Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейромедиаторные и морфофункциональные особенности реакции мозга на гипотермию гомо- и гетеротермных животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нейромедиаторные и морфофункциональные особенности реакции мозга на гипотермию гомо- и гетеротермных животных"

Р Г Б ОД 2 МАР т7

На правах рукописи

Пашаева Декада Эмнроеко&на

НЕЙРОМЕДИАТОРНЬЕЕ ИМОРФОФУНКЦИОНЛЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИИ МОЗГА НА ГИПОТЕРМИЮ ГОМО- И ГЕТЕРОТЕРМНЫХ

ЖИВОТНЫХ

03.00.04. - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г.Махачкала 1997 г.

Работа выполнена в НИИ Биологии Дагестанского Государственного Университета НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, академик РАЕН, заслуженный деятель науки РФ, профессор Э.З. Эмир беков

доктор биологических наук, профессор А.М. Менджерицкий

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Погорелова Т.Н. (г.Ростов-на-Дону) доктор биологических наук Хоружая Т.А. (г.Ростов-на-Дону) ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Ростовский Государственный Медицинский Университет (г.Ростов-на-Дону) Защита состоится

"3 1597 г. в часов на заседании диссертационного совета Д. 063.52.08. по биологическим наукам в Ростовском Государственной Университете (344006, г.Ростов-на-Дону, ул.Болыпая Садовая 105, РГУ, биолого-почвенный факультет, ауд._).

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке РГУ (344006, г.Ростов-на-Дону, ул.Пушкинская, 148).

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, . „

доктор биологических наук у /// В.Н.КИРОЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы внимание исследователей привлекает изучение компенсаторно-приспособительных механизмов, обеспечивающих устойчивость центральной нервной системы к повреждающим воздействиям и стрессорным состояниям. В течение долгого времени большое и даже исключительное внимание биологов и медиков было направлено на исследования стресс-реакций организма в ответ на изменение условий окружающей среды (Селье, 1982, Меерсон, Пшенникова, 1988). С современной точки зрения существуют две стратегии адаптации - резистентная и толерантная (Слоним, 1986, Хочачка, Сомеро, 1988, Malan, Caaguilhem, 1989). В ответ на воздействие любого фактора организм отвечает увеличением резистентности или повышением толерантности, что и обеспечивает высокую приспособляемость к изменяющимся условиям среды (Кулинский, Ольховский, 1992, Heller et al., 1986). В связи с вышеизложенным выявление соотношения двух механизмов адаптации и способов их регуляции при экстремальных состояниях является весьма перспективным.

Выяснение механизмов естественной адаптации к низким температурам имеет огромное практическое значение, так как использование гипотермии в качестве метода лечебного воздействия заставило ученых обратить внимание на частые осложнения, в ряде случаев заканчивающиеся летально (Акимов и др., 1977; Покровский и др., 1992). Поэтому сравнительное изучение биохимических механизмов влияния на организм искусственного и естественного охлаждения представляется весьма актуальным для разработай более совершенных методов лечебной гипотермии (Марченко и др., 1992).

В многочисленных исследованиях гипотермии особое место занимают элекгрофизиологические методы и описания нейрогуморальной регуляции деятельности головного мозга. Однако, тонкие ультраструктурные особенности организации головного мозга зимнеспящих, лежащие в основе уникальных механизмов их мозговой деятельности в условиях гипотермии, требуют дальнейшего изучения.

В последние десятилетия получены убедительные доказательства того, что основой любых приспособительных реакций мозга является его пластичность. Поэтому особенно актуально в настоящее время изучение центральных синаптических механизмов в работе системы терморегуляции, так как именно в синапсе происходят одни из главных

пластических перестроек, обеспечивающих реализацию адаптационной стратегии (Саркисов, 1994).

Целью работы явилось сравнительное исследование головного мозга гетеротермных и гомойотермных животных при различных режимах гипотермии с использованием комплекса биохимических и элек-тронномикроскопических методов.

В работе были определены следующие задачи исследования:

1. Изучить ультраструкгуру сенсомоторной коры головного мозга сусликов и крыс в норме и при различных режимах гипотермии;

2. В больших полушариях и в среднем и промежуточном мозгу крыс в динамике гипотермии и при последующем самосогревании изучит, содержание свободных и связанных дикарбоновых аминокислот и ГАМК, являющихся одновременно основными нейромедиаторами и энергетическими субстратами;

3. Изучить содержание свободных и связанных дикарбоновых аминокислот и ГАМК в больших полушариях и в среднем и промежуточном мозгу сусликов при различных режимах гипотермии;

4. Изучить содержание свободных и связанных дикарбоновых аминокислот в головном мозгу сусликов при зимней спячке.

Научная новизна работы:

1. Впервые исследована ультрасгруктура сенсомоторной коры головного мозга бодрствующих сусликов при нормотермии. Впервые проведен сравнительный анализ ультраструктурных изменений сенсомоторной коры гомойотермных и гетеротермных животных при принудительной гипотермии и показано принципиальное отличие направленности данных изменений.

2. Впервые установлено, что ведущую роль в обеспечении адаптации ЦНС гетеротермов к низким температурам играет активация структур, обеспечивающих нейромедиаторный и энергетический метаболизм, а также изменения синаптоархитекгоники, заключающиеся в активации тормозной синалтической сети и появлении активных аксо-аксонных синапсов.

3. Впервые показано, что у гомойотермов при гипотермии наблюдаются неспецифические сдвиги в организации синаптических контактов и частичное повреждение ультраструктуры цитоплазматических орган елл.

4. Впервые обнаружено, что содержание свободных и связанных глутамата, аспартата и ГАМК в мозгу гоиойотермоэ изменяется в более широких пределах, чем в мозгу гетеротермов; структуры среднего и промежуточного мозга реагируют на гипотермию более выражено, чем кора больших полушарий.

5. Впервые представлены данные о том, что большая устойчивость гетеротермов к принудительной гипотермии обусловлена поддержанием более стабильных концентраций в мозгу таких лабильных компонентов как глутамияовая, аспарагиновая аминокислоты и ГАМК и большей ассоциацией последних с белками и мембранными структурами нейронов, что подтверждается обнаруженными в данной работе наибольшими величинами связанных форм аминокислот в отделах головного мозга сусликов в состоянии зимней спячки.

Теоретическое и практическое значение: Результаты проведенного исследования нейрохимических изменений в комплексе с изучением ультраструкгурных особенностей мозга гомо- и гетеротермов при различных режимах гипотермии расширяют существующие представления о механизмах адаптации организма к низким температурам. Одной из особенностей морфо-функциональной организации мозга гетеротермов является превалирование связанных форм нейромедиатор-ных аминокислот. Полученные в данной работе результаты могут быть использованы для разработки моделей искусственного гипобиоза в экспериментальной биологии и медицинской практике.

Основное содержание работы используется при чтении курсов "Экологической биологии", "Нейрохимии" и "Биологии животных'1 в Дагестанском университете.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. В мозгу сусликов в условиях нормотермии обнаружены многочисленные неактивные тормозные синалтические контакты, в том числе аксо-аксонные, наряду с гипертрофией и пролиферацией белоксинтези-рующего аппарата нейронов.

2. Изменения синаптической организации сенсомоторной коры сусликов при различных режимах гипотермии, направленные на перестройку межнейронных отношений в сторону выраженной активации аксо-ак сонных синапсов-регуляторов, обеспечивают адаптацию ЦНС за счет механизмов синаптической пластичности, в то время как в сенсомоторной коре крыс при гипотермии происходят повреждения

о

ультраструктурной организации субклеточных структур и синаптиче-ских контактов.

3. Адаптивные возможности мозга гомо- и гетеротермных животных при гипотермическом воздействии в значительной степени определяются динамикой свободных и связанных аминокислот. Существенным является различие в соотношении свободных и связанных форм исследованных аминокислот в структурах мозга с превалированием связанной формы в мозгу гетеротермов, что может обеспечивать высокие адаптационные способности нейрональных структур мозга сусликов к низкой температуре тела.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: годичных научных сессиях профессорско-преподавательского состава ДГУ (Махачкала, 1994-95-96 гг.); 11 Собрании Европейского Нейрохимического Общества (Нидерланды, Гронинген, июнь 1996 г.); Международной конференции "Нейрохиыия и Фармакология наркомании и алкоголизма" (Санкт-Петербург, июнь 1996 г.); конференции по функциональной нейрохимии, посвященной 85-летию со дня рождения профессора Н.Н.Демина (Пушино, сентябрь 1996 г.); совместном заседании научно-технического Совета НИИ биологии и кафедры биохимии ДГУ (Махачкала, 10 сентября 1996 г.); заседании кафедры биохимии и микробиологии Ростовского государственного университета (21 января 1997 г.).

Публикации результатов исследования. По результатам работы опубликовало 6 статей и 1 находится в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов.

Работа содержит _ таблиц и 29 рисунков. В списке литературы

приведено_источников, из них_иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ: Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах, массой 150-200 г., и на типичных представителях гетеротермов - кавказских сусликах малых (Citellus pygmalus Pallas), массой 200-250 г. Гипотермию вызывали, помещая животных в холодовые камеры из органического стекла (Эмирбеков, 1986). Ректальную температуру у крыс снижали до 30СС и 20-19°С (умеренная и глубокая гипотермия), а у сусликов - до 20СС и до 10°С

(умеренная и глубокая гипотермия). Постгипотермические последствия исследовали через 3 часа и 7 суток после самосогревания. Изучение природной адаптации к низкой температуре тела проводили на сусликах. которых помещали в темную комнату, где поддерживалась температура 5-6 °С. Эксперименты проводили на 10 день после начала баута, что соответствует глубокой зимней спячке с температурой тела 7-9 °С.

Контрольных и подопытных животных декапитировали, выделяли большие полушария и суммарно средний и промежуточный мозг. Очищенные от капилляров отделы мозга быстро взвешивали и гомогенизировали. В осадке, полученном после центрифугирования в среде Рин-гера, определяли содержание связанных аминокислот (Elliot et al., 1965). Для определения содержания свободных аминокислот, находящихся в надосадочной жидкости, из супернатанта получали ТХУ-экстракты, которые обрабатывали водонасыщенным этиловым эфиром, упаривали на водяной бане. Сухой остаток растворяли в 0,2 мл бидистиллированной воды и использовали для разделения аминокислот с помощью электрофореза на бумаге по Дозе (1957) в пиридин-ацетатном буфере при напряжении 100 вольт/см и силе тока 1,5 ампер/см в течение 3 часов с последующим окрашиванием 0,2% раствором нингидрина в ацетоне. Содержание свободных и связанных аминокислот выражали в мкмоль/г свежей ткани.

Материал для электронной микроскопии (III-V слои сенсомогор-ной коры) получали тотчас после декапитации животного. Использовали общепринятый метод обработки материала (Bozzola. Rüssel, 1991). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме УМТП-6, контрастировали на сетках цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе ПЭМ-100.

Статистическую обработку данных проводили по t-критерию Сгьюдента (Владимирский, 1983), резко отклоняющиеся варианты отбрасывали с использованием критерия Шовене (Кокунин, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ультраструктура сенсомоторнон коры мозга крыс н сусликов при гипотермии.

Электронномикроскопическое исследование сенсомоторной коры мозга гибернантов в условиях нормотермии показало, что тонкая структурная организация различных элементов нервных, глиальных

клеток и компонентов нейропияя в основном соответствует таковой у других млекопитающих, в том числе у крыс. Вместе с тем у "легших" сусликов в период их активного бодрствования наблюдается гипертрофия и пролиферация белоксинтезирующего аппарата нейронов, о чем свидетельствует большое количество свободных и связанных рибосом (как одиночных форм, так и полисом), наличие более развитой сети шероховатого эндоплазматического ретикулума, а также расширенные ядерные поры.

Синаптический аппарат неокортекса гибернантов представлен тормозными аксо-соматическими синапсами, которые имеют симметричную структуру активной зоны, и возбуждающими аксо-дендритиче-скими и аксо-шипиковыми синапсами с асимметричной структурой активной зоны, то есть, I и II типом синапсов по Грэю. Тормозные си-наптические контакты имеют узкую синаптическую щель, немногочисленные синаптические везикулы, ультраструкгурная спецификация си-наптической мембраны (активная зона синаптического контакта) практически не выделяется и синапсы этого типа выглядят мало активными. Аксошипиковые возбуждающие синапсы выглядят функционально более активными, в пользу чего свидетельствует их широкая синаптиче-ская щель, многочисленные синаптические везикулы, локализующиеся вблизи активной зоны, четкое постсинаптическое уплотнение. К особенностям синапто-архитекгоники гибернантов следует отнести наличие в нейропиле структур, напоминающих таг; называемые "сериальные синапсы" - идущие один за другим аксо-соматические или аксо-дендри-тические контакты (Боголепов, 1975), а также наличие многочисленных неактивных в условиях нормотермии тормозных синаптических контактов. в том числе аксо-аксонных. По-видимому, именно эти компоненты ультраструктуры играют ведущую роль в осуществлении адаптивно-приспособительных реакций мозга сусликов на низкие температуры.

Электронномикроскопическое исследование сенсомоторной коры головного мозга зимнеспящих при принудительной гипотермии до 20°С показало, что снижение температуры мозга на 10 °С приводит к активации биосинтетических и энергетических процессов в нервных клетках при данном режиме гипотермии. Повышение энергетических потребностей нейронов при адаптации к гипотермии приводит к набуханию митохондрий, появлению делящихся гантелевидных форм. Б отростках

нейронов наблюдается группирование органелл, причем в дендритах преобладают вытянутые формы митохондрий, а в аксонах - округлые с элехтронноплотным матриксом и концентрическими кристами. Такие митохондрии были описаны ранее в мозге сусликов во время гиберна-ции (Штарк, 1970). В энергетическом аппарате астроцитов отмечаются сходные изменения, свидетельствующие о значительных энергетических затратах.

В тормозных аксо-соматических синапсах имеются признаки выраженной активации: количество синаптических везикул увеличено, отмечается их группирование у активной зоны контакта, то есть появляется пул активных синаптических везикул. Активная зона уплотнена за счет утолшения пре- и посгсинаптических мембран, синалтическая щель несколько расширена по сравнению с контролем. Отмечается резкая энергизация аксонных окончаний, формирующих тормозные аксо-соматические синапсы, в некоторых случаях аксоплазма выглядит заполненной митохондриями. В аксошипиховых синапсах имеются признаки снижения активности синаптаческой трансмиссии: количество синаптических везикул в аксонах незначительно, постсинаптическое уплотнение имеет нерегулярную структуру, шипиковый аппарат с признаками набухания и вакуолизации, синалтическая щель конгурируется не всегда. Кроме того дендритные шипики приобретают удлиненную форму и имеют меньший диаметр. Удлинение шипиков некоторые авторы наблюдали в результате воздействия на крыс сильного эндогенного адаптогена - дельта-сон индуцирующего пептида, что ассоциировалось с повышением адаптивных возможностей мозга при стрессе (Менджерицкий и др., 1994). Особого внимания заслуживает феномен активации многочисленных аксо-аксонных контактов в нейропиле нео-кортекса сусликов при данном режиме гипотермии. При этом как правило один из аксонов, формирующих аксо-аксонный контакт, формирует также асимметричный синапс с дендритом, что соответствует классической схеме нейропептидной регуляции синаптической передачи.

При глубокой гипотермии следует в первую очередь отметить появление многочисленных темных нейронов с осмиофильной цитоплазмой и ряда необратимых повреждений отдельных органелл: наиболее выражена деструкция митохондрий, что свидетельствует о недостаточности компенсаторно-приспособительных механизмов в плане энергетического обеспечения мозга гегеротермов. В светлых нейронах име-

ются признаки активации белоксинтезирующего аппарата, энергетические затраты компенсируются за счет активации деления митохондрий, чего не наблюдалось при предыдущем режиме гипотермии. В отличие от предыдущего режима гипотермии, глубокая гипотермия приводит к повышению проницаемости гемато-энцефалического барьера.

Ультраструктурные изменения синаптоархитеюгоники неокор-текса гибернантов имеют в основном ту же направленность, что и при предыдущем режиме гипотермии: отмечается активация регуляторных аксо-аксонных синапсов, в отдельных аксошипиковых контактах имеются признаки ультраструктурной дезорганизации, ведущей к нарушению механизмов синалтической трансмиссии в возбуждающих синапсах (в постсинапсе выражена редукция и вакуолизация шипикового аппарата, образуются глубокие инвагинации синаптических мембран в пресинаптическое аксонное окончание аксошипиковых синапсов, происходит дробление активных зон и адгезия синаптических везикул в центральной части аксоплазмы). Ультраструктура большей части пула аксо-соматических тормозных синапсов свидетельствует об их хорошей сохранности и активном функционировании однако, отдельные аксон-ные окончания имеют признаки дегенерации по светлому типу и содержат миелиноподобные структуры в аксоплазме.

При глубокой гипотермии в сенсомоторной коре крыс наблюдается дезорганизация клеточных структур, микроциркуляторного русла и глиального окружения, вплоть до необратимых изменений: в цитоплазме появляется большое количество вторичных лизосом и ли-пофусциновых гранул неправильной формы, в митохондриях наблюдается редукция крист и повреждения внутренних мембран, в дендритах появляются слоистые мембранные образования, напоминающие уплощенные цистерны гладкого ретикулума или гипертрофированные мембраны шипикового аппарата. Дендритные шипикм приобретают главным образом округлую форму и короткую толстую шейку. Выраженное округление шипиков, ассоциированное с редукцией его щейки, описано другими авторами в этих же слоях сенсомоторной коры крыс после глубокой гипоксии и подтверждено морфометрическими исследованиями (М^яошз, РолаЫШе, 1995). Следовательно, подобная реакция шипикового аппарата универсальна и отражает нарушение функционирования аксо-шипиковых синапсов при тяжелых повреждающих воздействиях. Ультраструктура тормозных аксо-соматических синапсов свидетель-

стпует о начальных этапах необратимых дегенеративных изменений пресинаптаческих аксонов.

Таким образом, сравнительный анализ ультраструктурных изменений сенсомоторной коры гомойотермных и гетеротермных животных при принудительной гипотермии показал принципиальное отличие направленности данных изменений у зимоспящих и незимоспяших млекопитающих и высокие адаптационные возможности мозга сусликов в плане приспособления к снижению температуры тела.

2. Свободные и связанные аминокислоты в отделах мозга крыс при гипотермии и последующем самосогревании

В условиях гипотермии содержание свободных аминокислот в головном мозгу крыс подвергается значительным изменениям (Рис. 1-3): при умеренной гипотермии в больших полушариях наблюдается преимущественное накопление глутамата на 118% (р<0,02); в то время как в среднем и промежуточном мозгу количество глутамата, аспартата и ГАМК снижается соответственно, на 56% (р<0,001), 48% (р<0,02) и 22% (р<0,05). Углубление гипотермии до состояния холодового "наркоза" (20-19°С) у крыс приводит к преимущественному накоплению ГАМК в исследованных отделах мозга при значительном снижении содержания свободного глутамата в больших полушариях мозга по отношению к контролю и к предшествующему этапу гипотермии (на 40% и на 81% р<0,01) и достоверном увеличении уровня аспартата в обоих отделах мозга по сравнению с предыдущим этапом гипотермии на 21% (р<0,05) и на 59% (р<0,05), соответственно. О накоплении ГАМК при этом режиме эксперимента во всех исследованных отдачах головного мозга свидетельствует и понижение соотношения (Глу+Асп)/ГАМК (Таблица 1). Накопление свободной формы ГАМК пропорционально степени охлаждения, обнаруженное в наших экспериментах с гомойотермными животными, согласуется с данными литературы о нарастании ГАМК при различных патологических состояниях (Менджерицкий и др., 1995; Самецкий, 1996). Однако, такое накопление тормозного нейромедиа-тора не всегда отражает увеличение функциональной емкости ГАМК нейронов, а может быть связано с ингибированием ее высвобождения в синаптическую щель или с прямым или опосредованным угнетением активности ферментов ее распада (Roberts, Hammerschlang, 1976).

А:

мкмоль/г свежей ткани

18 16 14 12 10 8 6 42 0 -О

температура тела

Б:

мкмоль/г свежей ткани

глутамат свободный, крысы

-е- глутамат связанный, крысы

глутамат свободный, суслики

-К- глутамат связанный, суслики

температура тела

Рис.1. Динамика содержания свободного и связанного глутамата в больших полушариях (А) и суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга (Б) крыс и сусликов при гипотермии и самосогревании через 3 (1, 3) часа и 7 суток (2, 4) после умеренной (1, 2) и глубокой (3, 4) гипотермии (40К - контрольные животные).

10 20 30

-*- глутамат свободный

крысы -»-глутамат связанный, крысы

глутамат свободный, суслики -У-глутамат связанный, суслики

«0 40 40 40 40

К 1 2 3 4

0 10 20 30 40 40 40 40 40 К 1 2 3 4

мкмоль/г свежей ткани

т

I

а -г

5 ■■ 432 1

О —

-4-аспартат сзободный

крысы -э- аспартат связанный крысы

аспартат сзободный суслики

аспартат сзязанный суслики

10 20 30 40 40 40 40 40

К 1 2 3 4

температура тела

мкмоль/г свежей ткани

5т

5

43

2 + 1 0

-♦-аспартат свободный крысы

—а-аспартат связанный крысы

-*- аспартат сзободный суслики

-Х- аспартат связанный суслики

10 20

30

40

К

40 1

40 2

40

3

40

4

температура тела

Рис.2. Динамика содержания свободного и связанного аспартата в больших полушариях (А) и суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга (Б) крыс и сусликов при гипотермии и самосогревании через 3 (1, 3) часа и 7 суток (2, 4) после умеренной (1, 2) и глубокой (3, 4) гипотермии (40К - контрольные животные).

мкмоль/г свежен ткани

9 8 7 6 5 4 3 2 1 + О

10 20

30

40 К

Б:

мкиоль/г свежей ткани

40 1

40

2

40

3

-♦-ТАМК свободный крысы

-е-ГАМ К связанный крысы

-А-ГАМК свободный суслики

-Х-ГАМК связанный суслики

40

4

температура тела

Ют 86 4 2 0

-♦-ГАМК свободный

крысы -в-ГАМК связанный крысы

ГАМ К свободный суслики -*-ГАМК связанный суслики

10 20 30 40 40 40 40 40

к 1 г ъ 4

температура тела

Рис.3. Динамика содержания свободного и связанного ГАМК в больших полушариях (А) и суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга (Б) крыс и сусликов при гипотермии и самосогревании через 3 (1, 3) часа и 7 суток (2, 4) после умеренной (1, 2) и глубокой (3, 4) гипотермии (40К - контрольные животные).

Таблица 1.

Соотношение суммы глутамата и аспартата к содержанию ГАМК в отделах головного мозга крыс при гипотермии и самосогревании.

Группа животных большие средний +

полушария промежуточный мозг

контроль 2,7 2,6

гипотермия до 30°С 2,8 1,6

до 20°С 0,8 03

самосогревание после

гипотермии 30°С через 3 ч 2,3 3,3

7 суток 4,0 2,3

самосогревание после

гипотермии 20°С через 3 ч 0,9 и

7 суток 2,9 2,3

О глубине нарушений метаболизма исследуемых аминокислот в мозгу крыс при гипотермии свидетельствует тот фаю-, что их содержание в отделах мозга при самосогревании после перенесенной гипотермии не восстанавливается ни через 3 часа, ни через 7 суток (Рис. 1-3). Нарушения в содержании данных аминокислот прежде всего могут затрагивать их энергетический и метаболический пупы, на что указывают данные визуального анализа ультраструктуры митохондрий. О влиянии гипотермии и на нейромедиаторный пул глутамата, аспартата и ГАМК свидетельствуют нарушения ультраструкгуры синапсов и данные о значительном сдвиге соотношения суммы возбуждающих нейромедиаторов (глутамата и аспартата) к содержанию тормозного медиатора ГАМК при гипотермии и дальнейшем самосогревании (Таблица 1). Вероятно, при гипотермии и дальнейшем самосогревании значительно изменяется эффективность синаптической передачи за счет структурных и метаболических сдвигов, происходящих как на пре-, так и на постсинаггга-ческом уровнях различных типов синапсов, что может вносить решающий вклад в развитие гипотермической патологии.

В связи с полученными данными большой интерес представляет исследование содержания ассоциированных с белками и нейрональ-ными структурами аминокислот при воздействии на крыс гипотермии (Рис.1-3). Обнаружено, что в начальном этапе гипотермии (30°С) резко увеличивается количество связанной ГАМК в больших полушариях

1Ь

мозга (в 2,2 раза) и в суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга (в 2 раза), в то время как содержание связанной аспарагино-вой кислоты увеличивается только в суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга (в 2,9 раза) по сравнению с таковым у интакт-ных животных. Дальнейшее снижение ректальной температуры у крыс до 20-19 °С сопровождается однонаправленными изменениями содержания связанного глутамата в исследованных отделах мозга: снижением на 50% (р<0,05) и 44% (р<0,05) в больших полушариях и суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга с одновременным увеличением содержания сзязанной ГАМК на 290% (р<0,001) в больших полушариях и неизменном ее уровне по отношению к контролю в суммарном среднем и промежуточном мозге. По сравнению с предыдущим этапом гипотермии уровни всех исследованных связанных аминокислот в суммарном среднем и промежуточном мозге снижаются, а в больших полушариях уменьшаются уровни только связанных аспар-тата и глутамата, в то время как содержание связанной формы ГАМК увеличивается на 75% (р<0,05, по отношению к предыдущему этапу гипотермии). Интересно, что содержание связанных форм исследуемых аминокислот во всех отделах мозга продолжает претерпевать изменения и при дальнейшем самосогревании и нормализации не наблюдается ни через 3 часа, ни через 7 суток после гипотермического воздействия (Рис. 1-3).

Анализ соотношения свободных и связанных глутамата, аспар-тата и ГАМК при гипотермии и в постгипотермическом периоде (Рис.4) позволяет сделать заключение о том, что процесс ассоциации белков-ферментов и мембранных структур мозга с низкомолекулярными компонентами подвержен температурной регуляции. Действительно, при низкой температуре синаптосомы мозга аккумулируют нейротрансмит-теры (Kontro, Oja, 1978; Baker et al., 1975), а в мозге увеличивается количество чувствительных к холоду синаптосом. Таким образом, наши данные об изменении содержания свободных и связанных форм аминокислот в мозгу крыс при гипотермии свидетельствует о том, что при данном воздействии нарушается не только метаболическая, но и нейро-трансмитгерная и модуляторная функция глутамата, аспартата и ГАМК в структурно-биохимической интеграции мозга.

3. Содержание свободных и связанных аминокислот в мозгу сусликов при принудительной гипотермии и зимней спячке

Для метаболизма мозга сусликов характерны большие сезонные колебания (Демин и др., 1988), поэтому для контрольных опытов брали бодрствующих зверьков одновременно с экспериментальными в один и тот же день. В больших полушариях мозга бодрствующих сусликов содержание исследованных нами свободных аминокислот соответствует уровню таковых у 1фыс. В то же время количество связанных аминокислот у крыс превышало уровень данных показателей у сусликов почти в 2 раза. В больших полушариях мозга сусликов преобладает свободная форма всех изученных аминокислот, судя по соотношению "свободные/связанные", а в суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга сусликов, ведущих активный образ жизни в июне, связанная форма ГАМК в 1,7 раза превышает количество свободной у-аминомасляной кислоты (Рис.5).

При принудительной гипотермии 20-19 °С, когда суслики находятся в довольно возбужденном состоянии, в больших полушариях мозга содержание свободных форм глугамата повышается на 10% (0,05<р<0,1), аспартата - на 29% (р<0,05), а ГАМК не изменяется. При этом в среднем + промежуточном мозге наблюдается уменьшение содержания свободных: глугамата на 10% (0,05<р<0,1), аспартата на 25% (р<0,02), ГАМК на 41% (р<0,05). Умеренная для сусликов гипотермия (20-19 °С) сопровождается довольно заметным увеличением содержания связанных глугамата, аспартата и ГАМК как в больших полушариях мозга, так и в среднем + промежуточном мозге (Рис. 1-3).

При дальнейшем снижении температуры тела сусликов до 10 °С, когда они впадают в состояние "холодового наркоза", содержание свободных глутамата, аспартата и ГАМК снижается в больших полушариях мозга, соответственно, на 17% (р<0,05), 37% (р<0,02) и 33% (р<0,05) по сравнению с предыдущим режимом гипотермии. В суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга содержание свободных глугамата и аспартата не изменяется по сравнению с предыдущим режимом гипотермии, в то время как свободная форма ГАМК накапливается по сравнению с гипотермией 20°С (на 28%,р<0,05), однако остается на 25% ниже уровня контроля (р<0,05).

Содержание связанного глутамата и аспаргата в больших полушариях мозга сусликов при глубокой гипотермии (10°С) увеличивалось на 29% (р<0,05) и на 26% (р<0,05), соответственно, а уровень ГАМК не изменялся по сравнению с предшествующим режимом гипотермии (20 °С). В суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга сусликов при глубокой гипотермии, содержание связанных аминокислот не изменялось по отношению к значениям, определенным при гипотермии 20°С.

Таким образом, гипотермия гомойотермов вызывает дискоорди-нашло обмена исследованных аминокислот в различных отделах мозга, что согласуется с данными о сдвигах активности ферментов их метаболизма (Эмирбеков, Львова, 1985; Авшалумов, Эмирбеков, 1994).

При сравнительном анализе данных о содержании глутамата, аспартата и ГАМК з отделах головного мозга гомойотермных и гетеро-термных животных при принудительной гипотермии видно (Рис. 1-3), что диапазон колебаний количества как свободных, так и связанных аминокислот по мере снижения температуры тела у крыс значительно шире, чем у сусликов. Поэтому большая устойчивость гегеротермов к принудительному охлаждению (даже при глубокой гипотермии) может быть обусловлена поддержанием более стабильных концентраций в мозгу таких лабильных компонентов как глутаминовая, аспарагиновая кислоты и ГАМК. Особенно важным представляется сохранение более постоянного уровня возбуждающих аминокислот, поскольку в развитии деструктивных изменений в центральной нервной системе большинство исследователей предполагают ведущую роль глутамат- и аспартат-ергических систем (Matson et al., 1989; Represa et al., 1995).

Еще одной интересной особенностью является более существенная (судя по содержанию исследованных свободных аминокислот) реакция на гипотермию подкорковых образований по сравнению с корой больших полушарий, вероятно за счет локализации в первых центров терморегуляции (Иванов, 1984). Так, у крыс при умеренной гипотермии более существенные сдвиги в уровне глутаминовой кислоты обнаружены в среднем + промежуточном мозге по сравнению с корой больших полушарий. Напротив, при глубокой гипотермии наибольшие отклонения в содержании возбуждающих аминокислот (особенно аспартата) наблюдались в коре головного мозга крыс, тогда как наибольшее накопление ГАМК отмечается в подкорковых образованиях.

Для сусликов отмечена более существенная реакция подкорковых образований при принудительной гипотермии - в отношении уровня ГАМК при умеренной гипотермии, а в отношении уровня возбуждающих аминокислот при глубокой гипотермии. Необходимо отметить, что у спящих сусликов в коре головного мозга содержание свободной глутаминовой кислоты не изменяется по сравнению с бодрствующими, в то время как содержание свободного аспартата уменьшается в 2 раза, а ГАМК, напротив, увеличивается в 2 раза у спящих сусликов по сравнению с бодрствующими. Поддержание более стабильного уровня свободного глутамата на фоне значительных колебаний в содержании другого возбуждающего нейромедиатора - аспарагиновой кислоты, является, вероятно, характерной чертой адаптационной стратегии гете-ротермов при переходе к зимней спячке (Таблица 2).

Таблица 2.

Содержание свободных и связанных дикарбоновых аминокислот и ГАМК в больших полушариях головного мозга (мкмоль/г свежей ткани) кавказских сусликов малых и соотношение "свободные/связанные" аминокислоты при зимней спячке (ноябрь) с температурой тела 79 °С (М±ш, п=5, *р<0,05).

Амин ОКИ слоты бодрствующие суслики спящие суслики

глутамат: свободный связанный связанный/свободный 10.04 + 0,16 4,01 ±0,07 2,5 10,05 + 0,13 4,16 ±0,06 2.4

аспартат: свободный связанный свободный/связанный 4,06 ± 0,08 2.34 ±0,09 1,7 2,34 ±0,12* 2,44 ±0,11 0,9

ГАМК свободный связанный свободный/связанный 2,49 ±0,09 3,07 ±0,12 0,8 4,00 + 0,07* 3,73 ± 0,09* 1,1

Другой возможной причиной большей устойчивости гетеротермов к охлаждению является то, что соотношение "свободные/связанные" у бодрствующих сусликов значительно ниже, чем у крыс (Рис 5), следовательно. у гетеротермов дикарбоновые аминокислоты и ГАМК в большей степени ассоциированы с белками и мембранными структурами нейронов. Кроме того, отличительной особенностью реакции сусликов на принудительную гипотермию является снижение соотношения свободные/связанные, что свидетельствует о сдвиге равновесия в мозгу гетеротермов при гипотермии в сторону большего связывания исследованных аминокислот (Рис.5). Это объяснение большей устойчивости гетеротермов к принудительному охлаждению подтверждается обнаруженными нами в данной работе наибольшими величинами связанных форм исследованных аминокислот в отделах головного мозга сусликов в состоянии зимней спячки по сравнению с теми же показателями у бодрствующих в июле и ноябре (Таблица 2).

Связывание аминокислот с макромолекулами может приводить к изменению транспорта веществ через мембраны нейронов, что и создает принципиальные отличия метаболизма и функционирования ЦНС при гипотермии и зимней спячке. Зависимость от температуры процесса ассоциации белков-ферментов и мембранных структур мозга с низкомолекулярными компонентами подтверждается изменением величины "свободные/связанные" аминокислоты при гипотермии и в постхипо-термическом периоде и данными литературы об аккумуляции синапто-сомами аминокислотных нейромедиаторов при снижении температуры мозга (Baker et al., 1985).

Таким образом, результаты показывают, что ассоциированные с белками и субклеточными структурами мозга глутамат, аспартат и ГАМК защищают мозг гипотермированного животного от повреждения. Установленный нами феномен изменения соотношения количества свободных и связанных форм аминокислот в различных отделах головного мозга при гипотермической патологии можно рассматривать как реакцию нейронов, направленную на обеспечение биологически оправданного перераспределения свободных и связанных аминокислот в патологически функционирующей системе.

Глу Асп ГАМК

Рис. 4. Соотношение свободные/связанные аминокислоты в больших полушариях (А) и суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга (Б) крыс: 1- контроль, гипотермия умеренная (2) и глубокая (3), самосогревание через 3 часа (4) и 7 суток (5) посте умеренной гипотермии, самосогревание через 3 часа (6) и 7 суток (7) после глубокой гипотермии.

Б:

31 □ 2

Г л у

А с п

Г А М К

11 □2

13

ГАМК

Рис. 5. Соотношение свободные/связанные аминокислоты в больших полушариях (А) и в суммарном гомогенате среднего и промежуточного мозга (Б) сусликов: 1- контроль, 2- гипотермия умеренная, 3-гипотермия глубокая

выводы

1. Ведущую роль в обеспечении адаптации ЦНС гетеротермов к низким температурам играет активация структур, обеспечивающих белковый синтез и энергообразование, а также активация тормозной синапти-ческой сети и появление активных аксо-аксонных синапсов, что является особенностью ультраструктуры сенсомоторной коры головного мозга сусликов в условиях нормотермии.

2. У гомо- и гетеротермов при нормотермии уровень свободных глута-мата, аспартата и ГАМК идентичен, в то время как связанная форма данных аминокислот является преобладающей в мозгу сусликов.

3. Большая устойчивость гетеротермов к принудительной гипотермии обусловлена поддержанием более стабильных концентраций глута-миновой, аспарагиновой кислот и ГАМК и большей ассоциацией последних с бедками и мембранными структурами нейронов.

4. Содержание исследуемых аминокислот в больших полушариях и в суммарном среднем и промежуточном мозгу крыс при самосогревании после перенесенной гипотермии как до 30 °С, так и до 20-19 °С не восстанавливается через 3 часа и через 7 суток.

5. У сусликов перед залеганием в зимнюю спячку в состоянии бодрствования, когда температура тела составляет 37-38 °С ( как у гомойотер-мов) значительно увеличивается содержание в мозгу всех исследуемых аминокислот. При этом, судя по соотношению "свободные/связанные" наблюдается преобладание свободных форм глутамата и аспартата и связанной формы ГАМК.

6. Во время зимней спячки сусликов содержание в мозгу свободных и связанных форм изучаемых аминокислот выравниваются за исключением глутаминовой кислоты, количество которой остается без изменения.

7. Соотношение свободных и связанных аминокислот является одним из факторов адаптивно-приспособительных реакций мозга к низким температурам, наиболее очевидно проявляющееся в мозгу гетеротермов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пашаева Д.Э. Эффект мочевины на азотистый обмен мозга при гипотермии // Сб.: "Биохимические механизмы зимней спячки и естественного сна". Тез. докладов Всесоюзного симпозиума, Махачкала, 1985. - С, 101.

2. Emirbekov E.Z., Shejkhova R.G., Pashajeva D.E., Emirbekova A.A. Correlation between brain free and bound aminoacids at hvpotermia// 11 Meeting Europ. Soci. Neurochem. Abstract, Netherland, Groningen, J. Neurochem. -1996. - Vol. 66, suppl. 2. - P. S6.

3. Emirbekov E.Z., Shejkhova R.G., Pashajeva D.E., Emirbekova A.A.The effect of ethanol on contents of free and bound decarboxylic amino acids in brain at hypothermia// Intern. Conf. "Neurochem. And Pharmacol of drug adiction and alcoholism". Abstr. St-Petersburg, 1996. - P. 87

4. Мационис A3., Павлов И.Ю., Пашаева Д.Э., Менджеришсий A.M., Повилайтите П.Е. Рекомбинации ультраструктуры неокортекса зим о спящих в процессе адаптации к гипотермии// Бюлл. эксп. биол. и мед. - 1996. - N 11. - С. 585-589.

5. Пашаева Д.Э., Шейхова Р.Г., Эмирбекова А.А., Эмирбеков Э.З. Свободные и связанные аминокислоты мозга при гипотермии и последующем самосогревании животных// Проблемы Криобиологии, 1996. - № .-С.

6. Шейхова Р.Г., Пашаева Д.Э., Эмирбекова А.А., Эмирбеков Э.З. N-ацетилированные дикарбоновые аминокислоты в мозгу при гипотермии II Проблемы Криобиологии. - 1996. - № . - С.

7. Эмирбеков Э.З., Львова С.П., Кпичханов Н.К., Нурмагомедова П.М., Пашаева Д.Э. Нейрохимические изменения при зимней спячке// Тезисы докл. конф. по функциональной нейрохимии, поев. 85-летпо со дня рождения и светлой памяти Н.Н. Демина. - Нейрохимия (в печати).