Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Холинергическая peгуляция некоторых показателей энергетического и углеводного обменов в изолированной печени крысы

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Холинергическая peгуляция некоторых показателей энергетического и углеводного обменов в изолированной печени крысы"

ЛЬВІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. ІВАНА ФРАНКА

РГ6 од

На правах рукопису

" 8 ОКТ 1996

ГОРИНЬ ОКСАНА ВАСИЛІВНА

ХОЛІНЕРГІЧНА РЕГУЛЯЦІЯ ДЕЯКИХ ПОКАЗНИКІВ ЕНЕРГЕТИЧНОГО І ВУГЛЕВОДНОГО ОБМІНІВ В ІЗОЛЬОВАНІЙ ПЕРФУЗОВАНІЙ ПЕЧІНЦІ ЩУРА

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Львів - 1996

Дисертацією є рукопис Робота виконана на кафедрі фізіології людини і тварин -Львівського державного університету ім. Івана Франка Наукові керівники: доктор медичних наук, професор,

академік АН ЕЩУ • Шостаковська І.В.

доктор біологічних наук Долібз М.М.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор,

заслужений діяч науки України Стояновський С.В.

кандидат біологічних наук, доцент Чайка Я.П.

Провідна установа - Київський національний університет ім.Т.Г.Шевченка, науково-дослідний інститут фізіології.

Захист дисертації відбудеться "S " ЬСО&МІ lS96p. о S. год. на засіданні спеціалізованої вченої ради К.04.04.09 з біологічних наук при Львівському державному університеті ім.І.Франка.

Адреса: £9üüü5. Львіе-5, вул.Грушевського,4.

5 дисертацією кожна ознайомитись у бібліотеці Львівського державного університету їм.І.Франка

Автореферат розіслано " 7^ " 1996 р.

Вчений секретар '

спеціалізовано: ради К.04.04.09 кандидат біологічних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОЕйТИ

Актуальність проблеми. Вивчення механізмів регуляції енергетичного та вуглеводного обмінів на клітинному і субклітинному рівнях залишається однією з найактуальніших проблем фізіології.

Вважається доведеним, що холінергічні регуляторні механізми посідають центральне місце у діяльності секреторних органів (Павлов. '1952; Еабкин, 1S60; Скляров, 1965; Скакун, Саратинов, 1977 та ін.). Збуджуючи секрецію, холінергічний медіатор - ацетилхолін (АХ) запускає пластичний обмін, який потребує енергетичного забезпечення (Davis, Lazarus,1976; Елаев,1978; Oberg', Robinovitch,1980; Шоста-

ковская, Дубицкий, 1984).

Дослідженнями І.Б.Шостаковської та співавторів встановлений стимулюючий вплив АХ на окисне фосфорилювання у. мітохондріях (MX), що полягає в істотному підвищенні швидкості окислення «-кетоглута-рату (а-КГ) (Шостаковська, Доліба, Гордій, 1986; Шостаковська, До-ліба, 1989). Енергетичне перетворення «к-КГ функціонально пов'язане з утворенням ГТФ (Jajpaul, 1983; Kondrashoya, Doliba, 1989). ГТФ необхідний для енергетичного забезпечення індукованих АХ синтезів глікогену (Shimazu, 1971), нуклеїнових кислот, фосфоліпідів і білків (Szostakowska,1965; Елаев, 1978; Дубицький, Шостаковська, 1984).

Вплив АХ на енергетичний обмін виявляється в активації транса-міназ ( Демин, 1967; Нилова, 1973; Елаев, 1978), що може бути істотним фактором підвищення ступеня забезпечення енергетичних процесів ( Кондрадіова, 1989,1991; Шостаковская 1968,1992; Гордий, Доліба, Муращук, 1985; Доліба, 1986), а також процесів глюконеогенезу шляхом постачання додаткової кількості субстратів (Мак-Мюрей, 1980; De Rosa, Swick,1975).

Ролі парасимпатичних нервів у регуляції вуглеводного обміну в печінці присвячено менше уваги , ніж ролі симпатичної нервової системи (Yamagucni, 1991). Зокрема, невідомою залишається їх роль в регуляції енергетичного забезпечення синтезу ГЛЮКОЗИ у процесі глю-конеогенезу.

Окремі дослідження проведені на цілісному організмі за умов стимуляції блукаючого нерва, або введення АХ. У цьому випад,ку ефект АХ може опосередковуватись 'через багато нейрогуморальних ланок всього організму. Так, відомо, що АХ стимулює вивільнення катехол-амінів із мозкового сару наднирників (Greenberg-,1982), звільнення інсуліну із в-клітин підшлункової залози ( Lundquist, 1982 ) тощо. S метою вилучення цих впливів ми дослідили вплив АХ на енергетичний обмін та глюконеогенез в ізольованій печінці щура.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було вивчиті на субклітинному й органному рівнях зміни деяких показників енергетичного та вуглеводного обмінів у печінці щура при активації холі-нергічного впливу на ізольовану печінку введенням АХ у перфуеійни розчин; з'ясувати значення регуляторного впливу холінергічних механізмів на синтез глюкози і глікогену, а також на клітинну енергети ку за умов стимуляції глюконеогенезу. Висувалось завдання: вивчит вплив АХ у-різних концентраціях на дихання й окисне фосфорилюванн у MX виділених з ізольованої печінки; визначити залежність величин ефекту АХ на згадані показники від часу експозиції медіатора; есте новити вплив АХ на утворення глюкози з лактату і пірувату та вміс глікогену в ізольованій печінці тура; дослідити зміни швидкосі поглинання кисню ізольованою печінкою щура за умов стимуляції глл конеогенезу та введення АХ; з'ясувати роль М-холінорецепторів у ps алізації дії введеного АХ на глюконеогенез ; вияснити вплив АХ ]

- з -

активність ферментів переамінування в ізольованій печінці щура при стимуляції глюконеогенезу ; дослідити змінн вмісту аденілових нук-лєотидіе та співвідношення пірузат/лактзт в ізольованій перфузоьа-ній печінці щура за умов стимуляції глюконеогенезу.

Наукова новизна. Вперше на ізольованому органові показано, що АХ стимулює дихання та окисне фосфорилювання у мітохондріях печінки шляхом активації окислення а-кетоглутарату з одночаснім підвищенням спряженості дихання і фосфорилювання, активує окислення сукцинату та сумішей глутамату з малатом і пірувату з малатом. Ефекти АХ залежать від дози та часу експозиції медіатора. На ізольованій печінці виявлено стимулюючий вплив АХ на глюконеогенев і синтез глікогену, який реалізується через М-холінореиепторн. За умов стимуляції глюконеогенезу АХ призводить до зростання рівна АТФ у тканині ізольованої печінки. Вперше встановлено, що АX за умов стимуляції глюконеогенезу активує аланін- та аспартатамінотрансферази, забезпечуючи потік субстратів для глюконеогенезу та синтезу додаткового а-кетоглутарату для окислення у циклі трикарбонових кислот. Виявлено підвищення активності сукцинатдегідрогенази під впливом АХ за умов стимуляції глюконеогенезу. Вперше доказано, що АХ збільшує швидкість поглинання кисню ізольованою печінкою щура, і цей ефект має тісний позитивний кореляційний зв'язок із продукцією глюкози.

- Науково-практична цінність роботи. Результати досліджень розширюють уявлення про механізм регуляторної дії нейротрансміттера ацетилхоліну на енергетичний та вуглеводний обміни. Виявлені особливості впливу АХ на дихання, окисне фосфорилювання і глзоконеогенез в- печінці, що полягають у підвищенні ефективності спряження дихання при окисленні й-КГ і з стимуляції синтезу глюкози з лактату і пірувату, можуть стати теоретичним обгрунтування для медико-клінічних

досліджень з метою розробки методів корекції енергетичного та вуглеводного обмінів. Дані про стимулюючий вплив холіноміметиків на синтез глюкози дадуть можливість рекомендувати ці речовини як такі, що підтримують гомеостаз глюкози після фізичного навантаження.

Апробація роботи. Беручи за основу матеріали дисертації, автор зробила доповіді: на II з'їзді фізіологів Західного регіону України (1993 р., Львів) ; на XIV з'їзді Українського фізіологічного товариства (1994 р., Львів-Київ), на 9-й європейській біоенергетичній конференції (серпень 1395 р., Льєж, Бельгія ), щорічних наукових конференціях Львівського університету (1990-1992 рр.,1995-1995 рр., Львів), на наукових семінарах кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету (1990р.,1995р.,1996р.) .

Матеріали дисертації висвітлені у дев'яти публікаціях. Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів досліджень та отриманих результатів, їх обговорення , висновків і списку літератури. Робота викладена на 125 сторінках, має 4 таблиці та 17 рисунків.

Декларація особистого внеску дисертанта. Дослідження виконане дисертантом повністю і самостійно. Аналіз отриманих результатів проведено спільно з науковими керівниками.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ Досліди проведені на тримісячних самцях білих лабораторних щурів масою 200-220 г. З метою моделювання холінергічного впливу на ізольовану печінку використовували ацетилхолінхлорид (АХ).

Для характеристик!! енергетичного і вуглеводного обмініЕ дослідження проводили &а такою схемою:

- в метою вивчення холінергічного впливу на дихання й окисне

фосфорилювання з ізольованої печінки виділялись мітохондрії (МХ) і проводилась полярографічна реєстрація їх дихання у різних станах за Чансом. Для цього ізольовану печінку ЗО хв попередньо промивали розчином Кребс-Генселейт, потім у перфузат вводився АХ у різних концентраціях (5*10~еМ; 10_7М; 5*10-?М; 10~°М) упродовж 10 і 15 хв. Як субстрати окислення використовували «-кетоглутарат, сукцинат, суміші матту з глутаматом та малату з піруватом;

- для оцінки впливу холіноміметиків на глюконеогенез проводилось визначення концентрації глюкози у витоку від печінки та глікогену в замороженій у рідкому азоті тканині печінки. Після преперфу-зії, яка тривала 50 хв. до розчину додавали лактат (5 мМ) і піруват (1 мМ), через 15 хвилин у перфузат вносили АХ і контролювали зміни у концентрації виділеної глюкози, паралельно стежили за змінами швидкості поглинання кисню ізольованою печінкою під дією різних концентрацій АХ. У серії дослідів стосовно змін у концентрації глікогену перфузія медіатором тривала £5 хвилин. Для встановлення специфічної діі введеного у перфузат АХ на синтез глюкози застосовувалась фармакологічна блокада М-холінорецепторів атропіном (доза 5*1и_ііг/1 г тканини печінки). Есб встановити походження виділеної у перфузат глюкози, використовували амінооксиацетат (ІмМ) - речовина, яка переривав шлях утворення глюкози з лактату і пірувату;

- для вияснення регуляторного впливу АХ на енергетичний обмін за умов стимуляції глюконеогенезу вивчали дихання та окисне фосфо-рилювання у МХ, виділених з ізольованої печінки, при додаванні лактату, пірувату , оксалоацетату (субстрати окислення: а-кетоглута-рат, сукцинат, суміш малату з піруватом), з також вивчали зміни в концснтрзціі ні^вкі лових нуклвотидїв, у спі-відношенні піруват/лактат, активності сукціїнатдегідрогеназіт та Ферментів гсереамікування.

З метою підсилення впливу АХ використовували інгібітор ацетилхолії естерази прозерин (доза: 3*10-4т на 1г тканини печінки).

Ізольовану печінку перфузували за методом Мілле{ (Miller,1973). MX печінки еиділяли методом диференційного центрифі гуЕання з урахуванням модифікацій, що максимальне забезпечують ) нативний стан (Кондрашова, Григоренко, 1985). Дихання Ж реєструвг ли полярографічнім методом з допомогою відкритого електрода Кларкг Названим методом реєстрували також швидкість поглинання кисі ізольованою печінкою. Вміст білка визначали за Лоурі та en. (Lowi et al., 1951). Активність аланін- і аспартатамінотрансфераз визнач; ли методом Осадчої (1982). Для визначення активності сукцинатдегі; рогенази використовували метод Єщенка, Вольського (1982).

Ферментативними аналізами визначали концентрації глюко; (Bergmeyer, Eernt, 1974), глікогену (Kepler, Decker, 1974), пірув; ту (Bucher et al., 1974), лактату (Honorst, 1974), аденілових нуі леотидів (АТФ,АДФ,АМ5) (Lamhrecht, Tracetshold,1974) (Metods с enzymatic analysis/ed. H.U.Eergemeyer.- New York: Academic Pres:

1974).

Отримані результати аналізували методом варіаційної статистики ( Деркач та ін.,1977). Отупінь спряженості між окремими де ліджуваними показниками і спрямованість існуючого між ними зв' язі-Еиеначали за коефіцієнтом кореляції.

РЕВУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

І.Бп-лнв ацетилхоліну в рівних концентраціях на глюконеогенез ; умре лелаьанкя у пеРсузіикпл розчин лактату і пірувату. Кількісі

методи дослідження глюконеогенезу проводяться переважно на препарг

ах ізольованих органів, здебільшого печінки і нирок, швидкість і арактер глюконеогенезу в яких оцінюють за приростом глюкози в при-утності різних попередників. Найздекватнішим варіантом цього мето-у є перфузія ізольованих печінки і нирок внаслідок забезпечення іівномірної оксигенації тканини без порушення цілісності органів Кенднш,1985; Талака, Chance, Qustorff, 1989).

1.6

t.

1,2 »

Jb o

0,8 |

0.4 j

А Б В ___ Г ' ■

Рис. 1. Вплив АХ в різних концентраціях на вміст глікогену і продукцію глюкози ізольованою печінкою щура.

Умови експерименту: А - перфузія без субстратів, Б- перфуаія з лактатом і піруватом, В - лактат+піруват+АХ (10-7М), Г -лактат+пі-руватч-АХ (1СГсМ) незаштриховані стовпичики - глікоген, заштриховані- глюкоза.

Наші дослідження проводились на ізольованій перфузованій печінці. Як субстрати глюконеогенезу ми використовувати лактат і пі-руЕат. У перші ЗО хв печінка перфузугалась розчином Кребс-Генсе-лейт, без субстратів з метою відмивання органу від залишків крові та біологічно-активних речовин, що діяли на орган в організмі. Крім того, за цей інтервал часу поглинання кисню печінкою виходить на

плато, що засвідчує встановлення певної метаболічної рівноваги. У цей період продукція глюкози становила 0.32+0.08 мк моль/хв*г. На 30-й хв від початку перфузії до розчину додавали лактат і піруват у концентраціях 5мМ і ІмМ відповідно. Через 15 хв це зумовило зростання продукції глюкози печінкою до 0.62±0.06 мк моль/хв*г, концентрація якої вимірювалась у пробах, взятих із витоку від печінки (рис.І.Е - заштриховані стовпчики).

Оскільки концентрація глюкози в перфузаті може зростати за рахунок синтезу з лактату і за рахунок розпаду глікогену доцільно було дослідити зміни в концентрації глікогену. На 30-й хв. від початку перфузії концентрація глікогену становила 12.00±2.33 мг/г, а через £5 хвилин перфузії лактатом і піруватом ця величина була рівна 21.33±2.87 мг/г тканини печінки (рис.1,В - лезаштриховані стовпчики) .

Отримані результати вказують, що внесення до перфузату лактату і пірувату стимулює продукцію глюкози печінкою, частина якої депонується у вигляді глікогену, а надлишок звільняється у перфузійний потік , тобто, має місце процес глюконеогенезу спряжений з синтезом глікогену.

Щоб встановити вплив холіноміметиків на процес синтезу в печінці глюкози і глікогену з лактату тз пірувату, ми додавали до перфувійногс розчину ацетилхолін у різних концентраціях. Результати наших досліджень засвідчують: додавання до перфузату АХ в обидвох

концентраціях (10-7 М і 10-СМ) призводить до збільшення продукції глюкози печінкою (рис.1,6 і Г • заштриховані стовпчики).

Зокрема, внесення до перфузату, що містив субстрати глюкокео-гекезу, АХ (10-^М) призводило до значного збільшення продукції глюкози ізольованою печінкою, яка становила 0.Убій.09 мк моль /1 хв на

1 г тканини. Це на 55% більше, ніж у контролі (перфузія розчином Кребс-Генселєйт, що містив лише лактат і піруват). Збільшення- концентрації медіатора у 10 разіЕ (10“®М) також зумовило достовірне зростання продукції глюкози (р<0.001),і ця величина становила 1.29+0.10 мк моль/хв*г тканини. Водночас із зростанням концентрації глюкози спостерігалось достовірне (р<0.00і) збільшення вмісту глікогену (рис.1,Б і Г - незаштриховані стовпчики) у тканині печінки під впливом обидвох досліджуваних концентрацій. Варто зазначити, що при використанні АХ у концентрації 1*Ю-,7М ефект медіатора на вміст глікогену був виражений чіткіше і становив 46.23±3.6? мг/г порівняно з контролем (21.33±2.87), ніж при використанні концентрації 1*10-бМ (34.35±2.33). Це підтверджує дозову залежність ефектів ацетилхоліну на продукцію глюкози і синтез глікогену в тканині ізольованої перфузованої печінки.

2. Бплив ацетилхоліну на швидкість поглинання кисню ізольованою перфузованою печінкою та гемодинзміку за умов стимуляції глюконео-генезу. У праці Танаки і співавторів показано, що додавання до пер-фузійного розчину суміші лактату і пірувату зумовлює ■ підвищення поглинання кисню ізольованою печінкою щура (Tanaka et al.,1989).

Результати наших досліджень показані на рис.2,(А,лінія-1).

Як бачимо, внесення _в перфузат 5 мМ лактату і ІмМ пірувату після ЗО хе перфузії печінки розчином без субстратів призводить до значного зростання швидкості поглинання кисню. Через 10-15 хв швидкість поглинання кисню досягає максимального рівня і становить 182% контрольних величин. Ці дані чітко корелюють із підвищенням продукції глюкози л?чінкою (А,лінія-2) (коефіцієнт кореляції г-0.9911). Внесення у перфузійний розчин АХ (1*1и"''М) також зумовлює збільшення швидкості поглинання кисню. Збільшення концентрації АХ до 5*10~7М

Рис. 2. Вплив АХ на швидкість споживання кисню і продукцію глюкози ізольованою печінкою за умов стимуляції глюконеогенеау.

А: крива 1 - швидкість поглинання кисню, крива 2 - звільнення глюкози у перфузат.

Б: напруженість кисню (запис справа наліво), АХ - ацетилхолін, ФР -фіаіологічний розчин, конц. АХ: 1 - 5*10-8М; 2-10 7М; 3 - 5*10 'М;

4 - 10~^М; 5 - атропін + 10~СМ.

призводило до зменшення ефекту, з концентрація 1*10 ®М навіть викликала зниження поглинання кисню (Б,лінія-4).

Ми припустили, що зниження поглинання кисню при високій концентрації ацетилхоліну може бути пов'язане з його впливом на гемо-динаміку. Результати досліджень засвідчують дозозалежне зниження швидкості перфузії у венозній системі печінки. Поступове збільшення концентрації АХ у 5,10,15 разів призводить до зменшення швидкості перфузійного потоку з 46 ші'хв (АХ:5*10_8М) до 38.7 мл/хв (АХ: 10-5М). У даному випадку атропін лише частково знімає ефект АХ у концентрації 10_5М.Це засвідчує опосередкування впливу медіатора на швидкість перфузії не лише через М-холінорецептори. Таку дію

ацетилхоліну необхідно брати до уваги при дослідженні біоенергетичних показників. Очевидно, що зниження поглинання кисню при дії АХ у концентрації 10-6М пов’язане із його впливом на гемодинаміку.

3.Усунення стимулюючої дії ацетилхоліну на глюконеогенез амі-нооксизцетатом. У праці Цедербаума і співавторів (СесіегЬаші еі аі., 1973) зазначається, що амінооксиацетат - інгібітор трансаміназних реакцій переривав шлях утворення глюкози з лактату і пірувату. Оскільки в печінці глюкоза може утворюватись внаслідок її синтезу в процесі глюконеогенезу і внаслідок розпаду глікогену, необхідно було з'ясувати походження глюкози, що виділялась у перфузат в умовах нашого дослідження.

На користь того , що зростання концентрації глюкози у витоку із печінки відбувається за рахунок її синтезу в процесі глюконеогенезу, засвідчує такий факт: амінооксиацетат у концентрації ІмМ повністю усував стимулюючий ефект ацетилхоліну на синтез глюкози. Оскільки в печінці присутні як М-, так і Н-холінорецептори, важливе значення має те, через які саме холінорецептори реалізує свій вплив АХ. Як показали наші дослідження, вплив АХ на синтез глюкози у процесі глюконеогенезу реалізується через М-холінорецептори, оскільки блокада їх атропіном повністю усувала ефект медіатора.

4.Зміни вмісту аденідових нуклеотидів за умови стимуляції глюконеогенезу та співвідношення піруват/лактат в ізольованій перФузо-ваній печінці аура під дією АХ. Як відомо, процес глюконеогенезу потребує значного енергетичного забезпечення (для синтезу 1 молекули глюкози необхідно 4 молекули АТФ). З цим, очевидно, пов'язане вростання гідролізу АТФ при дії АХ, шо відображається у зростанні концентрації АДФ і АШ. Таблиця 1 подає дані про вплив різних доз ацетилхоліну на вміст аденідових нуклеотидів в ізольованій перфузо-

ваній печінці щура. Як бачимо, низька концентрація ацетилхоліну (1*10-7М) призводить до зростання концентрації АТФ на 13% порівняно з контрольними величинами. Водночас достовірно зростає концентрація АДФ на 12% і АМФ на 33%. Очевидно, ’ "що поряд в активацією синтезу АТФ має місце й активація його гідролізу. Активація гідролізу АТФ під дією ацетилхоліну, ймовірно, пов'язана іе стимуляцією у печінці глюконеогенезу, який, як вже згадувалось, потребує значного енергетичного забезпечення .

Таблиця 1 також покззує, що дія ацетилхоліну в концентрації 1*10-ЄМ , призводить до достовірного зниження в тканині печінки концентрації АТФ на 33%, а також до зростання концентрації АДФ на 28%, АМФ на 87%,і Фн на 46% стосовно контролю. Таке зниження рівня АТФ, засвідчує насамперед про інтенсивний його гідроліз. Не виключено, що у згаданій концентрації АХ зумовлює зменшення його синтезу.

Важливим фактором регуляції глюконеогенезу є стан редокс-сис-теми. Згідно з дослідженнями Білл'ямсона Дж.Р. і співавторів (шііііатзоп еі а1,1969) співвідношення концентрацій пірувату і лактату (піруват/лактат) може бути відображенням цитоплазматичного співвідношення окисленої та відновленої форми піридиннуклеотидних коферментів (НАД+/НАДН). '

Результати наших досліджень показують, що концентрація лактату достовірно не змінюється під вливом АХ у концентраціях 10-7- 5*10~7 М і підвищується при високій концентрації 10~5 М (табл. 1). Концентрація ж пірувату істотно зменшується при всіх досліджуваних лозах АХ,і це приводить до зменшення співвідношення піруват/лактат на 59% при використанні АХ у концентрації 10”'"М, на 33% (АХ 5*10“'М) і на 40% при дії АХ 10-С'М. Отже, АХ за умови стимуляції глюконеогене-

. Таблиця 1.

Вплив рівних концентрацій ацетилхоліну на вміст аденілових нуклеотидів

і відношення піруват/лактат в ізольованій перфуеованій печінці щура.

Умови експерименту АТФ, мкмоль/г АДФ, мкмоль/г АМФ, мкмоль/г Рн, ' мМ Піруьат, мкмоль/г Лактат, мкмоль/г і Пірувзт / лактат

Контроль 2.30¿0.26 0.87+0.26 0.452:0.07 3.32+0.31 0.42+0.01 3.04і0.01 0.14010.003

Ацетилхолін, 1*10“^ 2.7310.15' 0.97+0.04 0.60±0.08* 3.4110.27 0.29Ю.01* 2.96±0.04 0.100£0.004*4

Ацетилхолін, 5*10~7М 2.25Ю.23 0.98+0.06 0.8010.09““ 3.40+0.20 0.27+0.01“ 2.86+0.04 0.094=0.003**

Ацетилхолін, 1*10_бМ 1.7310.0'?* 1.11+0.25 0.7510.13** 4.4810.81* 0.28=0.04** 3.31+0.06 “* 0.084±и.009**

Примітка: відношення піруват/лактат вказує на цитоплазматичний стан редокс-системи. * - р<0.02; .

** - р<0.01.

ву б ізольованій печінці щурз зумовлює зсув редокс-потенціалу до відновлених форм, що створює добрі умови для синтезу АТФ шляхом забезпечення потоку електронів у дихальний ланцюг.

5. Регуляція ацетилхоліном дихання й окисного Фосфорилювання в мітохондріях, виділених з ізольованої перфузованої печінки. Оскіль-ки метаболізм глюкози тісно пов'язаний через цикл Кребса з окисним фосфорилюванням, у процесі якого синтезуються макроерги необхідні для забезпечення реакцій глюконеогенезу, ми дослідили вплив АХ на дихання й окисне фосфорилювання в МХ, виділених з ізольованої печінки, за умов, коли в перфузаті присутня глюкоза (5мМ). -

Як показали результати, ін'єкція АХ (ІСГ'М) призводить до стимуляції швидкості контрольованого, і АДФ-стимульованого дихання при окисленні всіх досліджуваних субстратів. Зокрема, при окисленні а-КГ АХ (1СГ7М) зумовив достовірне вростання швидкості АДФ-стимульованого дихання до 53.89±4.31 нг-ат 02/хв*мг білка (р<0.001), водночас у контролі ця величина становила 41.23±2.12. При використанні сукцинату швидкість АДФ-стимульованого дихання становила у контролі 41.48±3.04 і зростала піл впливом АХ до 56.63±4.59 нг-ат С>2 /хе*мг білка. Достовірна зміна цього ж показника спостерігалась при окисленні суміші глутамату з малатом і становила 55.87+5.36 нг-ат Оо/хв*мг білка, що на 57% вище від контрольних величин (рис.З). Фосфорилювання доданої-АДФ проходить значно інтенсивніше при окисленні НАД-залежних субстратів, у даному випадку - «-кето-глутарату і суміші глутамату з малатом. Коефіцієнт інтенсивності окисного фосфорилювання під еплиеом АХ (ІСГ'М) порівняно з контролем зростає на 81% і 57% відповідно, але суттєво не відрізняється від контрольної величини при окисленні сукцинату. Необхідно зазначити достовірне підвищення на 33% (р<0.05) ефективності окисного

Нг - ат О; хв*мг білка ддф ' 60

'50

40

30

20

10

120с

гП і і

АДФ

АДФ

-1--

В

Рис. 3. Дихання й окисне фосфорилювання МХ, виділених з ізольованої печінки щура перфузованої АХ (10 7М).

Контроль - суцільна лінія; дослід - перервана лінія; субстрати окислення: А - «-КГ; В - глутамат + малат; В - сукцинат. * - р < 0.05.

Нг-ат 02 хв*мг білка

60 '

50

40

ЗО

20

10

АДФ

120с

АДФ

1

Ъ—І

АДФ

І

Г ■ + І 1

1 і_

І

в

Рис. 4. Дихання й окисне фосфорилювання МХ, виділених з ізольованої печінки щура перфузованої АХ (10 “М).

Контроль - суцільна лінія; дослід - перервана лінія; субстрати окислення: А - ос-КГ; В - сукцинат; В - глутамат + малат. * - р < 0.05.

фосфорилювання при окисленні а-КГ,а при окисленні сукцинату поряд ! активацією швидкості дихання, АХ (10~7М) істотно не впливає нг ефективність та інтенсивність окисного фосфорилювання.

Отже, можна стверджувати, що ацетилхолін (10-7М) в умовах пер-фузованого органу здебільшого реалізує свій активуючий вплив на дихання й окисне фосфорилювання через окислення НАД-залежних субстратів.

Стимулюючий ефект АХ (10-7М) виявився залежним від часу перфу-зії медіатором. Збільшення часу перфузії медіатором до 15 хв призводило до зниження величини стимулюючого ефекту ацетилхоліну н; АДФ-стимульоване дихання з 35%, на а-кетоглутараті та 42& на сукци-наті до 24% і 6% відповідно.

При дослідженні впливу АХ на дихання й окисле фосфорилювання : ізольованій перфузоЕаній печінці нами також Еикористотвувзлась відносно висока концентрація АХ - 10_Є'М. Результати засвідчують, щ<

збільшення концентрації медіатора у 10 разів призводить до зниженні швидкості фосфоршпоючого дихання всіх досліджуваних субстратів Зокрема, при окисненні «-КГ, сукиинату та суміші глутамату з манатом величина швидкості АДФ-стимульованого дихання становил, 22.50+0.53, 27.53±1.56, 25.13+1.79 нг-ат 02/хв*мг білка відповідно а в контролі ця величина дорівнювала 26.05±0.47 при окисленні а-КГ 36.21¿3.52 при окисленні сукцинату і 34.4111.53 при окисленні сумі ші глутамату з манатом (рис.4). Це, очевидно, пов'язане із згаданк ефектом АХ у високій концентрації на швидкість поглинання кисню гемодинаміку та вміст аценілових нуклеотидів у ізольованій печінц щура. Отже, залежно від дози АХ по-різному впливає на дихання : окисне фосфорилювання. Найрстогс ефекту можна досягти використовуючи концентрації 5*10-3№ і 1С,-7М. Збільшення концентрації АХ у 5-її

>азів призводить до зниження ефекту і навіть до гальмування \ЦФ-стимульсвакаго дихання. .

6. Дихання й окисне фосфорилювання у мітохондріях, виділених з ізольованої перйузованої печінки за умов стимуляції глюконеогенезу. Результати досліджень стосовно впливу ацетилхоліну на дихання й скисне фосфорилювання у мітохондріях, виділених із ізольованої пер-фузованої печінки за умов стимуляції глюконеогенезу (рис.5) показують, що АХ (5*10~3М) призводить до значної актигації АДФ-стимульо-ваного дихання за окислення а-КГ, сукцинату та суміші пірувату з малатом. Зокрема, при використанні субстрату окислення а-КГ величина швидкості АДФ-стимульованого дихання збільшується із 30.29±1.48 у контролі до 65.20±6.54 нг.ат Ог / мг білка за 1 хв під дією АХ; за окислення сукцинату цей показник змінюється з 38.17+3.17 до 61.18+4.59, а при використанні суміші пірувату з малатом шзндкість

нг-ат.Оі

хв-мг^їлка АПД

120с

- 1-контроль,

40 -

£

- 2 - перфузія розчином Кребса- Генселента з лактатом і піруватом +

АХ (5*10'8 М) +

прозерин

А

Б

В

о

Рис. 5. Дихання й окисне фосфорилювання у МХ, виділених з ізольованої пережованої печінки за умов стимуляції глюконеогенезу. А - а-КГ; Б - сукцинат; В - піруват + малат; * - р < 0.05.

АДФ-стимульованого дихання зростає з 23.06±1.56 до 56.3+5.36 нг-ат

О2 /1 мг білка за 1 хв. Значно скорочений час фосфорилювання доданої АДФ за дії АХ. Це призводить до істотного підвищення інтенсивності окисного фосфорилювання (АДФА) на 98, 151 і 147% відповідно

при окисленні а-КГ, сукцинату та пірувату з малатом. При окисленні «-КГ також спостерігається підвищення ефективності окисного фосфо-рилювання (коефіцієнт АДФ/0 у контролі становив 1.90±0.17, а під дією АХ його величина зростає до 2.5+0.14, що на 307. більше).

Варто зазначити, що за умов стимуляції глюконеогенезу ацетилхолін активує важливий фермент циклу трикарбонових кислот - сукци-натдегідрогеназу, активність якої порівняно з контролем зростає на

- 34%.

Отже, за умов стимуляції глюконеогенезу ацетилхолін у концентрації 5*10_8М активує процеси дихання й окисного фосфорилювання і при окисленні НАД -залежних, і ФАД -залежних субстратів. Це відображається в активації АДФ-стимульованого дихання і збільшення інтенсивності окислення досліджуваних субстратів. -

7. Роль амінотрансферазних реакцій у стимуляції ацетилхоліном глюконеогенезу в ізольованій перфузованій печінці. Амікотрансфераз-кі реакції виконують важливу роль у процесах глюконеогенезу, оскільки внаслідок цих реакцій створюється додатковий потік субстратів для синтезу глюкози. Зазначимо також, що трансферазні реакції, забезпечуючи утворення а-КГ у МХ, сприяють його окисленню в ЦТК (Долібз, 1993). Для з'ясування ролі ферментів переамікування у процесах глюконеогенезу ми дослідили вплив АХ на активність аланін- та аспартатамінотрансфераз. Результати досліджень показали (табл. 2), ще АХ у дозі 5х10_3М зумовлює достовірне зростання активності обид-еох досліджуваних ферментів переамінування. Якщо у контрольних дос-

лідах активність аспартатамінотранс-ферази в мітохондріальній фракції, виділеній з ізольованої перфузованої печінки, становила 0.30±

0.03 мМ пірувату Иа/Імг білка * 1 год., а аланінамінотрансферази

0.32± 0.11 мМ пірувату Иа/Імг білка * і год., то через 15 хв перфу-зії розчином , що містив ацетилхолін у концентрації 5*10_9М, в присутності лактату (5мМ), пірувату (ІмМ) і оксалоацетату (ІмМ) активність згаданих ферментів зростала до 1.30±0.11 і 0.43±0.02 мМ пірувату На/1мг білка*1 год відповідно в АспАТ і АлАТ. Це становить 162.5% і 134% контрольних величин.

Отже, АХ, активуючи трансамінази, сприяє синтезу глюкози в процесі глюконеогенезу, створюючи додатковий потік субстратів, а також сприяє утворенню ендогенного сс-кетоглутарату, що активує його окислення в ЦТК і забезпечує тим самим синтез АТФ і ГТФ для енергетичного забезпечення глюконеогенезу.

Таблиця 2.

Зміни активності АлАТ і АспАТ у мітохондріях,

виділених з ізольованої перфузованої печінки щура за умов стимуляції глюконеогенезу

Умови досліду аспАТ мМ пірувату На/ мг білка-1'год АлАТ мМ пірувату Иа/ мг білка-1 год

М ± іп % М ± ш %

Перфузія розчином Кребса-Генселейта 0,80 ± 0,03 100 0,32 ± 0,01 100

Перфузія розчином Кребса-Генселейта+ лактат + піруват+ сксалоацета’т’ + АХ (5 • 10"° М) 1,30 і 0,11“ 162,5 0,43 ± 0,02“ 134

4 - р < 0,01.

Т 20. ВИСНОВКИ

1. Ацетилхолін стимулює синтез глюкози з лактату і пірувату, також глікогену ізольованою перфузованою печінкою щура із достовір ним збільшенням його концентрації у тканині.

2. Стимулюючий вплив введеного у перфузат АХ на глюконеогенє опосередкований через М-холінорецептори, оскільки блокада їх атрс піном повністю усував ефект медіатора.

3. АХ у концентраціях 5*10-8,1*10-7 і 5*10-7М збільшує шви? кість поглинання кисню ізольованою печінкою за умови стимуляці глюконеогенезу з додаЕанням до перфузійного розчину пірувату і лаі тату. Зростання швидкості поглинання кисню ва згаданих умов мг чітку позитивну кореляцію із продукцією глюкози ізольованою печії кою (г-0.9911).

4. АХ у високих концентраціях (1*10-оМ) зніжує шепдкість цщ куляції в судинній системі печінки, що, ймовірно пов'язане із вазс дилатацією судин.

5. У концентрації 1*10“'М АХ призводить до зростання рівня А1 у тканині ізольованої печінки поряд із збільшенням концентрацій А.1* і АДФ, що, очевидно, пов'язане із його гідролізом для забезпечені реакцій простимульованого глюконеогенезу.

6. При перфузії ізольованої печінки ацетилхоліном зростає. . в< личина окисно-відновного потенціалу до відновлених форм піридинну: леотидів. Де засвідчує активацію ацетилхоліном аеробного енергетик ного обміну за умови стимуляції глюконеогенезу та створення пото: протонів для синтезу АТФ.

7. У МХ ізольованої печінки АХ стимулює дихання та окисне фо< посилювання шляхом активації окислення НАД-залежних (й-кетоглутар; ту, глутамату з малатсм, пірувату з малатом), і ФАД-залежних (суі

цкнат) субстрзтів. При окисленні сс-кетоглутарату АХ зумовлює одночасне підвищення інтенсивності та спряженості дихання і фосфорилю-вання. Дія АХ на дихання й окисне фосфорилювання залежить від концентрації та часу експозиції медіатора.

3. За умови стимуляції глюконеогенезу АХ підвищує активність ферментів переамінування - аланін- і аспартатамінотрансфераз. Це забезпечує додатковий потік субстратів для синтезу глюкози, а також його адекватне енергетичне забезпечення через утворення ендогенного а-кетоглутарату та його окислення у циклі трикарбонових кислот.

Список публікацій за темою дисертації:

1. Шостаковская И.В., Бабский A.M., Горинь О.В., Долиба Н.М. ,

Музыка Ф.В. Субклеточные механизмы реализации холин- и адренергических влияний в пищеварительных железах и миокарде // Проблемы физиологии гипоталамуса: Межведомств. научн. сб./ Под ред. А.Ф. Ко-

сенко и др.- К.: Лыбидь, 1992,-Вып.26,- С.116-122.

2. Шсстаковська І.В., Гордій O.K., ДолібаМ.М., Бабський A.M., Музика Ф,Б.. Горинь О.Б., Кургалюк Н.М. Роль катехоламінів і ацетилхоліну в регуляції дихання та окисного фосфорилювання в секреторних клітинах та їх мітохондріях // Актуальні проблеми фізіології: Тез. доп.- К.: Либідь, 1992.- С.54-55.

3. ДолібаМ.М., Кургалюк Н.М., Горинь О.В., Абдула Лакаль, Музика Ф.В., Ватаманюк М.З. Роль іонів кальцію в механізмі дії холі-нотропних речовин на енергетичний обмін в мітохондріях // Науково-методичні аспекти фізіології: З’їзд західно-регіонального відділення Укр. фізіолог, т-ва. - Львів, 1993,- Ч.1.- С.27-23.

4. Доліба М.М., Лакаль Абдула, Батаманюк М.5., Романик 0.5. , Кургалюк Н.М. Підвищення спряженості дихання та окисного фосфсрилю-

вання мітохондрій аа дії ацетилхоліну // Матеріали 1-го з'їзду Ук біофізичн. т-ва, 20-24 черв. 1994р. - K., 1994.- C. 88-89.

5. ДолібаМ.М., Гордій С.К., Ватаманюк М.З., Горинь О.В. Су клітинні механізми реалізації впливу холіноміметиків на енергетич процеси в міокарді та травних залозах //. XIV в'їзд Укр.фізіоло т-Еа, м.Київ, 1-4 листоп. 1994 p.: Тез доп.- K., 1994.- C.155.

6. Горинь О.В., ДолібаМ.М., Ватаманюк М.З. Порівняння д ацетилхоліну на енергетичний обмін в ізольованій перфузованій п чінці щура і в умовах in vivo // Еспериментальна та клінічна фізі логія. 36. наук, праць.- Львів,1995.- С.203-204.

7. Горинь О.В., ДолібаМ.М., Шостаковська І.В. Холінергіч регуляція деяких показників енергетичного обміну в ізольованій ne; фузованій печінці// Актуальні проблеми медицини, біології, Еетер: нарії та сільського господарства.- Львів: Віче, 1996.- С.124-129.

З. Горинь О.В., ДолібаМ.М., Ватаманюк М.З., Шостаковська І.і Вплив ацетилхоліну на глюконеогенез в ізольованій перфуаованій пі чінці// Бюллетень клінічної та експериментальної фізіології Львів: Ескулап, 1996 .- т.1.- N1-2.- С.12-16.

9. Goryn 0., Doliba М., Shostakovska I. Regulation < respiration and transferase activity by acetylcholin in perfus' isolated rat liver ' under giuconeogenesis stirnuiatii condition// EBEC reports.- 1996.- Vol.9.-P.239.

Г'орынь О.В. Холинергическая регуляция некоторых показателі енері-етического и углеводного обменов в изолированной печени крыс] Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических нУК ПО специальности 03.0Ü. 13. ~ фи?ї!ОЛОГІ1Я Ч6Л0В6КЗ. И ЙОИЕОТНЫХ.

На изолированном органе показано, что ацетилхолин стимулиру*

;ыхание и окислительное фосфорилирование в митохондриях печени пу-■ем активации окисления «-кетоглутарата с одновременным повышением юпряхения дыхания и фосфорилирования, активирует окисление сукци-гата и смесей глутамата с малатом и пирувата с малатом. Эффекты щетилхолина зависят от дозы и времени експозиции медиатора. Выяв-1ено стимулирующее влияние ацетилхолина на глюконеогенез и синтез •ликогена изолированной печенью. Продукция глюкозы корелирует с юзрастанием скорости поглощения кислорода. Влияние ацетилхолина на 'люконеогенез опосредованно через М-холинорецепторы. В условиях фостимулированногс глюконеогенеза в ткани печени под влиянием АХ юзрастает концентрация АТФ, одновременно увеличиваются концентрации АДФ и AKffi. Ацетилхолин активирует сукцинатдегидрогеназу, а такие аланин- и аспартатаминотрансферразы, способствуя увеличению потока субстратов для глюконеогенеза и синтезу ендогенного а-кетоглу-гарата для окисления в цикле трикарбоновых кислот.

Зогуп' O.V. Cholynergic regulation of some indexes of energetic and carbohydrate metabolisms in isolated perfused rat liver. Thesis for Ph.D. degree in biological sciences by speciality: 03.00.13 - Human and animals Physiology. Ivan Franko State University, Lviv, Ukaine,1996.

It was shown in isolated organ that acetylcholine leads to stimulation of respiration and oxidative phosphorylation in iiver mitochondria. Under «-ketoglutarate oxidation simultaneously effectiveness of oxidative phosphorylation increases. Acetylcholine activates cf succinate and glutamate-malate and pyruvate-malate mixtures oxidation. Acetylcholine effects dependent on dose aid time of mediator influence. It was shown that acetylcholine

stimulates glucose and glycogen synthesis. Glucose productio correlates with rate O2 uptake increase. Acetylcholine influenc intermed by M-cholinergic receptors. In liver tissue unde gluconeogenesis conditions Ach influence leads to ATP concentratio: increase at the same time to ADP and AMP concentration increase Acetylcholin activate succinatedehidrogenase and alanin- an' aspartataminotrasf'erases. This promote substrate flow increase fo: gluconeogenesis and endogenic ci-ketoglutarate synthesis fo: oxidation in Cycle of tricarbonic acids. .

Головні слова: ацетилхолін, глюконеогенев, печінка, мітохондрії

окисне фосфорилювання, а-кетоглутарат, сукцинат.