Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства детоксицированных токсических субстанций коклюшного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства детоксицированных токсических субстанций коклюшного микроба"

^ ~ 9 Я 7

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

СВОЙСТВА ДЕТОКСИЦИРОВАННЫХ

ТОКСИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЙ КОКЛЮШНОГО МИКРОБА

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

На крапах рукописи

/ДРСЕЕВЛ

03. 00. 07 - Микробиология

Ростов-на-Дону

1992

Работа выполнена в Ростовском ордена Друкбы народов медицинском институте.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Москаленко Е.И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Чупринина Р.П., доктор медицинских наук, профессор Геылешко Х.П.

Ведущая организация - Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.

Защита состоится "_" _ 1252 г. в _часов

на заседании специализированного совета Д.084.53.01 при Ростовском ордена Дружбы народов медицинском институте /344718, г. Ростов-на-Дону, пер.Нахкчиванский, 29/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского ыедац

Ученый секретарь специализированного совета доцент

Корганов Н.Я.

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

:eprdiAKfiajibHOGTb проблемы. В настоящее время вакцинопрофилактика

остается одним из наиболее эффективных способов борьбы с коклюшной инфекцией. Использование цельноклеточной коклюшной вакцины явилось причиной значительного снижения заболеваемости и летальности в СССР и за рубежом (Захарова Н.С.,1987; Сигаева Л.А., 1986; Mancklark ,1985). Тем не менее, применение корпускулярной вакцины очень' дискутабэльно вследствие местных и общих реакций, вызываемых ею (Брагинская В.П., I990;Baraff »1989; Hewlett ,1989). Присутствие в корпускулярной вакцине коклюшного токсина в неде-токсицированной форма (Ashworth ,1987; Cameron ,1987) приводит к развитию неврологических осложнений, таких как энцефалопатии, необычный и продолжительный крик, конвульсии, коллапс (Munoz ,1987; Cob.,1989), а также наряду с ЛПС обусловливают пирогенность коклюшных вакцин (Bannatyne ,1987; Ishida ,1989). Blimbarg (1988), Baraff (1989) установили,что пронзительный крик у детей,являющийся следствием местной реакции на иммунизацию,коррелирует с высоким уровнем лейкоцитоза,а также с токсичностью вакцин,выявляемой в тесте изменения массы тела мышей. Несмотря на это, отказ от про-тивококлюшной иммунизации не является оправданным,так как снижение удельного веса популяции вакцинированных детей в некоторых странах вследствие боязни развития поствакцинальных осложнений привело к росту заболеваемости коклюшем (Сухарева М.Е., Мохоп , 1990). В связи с этим разработка эффективных вакцинных препаратов со сниженной реактогенностью является актуальной задачей и имеет важное практическое значение.Создание ареактогенных коклюшных вакцин,по мнению ряда исследователей (Смирнов В.Д.,I99I;Cock-1е,1989),может быть связано с применением бесклеточных препаратов , содержащих токсические и антигенные субстанции B.perrtu33l3 ,

детоксицированных химическими и генно-инженерными методами.Причем, все предложенные в настоящее время бесклеточныэ вакцины содержат коклюшный токсин,рассматриваемый как главный протектив-ный антиген featо »I987;Savace ,1990). Однако следует подчеркнуть, что один коклшный токсин менее эффективен,чем цельнокле-точная коклюшная вакцина или коклюшный токсин в сочетании с другими антигенам: вакцины,содержащие только KT,стимулируют более высокий уровень антителообразования ( тП-сгЪг, I9S9; Sav^tp Д990). но'оказывают менее выраженный защитный эффект ( Marwick,1988). Поэтому целесообразно включение в бесклеточные коклюшные вакцины и других антигенных субстанций, таких как филаментозний гемагглю-тинин (ФГА),агглютиногеш, протеины внешних мембран ( Edwards,

1989? Мозсоп,199°5 îreston,l990),

При конструировании коклюшных вакцин применяются различные методы детоксикации, однако, наиболее широко используется формальдегид, обладающий высокой реакционной способностью при взаимодействии с аминокислотами и белками (Волков B.C.,1985;Костина Г.И., Povcrenny ,1975). Предложенные в настоящее вреш бесклеточные коклюшные вакцины, детоксицированнно формальдегидом,обладают меньшей реактогенностью по сравнению с корпускулярной коклюшной вакциной, но обусловливают более низкий процент защиты иммунизированных детей ( Gearing ,1987; Iferv/iclc ,1988). Кроме того, у вакцинированных бесклеточными коклюшными вакцинами на 50 % чаще,чем у новакцинированных развиваются инвазивные бактериальные инфекции ( l'-iti'ii; ,1988). Поэтому необходимость усовершенствования инактивации токсических субстанций коклюшных бактерий для получения препаратов с максимально сниженными токсическими и высокими протективными свойствами не вызывает сомнений.

Црльк> настоящего исследования явилась разработка метода де-

токсикации ультразвукового коклюшного антигенного комплекса,содержащего КТ, ЛПС, агглютиногены и другие субстанции коклюшного микроба, с помощью формальдегида и его аминопроизводных как ос-нозы выбора оптимального режима получения ареактогенннх коклюшных вакцин.

• Цель исследования определила необходимость решения следующих задач:

1. Изучить инактивирующев действие формальдегида и его аминопроизводных на токсины ультразвукового коклюшного антигенного комплекса.

2. Исследовать антигенную активность токсических субстанций, входящих в состав ультразвукового коклюшного антигенного комплекса, после воздействия формальдегида и его аминопроизводных.

3. Изучить токсические и имм^ногенные свойства ультразвукового коклюшного антигенного комплекса, инактивированного формальдегидом и его аминопроизводпнми.

4. Установить некоторые механизмы датоксикации ультразвукового коклюшного антигенного комплекса под влиянием формальдегида.

5. Определить роль отдельных компонентов коклюшных бактерий в формировании противококлюшного иммунитета.

По результатам проведенных исследований на защиту выносятся следующие основные положения: ,

- преимущество использования для инактивации токсинов ультразвукового коклюшного антигенного комплекса температурного режима +45 °С по сравнению с детоксикацией при температуре +37 °С;

- более высокая эффективность применения форшльдегида для инактивации токсинов ультразвукового коклюшного антигенного комплекса по сравнению с его аминопроизводными при +45 °С;

- предложенный детоксицирующий режим обеспечивает инактивацию

5

КТ, но не ЛПС, входящих в состав ультразвукового коклюшного антигенного комплекса;

- формальдегид и его аминопроизводные в избранном температурном режима по-разному влияют на жизнеспособность коклюшных бактерий и активность токсических субстанций;

- токсоидированный с помощью формальдегида при 45°С ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс сохраняет выраженные антигенные и имодуногенные свойства; не обнаружено связи между иммуно-генностьго детоксицированного ультразвукового коклюшного антигенного комплекса и его гистаминсенсибилизиругадей и лейкоцитозстиму-лирующей активностью.

Научная новизна:

В результате проведенных исследований разработан метод деток-сикации ультразвукового коклюшного антигенного комплекса.позволяющий сохранить его протективные свойства.Раскрыты некоторые механизмы детоксицируюцего эффекта формальдегида на модели ультразвукового коклюшного антигенного комплекса.Уточнена роль отдельных компонентов коклкшннх бактерий в формировании специфического иммунитета.

Теоретическая и практическая значимость работа:

Обоснована эффективность применения повышенного температурного режима +45 °С для детоксикации ультразвукового коклюшного антигенного комплекса .формальдегидом, а также вскрыты некоторые механизм ннактивирукщего влияния формальдегида и его аминопроиз-водных на токсины коклюшных бактерий, определены, особенности формирования противококлюшного иммунитета.Созданы новые подходы к формолинактивации токсических субстанций коклюшных бактерий, которые открывают перспективы создания более эффективных методов получения вакцинных препаратов,обладающих высокой протективной

активностью и сниженной токсичностью.По материалам исследований получено положительное решение на изобретение.

Апробация работа:

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых и специалистов РОДНМИ (Ростов-на-Дону,1990,1991), на конференции молодых ученых MHMSM им. Г.Н.Габричевского (М.,1991),. на У1 съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991).

Публикация материалов исследования:

По теме диссертации опубликовано 5 работ, имеется положительное решение на изобретение.

Структура и объем диссертации: Работа изложена иа 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, двух глав собственных исследований, главы обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. Материал иллюстрирован 30 таблицами и 7 рисунками. Библиография содержит 255 источников, в том числе 209 зарубежных.

Материалы и методы исследования:

В качестве исходного материала для получения исследуемого коклюшного антигенного комплекса использовали бактерии В.р<zrz.tuss>LS штаммов 305, 345 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасевича).выращенные на среде КУА в течение 48 часов. Корпускулярную коклюшную вакцину (ККВ) получали в соответствии с МРТУ И 262-68.Ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс получали с помощью ультразвуковой дезинтеграции коклюшных бактерий в соответствии с указаниями, описанными Е.П.Москаленко с соавт. в заявке "Способ дезинтеграции коклюшных бактерий" (A.C. № 975020). Детоксикацию ультразвукового коклюшного антигенного комплекса проводили с помощью форм-

7

альдегида (ФА), а также растворов, содержащих 0,033 ФА и 0,015М аминокислоты (глицин, лизин, £-лэйцин), 0,033 М ФА и 0,07 М аминокислоты, при температуре 37°С и 45°С в течение 48, 72 и 96 часов.

В предварительном исследовании было изучено влияние формальдегида на жизнеспособность коклюшных бактерий. С этой целью использовали бактериальную взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия (pH 7,2) густотой 100 ОЕ/мл. В качестве инактивирукщих веществ применяли раствор формальдегида в концентрации 0,012 М и его аминоцроизводные, полученные при соединении равных объемов формальдегида и 0,15 М раствора аминокислоты (глицин, лизин, ■£-лейцин). Через 2,3,4,6 и 24 часов инкубации бактерий с детоксици-рующими растворами производили высев по 0,1 мл взвеси на среду КУА. .

Токсические свойства исследуемых препаратов, выявляемые в тесте изменения массы тела мышей, определение ЛСА, ГСА, ГАА, а также защитные свойства, контролируемые при интрацеребральном заражении, были проверены в соответствии с "Инструкцией по отбору,проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий" (М.,1987). Токсичность оценивали и по влиянию на антителообразую-щие клетки (АОК) ("Способ определения токсичности коклюшных вакцин" (Москаленко Е.П. с соавт., A.C. Ji I32I227 от I марта 1987г.).

Исходный и детоксицированный ультразвуковой коклшный антигенный комплекс исследовали в системе общепринятых серологических тестов: РИГА, РТ11ГА, РНАт, а также ИФА„ Реакции,основанные на феномене пассивной гемагглютинации,ставили микромотодом в аппарате "Такачи" с использованием эритроцитарного коклюшного ультразвукового, диализатного и ЛПС-диагностикумов. С целью определения количественного содержания коклюшного токсина в исходном и детокси-

S

цированном ультразвуковом коклюшном антигенном комплексе использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА). Тест-система для ИФА была любезно предоставлена В.Д.Смирновым (Уфимский НИИВС им. И.И.Мечникова). Изучение антигенных особенностей исследуемых субстанций проводили на мышах Ва1Ъ/с массой 14-16 г при однократ-но.й внутрибрюшинной иммунизации коклюшными препаратами в дозэ 40, 6, I мкг в объеме 0,5 мл. На 14 и 28 сутки после иммунизации у мышей брали кровь путем дехапитации и определяли наличие в ней специфических антител в системе серологических реакций (РПГА, РТПГА, ИФА). Для постановки РПГА использовали эритроцитарный коклюшный ультразвуковой и диализатный диагностику?,и. Определение количественного содержания в сыворотках антител к КТ проводили с помощью ИФА.

Иммунологическую безвредность дэтоксиднрованных препаратов исследовали в соответствии с РД 42-28-10-90 "Порядок и ттода контроля иммунологической безопасности вакцин.Методические принципы" (М.,1989) путем определения функциональной активности рэгулятор-ных Т-лимфоцитов и поликлональной активности В-лимфоцитов.

Статистическую обработку цифрового материала проводили с помощью критерия Стыедента, а также регрессионного анализа на микроЭВМ "Электроника-60", программа составлена на языке бэйсик.

Результат» исследования и их обсуждение:

Учитывая тот факт, что реакционная способность формальдегида с аминокислотами и функциональными1 группами белгсов значительно возрастает при нагревании, для детоксикации коклюшных препаратов был избран повышеншй температурный режим (+3?°С, +45°С).При изучении влияния детоксицирукхдих режимов на жизнеспособность коклюшных бактерии штамма 305 было установлено, что микроорганизмы тлеют различную чувствительность к формальдегиду и его амияопройз-

'9.

водным в зависимости от избранных режимов воздействия. Инактиви-

ъ

руклций эффект формальдегида был обнаружен после 4-х часов воздействия температурных режимов 37°С и 45°С, однако наиболее интенсивно процесс отмирания протекал при 45°С. Об этом свидетельствует уменьшение количества колоний при двух- и трехчасовой экспозиции. Подобные результаты были получены и при воздействии аминопроизвод-ных формальдегида: коклюшные бактерии теряли жизнеспособность после инактивации при 45°С через 3 часа3 'при 37°С - через 4 часа.Наибольшей чувствительностью микробные клетки обладали к аминопроиз-водному формальдегида и -лейцина: гибель бактерий наблюдалась уев после трехчасового воздействия даже при 37 °0. Тага»! образом, при изучении действзи продуктов соединения формальдегида с аминокислотами на коклюшные бактерии установлено, что аминокотилслышо производные,как и формальдегид, вызывают гибель бактериальных клеток, которые наиболее чувствительна к воздействию кнактивируа-щах агентов прл 45°С. Причем, при данном решив змшюпроязводашо оказывают более выраженный эффект на жизнеспособность микробных клоток по сравнению с формальдегидом.

Принимая со внимание указании ряда авторов на рои, в формировании протгаэококлхпного иммунитета но только КГ, признанного плавким фактором вирулентности В.ре^изахз (тЬпип, 1Э?Э;Засо, 1990), по п других токсических к антигенных субстанций, таких как <£ГЛ ( ^'огЫзюг»19881 С>и1цоД9В8), ахтлютиногоны ( Ргея1-ог5; 1930) ,про-Т01ШЫ ВП0К1ШХ мембран ( иоп1<1-К<^ка, 1930).С целью отрзботкк рэ-шшш детоксикащш был избран ультразвуковой коклгсшкыЛ антиген, представляющий собой комплексный препарат.С помощью ИФЛ было ус-тановлено.что ультразвуковой коклюшшй антиген содержит 50x10 ^ ?исг КТ,а такжо (по даннигл РНЛт)- 10х10~омкг ШЮ в перосчетс на I ьасг бедка. Крош того, на основе РИГА с факторные сыворотками

/О

коклюшного микроба в составе ультразвукового коклюшного антигенного комплекса обнаружены агглютиногены 1,2,3. Наличие ТЛТ в исследуемом препарате было выявлено в тесте изменения массы тала мышей при подсчете коэффициентов регрессии,характеризующих разность массы тела на I и 2 сутки по сравнению с исходными.

■Сравнивая детоксицирующее влияние формальдегида и его амино-производных в тесте изменения массы тела мышей при различных температурных режимах детоксикации (37°С и 45°С, 48 час.),мы установили (рис.1), что как при использовании формальдегида, так и его аминопроизводных наибольший эффект наблюдается при 45 °С. При этом наилучшим шактивирующим действием обладал формальдегид, а также его аминопроизводнов с глицином, о чем свидетельствуют показатели разности массы тела мншей при введении токсоидов в дозе 125 мкг на 7 сутки по сравнению с исходными, соответствующими таковым при инокуляции 10 ОЕ ОСО-3. Однако ни в одном случае снижения токсичности до контрольного уровня (изотонический раствор хлорида натрия) не отмечалось.

Более низкий детоксицирующий Э(й5ект был достигнут при использовании 0,016 М раствора формальдегида с экспозицией инактивации 96 час. В этом режиме удалось снизить токсические свойства ультразвукового коклюшного антигенного.комплекса в дозе 62,5 мкг до уровня контроля (рис.2), в доза 125 мкг - значения РМТ?_0 были ниже контрольных, однако превышали таковые,характерные для стандартного препарата (ОСО-3) (Р<0,05).

Учитывая указания ¡ктог (1987), ВагаГГ (1989) на роль КТ в формировании патологических реакций при коклюше, было исследовано влияние детоксицирующих режимов на КТ,содержащийся в ультразвуковом коклюшном антигенном комплексе,Для оценки активности КТ изучили его способность влиять на изменение массы тела мышей

II.

РиоЛ. Изменениа массы тела мышей после введения ультразвукового коклюшного антигенного комплекса и его токсоидов (0,033 М формальдегида, 0,15 М аминокислоты, 48 час.,

37 °С - а; 45 °С - б)

Условные обозначения: по оси абсцисс - дни наблюдения;

по оси ординат - разница массы тела мышей в г (Ж ),

Н—И исходный антигенный комплекс ФА

ФА + глицин ФА + лизин

р_£ ФА + £ -лейцин

____ 0С0-3

• изотонический раствор хлорида натрия

i 2 3 4 5 6 7 дни наблюдения

Рис.2. Изменение массы тела мышей после введения ультразвукового коклюшного антигенного комплекса и его токсоида

(0,016 М ФА, 96 час., 45 °С)

Условные обозначения:

0-В

й—ш

- исходный антигенный комплеко (доза

125 мкг)

-исходный антигенный комплекс (доза

/ 62,5 мкг)

-токсоид (доза 7 250 мкг) -токсоид (доза - 125 мкг) -токсоид (доза - 62,5 мкг)

- 0С0-3 (доза 10 ОЕ)

-изотонический раствор хлорида натрия

на 4-2 сутки после введения препаратов, индуцировать лейкоцитоз-и гистаминсенсибилизиругацие эффекты.

Результаты исследования показали преимущество использования температурного режима 45 °С по сравнению с 37 °С, о чем свидетельствовали данные И«1Т^_2 мышей,характеризующие токсический аффект КТ. При этом было установлено, что при экспозиции 48 часов наилучший инактивируиций эффект на КТ оказывал формальдегид в концентрации 0,033 М, а также его аминопроизводное с глицином. Однако снижение токсичности до контрольных уровней наблюдали лишь при использовании 0,016 М раствора формальдегида с экспози-•цией инактивации 96 час., о чем свидетельствовали и данные подсчета коэффициентов регрессии (рис.3).__

Е.1Т

f-

1-0

ЮТ

1-0

шт.

2-0

шт

4-2

-1

-0,09

- ----------

-в=-Ц27 ^6=-0.35

g=-0l34 8=—0,45

в=—0,39 6=-0,49

62,5 125 2so 62,5 125 250 62,5 125 250 дозы

Рис.3. Линии регрессии ультразвукового коклшного антигенного комплекса и его токсоида (0,016 М ФА, 96 час, 45°С)

Условные обозначения:

ГЦ-. - нативный антигенный комплекс

---- - гретый антигенный комплекс

•-• - нативный токсовд

•----- - гретый токсоид

Преимущество использования формальдегида с экспозицией инактивации 96 час. било показано и при изучении токсичности ультразвукового коклюшного антигенного комплекса по влиянию на АОК (рис.4): процент снижения количества АОК составил 14,7 $,что не является статистически' значимым по сравнению с контролем.Причем, используя очищенные лрс-лараты КТ и ЛПС, было установлено,что токсический эффект антигенного комплекса, в данном тесте опосредуется КТ, но не .ШС, что нэ исключает причастности к токсическому действию и других субстанций.

Использование формальдегида и его амянопроизсодных при 45 °С с экспозицией лнактпваш'л 48 чае. способствовало выраженному сни-кеюго лейкощгаозсиауллрущей активности (ЛСА). Пол этом следует отметить, что наиболее ^Щокггазтшм явилось щвмздаииа формальдегида, я такио его амшоцролзводщого с диззном, способствующее падении ЛСА до контрольных уровне з*. Результаты изучения ггст?.?лин-оечслбвлизирущвй активное*:! (ГОЛ) гоксоздов ультразвукового кок-д;::::пого антигенного яошлокса доказали, что при экспозиции инактивации 48 час. шксолзэ эффективный является использование формальдегида в катостве дехокстщрутгв!.« ззиоства при таглторатурнсм рзтаю '15 °С: ПЗДе-0 тсксоидз на 5 су тюх составила 91,2 ота\ тогда как ГСДЦ0 исходного антигенного кемахазез - 04,67 тег. При -этом '.г':.'лненчя шэо.шкт'шке"! лктпглюсти атг^игенного кслдкекса при •^токаяягщп г г.в лвлосъ, тогда тли псяользо-

'¿зак'.з 8г.?шояпс'^зодита: ^с'.ллхпегэдга о гд-пншом д ^.-лоЗч^жн лр-чводп.^о к ;.5хо?орсму сн^есчиго 'ъштих сзоМсгп,

При сцояко лвйкоготопекг'у^'.фуг.-дей н гис?сю:нсонспс;:*дазпруп-г,зй акялапостг: дпглучхд''' потоксишфугцч2 оффокт ¿•ор:.*?! "лзгцда Сил обкарукоп яри удлинения скспоз'пщи тгагггязащш до 96 час: отмочено ортойияо ЛСА исходного екгпгочного дегдтдодол до кокт-

15.

, 0,0331,5 ФА /45°С„ 48 час./

Рис.4. Влияние ультразвукового коклюшного антигенного комплекса и его токсоидов на АОК

рольных уровней (табл.1), что не сопровождалось изменением про-тективной активности. Учитывая данные Хутяа (1984) о том, что бесклеточные коклшные препараты могут индуцировать позднюю сенсибилизацию к гистамину у подопытных животных, была изучена ГСА дотокГсицированного ультразвукового коклюшного антигенного комплекса не только на 5 сутки, но и на 12 сутки после введения препаратов. В результате проведенного исследования было показано, что детоксикация с помощью формальдегида в точение 72 и 96 час. приводила к падении гистаминсенсибилизирующэй активности как на 5, так п на 12 сутки: ГСД50 составляла в обоих случаях >> 125 ыкг.

Воздействуя на клетки лимфогемопоэтической системы, КТ способствует накоплению Т-супрессоров, что может иметь самые неблагоприятные последствия для организма. При определении характера воздействия исходного и детоксицированного антигенного комплек-16

Таблица I

Иммунобиологические свойства ультразвукового коклюшного антигенного комплекса и его токсоида (0.016М ФА,45°С,96час)

Показатели

Ультразвуковой коклюш-!ный антиген-!ний комплекс

{Токсоид

ОСО-3

10С0— 51

\ ! I I

ккв

4 ! 5 1 6

I.Количественное содержание токсических субстанций на I мкг белка

( ь ■■

ЪоЗлюшный токсин

ЖС

2.Токсичность:

-ГСДсП на 5 сутки на 12 сутки

-ЛСА (ЬЩ)

-РМТ7_0

3.Антигенность:

-уровень антителооб-разовмтя** к:

а)коклюшному токсину (ЕД/мл) на 28 сут.

б)ультразвуковому коклюшному антигену

(1# ) на 14 сут.

в)коклюшному диализат-ному антигену () на 14 сутки

4.Протективность (количество препарата,содержащее 5 МЗЕ)

5 .Имму но логическая безвредность5? : -способность к индукции Т-супроссоров (индекс эдфектипн.)

50x10 шг не опред. 10х10~3мкг ЮхЮ~эмкг

58,88 мкг 42,66 мкг

3,5х

-1,6х

120 95 37

2,02 1,81 1,2

1,88 1,72 1.3

>125 мкг >125 мкг

0.1

2,74х

98 57 45

1.9 1,88 1,15

1,64 1,72 1.2

100x10" мкг

- 5.89 ОЕ

- >10 ОЕ

3,26 2,3х

27,99 мкг 36,9 мкг 10 ОН

0,25* 0,26* 0,35

1,17

0,73г

1,87х

71 32 29

2,05 2,17 1,75

1,94 2,0 1,0

0,7

X

Ц ''

Продолжение таблицы I

Т 2 3 4 5 6

- способность к поли-клональной стимуляции В-клеток (индекс стимуляции) 3,6х.. 2,27х 1,1 1,6х 0,7 - - 3,6х 2,1х 1.5

ПРИМЕЧАНИЕ: х - достоверное отличие от контрольных показателей (Р<0,05)

хх - дозы введения ультразвукового коклюшного антигенного комплекса и его токсоида - 40 мкг, 6 мкг, I мкг; ККВ - 10 ОЕ, 2 ОЕ, 0,5 ОЕ.

са на функциональную активность Т-лимфоцитов, обнаружено, что исходный антигенный комплекс, как и ККВ, обладает выраженной Т-супрессорной активностью. При этом следует отметать, что прогревание коклюшного антигена при 45°С в течение 48 часов без инакти-вирующих веществ, как и обработка формальдегидом с экспозицией 48 и 72 час., а также аминопроизводными формальдегида с глицином и лизином влияния на способность антигенного комплекса индуцировать Т-супрессоры не оказывала. В то же время при использовании с целью инактивации соединения формальдегида и ^-лейцина.наблюдали повышение активности Т-супрессоров лишь при введении животным токсоидов в дозе 40 касс, тогда как при инокуляции меньших доз препаратов (6 мкг и I мкг) не обнаружено отличий активности Т-супрессоров опытных и контрольных групп животных. Удлинение экспозиции инактивации формальдегидом до 96 час. привело к полной отмене Т-супрессорной активности антигенного комплекса, введенного в дозе 40 мкг и 6 мкг. Более того, при инокуляции лабораторным животным токсоида в дозе I мкг наблюдали стимуляцию активности Т-хелперов: индекс эффективности составил 1,87. Такой эффект «окет бить связан не только с инактивацией Т-супрессорной

Л?

активности КТ, входящего в состав антигенного комплекса, но и наличием в препарате ЛГ1С, обладающего противоположно направлении коклюшному токсину действием.

Исследование антигенных свойств позволило установить, что ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс, как и его токсоидиро-ванный формальдегидом препарат (45°С, 96 час.), способствует синтезу антитоксических антител,выявляемых в ИФА (рис.5), несмотря на то, что в токсоидо содержание КТ, регистрируемое в ИФА,снижается до неопределяемых уровней. Это согласуется с данными АзН-стогЧЬ (1987) о том, что потеря активности в ИФА при обработка коклюшного токсина формальдегидом не ведет к утрате его способности к индукции токсин-нейтрализугощгос антител. Результаты РИГА с ультразвуковым коклюшным и диализатным диагностикумами показали (табл.1), что ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс, так те как и его токсоид,обладает выраженными антигенными свойствами, способствуя синтезу антител у экспериментальных животных. Получение данные свидетельствуют о сохранении антигенной активности ультразвукового коклюшного антигенного комплекса после детоксицпруга-г;их воздействий, что позволяет предположить возможную роль антител гс КТ и коклюшным антигенам в формировании защитных реакций.

Учитывая данные литературы о роли ЛПС в формировании поствакцинальных осложнений, а также протективных свойств корпускулярных коклюшных вакцин (Лапаева И.А. ,1930;Запла.£упе. ,1987), было изучено влияние детоксицируклшх режимов на ЛПС,содержащийся в ультразвуковом коклюшном антигенном комплексе.Результаты РНАт показали, тео изменения антигенных свойств ЛПС при использовании.различных режимов инактивации не происходит,тогда как токсическая активность ЩС„ по данным теста изменения массы тела мишей,несколько снизилась,о чем свидетельствуют значения коэффициентов регрессии Е.!Т

19

ВД/мл

14 сутки

100 -

50 "

!

40лкг I00E

100 .

50

ВД/мл

бмкг 20Е 1мкг 0,50Е 28 сутки

i

1

0 _

40мкг 100Е бмкг 20Е . 1ккг 0,50Е Рис.5. Содержание анти-КТ-антител у мшэй линии Bafô/c

после однократного введения ультразвукового коклюшного антигенного комплекса и его токсоида (0,016 M ФА, 96 час., 45 °С)

Условные обозначения:

- исходный антигенный комплекс | | - токсоад

- ккв

на I и 2 сутки по сравнению с исходными. Возможно, это объясняется модицикаДией термостабильного токсина, маркером которого является ЛПС, за счет инактивации белкового компонента. В то жа время результаты экспериментов показали, что после детоксикации сохраняется способность ЛПС к поликлональной стимуляции В-клеток: использование формальдегида и его гминопроизводных с целью детоксикации при введении экспериментальным животным в дозе 6 мкг не приводило к устранентю статистически значимых отличий от контрольных показателей: индекс поликлональной стимуляции во всех случаях превышал единицу, что свидетельствовало о сохранении активности ЛПС.

Совокупность представленных данных, отражающих характер воздействия детоксицирущих режимов на токсические субстанции ультразвукового коклюшного антигенного комплекса, свидетельствует о перспективности использования формальдегида при 45 °С с целью получения препаратов со сниженной токсичностью и выраженными про-тективннми свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Обработка ультразвукового коклюшного антигенного комплекса, содержащего набор токсических (КТ,ЛПС,ТЛТ) и антигенных (агглюти-ногены.гемагглютшпш) субстанций коклшкого микроба, при 45 °С способствует более эффективному» чем при 37°С снижению токсических свойств.

2. Инаятивирующий эффект формальдегида и его ампнопропзводных на токсины ультразвукового коклгашого антигенного комплекса при 45 °С обусловлен экранированием токсической активности субстанции белковой природы, но не ЛПС,входящих в его состав, о чем свидетельствует кырзгатюе снижение ле»жоцитозсти;.7лируюсо;: г. гистаг.сгн-сэнсибплизирувдей активности коклкгксго токсина, г также глосс'-

кости этого токсина и ТЛТ оказывать токсическое влияние на прибавку в весе мышей, тогда как активность ЛПС, проверенная в ряде тестов, сохраняется.

3. Установлено преимущество использования при 45°С формальдегида с целью инактивации токсинов ультразвукового коклюшного антигенного комплекса по сравнению с его аминопроизводными, позволяющего снизить токсичность антигенного комплекса до контрольных уровней.

4. Обнаружены различные эффекты под воздействием детоксициру-ющих режимов на жизнеспособность бактерий и токсические свойства антигенных субстанций: наибольшим летальным эффектом на бактерии обладают аминоцроизводные формальдегида, высокий же уровень инактивации токсина наблюдается под действием формальдегида.

5. ТоксоидированныЙ формальдегидом цри 45 °С ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс является полноценным антигеном,способствующим формировании защитных реакций в организме экспериментальных животных, тогда как использование с целью-детоксикации аминопроизводных формальдегида с глицином и -лейцином приводит к некоторому снижению протективной активности исходного антигенного комплекса.

6. Не обнаружено взаимозависимости между иммуногенной активностью токсоидов и их способностью сенсибилизировать организм лабораторных кивоных к гистамину, а также стимулировать лейкоцитоз. Токсоидирование формальдегидом коклюшного антигенного комплекса способствовало снижению лейковдтозстиадулирущей и гистаминсенсиби-лизирующей активности при сохранении защитных свойств.

7. Протективная активность токсоидированного формальдегидом ультразвукового коклюшного антигенного .комплекса обусловлена присутствием в нем не только инактивированного коклюшного токсина,

г г

ко и других субстанций коклюшного микроба.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние формальдегида и его аминомэтилольных производных на гистаминсенсибилизируюдае свойства ультразвукового коклюшного антигена // Программа и аннотация докладов "Дня;', науки" студентов, молодых ученых и специалистов РОДНМИ. - Ростов-на-Дону, 1990. - С.80.

2. Влияние формальдегида и его аминометилолышх производных на токсические свойства ультразвукового коклюшного антигена // Научно-практ.конф., посвящ. 60-лйтию ГОДНЫЙ. - Ростов-на-Дону, 1990. - С.385-386.

3. Влияние формальдегида и его аминопроизводных на продукцию антитедообразуювдх клеток у экспериментальных животных // Программ и аннотация докладов "Дня науки" студентов, молодых ученых и специалистов РОДИЛИ. - Ростов-на-Дону,1991. - С.53.

4. Детоксикация ультразвукового коклюшного антигенного комплекса формальдегидом и его аминопроизводннми (Москаленко Е-П., Поверенный A.M.) - // У1 Всероо, съезд мшфобиологов, эпидемиологов и паразитологов. -Нижний Новгород,1991. -C.I9I-I92.

5. Иммуногенные и антигенные свойства детоксицированного ультразвукового коклюшного антигенного комплекса // М„с199.I, -2 с. - Рук. деп. в ВИНИТИ й 21474.

6. Опособ получения коклюшного .антигенного комплекса (¡/.оека-пэнко E.1I., Поверешшй A.M., Ильина С.И,) - // Заявка й 48809/14 (108652), положитольноа решение от 27.05.91 г.