирован—х й коньягл-роваш. л с синтетически« носителем как вопмоаного кошонента нового вакцинного и диагностического препарата; получение коллекции мококяонаяьных антител к коыкшноыу даализатному антигену для изучения протвктивньс: антигенных детерминант коклюшного диализатиогс ашигеиа; использование моноклональпьк антител для диагностики кокллпа и дифферен^ацин с другиш: представителями рода Borietaiae,

Задачи_работы:

1. Охарактеризовать фичико-химические и иымунохииические свойства фракций коклюшного дкапизатного антигена.*

2. Получить коньсгировакные с синтетически« носителе« коклюшные антигенные препараты,

3. Изучить спектр биологической активности фракций коклюшного диалкз&тного антигена, исследовать особенности гуморальных и клеточных 'шыунннх реакций в ответ на введение кокявшиого диа-лизатного антигена и его фракцаЯ, кояьагированнык и неконыагиро-ааньых с еинтетичискии носителей.

4. Разработать оааыальиые условия получения гибридом, сек-» ротирующих нонок-оналмше антитела к коклшному диализатному • антигену.

5. Создать коллекцию гибредоы/стабилььо продуцирующих ыо-т ноклон&льнце антитела к антигенным детерминантам коклюшного д а-лизатного антигена.

о. Охарактеризовать свойства .олученних эноклокальных ан»' "ите i, определить кх антигенную иащ ¿вленность, изучить *>уикцио-насьчьэ свойства ША - активность а различных с рологических рэакцикх, o..j:wtb иьыунобиологччесние сзоаства моноклонашшх. антцтел в условиях in vlvo и in rttro.

Иа^йивл новизна и теорвтач^скм энашшость_раб£ты. В результате проведенных исследований разработан метод фракционирования коклюшного диализатного антигена и охарактеризованы физи-к'-химмческ/а к иммунохичические свойства фракций коклюшного диалиаетного антигена, проведено ксишогиро^аниа полученных фракций с синтетическим иммуностимулятором - полиоксидонием. Изучены токсически« и протектиБние свойства созданных препаратов, ях способность к квдухцик клиточноср ч гуморального звена иммунитета.

Получен нао'ор гкбридои, проецирующих моноклоьалькые англ-тела к коклюшному диализатному антигену, еыядшаощих в его составе 4. антигенные дьтерминанты. Изучена функциональная актичнссть ^„онэклональных антител к различным антигенным детерминантам коклюшного диализатного антигена. Созданные гкбрздомн секретируют МКЛ, проявляющие .высокую активность в различных серологических реакция- . обладают зшцктндаи свойствами -in vivo и in vitт.о. С помощьо íiüíA установлено наличие в коклюшном диашюатном антигене определенного количества коклюшного токсина и агглютиноге-HOD 2 И 3.

Практ11!че£1Юя_цешосг.ь состоит в возможности даль-

нейшего использования коклюшного диализатного антлгена и' его фракций, коньюгировшшых с синтетическим носителем - полиоксидонием для конструирования профилактических и диагностических препаратов.

Полученная коллекция стабильных гибридных культур, проду-. цируюпцгх ivtKÁ к кзклшшэму диалисатноыу антигену, использована в качестве источника стандартных моноспецйфических имчглогло-булинов для разработки усовершенствованных диагностических препаратов. Полученные препараты, в отлично от коммерческих, обладают большой чувстнительностью и гоэволяпт дифференцировать штаммы B.perfrusfds от других представителей рода-Bordatella.

Гибридные клеточннз линии-Л8 и ЕЮ, синтезирующие моноюгэ-нальные антитела к коклгашому диализатному ¿иг/нгепу, депонированы во Всесоюзной Специализиросанной коллекции перевиваешь клеточных культур под ноньра.-ли ВСЖШ) 61ЭД и БСК1.Ш) б¿ОД.

0сно_рны<з_п£Л£женияА дщзаг&9мые

- возможность проведения фракционирования ко'юошогс диализатного антигена и получения фракций, отлкчаяци::с« по n;<yyuoxi"'>:-ческим и иммунобиологические Свойствам;

- б -

- кокьюгирование фракций коклюшного диалиэ&тного антигена с синтетическим носителем - полиоксидонием приводит к созданию новых препаратов, обладающих высокими лротектпБНыми свойствами и вызывающих индукцию иммунных: реакций клеточного и гуморального типа;

- гибрвдом;;, получешше цутем соматической гибридизации иммунных елленоцитоа с клетками шеломы мши, продуцирующие мо-ноклональные рлтитела к коклюшному диалиаатному антигену, являются источником стандартных, высокоактивных, специфических и гомогенных, антител. Повышенна стабильности штаммов-продуцентов МКА достигнуто с помощью клонирования и реклонирования гибридных клеток методом предельных: разведений;

- уоноклональные антитела к коклюшному диализатному антигену выявляют в его составе антигенные детерминанты коклюшного токсина и агглютиногенов 2 и 3;

- гибридокш, продушрущие I£8к к коклюшному диелизатнсму антигену, служат источником биологически активных имиуноглобу-линов, представляющих собой ценный инструмент для конструирования высокоэффективны* и ареактогенных противококлюшкых профилактических и диагностических препаратов;

- высокая специфичность, чувствительность и стабильность монокчональных антител позволяет- использовать их для диагностики и идентификации возбудителя коклюша, полученные диагностические препараты моноклональных иммуноглобулинов превосходят г~ активности ь 4-8 раз,коммерческие факторнко сыворотки, предназначенные для серологической вдентификации возбудителя коклюша.

, ^що^адия, „работы: результаты исследовашй были доложены ка конференциях молодых ученых и специалистов РОДОМ, Ростов-на-Дону, 1988,1989; на 1 съезде Всесоюзного общества иммунологов, Москва, 1989; на Всесоюзной конференции молодых ученых, Ростов-на-Дону, 1989;. на Всесоюзной научной конференции "Теория и практика электрооптического исследования коллоидных систем", Оболенск, 1989; на I съезде иммунологов РСФСР, Новосибирск, 1991; на Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика ОСИ", Саратов, 19.)3.

Пу£л^кяция^азхл^тат£в_и£сле£1о_вали£1. Основные положения диссертации отражены в: 8 опубликованных научных работах.

Ст£у1пхра диссерта^и.' Диссертации изложена на 199 страницах машинописного текст«" и состоит из введения, обзора литера-

ратуры, описания материалов и ыотодоа исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего работы 74 отечественных и 162 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 1?. рисунками и 26 таблицами.

СОБСТВЕННЫЙ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

В качестве исходного материала для получения исследуемого коклюшного диализатного антигена использовали бактерии з. рвгЬ1на18 штаммов 305,345 (;юлле;:ция ГИСК им. Л.А.Тарасе-аича), выращенные на среде ПУЛ в течение 48 часов. Корпускулярную» коклюшную вакцину (ККВ) получали в соответствии с ¡¿РТУ №26268. Коклюшный диализатный антиген (КДД) ползали путем диализа через поры цоллофана. бактериальной взвеси» обработанной ультразвуком, в соответствии с указаниями, описаннши Е.Л.Москаленко с соавт. в авторском сйвдетельстве У 130Э364. Гель-хроматогра-фно антигенов проводили на колонках с гелем 4 '1'оуорекг1 НИ-551'", используя рекомендации фирмы-иэготоаитсля. В антигенных прзлера-тах определяли содержание белка ( «а., 1У51), угле-

водов (. 0иЪо1в et а1,, 1956).

Коклюшный диализатный антиген и его фракции исследовали £ системе общепринятых серологических тестов: РНГА, РНАт, РГА с эритроцитами различных животных. Реакции, основанные на феномене пассивной геыагглютинации, ставили с помощьо микрометода в аппарате "Такачи" с использованием коклюшного антительного и диишзатного антигенного диагностикумов. Коньюгированио ОД- и его фракций с синтетическими носителями проводили путем ковалентной конъюгации, используя традиционные методы ковалентного связывания: карбодиимццньй и реакции альдегидных групп с первичными аминогруппами.

Лейкоцитоэстимулирующие и защитные свойотпа, контролируемые при интрацеребральнол заражении, были проверены в соответствии с "Инструкцией по отбору, проверке и ранению производственных штаммов коклюшных бактериП" (1987). Изучение антигенных особенностей исслг уемых препаратов проводили на мыцрх Ба1Ъ/С массой 14-16 г. при однократной внутрибршыннск иммунизации коклюшными препаратами я дозе 2,5 ккг по белку я объема 0,5 мл. На 7,14,21 и 28 сутки поело иммунизац-ч у мышей брали кровь из рвт-роорбитального синуса и определяли наличие в ней специфических

- а

антител в системе серологических реакций, формирование реакции гиперчувствительности замедленного типа под злиянием коклюшных * препаратов изучали при постановке плантарного теста, вычисляя индекс плантарной пробы ( '.саыигп et сХ., 1984).

Гибр^дом^ая технологиям В гибридизациях использованы еле-., дующие клеточные партнеры: иммунные клетки селезенок мышей линии с Вп1Ъ/о с массой 16-20 г. и клетки мышиной ыиеломы РЗ-Х6З/а38.. 653, Наличие антител в кулътуральнш: супернатантах и аиштнчес-ких мадкостях осуществляли с помощью метода иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлуоресценции. Конкурентную реакцию ,-нар Ш. для определения индекса аддитивности проводили согласно " методике, предложенной РгК^ие^ et а1. <.1983). Определение класса иммунох'лобулинов, продуцируемых гибрадомами, проводили с помощью юллунофзрментного изотшшрующего набора фирмы "са1Ъ1о-сЬеи " (Швейцария) по инструкции изготовителя. Изучение про-тективной активности МКА проводили, используя интрацеребральнуга модель заражения согласно "Инструкции до- отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий"(1987).Нейт- . рализуюцие свойства полученных ЩА в отношении коклюшного токсина исследовали на »одели кле'лж СНО.

Gтaтиc^идecl^_oбpaбoтJ^_J)eзx^:ьг£.тoв проводили по К.Ц.Ат-марчну и А.А.Воробьеву Ц96£), достоверность вычисляли с использованием критерия С'.ьодента. _ •

результата иоущцойаш.

Хроматографическое разделение коклюшного диализатнэго антигена проводили с помощью метода гель-хроматографии на колонке ' с ГЗК^е! " Юуореиг! " при двух скоростях элпцчи -

10 и 2 ил/см . ч. При первой скорости элюции были получены три фракции КДД, раз. гааюцихся по содержанию белка, полисахаридов , и активности в РИГА и РНАг. Уетгнозланс, что I и Ш фр..кщи ВДА ;шелм более низкую активность в РИГА, чем исходный препарат, но высокие титры в РНат (табл. 1). Уровень активности П фракции ь РЛГА и РНАт был сопоставим с активностью Нами бала отмечена дискретность хроматографическоб зоны П фракции, вызванная наличием в её составе нескольких высокомолекулярных белков.

Испольрпвание скорости элюции 2 мл/см"^ ч-позволило разделить ЦДА на о фракций, отличавшихся между собой по содержанию балков, углеводов и активности в серологических реакциях. По

результатам серологических реакций обращала на себя внимание 1У фракция ВДА. Высокая активность 1У фракции, выявляемая в РЛГЛ, по сравнению с исходным дишшзаткш антигеном, по-видимому, объясняется тем. что изменение нежима стации при хроматог-рафичеокэм разделонии ведет.к изменению пространственной конфигурации антигенных детерминант коклюшного диализатного антигена, открывается наиболее функционально активные сайты антигена.

Для установления наличия в составе КДА. и его фракций коклюшного токсина и филаментозного гемагглютинина - одних из ведущих антигенов ь формировании противококлюшного иммунитета -использовали реакцию гомаггллтинации со свежев^целечными эритроцитами барана, курицы и человека ИО) группы крови. Вольная часть полученных фракций обладала в различно!; степени выраженной способностью агглютинировать эритроциты.

Важным этапом проведенных исследований явилось проведение. Коныогирования'И^Д с синтетическим сополимером - полиоксвдончем и иокогенным реакционно-способным производным природного полисахарида - декстрана - градексом. фракции ОД. коньагировиш с полиоксидонием. Синтез осуществлялл путем конъюгации коклюшных препаратов с полимерными носителями, используя ков&лент.чое связывание.

ч

С целью первичной оценки протективных свойств коклюшных препаратов использовали модель интрацеребра.\ьного заражения экспериментальных животных. Установлено, что введение коклюшно-. го диализатного антигена преллтствозало развитию экспериментального энцефаломиелита (ВД50 колебалась от 0,36 до 0,69 мкг по белку), протективный эффект оьш сравним с действием национального стандарта коклюшной вакцины (табл. I). Из исследуемых фракций, полученных при гель-хроматографии со скоростью элщии 10 мл/ск&ч, только I фракция обеспечивала аналогичный эффект. Коным ирование ЦДЛ и его фракций с полиоксидонием приводило к резкому увеличению защитного эффекта, протективность увеличивалась в несколько раз, особенно повышалась иммуногенность исходного НЦ^ и Ш фракции. Сам лолиоксидоний не защищал мышей от экспериментального энцефаломиелита.

Сравнительное изучение защитных свойств котюгатов ИДЛ с различными полимерные носителями показало пысскуго протективную активность коньюгагов как па основе полиоксидонил, так и грэдекса.

Таблица' I,

й^лунгбпологичзекие сьойсува фракций- коклюшного диализатного антигена..

! Удельная активность е ! !

Комканые ! ■ •• . ! 1

препарату _ _ _ _ _ „ _ _ _ 4 по Дустеру э. | ЛСА(ВД)

! I ГНУмкг белка| ГмЩлкг белка} мкг ш бмку [

'«А , 0.48 0,5 0,69 0,205*0,7

ЧДД4подкоксидоний -* 0,0136' 2,26*0,04

I фракция 3,125 0,012 ' 0,263 0,17*0,02

I фр.+ПОЛИОКС5УЮНКЯ - 0,068 0,54»0,024

Я фракция 0,155 0,62 5,685 0,06*0,01

П фр.+П0ЛИ9КСВД0НИЙ - - 0,352 0,43*0,11

!■! фракция 0,64 0,025 19,96 0,550,05

Ш фр.+полиексздониЕ - - 0,024 1,6*0,27

ККй - - 0,15 УЗЕ 2,23*0,87

При изучении злияаия коклюшных препаратов на индукции леЯ-ко-лимфоцитоза у подопытных тавотных было установлено, что НДА не шзкэает значительного пов.чшений количества лейкоцитов, в отличие от стандартного образца коклюшной вакцины серии 3 (табл.1). Но введение кошдоированного И^Д с полиоксидонкем приводило к повышению количества лейкоцитов, превышающего показатель лейкоцитоза яри введении 0С0-3. I и Г1 фракции ¿»ДА не обладали лейко-!^итоз стимулирующей активностью, индексы ЛСА находились на контрольно,»! уровне, и фракция характеризовалась показателем ЛСД, который несколько аышз уровня исходного коклипшого антигена. Введение животным конъюгированных фракций вызывало увеличение чке-' ла лейкоцитов в крови, однако,- при этом их количество Сило значительно меньше покеза'.'еля лимфо-лзИксцитоза при введении ОСО-З. Использование полиоксидония в качезтва иммунизирующего агента способствовало повышение лейкоцитозстимулирующей активности,что по данным Р.З.Петрова.с соавт. (1^36), связано с усилением миграционных процессов 1- и В-лимфо:мтоз при введении с организм иммуностимулирующих синтетических носителей.

При изучении уровня протизококлюшных антител и динамики «штителообразования у животных, иму|жзированных изучаемым." ан-тигояами, установлено, что гведение конъюгированных коклюшных препаратов приводило к увеличена» синтеза.противококлюшных антител у экспериментальных животных зо рее сроки исследований ' (7,14,21 и 2-5 сутки) (рис. I). При этом уровни прстивококлшных антител в группах иивотньк, иммунизированных ¡СКВ, Щ(Д м его фракциями, конъюгирован1'ьс.'»1 с полноксидонием, статистически почти не отличачксь ла 14 и сутки посла инокуляции, тогда как на 28 сутки наблюдалось повьшелие уровня антителогенеза по сравнению с раннш.::1 сроками исследования, и значения глтров антител у животных, лриемтих котюгироаанныыи препаратами, иренллшт таковые при исшльзов' ши Ш£В. По-видимому, ко:гьзгирование препарата с синтетические носителем ведет, к пролонгации антитель- ч ного ответа макроорганизма.

Характер фориир'ованил иммунных реакций клеточного типе, при введении коклюшных препаратов изучат с помощью реакции гипер-чувстБитольнзсти Ешдедлечного типа (ГЗТ) а плант&рноЛ пробе, валящейся показателем клеточно-опосредовшшого иммунитета (рио.2). При введении дйалиэитнего антигена наблюдали формирование) реак-

1<э титроЬ

2 -

О

ккз

вдд

I фр. П фр.

7 14 21 1«э тигйРоЬ

28

-1—

Г

с утки

ЮШ —

едл+и

I фр+П -

п фр-П -

Ш фр+П,

14

21

28

сутки

Рис. 1. игормировадие гуморального звена иммунитета у мыией при введении коклюшного диалсзагного антигена и его фракций, коныэгированных и изкояьыгировБнлах с синтетическим носитоаем.

1

Rio. 2. Нормирование клеточного звена иммунитета

у мшей при' введении коклюшного дкализатного , • антигена.|т его фракций, конйогированнкх и неконыогировздных о синтетичоеким.носителем.

-П - полидксэдоний» К - ö,I5 М расгрор хлэрзда натрия. ' .

. ций Г¿'S, интенсивность которой возрастала при конъюгиуовашш препарата с полиоксидонием. Индексы гшантарцой пробы достоверно превышали показатели ГЗТ, иццуцированной цельноклеючкой вакциной. Фрякции ВДА отличались выраженной способностью активировать клеточные реакции ГоТ. Но коньюгироваяие с полнокси,~онием приводило к повышению их способности вызывать PdT для Д/|Д и I фрак-, ции, тогда как для 11 и Ш фракций снижало показатели до уровня контрольной группы. Выяснение механизмов этого явления требует дополнительных исследовалий.

Таким образом, когаогиропаниз Vjiji и его фракций с синтетическим иммуностимулятором ведет к усилению и пролонгированию антительнрго ответа. Эти данные согласуется с результатами Р.В. Петрова с соавт. об иммуностимулирующем аффекте синтетических полимерных носиаелеРД1986). Развитие специфических реакций ги~ перчувзтвителиностн'замедленного типа наблидалм при введении ВД/1 и его фракций, а таю.е конгюгированных I фракции и исходного антигена.- Ког.ъюгирование с попио'ксидонием П и Iii фракций не обеспечивало положительных результатов штантарной пробы. Разно-направлэнное влияние коклюшных антигенов на гуморальное и кле-. ючноа звено иммунного ответа описано и другими исследователями (Ё.П.Москьлелко, В.Б.Ллаван, 1995).

Созокупчость предстаапепшх данных свидетельствует о том, что полученныа коньюгировшнш коклюшные прзпараты можно рассматривать как приеылимые в плане создания на их основа эффектный«. и безвредных срелсте специфической, профилактики коклюша.

Ьашпм аспектом проведенной работы явилось создание коллекции моноклональных антител к коклюшному диализатному антигену для изучения его структурио-<{)ункционалышх свойств,и аьделения в его составь, лротективных антигенных субстанций для разработки вакцинных препаратов принципиально нового типа.

Моноклональныа ацтитела получали путем слияния иммунных сгиеноцктэв мысей линии ИеХЬ/С , нммуниз про ванных коклюшным диалиэитньзл антигеном, с клетками мышиной миеломы РЗ-ХбЗ/AgS. 653, взятой в логарифмической фазе культивирования. " пталлцим агентом являлся 50% раствор полиэтиленгликол" с молекулярной массой 1500. Выращивание гибридных клегок проводили на ростовой среде КРИТ-1640 с эмбриональной телячьей сыворотки. Селективные сьойстьа среды обеспечивали добавки ашноптерина, гипо-ксатч.:а и ттздина.

. . Итогом отработки основных этапов методической процедуры слиятл явились серии эффективных гибридизаций и получение набора культур, продуцирующих антитела к коклюшному диачизатному ьнтигену. . •

В общей сложности было получено и исследовано на антитело-Образукщгю активность 1204 первичных гибрццнкх культур, 3(У, из Которых секретировали антитела к .ОДА« Первичные культуры клонировали и рйклонировали методом предельных разведений, отбирая на кшядоч этапе субклоны с максимальным уровнем антителсобразо-вгшия. Л результате получены гу5\слоны 7 разных первичных гибридных культур, Эти гибрвдомы бчли отобраны на основании взаиксдэйст- * вия синтезируемых И^А с коклюшным диализагннм глтнгеНом в имму-•'"нэфврменгноы анализе.

"г- С целью изучения антигенной направленности был проведен зпитопный анелиз коклшного диализатного антигена, для этого применили ВИЗА -аддитивный тест, ссносантй на конкуренции пар МЙА. Отчетливая'конкуренция была выявлена только между 4 антителами. Оценивая результаты исследований остальных пар !АКА, модно было предположить, что они направлены к разным антигенным детерминантам КДА, но . близко расположенным на субъединицах антигена и создающим стерическив.препятствия ьзаимоцр.йствшо молекул антигена^

Более детальную характеристику свойств -МКА проводили с помощью реакции агглютинации и метода непрямой иммунофяуорес-цзнции на наборе штатов з»рог^Еп1а » в.рксарвтгиз'эАо и В.ЪгопсЫ-верЙса . Все полученные' гибридомы продуцировали мо-ноклональные антитела, которые распознав? антигенные детерминанты нг. поверхности всех изученных штаммов з* ретива I л' , что является докаеательсгвом их нагг ^ьленног.ти к консервативным апитопам коклюшного диализаткого антигена,- Обращают на себя внимание МКЛ,гибрвдомы А8, кЬторыо отличались высокой активностью в реакций -агглютинации со всеми исследуемыми штаммами В.р8г1из81а и не давали' положительных результатов с другими представителями -рода Вогс^еПе . При .использовании кшучогло-булинов гибрвдомы А8 в ориентировочной реакции агглютинации на стекле бича установлено, что данные ыоноклональны^ антита.та образуют агглятинагы среднего раэбора со ясеми ктаммами в разведении до 1:16, р то время как диагностические коммерческие коклюшные и паракоклшные сыворотки к факторам 1,2,6 и 14 агглютинируют соответствующие микробные взвеси и развадонмл 1:2 - 1:4.

Нолучеьные данный позволяют рассматривать моноклональные антитела гибридомы А8 ь качестве кащидата для создания диагностических препаратов высокой специфичности для дифференциации коклюшных микробов от В,рцгерег41\ва1в и В.ЪгопоЫявр^са , так как МКА А8 превосходят по активности в 4-8 раз коммерческие факторные сыворотка, предназначенные для серологической идентификации возбудителя коклюша. .. -

Гемагглотинирующую активнооть ЫКА исследовали в РПГА и РНАг с фракциями коклшного диализатного антигена (табл. 2). Все МКА агглютинировали нагруженные КДА эритроциты. Но большинство моноклональных антител проявляли в этой реакции неодинаковую активность. Наибольшие титры в РПГА показали ЫКА гибридом А8 и Е10, выявляющие■различные антигенные детерминанты ВДА по данным эпи-топного' анализа. В то же время следует обратить внимание на то, что МКА пар гибридом А8 и К8 и £10, которые по индексу аддитивности выявляли одинаковые эпитопы ВДД, проявляли различную активность в РИГА. Разницу в активности ложно было объяснить различным аффинитетом моноклональных; антител.

Анализируя результаты РНАг с фракциями коклюшного диализатного антигена, следует отметить различную специфическую активность моноклональных антител; наибольшей активностью, как и в других реакциях, обладали МКА гибридом А8 и £т0. Все исследованные МКА отличались друг от друга по степени выраженности взаимодействия с ОДА и его фракциями, но у всех МКА наибольшие тигры баш о Ш-ЗУ фракцией ОДА. Следовательно, антигечние детерминанты ЗДД, к которым былгк получены гибридами, в большей степеш. представлены в Ш-1У фракциях. Полученные данные открывает возможность использования Ш-1У фракций для конструирования и»йлунологической тест-системы для изучения коклюшных антигенов (табл. 2).

Для имцунохицического анализа КДА был применен метод имму-но4-ерменхного анализа с использованием препаратов коклюшного токсина I* лилополисахарида З,рвг*ивв1в. Эксперименты по выяо-нению антигенной специфичности кКА в отношении агглютиногенов I,2 и 3 коклюшных микробов осуществляли методом конкуоонтного И^А с помощью диагностических сывороток к факторам 1,4 и 3 Е,рв1'гива1а

Подученные результаты показали, что моноклональных антитела гибридомы А8 выявляли эпитопы, представленные на макромолекула/ коклюшного токсина к агглютиногенов 2 и 3, Шй. гиОридо-

Таблица 2.

Активность монохлональных антител в РПГА,.И4А и РНАг с фракциями коклюшного

диализатного антигена.

гибридом. РИГА ВДА I фр. Й Фр/ Ш-1У фр. У фр. Л фр. взвесь 1_.р0Г-Си8Е13 0 КМ

■ШТ.ЗС5

- - А8 1:10240 1-Л20 1:160 1:160 1:2560 1:1280 1:160 1:20 1:500000 1:1^00000

РЭ 1:20 ■ 1:8 . 1:8 1:64 1:128 1:16 1:32 1:16 1:32000

£10 1:10240 1:320 1:320 1:640 1:5120 1:5120 1:2560 1:20 1:Гя'ООиО I: ЮОоООО

1 ЕВ 1:20 1:32 1:16 1:32 1:64 1:16 1:32 1:32 1:128000

1У и Сб 1:64 1:16 1:16 1:32 1:128 1:8 1:16 1:16 1:640и0

1 С9 1:16 1:8 •' 1:8 1:32 1:256 I:* 1:16 1:8 1:32000

С12 1:32 1?4 1-4 1:16 1:64 1:4 1:4 ■ 1:4 1:10240

Примечание: контроли

- коклюшная агглютинирупцая сыворотка серии 220 имела титр в РИГА 1:128000; .в ИМ с КДА - 1:128000; асцитическая шдкость мышкой ■шеломы ?3-Х63/Ад8.653ИМ с Ш - 1:2.

мы F3 - агглютиногенов 2 и 3. Монокпональные антитела осгаль- _ ных гибридом, по-садимому, взаимодействуют с антигенными детерминантами других субстанций B.pertueaie , входящих в состав коклюшного диадизатного .антигена.

При изучении 1ДА в модельной системе клеток CHQ установлено, что исследуемый антиген содержит определенное количество коклюшного токсина, так как вызывал характерные для него специфические морфологические изменения клеток (кластерообраэование), специфичность которых подтверждена нейтрапиэащ*"Ч действия анти-КТ-С' чрроткай. Показано, что из всех исследованных МКА только -иммуноглобулины гибридоыы А8 облагали способностью нейтрализовать действие ,КТ на 'СНО-клетки, причем проявляли большую активность, чем анти-КТ-сыворотка. Высокая анть-КТ-активность специфических иммуноглобулинов гибридомы А8 открывает перспективы для практического применения данных ыоноклональкых антител.

Изучение биологической активности ионоклоналышк иммуноглобулинов в тесте пассивной залдаты показало существенные различия в иммунобиологической роли отдельных ША (табл. 3). Все. изученные ША способны обеспечить защиту животных при зараае- -нии вирулентным штаммом коклюшного микроба. Наиболее выраженными протективншд свойствами обладали моноклональные антитела гибридом А8 и EIQ, РД^ которых составляла 11,8 и 12,8 ыкгпо белку, соответственно. Высокие протективные свойства проявляли UK& гибридом А8 и SIC, принадлежал^« к разным классам иммуноглобулинов (в и ig и ), что указывает на участие в защите мышей ov коклюша иммуноглобулинов 11 и о . Установлено, что защитная активность изученных МКА выше превентивных свойств коклюшного гамма-глобулина, ввделенного из гипориммунных сывороток мдаей,

'Гакии образом, МКА, полуденные к коклшному дкализаткому антигену, обладали выраженной способностью предотвращать гибель ишей от сьрацения вирулентной Культурой в,pertuaeie . Выраженная протективная активность ЫКА служит основанием для соэ-дашы на /х основе профилактически1' и диагностических репара-

TOB. • • . " ■ \ - ' ' \

á рез'цьткте проведенных ксследораний получены стабильные, технологичные гибридные культуры, продуцирующие моноклональные адгчтвла, которые могут служить тончим инструментом изучения иммунобиологических сеойсть отдельных антигенных детерминант Кикдю :огс микроба и базой для создания усовершенствованных диагностических препаратов.

' - Таблица 3.

Иммунобиологические свойства моноклонаяьных антител к ко шлейному диализатному антигену.

i'. о

! . ) • !кол-во7 i ! Специфичность ЫКА

,Класс m „ _ _ „ _ ¡белка РД=П } - к антигенам »оклепн^и',»

МКА ¡иммуно- Т и т р ы в Г ас ' "оО |Эш,т0П I микроба

- -______!Tí™f-¡ по Í ш

дои ,лияов ,-----,-----,-----j------, кой j б j . _ | кый j поли— } ткноч

I t РПГА PA I \Ж » ШФ- ! ! токсин jesxa- гены ___i________!__________!м®/мл1___!____1____1рид_ JJLkJu

А8 G"^ 1:10240 1:2046 .1:1000000.1:10000 23 11,8 I + + '•■■

РЗ & .1:20 1:5X2 1:32000 1:1000 " 26» 152 1У - ' +

EI0 М 1:10240 1:8 1:1000000.1:8 22 12,8 п' - -

ЬЗ & 1:20 .1:4 1:128000 1:100 24 к/и ' '. - . - . ' - '

С6 Ы 1:64 1:16 1:64000 1:320. 28 ' 153 Ш ■' • - ' - -

С9 & 1:16 1:16 1:32000 1:320 , IB, н/и .Ш - - - ."-..

. CI2 & 1:32 1:8 1:10240 1:160 17 н/и I .+ . - . . -

Коклго. ' , „

сыв-ка'- ' 128000 1:25600 1:128000 н/и , н/и Жло_ ' + + +

сер.220 ' булин) ■

х Обозначения:4 н/и - исследование не проводилось -

- положительный результат "г" Г отрицателкшЗ результат

ВЫВОДЫ:

1. При фракционировании коклюшного ди&чизатного антигена получено от 3 до 6 фракций, о^личшмтихся по содержанию белка

и углзводов, серологической, гемагглютинируюцяй и иммуногенной активностям, а также по способности формировать клеточный и гуморальный иммунный отвит у йкепдриментальних кийотных-.

2. 'Коншгироьание коклюшного диализат^ого антигена и его фракций с -полйоксидонием прйЕодило к увеличению валютных свойств препаратов, усилению и пролонгированию антительного ответа, способствовало повышении л е й ко ци тоз стимули\ующоК активности и ги-перчувствктзльности замедленного типа, что дает возмошооть использовать денные препараты для создания на их основе бос клеточных коклюшных, иммуногенных препаратов.

3. Получено? стабильньрс гибридных культур, продуцируюцих высокоспецифические монсклональкке.антител к коклюшному диали-затному антигену, которые распознают о его составе 4 антигенные детерминанты, обладают высокой активностью в различных серологических реакциях.

4. МоноклонЕЛЬные антитела гибридом А&, 01?. и Ь'З, подученные к коклюшному диализатиому антигену, распознают в его сос-. таве коклюшный токсин и аггльтиногены 2 и 3. Наличие данных антигенных субстанций, играющих важную роль в формировании проти-вококлюшного иммунитета, позволяет рекомендовать коклюшный дна-лиэатный антиген в качестве нового компонента бесклеточной коклюшной вакцины. Моноклокальныз антитела гибридом Е10, Сб, С9

и Е8 взаимодействуют с антигенными детерминантами других субстанций Б.рзхЧиааЗ-о , входящих в-состав .коклюшного диашпатного антигена. •

5. Полученные моноклональные антитела способны обеспечить зшциту животных при заражении вирулентный штаммом коклюшного микроба. Наиболее выраженными протективныш свойствами обладали ЫКА гибридом АВ и ЕЮ, принадлзжащих к двум разным классам иммуноглобулинов - Ы и О . ША гибридзмы А8 проявляли нейтрализующие свойства в отношении коклюшного токсина в модельной системе клеток ОНО.

6. лоноклоь&пьные антитело гибркдомы А8, полученной к коклюшному диализатному антигену, с- большей эффективностью, чем судестгущие коммерческие факторные сыворотки, позволяют дифференцировать ц.рв.-ЛизэАв от других изученных предстазитглзй рода Вогав(.в11а,

' СПИСОК РАБОТ, ОПШ1ЖОВАННЫХ ПО 'ШЕ ДИССЕРТАЦИИ:1

1. Фракционирование коовшнэго диализатного антигена // Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентод,' молодых ученых и специалистов РОДНМИ. - Ростоз-иа-До5!у, 1988. - С.83.

2. Получение глоноклопальных антигел против коклюшного диализатного антигена //Программа и аннотация докладов "дня науки" студентов, ыолодйх ученых / специалистов Р0ДК.1И. - Росгов-на-Дону, 1989. - С.74. '

3. Характеристика фракций кзклюшного протективного антигена, полученных на ИК-зв! " Тоуорог-г1 н;7-55Р " /Хюкапкпна С.О./, - //Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентов, молодик ученых и специелистов РОДНМИ. - Ростов-на-Дону, 1989.-С.73. • • '

. 4.' Иицунойиологическая характерагтика фракций коклюшного протективного антигена /Красильнлков 11.3./'. - //I съезд Всесоюзного общества ишфнологов: Тез. докл. - У.,1989. - С.396.

5. Серологические и протективные свойства фракций коклга-ного Диализатного антигена /ГЬкавкина С.Ю./.- //Микробиология, ймцунология и эпидемиология особо опасньл инфекций: Матер, обл.. конф. молодых ученых. ^ Ростов-на-Дону, 1989. - С.27.

6. Получение тшиных ыоноклональних антител к коклюшному . диалиэатнону антигену //Теория л практика эле^рооптаческого

исследования коллоидных систем: Матер. Зсесоюэ. науч. конф. -Ободенск. 1989. - С. 105-107.

7. Использование моноклепальных антител в иммунологических :реакциях при изучении фракций коклюшного диализатного антигена/ Алексеева JI.II.yi - // I съезд иммунологов России: Тез. докл. -Новосибирск, 19Л. - С.95.

8. йыявлониа коклюшного токсина вкоклзипкоь. диализатном

■ антигена /Сальникова О.Л./. - // Иммунология и спзцпрофилак'.'ика •ООН: Иатер. Рос. науч.; конф. - Саратов, 1993. - С.301. -

.Чойпи<и но /и га/ги- С/. ОУ-,. ФфЬмат. $0*34 7оиигага оуиг&ндл,

ПАтать с^гвт^-о^. У ¿е. г. У. Заг.а^

\; . • У. '1'М'