Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и анализ активностей регуляторных элементов хромосомы 19 человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и анализ активностей регуляторных элементов хромосомы 19 человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и ЮА Овчинникова

На правахрукописи

РУДА ВЕРА МИХАЙЛОВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ АКТИВНОСТЕЙ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук С Б. Акопов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор П.М. Рубцов кандидат биологических наук М.А. Эльдаров

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится 30 марта 2005 г. в 10 часов на заседании Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.АОвчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 28 февраля 2005 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Д.х.н., профессор

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Геном человека содержит около 40000 генов, всего один процент генома непосредственно кодирует белки. При этом он содержит огромное число функциональных элементов, не кодирующих белки. Так, более половины генома представлено повторяющимися элементами, которые содержат сотни тысяч регуляторных последовательностей, способных влиять на экспрессию генов (Lander et al, 2001). Примерами могут служить энхансеры, промоторы и терминаторы транскрипции, участки, ответственные за образование комплексов ДНК и РНК с белками, сайты интеграции ретровирусов, области начала репликации, инсуляторы и т.д.

' Картирование таких последовательностей поможет лучше понять механизмы регуляции на уровне всего генома. Более того, исследование геномных последовательностей, окружающих эти элементы, позволит изучить регуляторные механизмы, определяющие активность отдельных генов.

Однако, многие регуляторные элементы невозможно

идентифицировать, исходя исключительно из их нуклеотидной

последовательности, для этого требуется непосредственный анализ их

активности. Следует учитывать, что в геноме они существуют в составе

хромосом, каждый элемент - со своим уникальным окружением,

способным влиять на его активность. Примером последовательностей,

содержащих ряд различных взаимодействующих между собой

регуляторных элементов, являются длинные концевые повторы

эндогенных ретровирусов (LTR - Long Terminal Repeat), содержащие:

ТАТА-бокс, участки связывания ядерных факторов и сигнал

полиаденилирования. В геноме человека присутствуют тысячи таких

1

регуляторных комплексов. Многие эндогенные ретровирусы обладают транскрипционной активностью, а одиночные иГЯ способны влиять на экспрессию близко расположенных генов.

Следовательно, должны существовать механизмы, ограничивающие влияние регуляторных комплексов в составе генов или повторяющихся элементов на другие гены. Эту роль, возможно, играют последовательности, обладающие инсуляторной активностью, т.е. способные нейтрализовать действие окружающих последовательностей на ген. Эта активность (в экспериментальных условиях) проявляется в защите трансгена от эффекта положения, а также в «экранировании» промотора 01 дистально расположенного энхансера. За последние 15 лет инсуляторы были обнаружены в геномах растений, беспозвоночных и позвоночных животных. С практической точки зрения инсуляторы могут быть использованы для разработки систем генной терапии и трансгеноза, а именно для создания системы экспрессии гетерологичных генов, не зависящих от эффекта положения, и не влияющих на окружение. На сегодняшний день отсутствуют данные о функциональных исследованиях протяженных участков геномов, целью которых было бы выявление в них инсуляторов.

Недавние успехи секвенирования геномов открывают перспективы для нового направления - функциональной геномики, то есть для конструирования карт генов и транскрибируемых последовательностей и выявления их биологических функций и механизмов взаимодействий при помощи всей совокупности генетических, эволюционных и биохимических методов.

Данная работа направлена на решение фундаментальной проблемы биологии - картирование регуляторных элементов генома человека и изучение их свойств.

Цели и задачи работы.

Целью настоящей работы являлось изучение свойств различных типов регуляторных элементов генома человека. Работа состояла из двух частей: первая была посвящена изучению тканеспецифичности промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей LTR, принадлежащего семейству HERV-K(HML-2), а вторая - выявлению участков ДНК хромосомы 19 человека, обладающих инсуляторной активностью. Для решения второй задачи необходимым этапом было создание метода, позволяющего проводить поиск инсуляторов в протяженных участках ДНК.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- в различных клеточных линиях определить транскрипционную (промоторную и энхансерную) активность индивидуального LTR семейства HERV-K(HML-2);

- оценить влияние негативного регуляторного элемента (НРЭ) в составе LTR на его активность в различных клеточных линиях;

- исследовать инсуляторную активность участков ДНК, связывающихся с ядерным матриксом (S/MAR-элементов - Scaffold/Matrix Attachment Region), в условиях временной трансфекции;

- разработать метод, позволяющий проводить поиск инсуляторов в протяженных участках ДНК;

- применить разработанный метод для выявления инсуляторов в локусе хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и Сох7А1;

- построить карту распределения инсуляторов в локусе хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и Сох7А1.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые было проведено комплексное исследование промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей одиночного LTR семейства HERV-K(HML-2). Учитывая, что значительная часть LTR сохранила свой регуляторный потенциал в процессе эволюции и может принимать участие в регуляции экспрессии клеточных генов, исследование свойств LTR представляется важной задачей. Нами показана зависимость транскрипционной активности LTR от типа клеток.

Нами были проанализированы пять S/MAR-элементов на наличие у них промоторной, энхансерной, сайленсерной и инсуляторной активностей. Два S/MAR-элемента проявили инсуляторную активность в условиях транзиентной трансфекции. При этом ни один из пяти не проявил промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей. Подобная схема анализа может быть использована для изучения других регуляторных последовательностей. Найденные инсуляторы могут применяться в векторных конструкциях для генной терапии и трансгеноза, а именно при создании системы экспрессии гетерологичных генов, независимой от эффекта положения.

Для проведения поиска инсуляторов в протяженных участках ДНК нами

был разработан метод, основанный на защите транскрипции репортерного гена

от влияния энхансера. Применение данного метода позволило нам выявить 8

инсуляторов в локусе хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и CoxlAl.

Была построена карта их распределения относительно известных генов и

S/MAR-элементов, ранее картированных в данном локусе. Разработанный и

испытанный нами метод позволяет выявлять последовательности, обладающие инсуляторной активностью, что чрезвычайно актуально при создании функциональных карт геномов, поскольку в настоящее время не существует иных путей обнаружения инсуляторов, кроме прямого анализа специфической активности, который является очень трудоемким при исследовании протяженных последовательностей.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 2 статьи. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

1. VI чтения, посвященные памяти академика ЮА Овчинникова (Москва-Пущино, 2002);

2. 2nd International Workshop "Retrotransposons and genome evolution" (Сочи, 2003);

3. 29th meeting on Retroviruses (Cold Spring Harbor, 2004);

4. XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005).

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 195 ссылок. Работа содержит 27 рисунков и 10 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Анализ транскрипционной активности индивидуального ЕГО семейства HERV-K(HML-2).

Для анализа активности мы выбрали одиночный ЦШ, обозначаемый в работе ЦШ Ц47334, находящийся на 19-й хромосоме человека (номер по ОепБапк # Ц47334; 19я13.2). Это - человек-специфичный полноразмерный ЦШ, отсутствующий в соответствующем локусе генома шимпанзе. Он является представителем Ш-Ь подгруппы "молодого" подсемейства семейства HERV-K(HML-2) эндогенных ретровирусов человека. ЦШ Ц47334 предположительно возник в геноме предков человека менее 5,6 млн. лет назад (ЦеЬеёеу в( а!., 2000; Бшйт в( а!., 2003). Ранее в нашей лаборатории было показано, что данный ЦШ обладает промоторной и энхансерной активностью, а также содержит в Ш-области негативный регуляторный элемент (НРЭ) (Бошашку в1 а!., 2000; Доманский и др., 2002).

Нашей задачей было определить, зависят ли перечисленные активности ЦШ от типа клеток, то есть, являются ли содержащиеся в нем регуляторные элементы тканеспецифичными. Для решения поставленной задачи нами были проведены серии трансфекций (минимум по три на каждой линии, для каждой рассматриваемой конструкции) на клетках десяти линий различного происхождения (табл.1). В экспериментах по трансфекций были использованы конструкции, позволяющие исследовать промоторную (рОЦ3Б"У) и энхансерную (рОЦ3РУ) активности изучаемых фрагментов ДНК. В них ранее были клонированы в прямой ориентации

полноразмерный ЦШ Ц47334 (П9а) или его фрагмент, не содержащий предполагаемого НРЭ (Ш9а).

Для оценки промоторной активности и проверки влияния на нее НРЭ мы сравнивали экспрессию репортерного гена (люциферазы) в клетках, трансфицированных плазмидой рОЦ3ВУД19а с экспрессией люциферазы в клетках, трансфицированных плазмидой рвЦ3ВУ/ё19а или плазмидой рвЦЗРУ, содержащей промотор вируса 8У40 (рис.1). Наши результаты свидетельствуют о наличии промоторной активности ЦШ Ц47334 (в системе транзиентной трансфекции) в нескольких исследованных линиях клеток: 293, СНО, КвР-127, ЭТ2/Б1, РЛМС-1 и Тега-1. В линии клеток РЛКС-1 мы впервые наблюдали относительно высокую активность ЦШ HERУ-K в качестве промотора.

Рисунок 1. Относительная промоторная активность HERV-K(HML-2) ЦШ Ц47334 (Ша) и его фрагмента (ё19а) в различных клеточных линиях. Активность промотора вируса 8У40 принята за 100.

Таблица 1. Зависимость активности НРЭ, промоторной и энхансерной

активности ЦШ L47334 от типа клеточной линии.

Название, код АТСС Происхождение линии* Активность промотора Активность НРЭ Активность энхансера

293 CRL-1573 Почка эмбриона + + -

СН0-К1 CCL-61 Яичник китайскогб хомячка + + -

GS Карцинома почки - - -

HeLa CCL-2 Аденокарцинома шейки матки - - -

HL-60 CRL-1964 Промиелоцитарная лейкемия - - -

Jurkat TIB-152 Острая Т- лимфобластоидная лейкемия

NGP-127 Нейроэпителиома + + -

NT2/D1 CRL-1973 Эмбриональная карцинома яичка + + -

PANC-1 CRL-1469 Карцинома поджелудочной железы + +

Tera-1 НТВ-105 Эмбриональная карцинома яичка + + +

*Все использованные линии клеток, за исключением СНО, происходят из

человеческих тканей.

ЦШ Ц47334 оказывается относительно слабым промотором по

сравнению с промотором 8У40 во всех протестированных линиях клеток

за исключением Тега-1. Это может быть связано с действием НРЭ или с

тканеспецифичностью энхансера в составе ЦШ.

Однако, исследуемый НРЭ, видимо, не обладает выраженной

тканеспецифичностью, поскольку: (1) не содержащий НРЭ фрагмент ЕГО

(Ш9а) проявил промоторную активность во всех линиях, где был активен

8

полноразмерный L47334; (2) наблюдаемое относительное увеличение промоторной активности по сравнению с полноразмерным ЦШ было во всех линиях клеток практически одинаковым (рис1). Подобный НРЭ был ранее описан в ЦШ ММГУ (Мог1еу в( а1., 1987). Наблюдаемая нами широкая тканеспецифичность исследуемого НРЭ коррелирует с полученными Д.О.Трубецким данными о широком распространении регуляторных белков, взаимодействующих с НРЭ. Этот результат особенно интересен, поскольку значительная часть одиночных ЦШ HERV-K(HML-2) в геноме человека представлена 5' и 3' делетированными фрагментами (ЦеЬеёеу в( а1., 1995; Vinogradova в( а1., 1997).

Рисунок 2. Относительная энхансерная активность HERV-K(HML-2) ЦШ Ц47334 (£19 а) и его фрагмента ^19 а) в различных клеточных линиях. Активность промотора вируса SV40 принята за единицу.

Таким образом, различия в наблюдаемой промоторной активности

ЕГО Ы7334, вероятно, связаны не с активностью НРЭ, а с активностью

9

Таким образом, различия в наблюдаемой промоторной активности ЬТЯ Ь47334, вероятно, связаны не с активностью НРЭ, а с активностью энхансера в составе ЬТЯ. Результаты, представленные на рисунке 2, демонстрируют наличие выраженной энхансерной активности у полноразмерного и частично делетированного ЬТЯ, приводящей к существенному (до восьми раз) повышению уровня экспрессии репортерного гена в клеточной линии Тега-1.

Ни в одной из рассмотренных линий, кроме Тега-1, ни у полноразмерного, ни у лишенного НРЭ ЬТЯ не отмечалась энхансерная активность. Такая тканеспецифичность может быть связана с взаимодействием ЬТЯ с белком(ами), обнаруженным(и) Д.О.Трубецким в ядерном экстракте из клеток линии Тега-1. Поскольку наличие НРЭ не снижает энхансерную активность ЬТЯ в Тега-1, при этом он также влияет на экспрессию репортерного гена, не будучи включенным в состав транскрипта (Боташку в( а1, 2000), можно сделать предположение, что он влияет на способность промотора собирать транскрипционный комплекс и/или влияет на элонгацию транскриптов.

Исследование инсуляторной активности 8/МЛК-элементов

Известно, что некоторые инсуляторы способны блокировать действие энхансера в условиях временной экспрессии, причем проявляют максимальную активность в том случае, когда ограничивают энхансер в составе плазмиды с обеих сторон (Бипа^'ау в( а1, 1997; ЯесШаз-Таща в( а1, 1999). Ранее в нашей лаборатории была создана библиотека фрагментов ДНК, способных связываться с ядерным матриксом (ЯМ)

(Мко1аеу в1 аЬ, 1996; Акопов и др., 1997; Николаев и др., 1998). Для исследования инсуляторных свойств из этой библиотеки были выбраны 8/МАК-алементы с различными характеристиками: средний по длине и сродству к ядерному матриксу элемент М0А7; короткий, с высоким сродством элемент М0В9; длинный, с высоким сродством элемент М1Н10; короткий (М2Б2) и длинный (М3в5) элементы с низким сродством к ЯМ (табл.2).

Таблица 2. Свойства последовательностей 8/МАк, использованных в работе.

Элемент Б/МАЯ М0А7 8/МАЯ М0В9 Б/МАЯ М1Н10 В/МАЯ М2?2 8/МАЯ М3в5

Источник Человек Китайский хомячок Человек Человек Человек

Длина (п.н.) 350 290 550 200 550

Относительное сродство к ЯМ* 12 55 43 1,3 7

Активность промотора - - - - -

Активность энхан-сера/сайленсера - - - - -

Активность инсулятора - - + + -

* Сродство фрагментов ДНК к ЯМ по отношению к таковой фрагментов ДНК фага А, было определено в нашей лаборатории ранее (№ко1аеу в( ак, 1996).

Способность связываться с ЯМ не исключает, однако, наличия у этих фрагментов ДНК других активностей, в том числе промоторной, энхансерной или сайленсерной. Поскольку наличие такой активности в исследуемом фрагменте ДНК может помешать оценке его инсуляторной активности, предварительно был проведен ряд экспериментов по транзиентной трансфекции в клетки линии СНО различных векторов, позволяющих оценить промоторную или энхансерную/сайленсерную

активность клонированных исследуемых фрагментов ДНК. Было установлено, что в условиях транзиентной трансфекции ни один из исследуемых S/MAR-элементов не обладает такими активностями.

1,8

SflMARPr-/дг+—S/MARBntr~

1,41,2 1,0 0,8 -0,6 -0,4-

1,6 -

0,92

0,63

Т

0,2 - 0.09 0>0 шт

PV CV М0А7 М0В9 М1Н10 M2F2 M3G5

Рисунок 3. Относительная инсуляторная активность S/MAR-элементов. Серый квадрат "Рг" - промотор, стрелка "/мс+" - репортерный ген люциферазы, черный квадрат "Enh" - энхансер.

Для проверки наличия у S/MAR-элементов М0А7, М0В9, Ml НЮ, M2F2 и M3G5 инсуляторной активности, они были клонированы в вектор pGL3CV таким образом, чтобы ограничивать энхансер с обеих сторон (рис.3). Представленные на рисунке 3 результаты указывают на способность S/MAR-элементов М1Н10 и M2F2 заметно блокировать активацию энхансером SV40 его промотора. Предварительная проверка, не выявившая других активностей, подтверждает, что здесь мы наблюдаем именно инсуляторную активность. Сравнение свойств этих S/MAR-элементов - М1Н10 с высоким и M2F2 с низким сродством к ЯМ - позволяет предположить, что сила взаимодействия с ЯМ in vitro не коррелирует с инсуляторной активностью в условиях временной

экспрессии. Способность 8/МЛЯз блокировать энхансер в составе плазмиды указывает на то, что эти элементы не нуждаются в хромосомном окружении для проявления инсуляторной активности.

Поиск инсуляторов в протяженных участках ДНК

На первом этапе были сконструированы векторы, содержащие два селективных маркера: позитивный - ген неомицин-фосфотрансферазы (№оа) и негативный - ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (ИБУ-1к, делающий клетки чувствительными к ганцикловиру - вЛКС). В качестве положительного контроля при негативной селекции была изготовлена плазмида рРМТ/СМУ-тР, содержащая в регуляторной области перед геном тимидинкиназы только минимальный промотор СМУ (придающая клеткам фенотип №оа, вЛ^Са). В качестве негативного - плазмида рРМТ/СМУ-БтР, содержащая помимо минимального промотора энхансер СМУ, усиливающий экспрессию тимидинкиназы (фенотип №оа, ОЛ^СБ).

В вектор рРКТ/СМУ-БтР между энхансером и минимальным промотором была клонирована библиотека коротких перекрывающихся (благодаря использованию двух эндонуклеаз рестрикции при получении библиотеки) фрагментов локуса хромосомы 19 человека между генами ¥ХУБ5 и Сох7А1. Таким образом, было получено около 12 тысяч клонов. При наличии у клонированного фрагмента инсуляторной активности экспрессия гена тимидинкиназы в клетках, трансфицированных таким вектором, снижается по сравнению с клетками, содержащими рРКТ/СМУ-БтР, и повышается устойчивость клеток к ганцикловиру.

Было проведено две трансфекции клеток линии СНО клонотекой. Параллельно были проведены контрольные трансфекции векторами рРКТ/СМУ-шР и рРМТ/СМУ-ЕшР. Клетки, в геном которых интегрировал вектор, были отобраны по их устойчивости к неомицину (в-418). Неомицин-устойчивые клетки затем подвергали негативной селекции ганцикловиром. Доказательством успешно проведенной селекции служила 100% гибель клеток, содержащих вектор рРКТ/СМУ-ЕшР, делающий клетки чувствительными к ганцикловиру. На ДНК из клеток, прошедших негативную селекцию, была проведена ПЦР-амплификация участка между энхансером и промотором СМУ (рис.4). Обнаруженные вставки были секвенированы и картированы в исследуемом локусе хромосомы 19 между генами ¥ХУВ5 и Сох7А1.

Исследуемый фрагмент ДНК

Рисунок 4. Схема вектора в составе геномной ДНК трансфицированной клетки. Черными стрелками обозначены праймеры для ПЦР-амплификации вставки (исследуемого фрагмента библиотеки).

По результатам двух независимых трансфекции были отобраны восемь последовательностей, проявляющих в данной системе инсуляторную активность. В первой трансфекции были выделены и секвенированы две последовательности, во второй - еще шесть, причем, первые две были выделены повторно. Обнаруженные нами

последовательности, обладающие инсуляторной активностью, представлены в таблице 3. Схема расположения идентифицированных в работе инсуляторов относительно известных генов в локусе FXYD5 -Сох7А1 приведена на рисунке 5.

Второй раунд селекции проводили с использованием отобранных восьми последовательностей, поскольку существовала вероятность мутаций в гене тимидинкиназы, способных давать искомый фенотип (NeoR, GANCr), в первом раунде селекции. Для этого они были повторно клонированы в pPNT/CMV-EmP и трансфицированы в клетки линии СНО. При этом все восемь последовательностей также проявили инсуляторную активность, придающую значительной части содержащих их клеток устойчивость к ганцикловиру.

Мы картировали идентифицированные инсуляторные последовательности и определили их расположение относительно охарактеризованных в данном локусе генов. Предполагают, что последовательности, обладающие инсуляторной активностью, разделяют цепь ДНК на «звенья» - домены, в каждом из которых находятся гены, характеризующиеся специфичным для них профилем экспрессии. Используя базу данных сервера UCSC Human Genome Browser (http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewav'). мы сравнили профили экспрессии генов в локусе FXYD5 - Сох7А1. Нами были выявлены два гена, ограниченные с обеих сторон инсуляторами (№№: 5 и 1, 4 и 8, соответственно) (рис.5). Оба гена характеризуются высокой тканеспецифичностью экспрессии, отличной от специфичности окружающих их генов. Это АТР4А - ген каталитической а-субъединицы

К+/Н+-АТФазы - «насоса» желудка и APLP1 - ген белка, сходного с предшественником Р-амилоида, предположительно функционирующий в центральной нервной системе. Данный локус содержит кластер из четырех генов семейства ассоциированных с G-белками рецепторов первого типа: GPR40, GPR41, GPR42 и GPR43. Ранее были выявлены различия в экспрессии между GPR41 и GPR43, а также высказано предположение, что GPR42 является неактивным псевдогеном GPR41 (Brown et al, 2003). Между генами GPR42 и GPR43 нами был обнаружен инсулятор (№6), возможно, способствующий независимой экспрессии GPR41 И GPR43.

Шесть из восьми проанализированных последовательностей содержат повторяющиеся элементы. №№ 1 и 8 представляют собой фрагменты LINE (Long Interspersed Element) и LTR, соответственно. Остальные частично перекрываются с Alu (№№: 2, 4 и 7) и MIR (Mammalian Interspersed Repeats) (№6). Анализируя полученные данные, можно предположить, что одной из регуляторных функций повторяющихся элементов в геноме может быть их участие в создании доменов с независимой регуляцией экспрессии генов.

Таблица 3. Инсуляторы, обнаруженные нами в локусе хромосомы 19 между генами FXYD5 и Сох7А1, и их

расположение относительно известных генов.

GenBank " Длина (пн) Координаты в локусе Повторяющиеся элементы 6 Ближайшие гены, расположенные 5' <> 3' от инсуляторов, в скобках приведено положение инсуляторов в генах "

1 AC002115 126 427857427983 L1M4 М1Р1Е14; АТР4А о СОХ6В1

2 AD001502 220 330842331061 AluSx ОРЯ43 о г052Р10

3 AD001527 181 966446966625 — РОЬЯ21; СКАР1 (интрон2/экзонЗ) о САРЫ81

4 AD000864 356 713387713742 AluSx; (CA)20 NPHS1 о АРЬР1

5 AD000090 281 392332392612 — ОАРБЗ; Ы1Р1Е14 (интрон2/экзонЗ/-/интронЗ/экзон4) о АТР4А

6 AC002511 320 219103219282 MIR (SINE) СРЯ41, 42 о GPR43

7 AD001502 230 349978350207 AluSx GPR43; 2Б52Р10 (интрон9) о ОАРБ8

8 AD000864 154 727169727322 ERV1, LTR АРЬР1 о TA-NFKBH

а - Коды доступа в GenBank соответствующих космид; — указаны повторяющиеся элементы генома,

перекрывающиеся с исследуемыми фрагментами, выявленные с помощью программы RepeatMasker

(http://www.repeatmasker.org/); в — указаны близлежащие гены, обнаруженные с помощью сервера UCSC Human

Genome Browser (http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewav).

Рисунок 5. Карта локуса 19я 13.1 хромосомы 19 человека между генами ГХУБ5 и Сох7А1. Горизонтальные стрелки соответствуют известным генам. Вертикальные стрелки обозначают положение идентифицированных нами инсуляторов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Показано наличие промоторной активности ЦТК принадлежащего семейству НЕК^К (НМЦ-2), в различных опухолевых клеточных линиях человека: 293, КОР-127, РЛКС-1 и Тега-1, а также в линии клеток яичника китайского хомячка СНО. Выявлена тканеспецифичность промотора в составе ЦТК

2. Обнаружено, что негативный регуляторный элемент (НРЭ) ЦТЯ активен во всех исследованных линиях клеток, в которых наблюдается промоторная активность ЕГО.

3. Показана тканеспецифичность энхансерной активности ЦТК

4. Из пяти исследованных 8/МЛК-алементов два проявляют инсуляторную активность в условиях временной трансфекции в клетки линии СНО.

5. Разработана система для поиска инсуляторов в протяженных последовательностях ДНК. В локусе хромосомы 19 человека между генами ГХУБ5 и Сох7А1 идентифицированы и картированы восемь инсуляторов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Публикации в научных журналах:

1. У.М. Ruda, S.B. Akopov, D.O. Trubetskoy, N.L. Manuylov, A.S. Vetchinova, L.L. Zavalova, L.G. Nikolaev, E.D. Sverdlov (2004) Tissue specificity of enhancer and promoter activities os a HERV-K(HML-2) LTR. Virus Research, v. 104, p. 11-16

2. A.B. Cacc, B.M. Руда. СБ. Акопов, Е.В. Снежков, Л.Г. Николаев, Е.Д. Свердлов (2005) Исследование регуляторного потенциала S/MAR-элементов при временной экспрессии. Биоорган, химия, т. 31, стр.77-81

Тезисы российских и международных научных конференций:

1. СБ. Акопов, А.Н.Д оманский, В.М. Руда. Д.О.Трубецкой, Е.П.Копанцев, Л.Л.Завалова, Л.Г. Николаев, Е.Д. Свердлов «Длинные концевые повторы эндогенных ретровирусов человека семейства К -анализ функциональной активности». VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, 25.11 - 2.12, 2002, Москва-Пущино (тезисы докладов, стр. 45)

2. S.Akopov, A.Domansky, V.Ruda, N. Manuylov, A. Vetchinova, D.Trubetskoy, E.Kopantzev, L.Zavalova, L.Nikolaev, E. Sverdlov "Functional activity of human endogenous retrovirus К long terminal repeats". 2nd International Workshop "Retrotransposons and genome evolution" 20 - 22.04, 2003, Сочи, Россия (тезисы докладов, стр. 13)

3. V.M. Ruda. S.B. Akopov, D.O. Trubetskoy, N.L. Manuylov, A.S. Vetchinova, L.L. Zavalova, L.G. Nikolaev, E.D. Sverdlov "Negative regulatory element (NRE) of U5-region of human endogenous retrovirus К LTR does not display cell type specificity". 29th meeting on Retroviruses, 25 -30.05, 2004, Cold Spring Harbor, New York (Abstract book, p.236)

4. В.В.Батрак, В.М.Руда «Идентификация и картирование инсуляторов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека». XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 7 - 10.02, 2005, Москва (тезисы докладов, стр. 55)

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338 тираж 100 экз. Подписано в печать 22.02.2005 г.

Бл,

1466

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Руда, Вера Михайловна

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1 Краткая история изучения ретровирусов и ретроэлементов

2.2 Жизненный цикл ретровирусов, их строение и синтез LTR

2.3 Ретроэлементы: происхождение, структура и классификация

2.4 Семейство HERV-K(HML-2)

2.5 Функциональные элементы в составе LTR

2.6 Биологическое значение LTR

2.7 Инсулятор: блокирование взаимодействия энхансера с промотором

2.8 Инсулятор: защита от эффекта положения

2.9 Структурные особенности отдельных инсуляторов

2.10 Функции отдельных инсуляторов

2.11 Преодоление активности инсулятора

2.12 Механизмы действия инсуляторов

2.13 Перспективы использования инсуляторов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и анализ активностей регуляторных элементов хромосомы 19 человека"

Недавние успехи секвенирования геномов открывают перспективы для нового направления науки - функциональной геномики, то есть для конструирования карт генов и транскрибируемых последовательностей и выявления их биологических функций при помощи всей совокупности генетических, эволюционных и биохимических методов. Было установлено, что непосредственно последовательности аминокислотных остатков во всех белках закодированы одним процентом геномной ДНК человека (Lander et al., 2001). При этом геном человека содержит огромное число некодирующих белки функциональных элементов, которые невозможно идентифицировать, исходя только из их нуклеотидной последовательности. Их можно идентифицировать только непосредственным определением их активности. Примерами могут служить энхансеры, промоторы и терминаторы транскрипции, участки, ответственные за образование комплексов ДНК и РНК с белками, сайты интеграции ретровирусов, области начала репликации, инсуляторы и т.д. Кроме того, в геноме они существуют в составе хромосом, каждый элемент - со своим уникальным окружением, способным влиять на его активность. Поэтому исследование этих элементов и окружающих их геномных последовательностей позволит изучить регуляторные механизмы, определяющие активность отдельных генов. Картирование таких последовательностей поможет лучше понять механизмы регуляции на уровне всего генома.

Примером последовательности, содержащей ряд различных взаимодействующих между собой регуляторных элементов, являются длинные концевые повторы (Long Terminal Repeat - LTR) эндогенных ретровирусов, содержащие ТАТА-бокс, участки связывания ядерных факторов и сигнал полиаденилирования. В геноме человека присутствуют тысячи таких регуляторных комплексов. Геном человека содержит до 8% последовательностей, гомологичных последовательностям инфекционных ретровирусов (Lander et al., 2001). Эти элементы генома - эндогенные ретровирусы человека (Human Endogenous Retrovirus - HERV) -по-видимому, являются следами инфекций клеток зародышевого пути предков человека древними ретровирусами (Temin, 1980; Varmus, 1982; Sverdlov, 1998).

Обилие и сохранность этих элементов в геноме позволяет предположить наличие у них биологической роли (Casau et al., 1999).

Среди известных семейств эндогенных ретровирусов (всего их более двадцати) изучаемое нами семейство HERV-K(HML-2) или HTDV/HERV-K привлекает к себе внимание по нескольким причинам. Это семейство относительно обширно (в гаплоидном геноме присутствуют около 30 полноразмерных элементов) и является одним из наиболее биологически активных семейств HERV (Bannert and Kurth, 2004),

Экспрессия ретровирусных генов направляется регуляторными последовательностями в составе LTR, фланкирующих вирусные гены в интегрированном провирусе. Если интеграция провируса произошла вблизи гена клетки-хозяина, LTR может существенно изменить регуляцию экспрессии гена, влияя на ее уровень и тканеспецифичность. Появление LTR вблизи или внутри гена может также приводить к альтернативному сплайсингу, терминации транскрипции (Goodchild et al1992; Landry and Mager, 2003).

В геноме человека насчитывается более полутора тысяч одиночных LTR HERV-K(HML-2). Анализ их расположения относительно картированных локусов демонстрирует частую встречаемость LTR в непосредственной близости от генов. Более того, LTR часто располагаются вблизи генов, кодирующих регуляторные белки (Vinogradova et al., 1997; Artamonova et al., 2000). Изменяя транскрипционный статус таких генов, интегрированный в геном LTR может косвенно влиять на уровень экспрессии целого комплекса генов, что может приводить к серьезному изменению спектра экспрессирующихся в организме генов. Выступая "индукторами" таких изменений, LTR могут играть важную роль в процессах развития различных патологий, таких как злокачественная трансформация клеток или аутоиммунные заболевания. Придавая геному хозяина дополнительную изменчивость, LTR могут служить эволюционному развитию вида-хозяина, выступая в этом случае факторами эволюции. '

В настоящее время изучению биологической активности как эндогенных ретровирусов в целом, так и одиночных LTR, посвящено немало работ, однако мы все еще далеки от полного понимания всех функций HERV в геноме. Первая часть работы посвящена исследованию тканеспецифичности промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей LTR и влияния негативного регуляторного элемента (НРЭ) в его составе на активность LTR.

Целью второй части исследования является выявление участков геномной ДНК человека, обладающих инсуляторной активностью и анализ способности участков генома человека, специфически связывающихся с ядерным матриксом (Scaffold/Matrix Attachment Region — S/MARs), служить инсуляторами или пограничными элементами, разделяющими функциональные домены генома. S/MAR-элементы - одна из недавно открытых и относительно мало изученных групп регуляторных элементов. Они были найдены в геномах дрожжей, дрозофилы, позвоночных и растений. S/MAR представляют собой участки ДНК (200-1000 п.о.), потенциально ответственные за прикрепление интерфазного хроматина к внутреннему каркасу ядра (ядерному матриксу, ЯМ). Они обладают повышенным сродством к ЯМ in vitro и, как полагают, за счет связывания с ним образуют основания петельных доменов хроматина в ядре. Основной функцией, приписываемой S/MARs, является образование, поддержание и регуляция функционирования петельных доменов интерфазного хроматина (Глазков, 1995; Чернов и др., 2004).

Ранее в нашей лаборатории были выделены, картированы и частично охарактеризованы несколько десятков S/MAR-элементов из геномов человека и китайского хомячка. Эти последовательности различались по длине, коэффициентам связывания с ЯМ и некоторым другим характеристикам (Nikolaev et al., 1996); (Акопов и др., 1997; Николаев и др., 1998); (Chernov et al., 2002). Нашей задачей стало исследование их функциональной активности. Пять S/MAR-элементов, различающихся по длине и коэффициентам связывания с ЯМ, были проверены на наличие промоторной, энхансерной, сайленсерной и инсуляторной активностей.

Инсуляторы - это последовательности ДНК, способные, находясь между промотором и энхансером, блокировать активирующее действие последнего in vivo, а также, будучи помещенными по краям генетической конструкции (трансгена), вводимой генно-инженерными способами в клетки, защищать экспрессию трансгена от эффекта положения (Kuhn and Geyer, 2003). Различными авторами были получены данные, указывающие на наличие у некоторых S/MAR-элементов свойств, характерных для инсуляторных последовательностей. Так, 5'- и 3'-S/MAR^eMeHTbi, окружающие ген аполипопротеина В (ароВ), и S/MAR из локуса а 1-антитрипсина человека способны ограждать различные трансгены от эффекта положения (Kalos and Fournier, 1995; Namciu et al., 1998), а инсулятор ретротранспозона gypsy дрозофилы обладает свойствами S/MAR-элемента (Nabirochkin et al., 1998). В то же время, для ряда пограничных элементов, обладающих свойствами как S/MAR, так и инсуляторов, было показано, что за выполнение этих функций отвечают разные, неперекрывающиеся последовательности в составе этих элементов (Scott et al., 1999; Antes et al., 2001). Возможно, при более детальном изучении взаимосвязей между инсуляторами и S/MAR-элементами, удастся в каждом из них выделить отдельные последовательности, ответственные за свойства инсуляторов и связывание ЯМ.

Цели и задачи работы.

Настоящая работа посвящена идентификации и анализу активностей регуляторных элементов хромосомы 19 человека и состоит из двух частей: первая посвящена изучению тканеспецифичности промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей LTR, принадлежащего семейству HERV-K(HML-2), а вторая -выявлению участков ДНК хромосомы 19 человека, обладающих инсуляторной активностью. Для решения второй задачи неотъемлемым этапом было создание метода, позволяющего проводить поиск инсуляторов в протяженных участках ДНК. Были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- в различных клеточных линиях определить транскрипционную (промоторную и энхансерную) активность индивидуального LTR семейства HERV-K(HML-2);

- оценить влияние негативного регуляторного элемента (НРЭ) в составе LTR на его активность в различных клеточных линиях;

- исследовать инсуляторную активность S/MAR-элементов, выделеных и картированых ранее на хромосоме 19 человека, в условиях временной трансфекции;

- разработать метод, позволяющий проводить поиск инсуляторов в протяженных участках ДНК, и применить его для выявления инсуляторов в локусе хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и Сох7А1;

- построить карту распределения инсуляторов в локусе хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и Сох7А1.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Руда, Вера Михайловна

выводы

1. Показано наличие промоторной активности LTR, принадлежащего семейству HERV-K (HML-2), в различных опухолевых клеточных линиях человека: 293, NGP-127, PANC-1 и Тега-1, а также в линии клеток яичника китайского хомячка СНО. Выявлена тканеспецифичность промотора в составе LTR.

2. Обнаружено, что негативный регуляторный элемент (НРЭ) LTR активен во всех исследованных линиях клеток, в которых наблюдается промоторная активность LTR.

3. Показана тканеспецифичность энхансерной активности LTR.

4. Из пяти исследованных S/MAR-элементов два проявляют инсуляторную активность в условиях временной трансфекции в клетки линии СНО.

5. Разработана система для поиска инсуляторов в протяженных последовательностях ДНК. В локусе хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и Сох7А1 идентифицированы и картированы восемь инсуляторов.

2.14 Заключение

Как было показано, регуляториыми элементами ретровирусного провируса являются его длинные концевые повторы. Приведенные выше примеры указывают на наличие биологической активности у LTR представителей разных семейств эндогенных ретровирусов человека, наиболее интересным проявлением которой является их потенциальная способность влиять на экспрессию клеточных генов. При этом они сами находятся под влиянием геномного окружения, ядерных белков и других факторов, предоставляемых клеткой-хозяином. Исследование механизмов взаимодействия, сложившихся за миллионы лет совместного существования эндогенных ретровирусов и их хозяев, является интересной и актуальной задачей.

С учетом малого количества данных о регуляторном потенциале LTR HERV-K и, особенно, 115-области в их составе, анализ ткапеспецифичности активности LTR и его фрагмента, содержащего делецию З'-концевой части Ш-области представляет несомненный интерес.

S/MAR-элементы - участки ДНК, вовлеченные во взаимодействие с ядерным матриксом. По ряду данных, они обладают инсуляторной активностью, т.е. способностью блокировать взаимодействие между энхансером и промотором in vivo и, возможно, представляют собой целые инсуляторы или их фрагменты. Тем не менее, окончательного доказательства такого соответствия не существует. С целью получить дополнительную информацию об инсуляторной активности S/MARs из полученной ранее библиотеки этих элементов были выбраны пять фрагментов ДНК, различающиеся по длине и сродству к ядерному матриксу, для проведения проверки этих последовательностей на наличие у них свойств инсуляторов (или других регуляторных элементов) в условиях временной трансфекции.

Не все инсуляторы проявляют активность в условиях временной экспрессии. Кроме того, эксперимент по временной экспрессии не позволяет исследовать одновременно множество последовательностей, в то время как именно поиск новых инсуляторов приблизит нас к разгадке механизмов их действия и регуляции экспрессии генов. Поэтому необходимо разработать систему для выявления инсуляторных свойств изучаемых последовательностей при интеграции в геном и использовать ее для функционального анализа протяженных участков геномной ДНК. Для проверки системы использовали локус хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и Сох7А1.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3.1 МАТЕРИАЛЫ Реактивы

Агароза (LE, Molecular Biology Grade) - Promega (США). Дезоксинуклеозидтрифосфаты (2,5 мМ) - Boehringher Mannheim (ФРГ). Глицерин - Sigma (США).

Бромистый этидий (10 мг/мл) - GibcoBRL (США). Ксиленцианол, бромфеноловый синий, ЭДТА - Pharmacia (Швеция). Изопропанол, этанол, ацетат аммония, ацетат натрия, фенол, хлороформ - Реахим (Россия).

MgCl2 (25 mM) - Promega (США). Ампициллина натриевая соль - Биосинтез (Россия). G418 - Geneticin® (GibcoBRL, США). Ганцикловир - Цимевен® (Roche, Швейцария).

Ферменты

Taq ДНК полимераза (5 ед/мкл) - Promega (США). Т4 ДНК лигаза (5 ед/мкл) - Promega (США).

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Escherichia coli - MBI Fermentas (Литва). Эндонуклеазы рестрикции ВатШ (15 ед/мкл), Hindlll (25 ед/мкл) - Stratagene (США). Эндонуклеаза рестрикции Pstl (10 ед/мкл), Xhol (10 ед/мкл) - GibcoBRL (США). Эндонуклеазы рестрикции С1а\ (10 ед/мкл), Sail (10 ед/мкл), Xbal (10 ед/мкл) -Boehringher Mannheim (ФРГ).

Эндонуклеаза рестрикции SacW (10 ед/мкл), Sspl (10 ед/мкл) - Fermentas (США). Лизоцим марки В — Реахим (Россия).

РНКаза А из поджелудочной железы быка (10 мг/мл) - Serva (США). Протеиназа К - Promega (США). Трипсин - Calbiochem (США).

Буферные растворы

10х буферы для эндонуклсаз рестрикции — Boehringher Mannheim (ФРГ). 10х буфер для Т4 ДНК лигазы, с ЮшМ АТФ - Promega (США).

Юх буфер для ПЦР (без MgCl2,) - Gibco-BRL (США).

Буфер нанесения проб для гель-электрофореза: 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксиленцианол, 30% глицерин на буфере ТАЕ. Буфер ТЕ: Трис-HCl рН 8,5, 1 мМ ЭДТА рН 8.0.

Буфер ТАЕ: 40мМ Трис-ацетат, рН 8,2, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Lysis buffer (для выделения геномной ДНК): ЮшМ Tris НС1 рН 8.5, 5mM EDTA, 0,2% SDS, 0,2М NaCl, 0,1 mg/ml Proteinase К). PBS - фосфатный солевой буфер, ICN (США).

Фирменные наборы

Wizard®Plus Minipreps DNA Purification System - Promega (CLLLA). Wizard®Plus Midipreps DNA Purification System - Promega (CLLLA). Qiaex II Gel Extraction Kit - QIAGEN (ФРГ). QIAquick PCR purification kit - QIAGEN (ФРГ). Diatom TM DNA Elution - Lsogene Ltd (Россия).

Маркеры длин ДНК

100 п.о.: GeneRuler ЮОЬр DNA Ladder Plus - Fermentas (США). 1 т.п.о.: 1Kb DNA Ladder - GibcoBRL (США).

Среды

Среда LB: 10rBacto®-Tryptone, 5 г Bacto®-yeast extract, 5rNaCl на 1 литр стерильной дистиллированной воды.

Среда LB с ампициллином: к среде LB добавляли раствор ампициллина до конечной концентрации 75 мкг/мл.

Агаризованная среда LB с ампициллином: к 1 л среды LB добавляли 15 г агара и автоклавировали, после остывания до 50°С добавляли раствор ампициллина до конечной концентрации 75 мкг/мл.

Сухие смеси для приготовления культуральных сред (DMEM, DMEM:F12 НАМ, RPMI-1640) - GibcoBRL (США).

Эмбриональная сыворотка теленка - FCS, GibcoBRL (США).

Оборудование

Автоматические микропипетки - Gilson (Франция). Автоматический С02 инкубатор IR 1500 - Flow Laboratories (США). Источник питания Power Supply Model 500 - BioRad Laboratories (США). Ламинар - Laminar Flow, Babcock-BSH (ФРГ). Ламинар Gelaire® - Flow Laboratories (США). Люминометр биологический ЛБ-4АИ - Климби (Россия). Микроцентрифуга 5415, MiniSpin Plus - Eppendorf (ФРГ). Одноразовая стерильная пластиковая посуда - Corning (США)

Приборы (камеры) для горизонтального электрофореза - Pharmacia Biotech (Швеция). ПЦР-амплификатор РТС-150 - MJ Research, Inc. (США). Термостатируемая качалка Certomat®H, - B.Braun (США).

Термостатируемая качалка для микропробирок "Thermomixer comfort" - Eppendorf (ФРГ)

УФ-спектрофотометр GeneQuant - Amersham Pharmacia Biotech (Швеция). Ультрафиолетовый трансиллюминатор ТС-312 A Transilluminator (312 нм) с программой для обработки изображений Grabit 2,59 - UVP Inc. (США). Центрифуга-GPR Centrifuge, Beckman J2-21 (США).

Цифровая фотокамера и ультрафиолетовый трансиллюминатор White/Ultraviolet Электронные весы - Sartorius Е 5500 S, Sartorius GMBH Gottingen (ФРГ). EIA Reader 2550 - BioRad Laboratories (США).

3.2 МЕТОДЫ

3.2.1 ПЦР-амплификация

Для ПЦР-амплификации (Саики и др., в сб. "Анализ генома. Методы", 1990) и (Sambrook е/а/., 1989) использовали различные пары праймеров, нуклеотидные последовательности которых приведены в таблице 4. Реакцию проводили в смеси следующего состава:

- 1 Ох буфер для ПЦР реакции (-MgCl2, Gibco-BRL, США) 2,5 мкл

- MgCl2 (50мМ) 1 мкл

- смесь dNTP (2,5мМ) 2 мкл

- ДНК-матрица 1 мкл

- Праймеры (ЮмкМ, см. табл.4) по 1 мкл

- Taq ДНК-полимераза (5ед/мкл; ИБХ, Россия) 0,2 мкл

- деионизованная вода до 25 мкл Поверх смеси наслаивали минеральное масло.

Использовали амплификатор РТС-150 MiniCycIer™ (MJ Research, Inc., США) и следующий температурный режим ПЦР: 1 цикл: 94°С (2 мин); 20-30 циклов: 94°С (30 с);

50-60°С (30 с);

72°С (45 с); 1 цикл: 72°С (2 мин).

По окончании реакции 5 мкл амплификационной смеси смешивали с 2 мкл буфера для нанесения (0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксиленцианол, 30% глицерин, на буфере ТВЕ). Электрофорез проводили в 1,5% ТВЕ-агарозном геле (агароза: LE, Molecular Biology Grade (Promega Corp., США); буфер ТВЕ: 89 мМ Трис-НС1; 89 мМ борная кислота; 2 мМ ЭДТА), с добавлением бромистого этидия (0,1 мкг/мл). ДНК визуализировали при помощи УФ-лампы и фиксировали результаты, используя компьютерную программу Grabit (UVP Inc., США). Для последующего клонирования продукты ПЦР очищали с использованием реагентов и согласно рекомендациям фирмы Promega (Technical Bulletin #118).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Руда, Вера Михайловна, Москва

1. Георгиев, Г.П. и Бакаев, В.В. (1978). Три уровня структурной организации хромосом эукариот. Мол. биол., 12(6), 1205-1230.

2. Глазер, В.М. (1998). Гомологичная генетическая рекомбинация. Соросовский Образовательный Журнал, 7, 13-21.

3. Глазков, М.В. (1995). Петельно-доменная организация генов в эукариотических хромосомах. Мол. биол., 29(5), 965-982.

4. Доманский, А.Н., Акопов, С.Б., Лебедев, Ю.Б., Николаев, Л.Г. и Свердлов, Е.Д. (2002). Энхансерная активность одиночного длинного концевого повтора эндогенного ретровируса человека К. Биоорган, химия, 28(4), 308-311.

5. Николаев, Л. Г., Акопов, С. Б., Чернов, И. П., Глотов, Б. О., Эшворт, Л. К. и Свердлов, Е. Д. (1998). Расположение 19 участков связывания ДНК с ядерным матриксом (MARs) на хромосоме 19 человека. ДАН 361(3), 409-411.

6. Ю.Хиль, П.П., Лебедев Ю.Б. и Свердлов Е.Д. (1997). Подсемейства длинных концевых повторов (LTR) человеческих эндогенных ретровирусов типа HERV-К. ДАН, 356, 833-837.

7. П.Хиль, П.П., Лебедев Ю.Б. и Свердлов Е.Д. (1998). Длинный концевой повтор эндогенного ретровируса HERV-K в интроне гена ZNF91. Биоорган, химия, 24, 126-131.

8. Чернов, И. П., Акопов, С. Б. и Николаев, Л. Н. (2004). Структура и функции участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу (S/MARs). Биоорган, химия,30(1), 3-14.

9. Akopov, S.B., Nikolaev, L.G., Khil, P.P., Lebedev, Y.B. and Sverdlov, E.D. (1998). Long terminal repeats of human endogenous retrovirus К family (HERV-K) specifically bind host cell nuclear proteins. FEBS Letters 421(3), 229-233

10. Andersson, G., Svensson, A., Setterblad, N. and Rask, L. (1998). Retroelements in the human MHC class II region. Trends Genet 14(3), 109-114

11. Andersson, M.L., Lindeskog, M., Medstrand, P., Westley, В., May, F. and Blomberg, J. (1999). Diversity of human endogenous retrovirus class II-like sequences. J. Gen. Virol. 80(Part 1), 255-260

12. Antes, T.J., Namciu, S.J., Fournier, R.E. and Levy-Wilson, B. (2001). The 5' boundary of the human apolipoprotein В chromatin domain in intestinal cells. Biochemistry 40(23), 6731-6742

13. Artamonova, I.I., Gorodentseva, T.N., Lebedev, Y.B. and Sverdlov, E.D. (2000). Nonrandom distribution of the endogenous retroviral regulatory elements HERV-K LTR on human chromosome 22. Dokl Biochem 372(1-6), 87-89.

14. Baban, S., Freeman, J.D. and Mager, D.L. (1996). Transcripts from a novel human KRAB zinc finger gene contain spliced Alu and endogenous retroviral segments. Genomics 33(3), 463-472

15. Baer, A., Schubeler, D. and Bode, J. (2000). Transcriptional properties of genomic transgene integration sites marked by electroporation or retroviral infection. Biochemistry 39(24), 7041-7049

16. Baltimore, D. (1970). RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226(252), 1209-1211

17. Bannert, N. and Kurth, R. (2004). Retroelements and the human genome: New perspectives on an old relation. PNAS 101(suppl2), 14572-14579

18. Bell, A.C. and Felsenfeld, G. (1999). Stopped at the border: boundaries and insulators. CurrOpin Genet Dev 9(2), 191-198.

19. Bell, A.C., West, A.G. and Felsenfeld, G. (1999). The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98(3), 387-396.

20. Bell, A.C., West, A.G. and Felsenfeld, G. (2001). Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome. Science 291(5503), 447-450.

21. Bi, X. and Broach, J.R. (1999). UASrpg can function as a heterochromatin boundary element in yeast. Genes Dev 13(9), 1089-1101

22. Boiler, K., Frank, H., Lower, J., Lower, R. and Kurth, R. (1983). Structural organization of unique retrovirus-like particles budding from human teratocarcinoma cell lines. J. Gen. Virol. 64(2549-2559

23. Boiler, K., Konig, H., Sauter, M., Mueller-Lantzsch, N., Lower, R., Lower, J. and Kurth, R. (1993). Evidence that HERV-K is the endogenous retrovirus sequence that codes for the human teratocarcinoma-derived retrovirus HTDV. Virology 196(1), 349-353

24. Bonner, T.I., O'Connell, C. and Cohen, M. (1982). Cloned endogenous retroviral sequences from human DNA. PNAS USA 79(15), 4709-4713

25. Bramblett, D., Hsu, C., Lozano, M., Earnest, K., Fabritius, C. and Dudley, J. (1995). A redundant nuclear protein binding site contributes to negative regulation of the mouse mammary tumor virus long terminal repeat. J. Virol. 69(12), 7868-7876

26. Bulger, M. and Groudine, M. (1999). Looping versus linking: toward a model forlong-distance gene activation. Genes Dev 13(19), 2465-2477.

27. Cai, H. and Levine, M. (1995). Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376(6540), 533-536

28. Cai, H.N. and Levine, M. (1997). The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embryo. Embo J 16(7), 1732-1741.

29. Cai, H.N. and Shen, P. (2001). Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291(5503), 493-495.

30. Casau, A.E., Vaughan, J.E., Lozano, G. and Levine, A.J. (1999). Germ cell expression of an isolated human endogenous retroviral long terminal repeat of the HERV-K/HTDV family in transgenic mice. J. Virol 73(12), 9976-9983

31. Chen, S. and Corces, V.G. (2001). The gypsy insulator of Drosophila affects chromatin structure in a directional manner. Genetics 159(4), 1649-1658.

32. Christy, R.J. and Huang, R.C. (1988). Functional analysis of the long terminal repeats of intracisternal A-particle genes: sequences within the U3 region determine both the efficiency and direction of promoter activity. Mol Cell Biol 8(3), 10931102

33. Chung, J.H., Bell, A.C. and Felsenfeld, G. (1997). Characterization of the chicken beta-globin insulator. PNAS USA 94(2), 575-580

34. Chung, J.H., Whiteley, M. and Felsenfeld, G. (1993). A 5' element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74(3), 505-514

35. Cianciolo, G.J., Copeland, T.D., Oroszlan, S. and Snyderman, R. (1985). Inhibition of lymphocyte proliferation by a synthetic peptide homologous to retroviral envelope proteins. Science 230(4724), 453-455

36. Conrad, В., Weissmahr, R.N., Boni, J., Arcari, R., Schupbach, J. and Mach, B. (1997). A human endogenous retroviral superantigen as candidate autoimmune gene in type I diabetes. Cell 90(2), 303-313

37. Costas, J. (2001). Evolutionary dynamics of the human endogenous retrovirus family HERV-K inferred from full-length proviral genomes. JMol Evol 53(3), 237-243

38. Deininger, P.L., Batzer, M.A., Hutchison, C.A., 3rd and Edgell, M.H. (1992). Master genes in mammalian repetitive DNA amplification. Trends Genet 8(9), 307-311

39. Di Cristofano, A., Strazzullo, M., Parisi, T. and La Mantia, G. (1995). Mobilization of an ERV9 human endogenous retroviral element during primate evolution. Virology 213(1), 271-275

40. Donze, D. and Kamakaka, R.T. (2001). RNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexes are heterochromatin barriers in Saccharomyces cerevisiae. Embo J 20(3), 520-531

41. Dunaway, M., Hwang, J.Y., Xiong, M. and Yuen, H.L. (1997). The activity of the scs and scs1 insulator elements is not dependent on chromosomal context. Mol Cell Biol 17(1), 182-189

42. Eisfeld, K., Candau, R., Truss, M. and Beato, M. (1997). Binding of NF1 to the MMTV promoter in nucleosomes: influence of rotational phasing, translational positioning and histone HI. Nucleic Acids Res. 25(18), 3733-37342

43. Elkahloum, A.G., Bittner, M., Hoskins, K., Gemmill, R. and Meltzer, P.S. (1996). Molecular cytogenetic characterization and physical mapping of 12ql3-15 amplification in human cancers. Genes Chromosom Cancer 17(4), 205-214

44. Emery, D.W., Yannaki, E., Tubb, J. and Stamatoyannopoulos, G. (2000). A chromatin insulator protects retrovirus vectors from chromosomal position effects. PNASUSA 97(16), 9150-9155.

45. Feigner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M., Roman, R., Chan, H.W., Wenz, M., Northrop, J.P., Ringold, G.M. and Danielsen, M. (1987). Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. PNAS USA 84(21), 7413-7417

46. Feuchter, A. and Mager, D. (1990). Functional heterogeneity of a large family of human LTR-like promoters and enhancers. Nucleic Acids Res. 18(5), 1261-1270

47. Fong, S.E., Pallansch, L.A., Mikovits, J.A., Lackman-Smith, C.S., Ruscetti, F.W. and Gonda, M.A. (1995). cis-acting regulatory elements in the bovine immunodeficiency virus long terminal repeat. Virology 209(2), 604-614

48. Gaszner, M., Vazquez, J. and Schedl, P. (1999). The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev 13(16), 2098-2107.

49. Gdula, D.A., Gerasimova, T.I. and Corces, V.G. (1996). Genetic and molecular analysis of the gypsy chromatin insulator of Drosophila. PNAS USA 93(18), 93789383.

50. Gerasimova, T.I. and Corces, V.G. (1998). Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 92(4), 511-521

51. Geyer, P.K. and Corces, V.G. (1992). DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev 6(10), 1865-1873

52. Geyer, P.K., Green, M.M. and Corces, V.G. (1990). Tissue-specific transcriptional enhancers may act in trans on the gene located in the homologous chromosome: the molecular basis of transvection in Drosophila. Embo J 9(7), 2247-2256

53. Ghosh, D., Gerasimova, T.I. and Corces, V.G. (2001). Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. Embo J 20(10), 2518-2527.

54. Goodchild, N.L., Wilkinson, D.A. and Mager, D.L. (1992). A human endogenous long terminal repeat provides a polyadenylation signal to a novel, alternativelyspliced transcript in normal placenta. Gene 121(2), 287-294.

55. Gould, S.J. and Subramani, S. (1988). Firefly luciferase as a tool in molecular and cell biology. Anal. Biochem. 175(5-13

56. Harris, J.R. (1998). Placental endogenous retrovirus (ERV): structural, functional, and evolutionary significance. Bioessays 20(4), 307-316

57. Hart, C.M., Zhao, K. and Laemmli, U.K. (1997). The scs' boundary element: characterization of boundary element- associated factors. Mol Cell Biol 17(2), 9991009.

58. Herbst, H., Kuhler-Obbarius, C., Lauke, H., Sauter, M., Mueller-Lantzsch, N., Harms, D. and Loning, T. (1999). Human endogenous retrovirus (HERV)-K transcripts in gonadoblastomas and gonadoblastoma-derived germ cell tumours. Virchows Arch 434(1), 11-15

59. Herbst, H., Sauter, M., Kuhler-Obbarius, C., Loning, T. and Mueller-Lantzsch, N. (1998). Human endogenous retrovirus (HERV)-K transcripts in germ cell and trophoblastic tumours. Apmis 106(1), 216-220.

60. Hogga, I. and Karch, F. (2002). Transcription through the iab-7 cis-regulatory domain of the bithorax complex interferes with maintenance of Polycomb-mediated silencing. Development 129(21), 4915-4922

61. Hogga, I., Mihaly, J., Barges, S. and Karch, F. (2001). Replacement of Fab-7 by the gypsy or scs insulator disrupts long-distance regulatory interactions in the Abd-B gene of the bithorax complex. Mol Cell 8(5), 1145-1151

62. Hohenadl, C., Leib-Mosch, C., Hehlmann, R. and Erfle, V. (1996). Biological significance of human endogenous retroviral sequences. J Acquir Immune Dejic SyndrHum Retrovirol 13 Suppl l(S268-273

63. Hsu, T.W., Sabran, J.L., Mark, G.E., Guntaka, R.V. and Taylor, J.M. (1978). Analysis of unintegrated avian RNA tumor virus double-stranded DNA intermediates. J. Virol. 28(3), 810-818

64. Hughes, J.F. and Coffin, J.M. (2004). Human endogenous retrovirus К solo-LTR formation and insertional polymorphisms: Implications for human and viral evolution. PNAS 101(6), 1668-1672

65. Indraccolo, S., Gunzburg, W.H., Leib-Mosch, C., Erfle, V. and Salmons, B. (1995). Identification of three human sequences with viral superantigen-specific primers.

66. Mamm. Genome 6(5), 339-344

67. Inoue, H., Nojima, H. and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96(1), 23-28

68. Kalos, M. and Fournier, R.E. (1995). Position-independent transgene expression mediated by boundary elements from the apolipoprotein В chromatin domain. Mol Cell Biol 15(1), 198-207

69. Kapitonov, V.V. and Jurka, J. (1999). The long terminal repeat of an endogenous retrovirus induces alternative splicing and encodes an additional carboxy-terminal sequence in the human leptin receptor. J. Mol. Evol. 48(2), 248-251

70. Kato, N., Shimotohno, K., VanLeeuwen, D. and Cohen, M. (1990). Human proviral mRNAs down regulated in choriocarcinoma encode a zinc finger protein related to Kruppel. Mol Cell Biol 10(8), 4401-4405

71. Kellum, R. and Schedl, P. (1991). A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64(5), 941-950

72. KelIum, R. and Schedl, P. (1992). A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol Cell Biol 12(5), 2424-2431

73. Kent, W.J. (2002). BLAT—The BLAST-Like Alignment Tool. Genome Res. 12(4), 656-664

74. Khodosevich, K., Lebedev, Y. and Sverdlov, E.D. (2004). Large-scale determination of the methylation status of retrotransposons in different tissues using a methylation tags approach. Nucleic Acids Res 32(3), еЗ 1

75. Kingsman, S.M. and Kingsman, A.J. (1996). The regulation of human immunodeficiency virus type-1 gene expression. Eur. J. Biochem. 240(3), 491-507

76. Knossl, M., Lower, R. and Lower, J. (1999). Expression of the human endogenous retrovirus HTDV/HERV-K is enhanced by cellular transcription factor YY1. J. Virol. 73(2), 1254-1261

77. Kongsuwan, K., Allen, J. and Adams, J.M. (1989). Expression ofHox-2.4 homeobox gene directed by proviral insertion in a myeloid leukemia. Nucleic Acids Res. 17(5),1881-1892

78. Kowalski, P.E. and Mager, D.L. (1998). A human endogenous retrovirus suppresses translation of an associated fusion transcript, PLA2L. J. Virol. 72(7), 6164-6168

79. Kuhn, E.J. and Geyer, P.K. (2003). Genomic insulators: connecting properties to mechanism. CurrOpin Cell Biol 15(3), 259-265

80. Kuhn, E.J., Viering, M.M., Rhodes, K.M. and Geyer, P.K. (2003). A test of insulator interactions in Drosophila. EMBOJ. 22(10), 2463-2471

81. Kurth, R., Lower, J., Lower, R., Boiler, K. and Frank, H. (1983). Retroviruses in human tumors. Arch Geschwulstforsch 53(4), 289-299

82. Laird, P.W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M.A., Jaenisch, R. and Berns, A. (1991). Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Res 19(15), 4293

83. Landry, J.R. and Mager, D.L. (2003). Functional analysis of the endogenous retroviral promoter of the human endothelin В receptor gene. J. Virol. 77(13), 74597466

84. Lebedev, Y.B., Belonovitch, O.S., Zybrova, N.V., Khil, P.P., Kurdyukov, S.G., Vinogradova, T.V., Hunsmann, G. and Sverdlov, E.D. (2000). Differences in HERV-K LTR insertions in orthologous loci of humans and great apes. Gene 247(1-2), 265-277.

85. Lebedev, Y.B., Volik, S.V., Obradovic, D., Ermolaeva, O.D., Ashworth, L.K., Lennon, G.G. and Sverdlov, E.D. (1995). Physical mapping of sequences homologous to an endogenous retrovirus LTR on human chromosome 19. Mol. Gen. Genet. 247(6), 742-748

86. Leib-Mosch, C., Bachmann, M., Brack-Werner, R., Werner, Т., Erfle, V. and Hehlmann, R. (1992). Expression and biological significance of human endogenous retroviral sequences. Leukemia 6 Suppl 3(72S-75S

87. Leib-Mosch, C. and Seifarth, W. (1995). Evolution and biological significance of human retroelements. Virus Genes 11(2-3), 133-145

88. Leis, J., Baltimore, D., Bishop, J.M., Coffin, J., Fleissner, E., Goff, S.P., Oroszlan, S., Robinson, H., Skalka, A.M. and Temin, H.M. (1988). Standardized and simplified nomenclature for proteins common to all retroviruses. J. Virol. 62(5), 1808-1809

89. Litt, M.D., Simpson, M., Recillas-Targa, F., Prioleau, M.N. and Felsenfeld, G. (2001). Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. Embo J20(9), 2224-2235

90. Lower, R., Lower, J. and Kurth, R. (1996). The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences. PNAS USA 93(11), 5177-5184

91. Lu, L. and Tower, J. (1997). A transcriptional insulator element, the su(Hw) binding site, protects a chromosomal DNA replication origin from position effects. Mol Cell Biol 17(4), 2202-2206.

92. Mager, D.L. and Freeman, J.D. (1995). HERV-H endogenous retroviruses: presence in the New World branch but amplification in the Old World primate lineage. Virology 213(2), 395-404

93. Mager, D.L., Hunter, D.G., Schertzer, M. and Freeman, J.D. (1999). Endogenous retroviruses provide the primary polyadenylation signal for two new human genes (HHLA2 and HHLA3). Genomics 59(3), 255-263

94. Magin, C., Lower, R. and Lower, J. (1999). cORF and RcRE, the Rev/Rex and RRE/RxRE homologues of the human endogenous retrovirus family HTDV/HERV-K. J. Virol. 73(11), 9496-9507.

95. Martin, J., Herniou, E., Cook, J., Waugh O'Neill, R. and Tristem, M. (1997). Human endogenous retrovirus type I-related viruses have an apparently widespread distribution within vertebrates. J. Virol. 71(1), 437-443

96. Martin, M.A., Bryan, Т., Rasheed, S. and Khan, A.S. (1981). Identification and cloning of endogenous retroviral sequences present in human DNA. PNAS USA 78(8), 4892-4896

97. Mayer, W.E., O'hUigin, C. and Klein, J. (1993). Resolution of the HLA-DRB6 puzzle: a case of grafting a de novo-generated exon on an existing gene. PNAS USA 90(22), 10720-10724

98. Medstrand, P., Landry, J.R. and Mager, D.L. (2001). Long terminal repeats are used as alternative promoters for the endothelin В receptor and apolipoprotein CI genes in humans. J Biol Chem 276(3), 1896-1903

99. Medstrand, P., Lindeskog, M. and Blomberg, J. (1992). Expression of human endogenous retroviral sequences in peripheral blood mononuclear cells of healthy individuals. J. Gen. Virol. 73(Pt 9), 2463-2466.

100. Medstrand, P. and Mager, D.L. (1998). Human-specific integrations of the HERV-K endogenous retrovirus family. J. Virol. 72(12), 9782-9787

101. Medstrand, P., Mager, D.L., Yin, H., Dietrich, U. and Blomberg, J. (1997). Structure and genomic organization of a novel human endogenous retrovirus family: HERV-K (HML-6). J. Gen. Virol. 78(7), 1731-1744

102. Mighell, A.J., Markham, A.F. and Robinson, P.A. (1997). Alu sequences. FEBSLett 417(1), 1-5

103. Milman, G. and Herzberg, M. (1981). Efficient DNA transfection and rapid assay for thymidine kinase activity and viral antigenic determinants. Somatic Cell Genet 7(161-170

104. Modolell, J., Bender, W. and Meselson, M. (1983), Drosophila melanogaster mutations suppressible by the suppressor of Hairy-wing are insertions of a 7.3-kilobase mobile element. PNAS USA 80(6), 1678-1682

105. Morley, K.L., Toohey, M.G. and Peterson, D.O. (1987). Transcriptional repression of a hormone-responsive promoter. Nucleic Acids Res 15(17), 6973-6989

106. Morris, J.R., Chen, J.L., Geyer, P.K. and Wu, C.T. (1998). Two modes of transvection: enhancer action in trans and bypass of a chromatin insulator in cis. PNAS USA 95(18), 10740-10745.

107. Nabirochkin, S., Ossokina, M. and Heidmann, T. (1998). A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence. J Biol Chem 273(4), 2473-2479

108. Nagaya, S., Yoshida, K., Kato, K., Akasaka, K. and Shinmyo, A. (2001). An insulator element from the sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus suppresses variation in transgene expression in cultured tobacco cells. Mol Genet Genomics265(3), 405-413.

109. Namciu, S.J., Blochlinger, K.B. and Fournier, R.E. (1998). Human matrix attachment regions insulate transgene expression from chromosomal position effects in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 18(4), 2382-2391

110. Nelson, P.N., Carnegie, P.R., Martin, J., Davari Ejtehadi, H., Hooley, P., Roden, D., Rowland-Jones, S., Warren, P., Astley, J. and Murray, P.G. (2003). Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol 56(1), 11-18

111. Nikolaev, L.G., Tsevegiyn, Т., Akopov, S.B., Ashworth, L.K. and Sverdlov, E.D. (1996). Construction of a chromosome specific library of human MARs and mapping of matrix attachment regions on human chromosome 19. Nucleic Acids Res 24(7), 1330-1336

112. Nomiyama, H., Fromental, C., Xiao, J.H. and Chambon, P. (1987). Cell-specific activity of the constituent elements of the simian virus 40 enhancer. PNAS USA 84(22), 7881-7885.

113. Ogbourne, S. and Antalis, T.M. (1998). Transcriptional control and the role of silencers in transcriptional regulation in eukaryotes. BiochemJ 331(Pt 1), 1-14.

114. Ohtsuki, S. and Levine, M. (1998). GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter in the Drosophila embryo. Genes Dev 12(21), 33253330.

115. Ono, M. (1986). Molecular cloning and long terminal repeat sequences of human endogenous retrovirus genes related to types A and В retrovirus genes. J. Virol 58(3), 937-944

116. Palla, F., Melfi, R., Anello, L., Di Bernardo, M. and Spinelli, G. (1997). Enhancer blocking activity located near the 3' end of the sea urchin early H2A histone gene. PNAS USA 94(6), 2272-2277.

117. Parnell, T.J. and Geyer, P.K. (2000). Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes. EMBOJ. 19(21), 5864-5874

118. Peeters, A., Lambert, P. and Deacon, N. (1996). A fourth Spl site in the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat is essential for negative-sense transcription. J. Virol. 70(10), 6665-6672

119. Pereira, L.A., Bentley, K., Peeters, A., Churchill, M.J. and Deacon, N.J. (2000). A compilation of cellular transcription factor interactions with the HIV-1 LTR promoter. Nucleic Acids Res 28(3), 663-668

120. Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J. and Lipps, H.J. (1999). A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res 27(2), 426-428

121. Pikaart, M.J., Recillas-Targa, F. and Felsenfeld, G. (1998). Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methylation and histone deacetylation and is prevented by insulators. Genes Dev 12(18), 2852-2862

122. Qin, W., Golovkina, T.V., Peng, Т., Nepomnaschy, I., Buggiano, V., Piazzon, I. and Ross, S.R. (1999). Mammary gland expression of mouse mammary tumor virus is regulated by a novel element in the long terminal repeat. J. Virol. 73(1), 368376

123. Recillas-Targa, F., Bell, A.C. and Felsenfeld, G. (1999). Positional enhancerblocking activity of the chicken beta-globin insulator in transiently transfected cells. PNASUSA 96(25), 14354-14359

124. Recillas-Targa, F., Valadez-Graham, V. and Farrell, C.M. (2004). Prospects and implications of using chromatin insulators in gene therapy and transgenesis. Bioessays 26(7), 796-807

125. Robinett, C.C., O'Connor, A. and Dunaway, M. (1997). The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes. Mol Cell Biol 17(5), 2866-2875.

126. Roseman, R.R., Pirrotta, V. and Geyer, P.K. (1993). The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. Embo J 12(2), 435-442

127. Roseman, R.R., Swan, J.M. and Geyer, P.K. (1995). A Drosophila insulator protein facilitates dosage compensation of the X chromosome min-white gene located at autosomal insertion sites. Development 121(11), 3573-3582.

128. Saitoh, N., Bell, A.C., Recillas-Targa, F., West, A.G., Simpson, M., Pikaart, M. and Felsenfeld, G. (2000). Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken beta-globin domain. Embo J 19(10), 2315-2322

129. Schon, U., Seifarth, W., Baust, C., Hohenadl, C., Erfle, V. and Leib-Mosch, C. (2001). Cell type-specific expression and promoter activity of human endogenous retroviral long terminal repeats. Virology 279(1), 280-291

130. Schulte, A.M. and Wellstein, A. (1998). Structure and phylogenetic analysis of an endogenous retrovirus inserted into the human growth factor gene pleiotrophin. J. Virol. 72(7), 6065-6072

131. Scott, K.C., Taubman, A.D. and Geyer, P.K. (1999). Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics 153(2), 787-798

132. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J. and Klenk, D.C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal.Biochem. 150(1), 7685

133. Sompayrac, L.M. and Danna, K.J. (1981). Efficient infection of monkey cells with DNA of simian virus 40. PNAS USA 78(7575-7578

134. Strazzullo, M., Majello, В., Lania, L. and La Mantia, G. (1994). Mutational analysis of the human endogenous ERV9 proviruses promoter region. Virology 200(2), 686-695

135. Strazzullo, M., Parisi, Т., Di Cristofano, A., Rocchi, M. and La Mantia, G. (1998). Characterization and genomic mapping of chimeric ERV9 endogenous retroviruses-host gene transcripts. Gene 206(1), 77-83

136. Sverdlov, E.D. (1998). Perpetually mobile footprints of ancient infections in human genome. FEBS Lett 428(1-2), 1-6.

137. Sverdlov, E.D. (2000). Retroviruses and primate evolution. Bioessays 22(2), 161-171

138. Temin, H.M. (1971). The protovirus hypothesis: speculations on the significance of RNA-directed DNA synthesis for normal development and for carcinogenesis. J. Natl. Cancer Inst. 46(2), 3-7

139. Temin, H.M. (1980). Origin of retroviruses from cellular moveable genetic elements. Cell 21(3), 599-600

140. Temin, H.M. (1981). Structure, variation and synthesis of retrovirus longterminal repeat. Cell 27(1 Pt 2), 1-3

141. Temin, H.M. and Mizutani, S. (1970). RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226(252), 1211-1213

142. Thomas, M.J. and Seto, E. (1999). Unlocking the mechanisms of transcription factor YY1: are chromatin modifying enzymes the key? Gene 236(2), 197-208

143. Tonjes, R.R., Czauderna, F. and Kurth, R. (1999). Genome-wide screening, cloning, chromosomal assignment, and expression of full-length human endogenous retrovirus type К .J. Virol. 73(11), 9187-9195

144. Torigoi, E., Bennani-Baiti, I.M., Rosen, C., Gonzalez, K., Morcillo, P., Ptashne, M. and Dorsett, D. (2000). Chip interacts with diverse homeodomain proteins and potentiates bicoid activity in vivo. PNAS USA 97(6), 2686-2691.

145. Tristem, M. (2000). Identification and characterization of novel human endogenous retrovirus families by phylogenetic screening of the human genome mapping project database. J. Virol. 74(8), 3715-3730

146. Tybulewicz, V.L., Crawford, C.E., Jackson, P.K., Bronson, R.T. and Mulligan, R.C. (1991). Neonatal lethality and lymphopenia in mice with a homozygous disruption of the c-abl proto-oncogene. Cell 65(7), 1153-1163

147. Urnovitz, H.B. and Murphy, W.H. (1996). Human endogenous retroviruses: nature, occurrence, and clinical implications in human disease. Clin. Microbiol. Rev. 9(1), 72-99

148. Valadez-Graham, V., Razin, S.V. and Recillas-Targa, F. (2004). CTCF-dependent enhancer blockers at the upstream region of the chicken {alpha}-globin gene domain. Nucl. Acids Res. 32(4), 1354-1362

149. Varmus, H.E. (1982). Form and function of retroviral proviruses. Science 216(4548), 812-820

150. Vydra, J., Vytasek, R., Sainerova, H., Mandys, V., Sovova, V., Hejnar, J., Sloncova, E., Pouckova, P., Bubenik, J., Novaak, J. and et al. (1988). A new cell line, GS, derived from a human renal cell carcinoma. Folia Biol 34(5), 308-315

151. Welsh, S. and Kay, S.A. (1997). Reporter gene expression for monitoring gene transfer. Curr. Opin. Biotechnol. 8(5), 617-622

152. Wilson, C.A., Laeeq, S., Ritzhaupt, A., Colon-Moran, W. and Yoshimura, F.K. (2003). Sequence Analysis of Porcine Endogenous Retrovirus Long Terminal Repeats and Identification of Transcriptional Regulatory Regions. J. Virol. 77(1), 142-149

153. Yang, P., Zemba, M., Aboud, M., Flugel, R.M. and Lochelt, M. (1997). Deletion analysis of both the long terminal repeat and the internal promoters of the human foamy virus. Virus Genes 15(1), 17-23

154. Zhan, H.C., Liu, D.P. and Liang, C.C. (2001). Insulator: from chromatin domain boundary to gene regulation. Hum Genet 109(5), 471-478.

155. Zhong, X.P. and Krangel, M.S. (1997). An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus. PNAS USA 94(10), 5219-5224

156. Zhou, J., Ashe, H., Burks, C. and Levine, M. (1999). Characterization of the transvection mediating region of the abdominal- В locus in Drosophila. Development 126(14), 3057-3065.

157. Zhou, J. and Levine, M. (1999). A novel cis-regulatory element, the PTS,mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell 99(6), 567-575.

158. Zhu, Q., Gregg, K., Lozano, M., Liu, J. and Dudley, J.P. (2000). CDP Is a Repressor of Mouse Mammary Tumor Virus Expression in the Mammary Gland. J. Virol. 74(14), 6348-6357

159. Zsiros, J., Jebbink, M.F., Voute, P.A. and Berkhout, B. (1998). Identification of novel human endogenous retroviral sequences belonging to the HERV-K family. AIDS Res Hum Retroviruses 14(12), 1093-1098

160. Я хочу выразить самую искреннюю признательность своему научному руководителю к.б.н. С.Б. Акопову за прекрасную атмосферу, советы и помощь на каждом этапе работы.