Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хроматографическая очистка микробных пектиназ и целлюлаз и использование их при изолировании протопластов высших растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хасирджева, Альбина Константиновна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . . II

ГЛАВА I. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

1.1. Структурные вещества клеточных стенок высших растений и характеристика ферментов, расщепляющих эти вещества . . II

1.2. Изолирование жизнеспособных протопластов растений под действием ферментных препаратов

ГЛАВА 2. ПЕКТОЛИТИЧЕСЖЕ И ЦЕЛЛШОЛИТИЧЕСКИЕ КОМПЛЕКСЫ И МЕТОДЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ

2.1. Неполитические и целлюлолитические системы у микроскопических грибов

2.2. Гель-хроматография как эффективный метод очистки белков и ферментов . . 35 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Ферментные препараты как источник получения высокоактивных комплексов пекти-назного и целлкшазного действия

3.2. Методы определения активности ферментов

3.2.1. Определение активности ферментов пектолитического комплекса

3.2.2. Определение активности целлкшаз

3.2.3. Оцределение активности ферментов, цри-сутствущих в пектиназном и целлкшазном комплексах (ксиланаза, лихениназа, ламинариназа, инвертаза, N -ацетил-^Ь- о-глю-козаминидаза, цротеаза, амилаза) . 48 3.3. Определение содержания белка, нейтральных Сахаров и цветности в ферментных препара

3.4. Методы выделения и очистки пектиназных и целлкшазных препаратов.

3.5. Методы биохимической характеристики очищенных ферментных препаратов.

3.6. Выделение растительных протопластов

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРИЕМОВ МЬ-ХРОМАТОГРАФИИ НА АКРИЛЕКСЕ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ И ДЕЛЛЮ-ЛОЛИТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

4.1. Вдияние концентрации белков и солей на структуру зерен полиакриламидного геля в статических условиях.

4.2. Влияние вязких концентрщюванных растворов на структуру геля при хроматографии на колонках.

4.3. Изучение режима г ель-хромат ографии концентрированных ферментных растворов .для масштабирования процесса очистки

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОГО ПРЕПАРАТА ПЕКГИНАЗЫ ("ПЕКТИНАЗА-500") НА ОСНОВЕ ГЕЛЬ-ХРОМТОГРАФИИ

5.1. Испытание разных приемов очистки пектоли-тического комплекса из препаратов пекто-фоетидина ПЮх и пектофоетидина ГЗх

5.2. Получение высокоактивного пектолитического препарата по разным схемам и их сравнительная оценка

5.3. Характеристика компонентного состава препарата пектиназа-500 (в сравнении с пектиназой мацерозим 5-Ю)

5.4. Разделение ферментного комплекса пекти-назы-500 гель-хроматографией на ультрагеле АсА-44.

5.5. Разделение пектиназы-500 методом изоэлек-трического фокусирования и определение изоэлектрических точек отдельных компонентов

5.6. рН-зависимость эндополигалактуроназы как основного компонента пектиназного комплекса, ответственного за процесс мацерации растительной ткани

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОГО ЦЕЛЛКЖОЛИТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ("ЦЕЛЛЮЛАЗА-1000") С ПРИМЕНЕНИЕМ ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФШ 6.1. Испытание целлюлолитических препаратов целлоконингин ПЮх, целлолигнорин ШОх, целловиридин ГЗх, целлокандин ГЗх при очистке их концентрированных растворов гель-хроматографией

6.2. Получение высокоактивного целлкшолити-ческого препарата из целлокандина ГЗх по разным схемам и их сравнительная оценка

6.3. Характеристика компонентного состава препарата целлюлаза-1000 (в сравнении с целлкшазой Онозука В-10). III

6.4. Изучение влияния рН на целлкшазную активность препаратов целлюлаза-1000 и Онозука К-10 .ИЗ

6.5. Стабильность высокоактивных целлкшолити-ческих црепаратов, полученных из целло-кандина ГЗх, цри хранении

ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ И ПОДБОР УСЛОВИЙ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ С ПОМОЩЬЮ ПЕКТИНАЗЫ-500 И ЦЕЛЛКЖАЗЫ-1ООО

7.1. Замена японского препарата мацерозим Е-10 на препарат пектиназа-500 в методике выделения цротопластов.

7.2. Замена японского препарата целлюлазы Онозука Е-10 на препарат целлкшаза-1000 цри выделении протопластов

7.3. Получение жизнеспособных растительных протопластов с помощью двух препаратов -пектиназы-500 и целлкшазы-ЮОО

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хроматографическая очистка микробных пектиназ и целлюлаз и использование их при изолировании протопластов высших растений"

Развитие научно-исследовательских работ в области физико-химической биологии и биотехнологии и использование их достижений в медицине, сельском хозяйстве и промышленности определены Директивами ХХУ1 съезда КПСС.

Важнейшим звеном биотехнологии наших дней является клеточная технология, предусматривающая широкое применение в практике культур растительных и животных клеток. Возможности клеточной инженерии существенно увеличиваются при использовании протопластов, получаемых в результате удаления клеточной оболочки.

Протопласты являются удобной моделью при изучении генетических и физиологических свойств растений. Результаты этих исследований оказывают прямое влияние на получение для селького хозяйства новых гибридов с высокой урожайностью и максимальной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды.

Благодаря интенсивному развитию энзимологии стало возможным выделение больших количеств протопластов с использованием мягких ферментативных методов. Для этих целей применяют ферментные препараты, содержащие комплекс таких ферментов, как пектиназы, цел-лгалазы, гемицеллюлазы и ряд других.

В настоящее время микробиологическая промышленность нашей страны производит для различных отраслей народного хозяйства целый ряд технических и очищенных ферментных препаратов, в том числе препаратов пектиназного и целлкшазного действия, из которых могут быть выделены высокоактивные ферментные комплексы, пригодные для гидролиза межклеточного вещества и клеточных оболочек растений. Ряд зарубежных фирм выпускает такие препараты в качестве биохимреактивов с целью выделения растительных протопластов.

Принимая во внимание растущие масштабы клеточной инженерии, следует ожидать повышенного спроса в таких реактивах в ближайшем будущем.

Целью данной работы являлось создание новых отечественных препаратов "пектиназа-500" и "целлшаза-ЮОО", предназначенных для использования в качестве биохимреактивов для проведения исследований в области биохимии, физиологии и генетической инженерии растений.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

- исследовать особенности гелевой хроматографии концентрированных ферментных растворов в интенсивном режиме и разработать способ хроматографической очистки пектиназных и целлншазных комплексов, обеспечивающий нецрерывное использование гелевой колонки в течение многих хроматографических циклов;

- разработать схему очистки неполитических и целлюлолити-ческих ферментных препаратов с сохранением их многокомпонентного состава на основе гель-хроматографии;

- охарактеризовать ферментные комплексы полученных препаратов по компонентному составу, биохимическим свойствам и сравнить их с зарубежными аналогами;

- исследовать действие пектиназы-500 и целлншазы-1000 на растительную ткань и установить оптимальные условия образования изолированных клеток и протопластов на модели-листовой ткани табака;

- разработать метод ферментативного выделения жизнеспособных цротопластов высших растений с использованием отечественных биохимреактивов для применения в клеточной технологии.

Изучение литературы по данному воцросу показало, что для получения высокоактивных, многокомпонентных пектиназно-целлюлазных систем необходима групповая очистка, которая может быть осуществлена гель-хроматографией.

Научная новизна исследования состоит в разработке приёмов гель-хроматографии на плотно сшитом геле для концентрированных ферментных растворов. Изучение влияния интенсивных факторов (концентрации растворов, скорости элюирования, размеров колонок) на сжимаемость геля типа акрилекс и условий его регенерации позволило достигнуть многократного использования гелевой колонки объёмом 30 л и хорошей воспроизводимости хроматографического процесса. На способ хроматографической очистки получено авторское свидетельство № 679588.

На основе гель-хроматографии разработаны схемы групповой очистки пектиназных и целлкшазных комплексов и получены новые высокоактивные ферментные препараты-биохимреактивы пектиназа-500 и целлюлаза-1000. На способ получения пектолитического препарата получено авторское свидетельство № 891775.

Впервые охарактеризован состав пектиназы-500 и целлюлазы-1000 по компонентам, их из о электрическим точкам и молекулярным массам.

Изучены сочетания ферментных отечественных и зарубежных препаратов (пектиназы-500, целлюлазы-1000, мадерозима 5-10 и целлшазы Онозука Н-10) при действии на листовую ткань табака как модельный растительный объект. Показано, что полученные нами препараты пектиназа-500 и целлшаза-1000 обеспечивают хорошее изолирование жизнеспособных цротопластов, а также выделение отдельных клеток растительных тканей.

Практическая ценность работы заключается в разработке и внедрении способа гелевой хроматографии высококонцентрированных ферментных растворов в интенсивном режиме, пригодного для очистки любых ферментов и других высокомолекулярных соединений от солей и низкомолекулярных примесей.

- 10

Разработанный способ хроматографической очистки положен в основу схемы получения высокоактивных препаратов пектиназы и целлюлазы, внедрённой на Московском опытном заводе ферментных препаратов.

Созданы два новых отечественных биохимреактива - пектиназа-500 и целлкшаза-ЮОО, и разработана эффективная методика изолирования жизнеспособных протопластов высших растений с использованием этих црепаратов. Показано, что препараты пектиназа-500 и целлюлаза-1000 могут быть с успехом использованы вместо зарубежных аналогов при выделении клеток и протопластов высших растений.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хасирджева, Альбина Константиновна

выводы

1. Впервые получены отечественные высокоактивные комплексные препараты - пектиназа-500 с активностью по эндополигалакту-роназе не менее 500 ед./г и целлшаза-1000 с активностью по Ман-дельс-Веберу не менее 1000 ед./г» предназначенные для ферментативного выделения протопластов в клеточной технологии растений.

2. Разработана интенсивная гель-хроматография высококонцентрированных ферментных растворов в условиях частичного сжатия геля. Изучено влияние концентрации ферментов, скорости элюирова-ния и масштабирования на стабилизацию режима хроматографии. Показана хорошая воспроизводимость хроматографического процесса, длительность использования геля в интенсивном режиме (более 20 циклов) и возможность ведения гель-хроматографии на укрупнённых колонках объёмом 30 л.

3. На основе гель-хроматографии разработаны схемы групповой очистки промышленных и опытных препаратов пектолитического и целлюлолитического действия.

4. Установлено, что ферментный комплекс пектиназы-500 содержит широкий набор карбогидраз. С помощью хроматографии на ультрагеле АсА-44 цроведено разделение комплекса на отдельные компоненты, определены их молекулярные массы и изоэлектрические точки. Для пектолитических ферментов молекулярные массы составляют 34000-52500. Изоэлектрические точки для всех обнаруженных в препарате ферментов имеют близкие значения ж находятся в интервале рН от 3,3 до 4,8.

5. В црепарате пектиназа-500 обнаружено высокое содержание уЗ -глюкозидазы (целлобиазы) с молекулярной массой более 130000 и изоэлектрической точкой 3,6-4,0. Пектиназа-500 может быть ре

- 135 комендована для обогащения целлшазных систем с целью глубокого гидролиза целлюлозосодержащих материалов.

6. На основе сравнения компонентного состава препарата пек-тиназа-500 с препаратом мацерозим К-Ю и целлшазы-1000 с целлю-лазой Онозука К-Ю показана возможность замены зарубежных реактивов в процессе выделения растительных клеток и протопластов.

7. Разработан метод ферментативного выделения жизнеспособных цротопластов высших растений с использованием препаратов пектиназа-500 и целлюлаза-1000. Впервые установлено влияние значений рН буферных систем на процесс изолирования отдельных клеток растительной ткани.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хасирджева, Альбина Константиновна, Москва

1. А.с.362871 (СССР). Штамм Aspergillus niger 15 продуцент кеиланазы / Р.В.Фениксова, Н.А.Родионова, И.В.Итомленеките, И.В.Улезло, Н.Я.Кобзева. - Опубл. в Б.И., 1973, № 3.

2. А.с.378303 (СССР). Способ получения целлюлазы / Р.В.Феник-сова, Н.А.Тиунова, Н.А.Родионова, Т.И.Кудряшова, Н.И.Сидора, Л.И.Мартинович. Опубл. в Б.И., 1973, № 9.

3. А.с.482494 (СССР). Способ получения целлюлазы / Л.С.Лося-кова, Р.В.Фениксова, О.П.Кожемякина, Т.И.Кудряшова, З.Н.Мишина, Н.А.Тиунова, Н.А.Родионова, И.С.Коршунов. Опубл. в Б.И., 1975, № 32.

4. А.с.495347 (СССР). Способ выделения ферментов из растворов / К.А.Калунянц, М.С.Ваганова, Г.В.Щусь, Т.В.Чутунова, Л.И. Стрельникова. Опубл. в Б.И., 1975, № 46.

5. А.с.577230 (СССР). Штамм Trichoderma longibrachiatum 7-26 продуцент целлюлолитических ферментов / И.М.Грачева, В.П. Саловарова, К.А.Калунянц, М.С.Ваганова, Г.В.Шусь. - Опубл. в Б.И., 1977, № 39.

6. А.с.679588 (СССР). Способ хроматографической очистки ферментов и других высокомолекулярных веществ / В.И.Максимов, А.К.Ха-сирджева, Г.А.Молодова. Опубл. вБ.И., 1979, №30.

7. А.с.696024 (СССР). Способ очистки -амилазы / О.В.Вар-навская, А.А.Селезнева, Г.В.Самсонов и др. Опубл. в Б.И., 1979, № 41.

8. А.с.720010 (СССР). Способ получения целлюлазы / А.Г.Лоба-нок, Р.П.Зелтань, И.М.Эдинып, Р.Ф.Карклинь, М.Е.Бекер, В.Х.Кир-сис. Опубл. в Б.И., 1980, Р 9.

9. А.с. 975 796 (СССР). Способ выделения целлюлазы / М.Л.Рабинович, А.А.Клесов, И.В.Березин, И.В.Мягких, В.А.Мартьянов. Опубл. в Б.И., 1982, Г- кЪ.- 137

10. Багратишвили Д.Г., Запрометов М.Н., Бутенко Р.Г. Получение суспензионной! культуры клеток чайного растения. Физиол. раст., 1979, т.26, вып.2, с.449-451.

11. Билай Т.И., Мусич Е.Т. Состав целлюлолитического комплекса термофильных грибов. Микробиол. жизнь, 1981, т.43, Р 5, с.615-618.

12. Бравова Г.Б., Самойлова М.В. Мацерирующие ферменты. Получение и применение в народном хозяйстве (обзорная информация).- ОНТИТЭИмикробиопром, M., 1981, 44 с.

13. Бутенко Р.Г. Изолированные протопласты растений объект и модель для физиологических исследований. - В кн.: Культура клеток растений. М.: Наука, 1981, с.69-84.

14. Бутенко Р.Г., Кучко A.A. Физиологические аспекты получения, культивирования и гибридизации изолированных протопластов картофеля. $изиол. раст., 1979, т.26, Р 5, C.III0-III9.

15. Бутенко Р.Г., Кучко A.A., Витенко В.А., Аветисов В.А. Получение и культивирование изолированных протопластов мезофилла листа Solanum tuberosum и Solanum chacoense физиол. раст., 1977, т.24, вып.З, с.660-665.

16. By Дык Куанг, Шамина З.Б. Действие мацерирующ'их ферментов на культуру клеток кукурузы. Физиол.раст., 1983, т.ЗО, вып.З, с.616-622.

17. Гайворонская Л.М., Хасирджева А.К., Бутенко Р.Г., Максимов В.И., Молодова Г.А. Получение протопластов и клеток из ткани листьев табака с применением препарата пектиназа-500. Шизиол. раст., 1982, т.29, вып.4, с.794-798.

18. Герасимов С.Б. Новый способ получения протопластов растений. Докл. ВАСХНИЛ, 1976, Р 3, с.22-23.

19. Глеба Ю.Ю., Сытник K.M. Слияние протопластов и генетическое конструирование высших растений. Киев: Наукова думка, 1982, 104 с.- 138

20. Глеба 10. Ю., Швыдкая Л.Г., Бутенко Р.Г., Сытник K.M. Культура изолированных протопластов. Физиол. раст., 1974, т.21, вып.З, с.598-605.

21. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Пищевая промышленность, 1975, 392 с.

22. Грачева И.М., Саловарова В.П., Дуда В.И., Ваганова М.С. Биосинтез целлюлолитических ферментов культурой гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26. В кн.: Целлюлазы микроорганизмов, М.,1981, с.130-141.

23. Гусаков A.B. Сравнение эффективности различных целлюлаз-ных препаратов при ферментативном гидролизе хлопкового линта в реакторе колоночного типа. В кн.: Биоконверсия: тезисы докл.,1982, т.1, с.57-58.

24. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970, 252 с.

25. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1966, 816 с.

26. Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Фракционирование клеточной суспензии диоскореи. Физиол. раст., 1978, вып.25, Р 6.

27. Дорохов Ю.Л., Александрова Н.М. Выделение протопластов мезофилла табака при низкой температуре и анализ полирибосом при их регенерации. Физиол.раст., 1981, т.28, № 6.

28. Евтихов П.Н., Курзина Л.В., Медведева Г.К., Пушкина А.П. Сравнение субстратов при определении fb-глюканазной активности.-- Ферм, и спирт, пром-сть, 1984, № 5, с.41-43.

29. Заяц Н.Л., Щербаков М.А. Поиски активных культур микроорганизмов продуцентов целлюлаз и ксиланаз. - Микробиол. журн., 1977, № 4, с.501-502.

30. Игнатова Л.И. Получение протопластов из Cg и С^ растений и их фотосинтетическая активность. Физиол. раст., 1980, т.27, вып.1, с.80-85.- 139

31. Инструкция по технохимическому и микробиологическому контролю производства ферментных препаратов при поверхностном культивировании плесневых грибов. М., 1972, 217 с.

32. Калунянц К.А., Ваганова М.С.у Щусь Г.В., Чугунова Т.В., Грачев Ю.П. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза целлюлазы грибом Trichoderma viride.- Прикл. биохим. и микробиол., 1976, т.12, № 2, с.269-272.

33. Калунянц К.А., Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты (Технология и оборудование). М.: Пищевая пром-сть, 1979,304 с.

34. Калунянц К.А., Ездаков Н.В., Пивняк Й.Г. Применение ферментных препаратов в животноводстве. В кн.: Применение продуктов микробиологического синтеза в животноводстве. М.: Колос, IS80, с.213-226.

35. Калунянц К.А., Лосякова Л.С., Гребешова Р.Н. Производство пектолитических ферментных препаратов и их применение. М.: Пищевая пром-сть, 1975,**41 с.

36. Калунянц К.А., Фениксова Р.В., Ваганова М.С., Щусь Г.В., Саловарова В.П. Влияние различных источников азота на биосинтез целлюлаз при глубинном культивировании гриба Trichoderma viride.-Прикл. биохим. и микробиол., 1976, т.12, №3, с.345-347.

37. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеоли-тической активности для комплексных препаратов протеаз. Прикл. биохим. и микробиол., 1971, № I, с.74.

38. Калинин Ш.Л., Сарнацкая В.В., Полшцук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка, 1980,-488 с.

39. Капитонова Л.С. Пектолитические ферменты Clostridium Pelsineum шт.5, мацерирующие стебли льна. Автореф.дисс. канд.биол.наук. М., 1973,-21 с:*- 140

40. Клесов A.A., Березин И.В. Ферментативное получение глюкозы из целлюлозы: кинетика и механизм действия целлюлазного комплекса. В кн.: Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981, с. 7382.

41. Клесов A.A., Рабинович M.JI. Ферментативный гидролиз целлюлозы. В кн.: Инженерная энзимология и биоорганический катализ, М., 1978, с.49-91 (Итоги науки и техники, сер. Биол. химия, т.12).

42. Клесов A.A., Рабинович M.JI., Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. I. Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных субстратов. Биоорганич. химия, 1980, т.6, № 8, с.1225-1242.

43. Клесов A.A., Чурилова И.В. Гидролиз микрокристаллической целлюлозы под действием полиферментных целлюлазных комплексов различного происхождения. Биохимия, 1980, т.45, с.1685-1694.

44. Кретович В.Л. Техническая биохимия. М.: Высшая школа, 1973, 456 с.

45. Кретович В.Л. Биохимия растений. М.: Высшая школа, 1980, 445 с.

46. Крюкова Л.М., Медведкова В.В., Маевская З.В., Родионова H.A., Тиунова H.A. Выделение протопластов из листьев Vicia faba с помощью ферментного препарата "целлокандина". Прикл. биохим.и микробиол., 1977, т.13, вып.5, с.766-768.

47. Лабораторное руководство по хроматографии и смежным методам. / Микеш 0., Новак Й., Прохазка 3. и др. М.: Мир, 1982, ч.1, 400 с.

48. Лобанок А.Г., Романов С.Л. Образование целлюлаз Tricho-derma lignorum QM 534 на средах с целлюлозой и лактозой и характеристика ферментных комплексов. В кн.: Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981, с.109-114.- 141

49. Логинова Л.Г., Ташпулатов Ж. Целлюлолитическая активность термотолерантного гриба Aspergillus terreus 17р при поверхностном культивировании. Прикл. биохим. и микробиол., 1978, т.14,1. Р 3, с.361-365.

50. Лосякова Л.С., Кожемякина О.П., Шилова А.А. Исследование биосинтеза целлюлазы при культивировании микроскопических грибов на твердофазных средах. Б кн.: Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981, с.125-130.

51. Лосякова Л.С., Мушникова Л.Н., Мишина В.Н. Получение очищенного комплексного ферментного препарата из культуры гриба Aspergillus awamori для соковой и винодельческой промышленности.-Микробиол. пром-сть, 1971, Р I, с.28-32.

52. Максимов Б.И. Целлодекстрины, их получение и характеристика как субстратов целлюлазы. Прикл. биохим. и микробиол., 1982, вып.5, т.18, с.659-663.

53. Максимов В.И., Хасирджева А.К., Молодова Г.А. Гель-фильтрация на укрупненных колонках при получении целлюлазно-пектиназ-ных комплексов. Ферм, и спирт, пром-сть, 1980, Р 2, с.16-17.

54. Мартьянов В.А. Разработка технологии выделения и характеристика целлюлазного комплекса из Trichoderma longibrachiatum. -Дисс. . канд.техн.наук. М., 1982, 19 с.

55. Мартьянов В.А., Рабинович М.Л., Гернет М.В. Особенности получения высокоактивных препаратов целлюлаз для биоконверсии целлюлозы. В кн.: Биоконверсия: Тезисы докл., 1982, т.1, с.85-86.

56. Мезенцев А.В., Бутенко Р.Г., Родионова Н.А. Получение изолированных протопластов из мезофилла многолетних трав и ячменя. Физиол. раст., 1976, т.23, Р 3, с.508-512.

57. Мгалоблишвили М.П., Литвинов А.И., Каландадзе А.Н., Са-надзе Г.А. Действие циклoreксимидина, хлорамфеникола и диурона на фотосинтез и изопреновый эффект протопластов мезофилла листьев тополя. Физиол. раст., 1982, т.29, Р 2, с.372-377.- 142

58. Микеш 0., Новак Й., Прохазка 3. и др. Лабораторное руководство по хроматографии и смежным методам. М. : Мир, 1982, чЛ, 400 с.

59. Мосичев М.С., Складнев A.A., Котов В.В. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982, 264 с.

60. Номенклатура ферментов (Рекомендации международного биохимического союза). М.: ВИНИТИ, 1979, 318 с.

61. Окунев О.Н., Билай Т.И., Мусич Е.Г. Образование целлюлаз плесневыми грибами при росте на целлюлозосодержащих субстратах. -- Прикл. биохим. и микробиол., 1981, т.17, № 3, с.408-414.

62. Острикова H.A., Коновалов С.А. Целлюлолитические ферменты: реальные возможности и перспективы их применения (обзорная информация). М.: ОНТИТЭИмикробиопром, 1983, 40 с.

63. Писецкая Н.Ф., Мусорок Т.И., Рейфман В.Г., Журавлев Ю.Н. Две модификации метода Такебе, обеспечивающие быстрое выделение протопластов из листьев табака. Физиол. раст., 1975, т.22, вып.2, с.430-435.

64. Родионова H.A. Ферментативное расщепление целлюлозы. В кн.: Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981, с.4-40.

65. Родионова H.A., ¡Румянцева Г.Н., Мартинович Л.И., Бахтад-зе Л.Н. -глюкозидазы из гриба Geotrichum candidum. Биохимия, 1977, т.42, с.43-50.

66. Родионова H.A., ТиуноваН.А., Фениксова Р.В., Кудряшо-ва Т.И., Мартинович Л.И. Целлюлолитические ферменты Geotrichum candidum. Докл. Акад. наук СССР, 1974, т.214, № 5, с.1206-1209.- 143

67. Родзевич В.И., Яровенко В.Л., Устинников Б.А., Мазур Н.С., Тютюник И.М. Значение и роль целлюлаз в производстве спирта из крахмального сырья. В кн.: Целлюлазы микроорганизмов, М.: Наука, 1981, с.204-206.

68. Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981, 288 с.

69. Селезнева A.A., Самсонов Г.В. Проницаемость карбоксильных катионитов для белков и ферментов (Обзор). Хим.-фармац. журн., 1981, т.15, № 7, с.77-85.

70. Ташпулатов Ж., Джалалова X., Авбуллаев Т., Мирзарихимо-ва М. Целлюлаза Trichoderma lignorum 19. В кн.: Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981, с.114-125.

71. Тиунова H.A. Применение целлюлаз. В кн.: Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, IS8I, с.40-73.

72. Тиунова H.A., Родионова H.A., Мартинович Л.И. Образование целлюлолитических ферментов грибом Geotrichum candidum и их получение в производственных условиях. В кн.: Биотехнология и биоконверсия, т.1. Рига: Зинатне, 1978, с.152.

73. Тиунова H.A., Родионова H.A., Мартинович Л.И. Ферментная система Geotrichum candidum, гидролизующая целлюлозу. Прикл. биохим. и микробиол., 1980, т.16, вып.1, с.40-44.

74. Тиунова H.A., Родионова H.A., Мартинович Л.И., Гоголев М.Н. Получение целлюлолитических ферментов из Geotrichum candidum. -Прикл. биохим. и микробиол., 1980, т.16, с.185-190.

75. Томпсон А., Вольфром М.Л. Методы химии углеводов. М.з-Мир, 1967, 512 с.

76. Уонг Д., Кооней Ч., Демайн и др. Ферментация и технология ферментов. М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1983, 336 с.- 144

77. Фонин B.C., Шаин С.С., Копылова Н.Е., Гумянцева Г.Н. Гидролиз сердечных гликозидов с помощью целлюлазных препаратов микробного происхождения. В кн.: Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981, с.197-203.

78. Хромова Л.М., Седнина Г.В., Бургутин А.Б., Бутенко Р.Г. К методике выделения и культивирования протопластов картофеля. -Физиол. и биохимия культурных раст., 1983, т.15, № I, с.81-87.

79. Хасирджева А.К., Максимов В.И., Молодова Г.А. Ферментные препараты,для выделения растительных протопластов: получение и применение. Обзорная информация. М.: ОНТИТЭИмикробиопром, 1984, 48 с.

80. Чурилова И.В., Максимов В.И., Клесов A.A. Очистка и свойства низкомолекулярной эндоглюканазы целлюлазного комплекса из Trichoderma koningii Биохимия, 1980, т.45, с.669-678.

81. Шакуров М.П. Особенности культивирования изолированных протопластов разных видов рода TTicotiana Физиол. раст., 1982, т.29, W I, с.150-160.

82. Щербухина Н.К. Состав и архитектура углеводно-белкового каркаса первичной стенки растительной клетки. В кн.: Рост растений. Первичные механизмы, 1978, М.: Наука, с.16-37.

83. Щербухин В.Д., Миронова Л.И., Козырева Л.В., Грюнер B.C. Определение глюкозы глюкозооксидаяным методом с использованием ферроцианида калия. Прикл. биохим. и микробиол., 1970, т.II, вып.4, с.467-469.

84. Юдин Е.В., Туркина Т.И., Родзевич В.И. Многокомпонентное^ пектолитических ферментов в препаратах. Прикл. биохим. и микробиол., 1977, т.13, вып.5, с.666-672.

85. Alb er she im P., Bauer W«;D., Keestra K., Talmadge K.W. -In: Biogenesis of plant cell wall polysaccharides (Loewns F. ed.), 1973, p.117-147. Academic press, New York.

86. Albersheim P. The primary cell wall. In: Plant Biochemistry. Hew York-San Francisco-London: Academic Press, 1976» p.225-274.

87. Allen A.L., Andreotti R.L. Continuos culture of Aspergillus phoenicis QM 329 for the production of cellobiase. Bio-technol. andBioeng., v.24, 1982, p.2747-2751.

88. Arinze A.E., Smith G.M. The production of a polygalactu-» ronase complex by Botryodiplodia theobromae and its involvement in the rot of sweet potato. Physiol. Plant. Pathol., 1979, v.14, p.141-152.

89. Arcioni S., Davey M.R., Santos A.V.P.dos, Cocking E.C. Somatic ambryogenesis in tissues from mesophyll and cell suspension protoplasts of Medicago coerulea and M.glutinosa. Z. Pflan-zenphysiol., 1982, v.106, No 2, p.105-110.

90. Bateman D.F., Basham M. G. Degradation of plant cell walls and membranes by microbial enzymes. In: Encyclopedia of plant physiology, Vi 4. Physiological plant pathology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1976, p.316-355.

91. Bateman D.F., Millar P.L. Pectic enzymes in tissue degradation. In: Rev. Phytopathol., 1966, v.4, p.119-146.

92. Bharal S., Rashid A. HypocOtyl, stem, callus and leaves of the legume vigna sinensis as systems for isolation of protoplasts. Z. Pflanzenphysiol., 1979, v.91, No 5, p.465-468.

93. Bidney D.L., Shepard J.P. Öolony development from sweetpotato petiole protoplasts and mesophyll cells. Plant Sei.Lett., 1980, v.18, No 4, p.335-342.

94. Bracha M., Sher N. Fussion of enucleated protoplasts with nucleated miniprotoplasts in onion (Allium cepa L.). Plant Sei. Lett., 1981, v.23, No 1, p.95-101.- 146

95. Butenko R.G. Cultivation of isolated protoplasts and hybridization of somatic plant cells. Internat. Rev. Cytol, 1979, v.59, p.323.

96. Cassells A.C., Cocker P.M., Austin S. Ethylene release during tobacco protoplast isolation and subsequent protoplast survial. Plant Sci. Lett., 1980, v.19, Ho 2, p.169-173.

97. Cervone P., Scala A., Poresti M. Endopolygalacturonase from Rhizoctonia fragariae; purification and characterization of two isoenzymes. Biochim. et Biophys. acta, 1977 b, v.482, p.379-385.

98. Chin I.C., Scott K.J.A. Large-scale isolation procedure for cereal mesophyll protoplasts. Ann. Bot., 1979, v.43, No 1, p.23-32.

99. Cocking E.C. Plant cell protoplasts isolation and development. - Ann. Rev. plant PhysioL, 1972, No 23, p.23-50.

100. Curling B.I.,Process gel filtration. Part I: Prom laboratory to process scale. American Laboratory, 1976.

101. Dodds I.M. Isolation of protoplasts from the CAM plant umbilicus pendulinus DC. Z. Pflanzenphysiol., 1980, v.96, No 2, p.177-179.

102. Dunnill P., Lilly M.D. Continuous enzyme isolation. -- Biotechnol. Bioeng. Symp., 1972, No 3, p.104.

103. Eliakova L.A., Zwyagintseva T.N. A study of the lamina-rins of some far-eastern brown seaweeds. Carbohydrate Res., 1974, v.34, p.241-248.

104. Enari T.-M., Niku M., Pavlova M.L., Nummi M. Comparison of cellulolytic enzymes from Trichoderma reesei and Aspergillus niger. Ins Bioconversion and biochemical engineering. Sympos«2, New Delhi, 1980, p.87-95.- 147

105. Evans P.K., Keates A.G., Cocking E.C. Isolation of protoplasts from Cereal Leaves. Planta, 1972, No 104, p.178-181.

106. Farhas V., Labudova I., Bauer S., Ferenczy L. Preparation of mutants of Trichoderma viride with increased production of cellulases. Folia microbiol., 1981, v.26, No 2, p.129-132.

107. Galun E. Plant protoplasts as physiological tools. Ann. Rev. Plant Physiol., 1981, v.32, p.237-266.109« Ghose T.K. Cellulase biosynteis and hydrolysis of cellu-losic substances. Adv. Biochem. Eng., 1977, v.6, p.39-76.

108. Halliwell G. Mode of action of the components of the cellulase complex in relation to cellulolysis. In; Symposium on enzymatic hidrolysis of cellulose. - Helsinki, Finlands, 1975, p.319-336.

109. Hampp R. Rapid separation of the plastid, mitochondrial, and cytoplasmic fractions from intact leaf protoplasts of Avena. Determination of invito ATP Pool Sizes during Greeming. Planta, 1980, v.150, No 4, p.291-298.

110. Harada H.A. New method obtaining protoplasts from mesophyll cells. Z. Pflanzenphyriol., 1973, v.69, No 1, p.77-80.

111. Ishii S., Yokotsuka T., Maceration of plant tissues by pectin trans-eliminase. Agric. Biol. Chem., 1971, v.35, No 7, p.1157-1159.

112. Janson J.-C. Columns for large gel filtration on porous gels. Agr. Food Chem., 1971, v.19, No 4, p.581-588.115« Janson J.-C., Heldman P. Large scale chromatography of proteins. Adv. Biochem. Eng., 1983, No 25, p.43-99.

113. Johnson L.B., Stuteville D.L., Higgins R.K., Shinner D.Z. Regeneration of alfalfa plants from protoplasts of selected Regen S chones. Plant Sci. Lett., 1981, v.20, No 4, p.294-304.

114. Jones M.G.K., Dale P.J. Reproducible regeneration of callus from suspension culture protoplasts of the grass Lolium multiflorum. Z. Pflanzenphysiol., 1982, v.105, No 3, p.267-274.

115. Keegstra K., Talmadge K.W., Bauer W.D., Albersheim P. A model of the walls of suspension-cultured sycamore cells based on the interconnection of the macromolecular components. Plant. Physiol., 1973, v.51, p.188-196.

116. Kuby S.A., Lardy K.A. Purification and kinetics of galactosidase from Escherichia coli, strains K-12. J. Amer. Chem. Soc., 1953, v.4, p.890-896.

117. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Parr A.Li, Randall R.J. Protein measurement with Polin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v.193, p.265-275.

118. Lu Chin-yi, Vasil V., Vasil I.K. Isolation and culture of protoplasts of Panicum maximum Jac g (Gwinea grass): somatic embriogenesis and plantlet formation. Z. Pflanzenphysiol., 1981, v.104, No 4, p.311-318.

119. Mandels M., Weber J. Production cellulases. In: Cellu-lases and their application. Wash. Amer. Chem. Soc., 1969, p.391-414 (Adv. Chem. Ser. 95).

120. Nelson IT. A photometric adaptation of the Somodyi method for determination of glucose. J. Biol. Chem., 1944, v.153, p.375-380.

121. Olutiola P.O. Growth, isolation and production of pectic and cellulolytic enzymes. Trans. Britt. Mycol. Soc., 1978, v.70, Ho 1, p.109-114.

122. Otsuki G., Takebe I. Isolation of intact mesophyll cells and their protoplasts from higher plants. Plant Cell Physiol., 1969, v.10, No 4, p.917-921.

123. Patent 3250058 (USA). Method of and apparatus for chromatographic separations / R.F.Baddour. Publ. 10.05.66.

124. Patent 3539505 (USA). Large-scale column chromatography process and apparatus therefor / K.Lauer, G.Stoeck. Publ. 22.10.68.

125. Patnaik G., Wilson D., Cocking E.C. Importans of enzyme purification for increased plating efficiency and plant regeneration from single protoplasts of Petunia parodii. Z. Pflanzen-physol., 1981, v.102, No 3, p.199-205.

126. Pilnik W., Rombouts P.M. Pectic enzymes. In; Poly-sacharides in food. Butteworths, London-Boston, 1979, p.109-126.133« Process gel filtration. Part I: Prom laboratory to process scale / B.I.Curling. Reprinted from American Laboratory,1976, 12 p.

127. Pyc. R., Fiechter A., Galas E. The production of cellulolytic enzymes by fungal cultures. Eur. J. Appl. Microbiol.,1977, v.4, No 3, p.151-158.

128. Raff I., McKenzie F.C., Clarke A.E. Antigemic determinants of Prunus avium are associated with the protoplast serface.-- Z. Pflanzenphysiol., 1980, v.98, No 3, p.225-234.

129. Rose R.I. Factors that influence the yield stabilityin culture and cell wall regeneration of spinach mesophyll protoplasts. Austral. J. Plant Physiol., 1980, v.7, No 6, p.713-725.

130. Santos A.V.P. dos, Outka D.E., Cocking E.C., Davey M.R. Organogenesis and somatic embryogenesis in tissues derived from leaf protoplasts and leaf explants of Medicago sativa. Z. Pflan-zenphysiol., 1980, v.99, No 3, p.261-270.

131. Saxena P., Gill R., Rashid A., Maheshwari S.C. Colony formation by cotyledonary protoplasts of Cyamopsis tetragonoloba L. Z. Pflanzenphysiol., 1982, v.106, No 3, p.277-280.

132. Scale up to process chromatography: a sistsmatic guide to the design and scale up of protein purification for the biotechnology industry / Pharmacia Pine Chemicals. Sweden, 1983, 24 p.

133. Schuman U., Koblitz H., Opatmiy Z. Plant recovery from long-term callus cultures and from suspension culture derived protoplasts of Solanum phureja. Biochem. und Physiol. Pflanz, 1980, v.175, No 7, p.670-675.

134. Schurz I. How to make native lignocellulosic materials accesible to chemical and microbial attack. In: Bioconversion of cellulosic substances into energy chemicals and microbial protein. - New Delhi: Aroon Parie at Thomson Press, 1977, p.37-58.

135. Schwenk P.W., Pearson C.A., Roth M.R. Soybean mesophyll protoplasts. Plant Sci. Lett., 1981, No 2, p.153-155.

136. Senn A., Pilet P. E. Isolation and some morphological properties of maise root protoplasts. - Z. Pflanzenphysiol., 1980, v.100, No 4, p.299-310.- 151

137. Shalin E.A., Shepard I.P. Cassava mesophill protoplasts: isolation, proliferation and shoot formation. Plant. Sci. Lett.,1980, v.17, Ho 4, p.459-465.

138. Shepard I.E., Totten R.E. Mesophyll cell protoplasts of potato. Isolation, proliferation and plant regeneration. Plant Physiol., 1977, v.60, No 2, p.313-316.

139. Shoemaker S.P., Brown R.D., Jr. Purification and characterization of endd-1,4- -glucanases from Trichoderma viride. •- Biochim. et biophys. acta, 1978, v.253, p.113-146.

140. Sitaram N., Monammad Kunhi A.A., Giithadevi B.R. , Rama-chandra Rac T.N. Production of fungal protein from cellulosic plant materials. Indian J. Microbiol., 1978, v.18, No 2, p.90-92.

141. Slabas A.R., Powell A.J., Lloyd C.W. An improved procedure for the isolation and purification of protoplasts from carrot suspension culture. Planta, 1980, v.147, p.283-286.

142. Slogteren G.M.S. van, Plangue K. Lekkerkerk I. Evaluation of parameters affecting the initiation of division of protoplasts of haploid and diploid Nicotiana sylvestris and Nicotiana tabacum. Plant Sci. Lett., 1980, v.20, No 1, p.35-45.

143. Somerville C.R., Somerville S.C., Orgen W.L. Isolation of photosyntetically active protoplasts and chloroplasts from Arabidopsis thalicena. Plant Sci. Lett., 1981, v.21, No 1, p.89-96.

144. Somodyi M. New reagent for the determination of sugars.- J. Biol. Chem., 1945, v.160, p.61-68.154« Somodyi M. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem., 1952, v.195, p.19-23.

145. Sternberg D., Yijakumar P., Reese E.T. Beta-glucosidase: microbial production and effect on enzymatic hydrolysis of cello-biose. Can. J. Microbiol., 1977, v.23, No 2, p.139-147.- 152

146. Steward I.G., Parry I.B. Factors influencing the production of cellulase by aspergillus fumigatus (Fresenium). Gen. Microbiol., 1981, v.125, No 1, p.33-39.

147. Takebe I., Otsuki Y., Aoki S. Isolation of tabacco mesophyll cell in intakt and active state. Plant and Cell Physiol., 1968, v.9, p.115-120.

148. Thibault F. Nature des interactions entre c1agarose et les endopolygalacturonases d'Aspergillus niger. C.R.acad.sci. Paris, 1978, v.1, p.287.

149. Ulrich T.N., Chomdhury I.B., Widholm I.M. Callus and root formation from mesophyll protoplasts of Brassica rapa. -- Plant Sci. Lett., 1980, v.19, No 4, p.347-354.

150. Urbanek H., Zalewska-Sobezak I. Characterisation of polygalacturonases of Botrytis cinerea E-200. Bull. Acad. Pol. Sci. Ser. Biol., 1975, v.23, p.665-674.

151. Vasil V., Vasil I.K. Isolation and culture of cereal protoplasts. I. Callus formation from pearl milDst (Pennisctum americanum) protoplasts. Z. Pflanzenphysiol., 1979, v.22, No 5» p.379-383.

152. Weissman B., Rowin G., Marshall I., Friederce D. Mammalian alfa-acetylglucosaminidase. Enzymic properties, tissue de-stribution and intracellular localization. Biochem., 1967, v.6, No 1, p.207-214.

153. Wermicke W., Lorz H., Thomas E. Plant regeneration from leaf protoplasts of haploid Hioscyamus muticus L., produced via anther culture. Plant Sci. Lett., 1979, v.15, No 3, p.239-249.

154. Wood T.M., McCrae S.I. The mechanism cellulose action with particular reference to the C^ component. In; Bioconversion cellulosic substances into energy, chemicals and microbial protein. Delhi: Aroon Parie at Thomson Press, 1977, p.111-141.

155. Yamada Yasuynki, Hara Yasuhiro, Katagi Hiroaki, Senda Mitsugi. Protoplast fusion. Effecrb of low temaerature on the membrane fluidity of cultured cells. Plant Physiol., 1980, v.65, No 6, p.1099-1102.

156. Yasuynki Y., Yasuhiro H., Hiroaki K., Mitsugi S. Protoplast fusion. Effect of low temperature on the membrane fluidityof cultured cells. Plant Physiol., 1980, v.65, No 6, p.1099-1102.

157. Zelcer A., Galun E. Culture of newly isolated tobacco protoplasts: cell division and precursor incorporation foiiowing a transient exposure to coumarin. Plant Sci. Lett., 1980, v.18, No 2, p.185-190.

158. Полученные образцы высокоочищенной целлюлазы (целлюлазы-ЮОО) соответствовали требованиям, заложенным в технических условиях на препарат ферментный целлюлаза-1000.

159. Данный ферментный препарат предназначен для использования в качестве биохимического реактива в/научно-исследовательских работах по разрушению растительных тканей*

160. Председатель комиссии ,,,, .гл.инженер МОЭВД /Ц ИЛ Ю.И.Гончаров1. Члены комиссииI уУ?1. Нач. ПТО

161. Ст.инженер-технбяог ¡¿озирал. Г.А.Казанцева Зав. ла б. технологииферментов медиц.наш, л^^-Г.А.Молодова Ст.научн.сотр.лаб. В.И.Максимов

162. Мл.научн.сотр.лаб. А.К.Хасирдкева

163. Гиппц^ '-оклупс-ломпчя'иизя I*.■ рмл „Уя Г1-2

164. Утас;. д«чи ЦСУ! ССС! 18.08.76 г.црошрагоз

165. Лячалы!^;«Алела по «лпПрета-■1 )■ ствду Г1Р 1, попа.:и пинии7 / I1. I, М-1,'(ШИ/.

166. Лр! с с 1 (и: (начальник то отдела или у пол« шочетшй по рлдцоппл! шпни У/ ¿¡2 и .изобретательству)>'1. ПидЦЛгЬ ■йЕцевш» >ш;.'адом использования предложения озпа!Ебмлсн(и) . -¿щВЦрЛ---Щ Лнгор (соавторы), ^¿'^Л1ЮД(1ГЛ1. OЛUJ £1. В#> * -ь ¿I1 ii.jiiii.7C

167. МЯли, типографий 'Л — Iй О1. С С С Р

168. МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. ¡В.'Ломоносова1. ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

169. Мосваа, В-234,,Л«)1гас1М Гору Тмафш: 1 -$-в -Ц-71Жянваря1. ЗАКЛЮЧЕНИЕ • ; .по очищенному целлюлазному комплексу-из сап<11<1ит производства лаборатории по получению ферментов для медицинских целей, ВНИКБиотехника.

170. Испытания активности очищенного целлюлазного комплекса из й.сап<ш.ит показали следующие характеристики препарата (активности определены в международных единицах,^М продукта в мин; на г сухого препарата):

171. Эндоглюканаза неупорядоченного действия 2200 ед. (уменьшение вязкости раствора КМЦ)

172. Эндоглюканаза упорядоченного действия 1180 ед. (накопление неглюкоз ных восстанавливающих Сахаров при гидролизе КМЦ)

173. ЭкзоглюКаназы 330 ед. (накопление глюкозы при гидролизе КМЦ)

174. Целлобиаза 220 ед. (образование глюкозы при гидролизе целлобиозы)

175. Арил-/$-глюкозидазы 240 ед. (гидролиз п-нитрофенил-А-Б -глюкозида) '

176. Активность по гидролизу фильтровальной бумаги 2500 ед. (тест Мандельс-Вебера)

177. Зав.кафедрой химической энзимологии МГУ чл.-корр. АН СССР,профессор1. Старший научный сотрудниксzr^fir К.В.Березин1. А.А.Клёсовт • Типовая междуи' тмсТпеииая форма № ''-2

178. Утверждена ЦСУ СССР ts.OS.7G г.довский опытный завод ферментныхл ре^п рн н т н е / о^м^^ш^ лде и) I (•

179. Акт об использовании предложениянеграцйбнний ?но.ме^.рац11онпл11заторскогп предложения или авторского спидетельстпаттедгеков' свидетельство Р 6195т(з&явка№25бомфз-о4отГГА2ЖП.

180. Способ хроматографической очистки ферментов и других

181. ДСОКОМ0Л9КУля рних веществ,зФлр^М^и^г»* ' В. и. тХясирдаеза А .К. .Молодова Г, А.-;/> ¿¿-к-- :'10Л1,ЗОМ110 -У января.19/60,-.

182. Й|.иэо'бретательству)--:—"" (12ддубева Г,М. )- подпись ^ " . 'лид1шс1.иачал6Ш':исподьзовф1ия предложения ознакомлен(и).л Л:' • .-.'1. Л1л■■. /1. Максимов В.И.')подпись(Хасирзздева А. К (Молодова Г. А.)

183. М-Яросл. типография ?Л1М — 1Г|.0-.»¿к