Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация глутаматергических синапсов в коребольших полушарий головного мозга

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация глутаматергических синапсов в коребольших полушарий головного мозга"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Идентификация глутаматергических синапсов в коре больших полушарий головного мозга.

Специальность 03. 00.13. - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи

х) /

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в НИИ физиологии им. А. А. Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: докт. биол. наук,

вед.н.с., А. А.Александров

Официальные оппоненты - докт. биол.наук, Акоев Г. Н.

канд. биол. наук, с.н.с. Демьяненко Г. П.

Ведущее учреждение: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН

Защита диссертации состоится юо6/ " ^¿¿ЬОшЯ _199в г. в 16 часов на заседании диссертационное/ совета К 063.57.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9;.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

гтореферат разослан " 199й г.

Ученый секретарь диссертационного совета А. Г.Марков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение.синаптических механизмов деятельности мозга позволяет выяснить ряд важнейших теоретических и прикладных вопросов, таких как взаимодействие процессов возбуждения и торможения, пластичность центральной нервной системы при адаптивных перестройках в условиях быстро меняющейся внешней среды, позволяет объяснить многие аспекты нормальной высшей нервной деятельности и патологии мозговых процессов /Sherrington, 1920; Hebb, 1949; Eccles, 1953; Kandell, 1976; Шаповалов, 1979; Батуев, 1931/. Особенно интенсивно идет развитие представлений о химической передаче в центральных синапсах, использующих глутамат (Глу) в качестве нейромедиатора /Streit 1984; McCormlck, 1992; Morris, Davis, 1994; Hollmann, Heinemann, 1994/. В течение 30 последних лет было накоплена большое количество физиологических, анатомических и фармакологических данных, указывающих на то, что большинство нервных клеток в коре головного мозга млекопитающих, а также нейроны релейных ядер таламуса. образующих основные сенсорные пути в кору, являются глутаматергическими /Тsumoto. 1990; Kicks et a!., 1991/. Однако, существующие данные о сикаптической рели Глу в кере недостаточны, так как до настоящего времени собственно синапткческие структуры коры в силу технических препятствий, не могли быть объектом единого морфофункционального исследования .

Открытиями последних лет в области молекулярно-нейробиологи-чееккх исследований стали определение структуры белкоз-субъединпц Глу рецепторов, идентифицированных ранее только по фармакологическому действию структурных аналогов глутамата: КМДА, АКРА, каи-ната и др. Медико-биологическое значение каждого из открытых классов Глу рецепторов подробно изучается и охватывает широкий спектр функций мозга. Например, было доказано, что Н!'ДА рецепторы вовлечены в формирование долговременной пстенциации б гиппскакпе, часто рассматриваемой в качестве достоверной синаптическсй мелели механизма памяти в ЦНС /Bashir et al.. 1994/. НМДА рецептор играет ключевую рель в сикаптической передаче в раннем онтогенезе и обеспечивает поздние компоненты синаптической передачи во взрослом состоянии /Salt., 1994/, тогда как АМРА рецептор специализирован для быстрой синаптической передачи возбуждения /Armstrong-James et al., 1993/. Считается, что центральный синапс со-

- г -

держит оба типа рецептора, однако прямого доказательства ко-лока-лизации АМПА и НМДА рецепторов до настоящего времени не имелось. Рецепторы Глу активируют нейротоксические процессы, сопряженные с синаптическим выделением Глу при различных патологиях, например при ишемии мозга /Herrling, 1994; Clark et al., 1994/. Большинство патологических эффектов прежде связывалось с проницаемыми по кальцию НМДА рецепторами, однако, в настоящее время появились данные, указывающие на возможное участие АМРА рецепторов, также вследствие их потенциальной проводимости по кальцию. Исследования ближайшего будущего должны показать насколько дивергентная природа Глу рецепторов найдет отражение в разнообразии функций корковых нейронов.

Нейроанатомические и нейрохимические исследования коры больших полушарий в ряду представителей млекопитающих свидетельствуют об общем плане клеточной композиции и принципиально сходном нейрохимическом фенотипе неокорковых зон /Jones, 1981, 1986/. Возбуждающие нейроны коры, в основном, это пирамидные нейроны, которые посредством аксонных коллатералей дают начало глутаматергическим корково-корковым связям /Conti et al., 1987/. Тормозные нейроны в коре представлены несколькими классами непирамидных клеток, преимущественно ГАМК-ергических. В ряде физиологических исследований было показано что пирамидные и непирамидные нейроны обладают различной реактивностью на синаптическое действие Глу при активации близлежащих пирамидных нейронов или других корковых связей /НаЬ-litz. Sutor, 1990; Hestrin, 1993; Thomson et al., 1993 а, 6/.

Взаимодействие тормозных и возбуждающих клеток особенно ярко выражено в корковых механизмах сенсорного восприятия, таких как распознавание физических признаков сенсорного сигнала /Slllito, 1977; Batuev et al.. 1989/. Электрофизиологические и фармакологические данные указывают на то, что афферентная активация нейронов сенсорной коры сопровождается выделением Глу /Ташга et al., 1990; Hicks et al.. 1991/ и приводит к распространению как возбуждения, так и торможения /Jones, 1981/, предположительно через соответственно глутаматергические и ГАМК-ергические синаптические связи. Данное положение о пост-афферентном распространении возбуждения в коре с обязательным подключением ГАМК-ергического торможения особенно ярко было показано в экспериментах с отдаленной микроэлектрофоретической аппликацией Глу, наиболее адекватно имитирующей глутаматергическую афферентную активацию /Александров и др., 1982, 1983/, При этом функциональные свойства нейронов коры

достоверно меняются, например, клетки коры приобретают свойства нейронов-детекторов /Александров и др., 1986; Батуев и др., 1987/."" Однако - прежние данные по внутрикорковой активации на ин-тактной коре нуждались в подтверждении на'препарате-изолированной коры.

Комбинирование экспериментальных подходов молекулярной биологии Глу рецептора с современными представлениями о возбуждающих и тормозных типах нейронов в ЦНС пока было возможно только в работах. проделанных в условиях in vitro, на ранних стадиях онтогенеза мозга /Geiger et al., 1995/. Существует очевидная необходимость интегрирования последних достижений в молекулярной нейроби-ологии Глу и глутаматных рецепторов и традиционных анатомических и физиологических in vivo подходов.

Цель исследования - Целью настоящей работы явилось комплексное изучение синаптической организации глутаматергических связей коры, включая: а) физиологическое доказательство существования внутрикорковых возбуждающих и тормозных связей, активируемых глу-таматом; б) анатомическую идентификацию глутаматергических тала-мо-корковых и корково-корковых синапсов на корковых нейронах; в) выявление природы Глу рецепторов на возбуждающих и тормозных нейронах коры и определение особенностей синаптической локализации Глу рецепторов на мембране корковых нейронов.

Задачи исследования:

1. Изучение реактивности корковых нейронов к отдаленной мик-рсэлектрофоретической аппликации Глу в условиях in vivo, в изолированной по методу Сентаготаи полоске сенсомоторной коры.

2. Сравнительное изучение содержания Глу и особенностей анатомических свойств идентифицированных аксонных терминалей в коре.

3. Микроскопическое исследование особенностей клеточного, субклеточного и синаптического распределения субъединиц АМПА- и НМЛА-селективных Глу рецепторов в соматической коре.

Основные положения выносимые на защиту. На основе анализа динамики реагирования корковых нейронов на отдаленную аппликацию Глу в деафферентированной коре делается вывод о существовании Глу-активируемкх возбуждающих и тормозных внутрикорковых связей. Ка примере популяции синаптических терминалей IV слоя коры доказывается положение о медиаторной роли эндогенного Глу в основных афферентных входах на корковые нейроны: таламо-корковых и корко-во-корковых. На основе данных по распределению субъедкниц АМПА Глу рецепторов на пирамидных и непирамидных ГАМК-ергических ней-

ронов делается вывод об особых синаптических свойствах тормозных нейронов коры. Описывается синаптическое распределение АМПА и НМДА рецепторов.

Научная новизна исследования:

1. Впервые проведено электрофизиологическое исследование на изолированном препарате коры с использованием отдаленной микроэ-лектрофоретической аппликации Глу, при этом доказана внутрикорко-вая природа возбуждения и торможения, вызываемых данным воздействием.

2. Впервые исследовалось содержание эндогенного Глу в идентифицированных таламо-корковых и корково-корковых синаптических терминалях. Настоящая работа представляет собой первое исследование синаптического содержания Глу в таламо-корковой сенсорной системе.

3. Впервые изучалась ко-локализация субъединиц АМПА типа глутаматного рецептора на идентифицированных ГАМК-ергических нейронах у взрослых животных. Установлен факт, что ГАМК-ергические нейроны в коре могут иметь проницаемую по кальцию форму АМПА рецептора.

Теоретическое и практическое значение работы: Полученные результаты дополняют существующие научные представления в нейро-биологки коры головного мозга млекопитающих. Данные по реактивности нейронов к искусственно подводимому Глу находят подтверждение в реальном содержании эндогенного Глу в корковых синапсах, как таламо-корковых, так и корково-корковых. Полученные сведения расширяют представление о механизмах, лежащих в основе синапти-чеекой рецепции глутамата у различных типов корковых нейронов.

Использованный подход позволяет выявить и оценить роль таких факторов, как уровень Глу в пресинаптической терминали. локализация и конфигурация Глу рецептора на постсинаптической терминали, имеющих ключевую роль в функционировании основного звена корковых возбуждающих связей - глутаматергического синапса. Высокая возможность для разнообразия синаптических свойств в глутаматерги-ческой передаче указывает на источник изменчивости и пластичности синаптической деятельности коры головного мозга.

Полученные в настоящей работе данные о функциональной и нейрохимической организации корковых связей могут быть использованы в неврологии, нейрофармакологии и невропатологии.

Апробация диссертационного материала. Основные положения

диссертации доложены и обсуждены на научных заседаниях кафедры физиологии высшей-нервной деятельности Санкт-Петербургского университета (1994,1995). заседании Ученого-совета-Физиологического НИИ им.А.Л. Ухтомского Санкт-Петербургского университета (1994). на второй Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев. 1986), на заседании Физиологического общества (Ленинград. 1991), на 4-х ежегодных конференциях Общества по нейронаукам (США, 1992-1995). По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 1Ю страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех разделов описания и анализа результатов, заключения, выводов и списка псг.сльзованной литературы. Работа иллюстрирована 27 рисунками и фотографиями и включает 4 таблицы. Указатель литературы содержит 12 источников отечественной литературы и 243 работы зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2. Материалы и методы исследования

2.1. Опыты проводились на взрослых кошках обоего пола весом 2,4-4,4 кг условиях острого эксперимента. Для наркотизкрсвакия животных применялся кетамин (25 мг/кг. внутримышечно). Изоляцию участка корь: осуществляли по методу Сентагстаи /Szeru ago thai, 1962/ при помощи обоюдоострого режущего инструмента (диссектора) полукруглей формы с радиусом около 5 мм, таким образом, что при операции сохранялась целостность сосудов мягкой мозговой оболочки.

Склеенные параллельно друг другу две (3-5)-ствольные пирекс-ные микропипетки обеспечивали как микроэлектрофорез, так и регистрацию нейронной активности. Кончики микропипеток были кг одном уровне и отстояли друг от друга на 200-300 мкм. Один-два ствола каждой из двух микропипеток заполнялся О,5М раствором глу-тамата натрия, рН 9-10, остальные стволы заполнялись 2М раствором NaCl, при этом сопротивление электродов, измеренное при постоянном токе, было порядка 2-5 МОм. Микрозлектрофорез Глу осуществлялся положительным током 0-40 пА. Для предотвращения утечки Глу использовался отрицательный постоянный ток 10-15 на. Регистрация нейронной активности производилась при помощи многоканального

усилителя биопотенциалов с выносными предусилителями, имеющих входное сопротивление порядка 1 ГОм.

2.2. Стереотаксические инъекции в таламус были сделаны 18 крысам (альбиносы, самцы весом 250-300 г), координаты точек инъекций определялись по атласу мозга крысы /Paxinos, Watson, 1986/. В качестве аксонного маркера использовался 1% водный раствор пшеничного лектина. конъюгированного с пероксидазой хрена (ПЛ-ПХ, известного как WGA-HRP). Инъекции производились в ядра вентроба-зального комплекса (ВБ): вентральное постериолатеральное (ВПЛ) и вентральное постериомедиальное (ВПМ). Для сравнения содержания Глу в различных таламо-корковых проекциях, аксонный маркер вводился (микроглектрофоретически) в другие релейные ядра галамуса: дорзальное каружнее коленчатое ядро (тело) (ДНКТ, релейное ядро зрительной системы) и вентральное внутреннее коленчатое ядро (тело) (ВВКТ, релейное ядро слуховой системы). Для сравнения уровня Глу в таламо-корковых (Т-К) и корково-корковых (К-К) связях у 4 крыс были произведены микроэлектрофоретические инъекции ПЛ-ПХ в одно из полушарий, в соматосенсорную кору, слои IV-VI. Двум крысам был инъецирован 1% раствор лектин холерного токсина конъюгированного с пероксидазой хрена (ХТ-ПХ). После 48 часов животные наркотизировались летальной дозой нембутала (80 мг/кг) и перфузи-ровались.

Проявление пероксидазы осуществлялось с использованием реактива тетраметилбензидина, стабилизированного вольфрамом (ТМБ-W) /Weinberg. Van Eyck. 1991/. Ультратонкие срезы помещались на никелевые сетки и подвергались процедуре иммунохимического мечения коллоидным золотом или только на Глу, или же на Глу в комбинации с меткой на ГАМК, с использованием частиц золота разного диаметра /Phend et al., 1992/.

2.3. В настоящем исследовании использовались антитела, распознающие синтетические олигопептиды идентичные участкам молекул белков-субъединиц глутаматных рецепторов. Для АМПА: ГлуР1-ГлуР4 (поликл.) /'iventhold et al., 1992/; ГлуР2(монокл.) /Siegel et al., 1995/, НМДАР1 /Petralia et al.. 1994/. НМДАР1(монокл.) /Siegel et al., 1993/. В исследовании использовалось 12 крыс (200-300 г). Животные были наркотизированы нембуталом (60 мг/кг) и перфузиро-вакы через аорту смесью альдегидов. Окрашивание производилось по методикам иммунопероксидазного и иммунофлуоресцентного мечения.

Для локализации молекул рецепторов производилось мечение коллоидным золотом /Phend et al., 1995/. В данной серии было ис-

пользовано 3 крысы. Перфузия животных производилась фиксатором, содержащим 2, 5% глутаральдегида и 1% параформальдегида на ФБ, рН 7.4. Анализ"распределения частиц золота производился при сканировании негативов, содержащих участки нейропиля при увеличении Х40000. Меченые синапсы исследовались на распределение метки (частиц золота) вдоль синаптической щели по формуле: |а+в/а-в|, где а и б - расстояния от центра частицы до одного из двух концов синаптического контакта. Кроме того, измерялось расстояние от центра частицы до постсинаптической мембраны.

3. Результаты исследования и их обсуждение. 3.1. Нейронные реакции клеток в условиях острой изоляции отличались от в поведения клеток в интактной коре. При этом в 24 случаях (54%) наблюдалось возбуждение, у девяти нейронов было выраженное торможение импульсации (21%). в И случаях эффект отсутствовал (25%). Таким образом, при сравнении с ранее опубликованными результатами полученными на интактной сенсомоторной коре, с такой же ориентацией и таких же расстояниях между кончиками микропипеток /Александров и др., 1983/, в полоске наблюдалось трехкратное увеличение процента возбуждающих реакций (54 против 18) и уменьшение дели тормозных реакций (21 против 32).

Возбуждающие реакции в полоске коры представляли собой 2-5 кратное увеличение частота импульсации, возникавшее на фоне отдаленной аппликааиии Глу и прекращавшееся после выключения тока. В стличие от возбуждающих реакции на прямую аппликацию Глу, отдаленный эффект обнаруживался при больших значениях тока аппликации (60-90 нА). Контрольные инъекции тока через ствол, заполненный хлоридом натрия ни к прямому, ни к отдаленному возбуждению нейронов не приводили.

Тормозные реакции в полоске, в отличие от реакций нейронов интактной коры, редко приводили к полному вытормажизанию импульсации. Более обычными были реакции с появлением длительных межимпульсных интервалов Интересен факт, что в ряде случаев уровень фоновой импульсации после тормозной паузы не восстанавливался до прежнего уровня.

Отдельные нейронов: проявили склонность к "ускользанию" из под тормозного влияния, еще до завершения отдаленной аппликации. При этом тормозная реакция могла сразу перейти в фазу возбуждения или появление длительных тормозных пауз прерывалось всплесками импульсной активности в виде "пачек" импульсов.

Тормозные реакции в ответ на аппликацию Глу свидетельствуют

о возможном существовании естественных глутаматергических связей между пирамидными нейронами и тормозными интернейронами. В недавнем электрофизиологическом исследовании, проведенного в условиях переживающих срезов, на парах нейронов: пирамидный-пирамидный и пирамидный-непирамидный /Thomson et al.. 1989 а.б/ было показано, что стимуляция пирамидных нейронов вызывает глутаматергический синаптический ответ у соседних пирамидных и непирамидных нейронов.

Обращает на себя внимание расхождение в соотношении возбуждающих и тормозных реакций, с результатами полученными на интакт-ной коре. Возможно, что за это ответственно устранение подкорковых влияний. Подрезка афферентных аксонов лишает кору значительной части возбуждающих синаптических влияний, что может отразится на мембранных свойствах клеток внутри полоски. Кроме того, подрезка коры может привести к метаболическому сдвигу в изолированном участке ткани. Деафферентация коры по методу, предложенному Сентаготаи оставляет интактным пиальное кровобращение. ишемичес-кие последствия при этом значительно менее травматичны, чем в условиях переживающих срезов. Тем не менее, какая то часть клеток коры по-видимому погибает вследствие ишемии. Утрата определенных клеточных элементов, например тормозных нейронов, при подрезке коры может объяснить различия между данными по возбужден™ и торможению в полоске и на интактной коре.

3.2. Электронно-плотный продукт реакции пероксидазы и ТМБ-W был сосредоточен в миеленизированных и немиеленизированных аксонах и аксонных терминалях, образующих асимметричные, преимущественно аксо-шипиковые. синаптические контакты. Синаптических контакты, образованные меченными Т-К окончаниями обычно имели перфорированные активные зоны, содержали митохондрии и большое количество синаптических пузырьков, которые были диффузно распределены в ак-соплазме. Сравнение площадей профилей большого числа меченых терминалей после инъекций в вентробазальный комплекс (ВБ), но в различные ядра, показало сходство в размерах окончаний (-0,55-0,6 ккм2), при этом доля митохондрий в аксонных терминалях была (-20%), примерно одна и та же. Сравнение аксонных окончаний в слое IV соматической, слуховой и зрительной коре, наоборот, показало существенное различие: Т-К терминали в соматической системе были достоверно больше по размеру чем в слуховой, а в слуховой соответственно больше чем зрительной. При этом доля митохондрий в

окончаниях была примерно одинакова во всех трех сенсорных системах. Наибольшая разница была обнаружена при сравнении площадей и мйтохокдриальной доли в Т-К.и К-К меченых терминалях исследованных в слое IV соматической коры. К-К аксонные" окончания-были примерно вдвое меньше по размерам и по содержанию митохондрий. Они как правило, обладали неперфорированными синаптическими активными зонами, синаптические пузырьки были плотно упакованы и сосредоточены около пресинаптической мембраны.

Различия между размерами Т-К терминалей из соматической, слуховой и зрительной коры, возможно, указывают на относительную важность сенсорных систем у белых лабораторных крыс, более ориентирующихся на соиатосенсорное чувство и менее всего на зрительное /Vincent, 1912; Krieg, 1946/. Больший размер синаптических терминалей у синапсов с повышенной активностью был отмечен в других структурах, таких как нервно-мышечный контакт, синапсы в симпатических ганглиях, кохлеарных ядрах и др. /Pierce, Lewin, 1994/. Насыщенность таламических терминалей энергетическим субстратом -митохондриями, свидетельствует о более высокой синаптической активности Т-К волокон, по сравнению с К-К терминалямк.

Количественный анализ содержания Глу в Т-К окончаниях производился на меченых ПЛ-ПХ или ПЛ-ПХ-аминокапроатом аксо-шипиковых синаптических скончаниях с использованием высокоселективных антител, выработанных к Глу ."Kepler et al., 1938/. Качественный анализ метки на Глу показал, что большинство (./60Х) Т-К терминалей интенсивно метилось на глутамат. Для доказательства данного положения, помимо содержания Глу в самих окончаниях, аналогичное измерение проводилось в отношении дендритных шипиков, постсиналти-ческих к измеряемым таламическим окончаниям, а также в отношении соседних к ним дендритных стволов, отростков глии и ГАМК-положи-телькых синаптических терминалей. Данный анализ проводился в первичных проекциях соматической, зрительной к слуховой систем.

Сравнение плотностей иммунной метки в цитоплазме у всех указанных типов профилей показало, что наиболее высокий уровень содержания глутамата приходится на таламические окончания, он был достоверно выше уровня Глу в постсинаптических шипиках (р<0,01), дендритных стволах (р<0.001), ГАМК-положктельккх терминалях (р<0,001) и глии (р<0.001). Содержание Глу в Т-К скончаниях разных сенсорных систем было примерно одинаково. Содержание Глу у меченых Т-К терминалей сравнивалось с уровнем Глу у меченых ПЛ-ПХ К-К окончаний. При этом средние значения плотности метки

для обоих типов терминалей были примерно одинаковы: 72 у К-К против 76 (частиц/мкм2) у Т-К. тогда как разброс значений для К-К терминалей был выше, чем для Т-К: стандартное отклонение для К-К было 41 против 17 (частиц/мкм2) у Т-К.

Факт, что Глу имел достоверно повышенный уровень в Т-К волокнах свидетельствует в пользу его медиаторной синаптической функции в Т-К системе. Данный метод доказательства был использован в многочисленных исследованиях на других структурах мозга /Somogyi et. al.. 1986: Montero, 1990/. Плотность мечения частицами коллоидного золота находится в соотношении близком к линейному с концентрацией эндогенного Глу в ткани /Ottersen, 1989/. Биохимическими исследованиями было показано, что в синаптических пузырьках, выделенных из коры крыс, концентрация Глу порядка 50 мМ /Burger et al., 1989/.

Мы использовали метку на ГАМК для идентификации синаптических структур, которые наиболее вероятно используют Глу в метаболических целях. Низкий уровень Глу в ГАМК-ергических нейронах был показан в предыдущих исследованиях /Ottersen, Storra-Mathisen, 1984; Somcgyi et al., 1986; Jl et al., 1991/. Поскольку Глу является предшественником ГАМК, то можно предположить, что активность Глу декарбоксилазы - фермента, превращающего Глу в ГАМК, понижает уровень Глу в ГАМК-ергических структурах. С другой стороны постоянная потребность в субстрате синтеза ГАМК, по мнению ряда исследователей /Martin. Rimvall, 1993/ может приводить к накоплению Глу в микроскопических дискретных объемах цитоплазмы или митохондрий. Однако, подобных очагов синтеза ГАМК с высоким содержанием Глу в настоящем или других исследованиях, проведенных на ЭМ уровне, обнаружено не было.

При сравнении Т-К и К-К терминалей было отмечено, что при достаточно большой выборке, средние значения уровня Глу были примерно одинаковы, но стандартное отклонение среднего было намного больше для К-К окончаний. Пресинаптический уровень Глу может определять количество медиатора, выделяющегося в синаптическую щель. Таким образом, наличие большего разнообразия в уровнях Глу в К-К синаптических окончаниях может отражать более сложную функциональную организацию К-К связей по сравнению с Т-К терминалями.

3.3. Антитела, выработанные против олигопротеина субъединицы ГлуPI интенсивно метили тела и дендриты многочисленных непирамидных нейронов во всех шести корковых слоях. Пирамидные нейроны во

всех слоях интенсивно метились антителами, распознающими субъединицы ГлуР2/3 или ГлуР2. Антитела против субъединицы ГлуР4 слабо окрашивали"пирамидные-нейроны-и интенсивно метили астроциты. Антитела на НМДАР1 метили большинство нейронов в коре как"пирамидных, так и непирамидных. Небольшое число непирамидных нейронов имели повышенное содержание НМДАР1. Наибольшее разнообразие в клеточном и послойном распределении из всех тестированных субъединиц было обнаружено для субъединиц ГлуР1 и ГлуР2, особенно в популяции непирамидных нейронов. В отношении субъекницы ГлуР1 был проведен более детальный послойный анализ, оценивалось распределение интенсивности иммунофлуоресценции отдельных клеток на содержание Глу?1. проведено морфологиическое описание и классификация нейронов. С использованием метода двойного мечения была изучена ко-локализация ГлуР1 и ГД/ГАМК. ГлуР1 и ГлуР2. Антитела на ГлуР1 интенсивно метили обширную популяцию нейронов, по морфологическим признакам относящихся к основным типами непирамидных нейронов, определенных ранее при импрегнации по Гольджи /Feldman, Peters, 1978/: мультиполярные, биполярные и клетки с двойным пучком дендритов. Обширные дендритные ветвления ГлуРЗ-положительных клеток, особенно в слое III, могут служить для интеграции синап-тическэй информации по значительному объему корь:.

ЭМ исследование метки ка Глу?1 в коре показало локализацию данной субъединицы преимущественно б дендритах и телах клеток, тогда как аксонное мечекие встречалось крайне редко. Метка на ГлуР1 в соме нейронов присутствовала в наибольшем количестве в шероховатом эндоплазматическом рэтикулуме (ЭПР) и в окружающей его цитоплазме, а также в перинуклеарных цистернах. Стволы ГлуР1-положительных дендритов имели высокую плотность аксо-денд-ритических синаптических окончаний, выше чем, например, на стволах дендритов пирамидных нейронов. Дендритные шипики на ГлуР1-по-ложительных дендритах отсутствовали. Метка в дендритах обычно была сконцентрирована б области постсинаптического уплотнения, непосредственно примыкала к постсинаптаческой мембране, часто вовлекая саму мембрану и синаптическую щель.

ЭК исследование показало концентрацию метки в цистернах шероховатого эндсплазматическсго ретнкулума. Таким образсм. ГлуР!-положительные нейроны должны были иметь высокий уровень синтеза данной субъединицы. В дендритах метка часто была сконцентрирована в субсинаптической области с наибольшей плотностью метки в области постсинаптического уплотнения. Данный факт был

отмечен в предыдущих ЗМ исследованиях /Petralia, Wenthold, 1992/. По нашему мнению, накопление белка в субсинаптических областях может быть связано с реально существующим резервным депо рецеп-торного белка, готового к встраиванию в синаптическую мембрану.

Доказательство ГАМК-ергической природы ГлуР1-положительных интернейронов было проведено на полутонких срезах. Исследование показало, что 95% нейронов имели двойною метку. Сравнение интенсивно ГлуР1/ГАМК-положительных нейронов с соседними только ГАМК-положительными клетками показало, что ГлуР1-положительные нейроны в основном составляют популяцию малых ГАМК-ергических нейронов (р < 0.01). Мечение на ГАМК с использованием коллоидного золота ЭМ материала, содержащего профили ГлуР1 -положительных нейрона показало, что все интенсивно ГлуР1-положительные нейроны также метятся на ГАМК.

Нами также проводилось иммунофлуоресцентное двойное мечение на ГлуР1 и Глу декарбоксилазу (ГД)-фермент синтеза ГАМК. Приблизительно 90% интенсивно ГлуР1 -положительных непирамидных нейронов содержали ГД, что составило 25-30% от всех содержащих ГД клеток т.е. от всей популяции ГАМК-ергических интернейронов. Детальное картирование ГД- и ГлуР-положительных нейронов на одних и тех же срезах дало 70%-ное совпадение обеих популяций.

В настоящем исследовании была выявлена ко-локализация ГлуР1 с ГАМК и ко-локализация с ферментом синтезирующим ГАМК - Глу де-карбоксилазой (ГД). Оба маркера широко используются при идентифицировании ГАМК-ергических нейронов /Martin, Rimvall, 1993/. В исследовании на полутонких срезах было доказано, что более 90% интенсивно ГлуР1-положительных нейронов являются ГАМК-ергически-ми, что составляет примерно 30% от всей популяции ГАМК-ергических нейронов и примерно столько же от популяции ГлуР1-положительных нейронов. Наши результаты хорошо согласуются с тем, что ГАМК-ер-гические интернейроны в коре возбуждаются преимущественно через АМПА рецепторы /Hablitz, Sutor, 1990; Hestrin, 1993/.

Ко-локализация ГлуР1 и ГлуР2 была исследована на отобраных в случайном порядке непирамидных нейронах из разных слоев коры, интенсивно меченных хотя бы одним из указанных маркеров. Из них 93% нейронов были ГлуР1-положительны и ГлуР2-отрицательны; 6% нейронов были положительны на ГлуР2 и отрицательны на ГлуР1 и только 1% клеток были мечены на оба маркера. Большинство пирамидных нейронов были ГлуР2-положительными и ГлуР1-отрицательными, однако в слое V многие крупные пирамидные клетки метились на оба антигена.

при этом интенсивность двойной окраски имела тенденцию к положительной - корреляции....

Хотя ко-локализация ГлуР1 к ГлуР2 наблюдалась во многих пирамидных нейронах, практически все интенсивно и большинство средне окрашенных Глу?1-положительные нейронов проявили практически негативное окрашивание на ГлуР2. Отсутствие ГлуР2 субъединицы в рецепторе ведет к появлению проводимости канала по кальцию /Mis-hina et al.. 1991; Verdoorn et al., 1991; Burnashev et al.. 1992; Jonas et al.. 1994/. Ланное свойство имеет чрезвычайно важное значение поскольку связывает быструю синаптическую передачу и систему кальций-зависимых процессов в клетке.

Измерение положения частиц золота относительно синаптической активной зоны показало, что метка была сконцентрирована в области синаптических активных зон. с наибольшей плотностью в синаптичес-кой щели и пост-синаптической мембране. Метка также присутствовала в области пресинаптических терминалей и пресинаптической мембраны. Молекулы рецептора присутствовали в значительном количестве в цитоплазме дендрита, в области непосредственно примыкающей к активной зоне, занятой постсиналтическим электронно-плотным веществом. Метка присутствовала в телах нейронов в незначительном количестве, по сравнению с иммунолерокскдазным окрашиванием, ко была так же локализована в области ЭПР.

Сравнение распределений в аксо-декдритком направлении для различных АМПА субъединиц показало их принципиальное сходство, тогда как латеральное распределение субъединиц было различно для ГлуР1 и ГлуР2/3 или ГлуР2. ГлуР1 субъединица имела более центральное положение, тогда как ГлуР2/3 или ГлуР2 локализовались более латерально, на периферии синапсов. НМДАР1 субъединица имела больнее сходство с распределением ГлуР1 чем с ГлуР2/3.

Морфометркческие измерения меченых синапсов в верхних слоях коры показали, что АМПА рецептор более чем КМДА характерен для синапсов с большим диаметром (р<0,01), особенно в слое IV. При выраженном различии в локализации АМПА и НМДА субъединиц, двойное мечение на ГлуР2/3 и НМДАР1 выявило, что значительное число синапсов в коре содержало оба типа рецепторов, также были случаи когда соседние синапсы на одном дендрите содержали разные субъ-единкцьг одного типа. Например, на одном дендрите в слое III было найдено 9 соседствующих синапсов: 4 содержали ГлуР2/3, 4 имели НМДАР1 и только один имел двойную метку.

Присутствие метки в области непосредственно примыкающей к

синаптической активной зоне указывает на существование либо резервного запаса молекул рецептора, либо продуктов их распада в процессе обновления синаптической мембраны. Пресинаптическая локализация была наиболее выражена для НМДА рецептора, что соответствует данным предыдущего исследования с использованием имму-нопероксидазного метода /Huntley et al., 1994/. Данные нашего исследования подтверждают возможность кооперативного участия АМПА и НМДА рецепторов в генерации синаптических токов, -наблюдаемых в корковых нейронах /Thomson et al., 1993а.б/

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По данным наших исследований микроэлектрофоретическая аппликация Глу в условия изолированной полоски коры приводит к возбуждению нейронов в месте аппликации и к выраженным возбуждающим и тормозным реакциям на расстоянии 200-300 мкм от точки аппликации. Данный факт однозначно доказывает существование внутрикорковых возбуждающих и тормозных связей в коре и подтверждает реактивность нейронов коры к Глу. Наши результаты подтверждают выводы предыдущих исследований выполненных на интактной коре /Blscoe, Curtis, 1958; Александров и др., 1982, 1983/ о том, что феномен химического торможения/ возбуждения вызванного инъекцией Глу основывается на локальном возбуждении популяции корковых нейронов проецирующихся в точку коры, из которой производилась регистрация.

Идентифицированные с помощью аксонного маркера Т-К и К-К си-наптические терминали содержат повышенный уровень Глу. Данный факт является доказательством медиаторной роли Глу в таламо-кор-ковой и части корково-корковых проекций. Измерение уровня Глу у идентифицированных Т-К терминалей в соматической, зрительной и слуховой системах показало принципиальное сходство в содержании Глу, что подтверждает роль глутамата в качестве основного медиатора возбуждения в коре головного мозга. Данные нашего иммуноци-тохимического исследования рецепторов Глу показали, что практически все нейроны коры содержат в различной мере субъединицы рецепторов к глутамату: АМПА и НМДА. ГАМК-ергические тормозные интернейроны обладают отличной от пирамидных нейронов конфигурацией АМПА рецептора на мембране, которая обладает свойством повышенной проводимости по кальцию /Jonas et al., 1994; Bochet et al.. 1994/. АМПА рецептор-канал, в особенности комплекс гомомерный по

ГлуР1 субъединице, является более быстрым в динамике канала /Boulter et al., 1990/. Быстрый вход кальция в ГАМК-ергические нейроны может "обеспечивать-соответственно быструю_ пластическую перестройку синаптических свойств, которые в свою очередь могут"при водить к эффективному участию в тормозной настройке сенсорных свойств нейронов коры, описанных ранее /Batuev et al., 1989, Александров, 1990/.

ВЫВОДЫ

1. Реакции нейронов изолированной сенсомоторной коры на отдаленную микроэлектрофоретическую аппликацию глутамата согласуются с предположением, что рецепторы глутамата присутствуют как на пирамидных нейронах, так и на внутрикортикальных интернейронах.

2. Таламо-корковые и корково-корковые синаптические терминали в слое IV соматической коры обладают выраженными отличительными морфологическими свойствами.

3. Таламо-корковые и корково-корковые синаптические терминали в

соматической коре содержат повышенный уровень эндогенного Глу, что свидетельствует с нейромедиаторной роли Глу в исследованных проекциях. Таламо-корковые синаптические терминали в соматической, слуховой и зрительной сенсорных системах обладают сходным, повышенным уровнем Глу.

4. Субъединицы АМПА рецептора гетерогенно распределены в корковых клетках. Пирамидные нейроны преимущественно содержат ГлуР2 и ГлуРЗ субъединицы, тогда как непирамидные нейроны, в основном, содержат ГлуР1. Непирамидные нейроны, обладающие высоким содержанием ГлуР1 являются ГАМК-ергическими нейронами.

5. Нейроны содержащие высокий уровень ГлуР1 имеют низкий уровень ГлуР2. Данное свойство может определять проницаемую по кальцию конфигурацию синаптических АМПА рецепторов более чем у трети ГАКК-ергических нейронов коры.

6. Субъединицы АМПА рецептора и НМДАР1 могут иметь различную си-наптическую локализацию, присутствовать в синапсах различной длины и в различных локусах в пределах одного синапса.

7. АМПА и НМДА рецепторы могут быть ко-локализованы на одном дендрите и в пределах одного и того же синаптического контакта.

Список работ опубликованных по материалам диссертации.

1. Батуев А. С., Александров А. А., Щейников Н. А., Харазия В.Н.. Чан Тхи-Чинь Ан. Роль процесов торможения в формировании функциональных свойств нейронов проекционной зоны вибрисс соматосенсор-ной коры кошки // Журн. высш. нервн. деят. 1987, Т.37, N4. С.711-719

2. Харазия В.Н., Лопанцев В.Э., Александров А. А. Действие отдаленной химической стимуляции нейронов изолированной полоски сен-сомоторной коры кошки // 2-я Всесоюзная конференция по нейронау-кам. Тезисы докладов. Киев, 1988. С.224-225.

3. Kharazia V.N., Weinberg R.J. Glutamate in terminals of thalamocortical fibers in rat somatic sensory cortex. Neurosci. Lett., 1993. V. 157 P. 162-166.

4. Kharazia V.N., Weinberg R.J. Glutamate in thalamocortical fibers terminating layer IV of sensory cortex of the rat // J. Neurosci.. 1994. V. 14 P. 6021-6032.

5. Kharazia V.N., Rustioni A., Wenthold R.J, Weinberg R.J. Laminar distribution of glutamate receptors in rat somatosensory cortex. Soc. Neurosci. Abst. (Miami, USA, 1994) T. 20., С. I 634.

6. Kharazia V.N., Phend K., Wenthold R.J and Weinberg R.J. Synaptic localization of AMPA and NMDAR1 receptor subunits In rat ce-_ rebral cortex. Neurosci. Abst. (San-Diego. USA. 1995) Т. 2.|, C. 1337

Подписано к печати 18.01.96. Заказ 12 Тираж 100 Объем I п.л. ЦОП СПГУ. 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова,6.