Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика процессов, регулирующих цитолитическое действие лимфокин-активированных киллеров

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика процессов, регулирующих цитолитическое действие лимфокин-активированных киллеров"



На правах рукописи

ЛУКЬЯНОВА Тамара Ивановна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ЦИТОЛИТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИМФОКИН-АКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ

специальность 03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук Н. В. Гнучев, кандидат биологических наук Л. П. Сащенко

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент РАЕН, доктор биологических наук,

профессор В. Я. Арион,

доктор биологических наук С. М. Деев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт иммунологии Минздравмедпро-ма РФ

Защита диссертации состоится 1995 г.

■Ц. час. СЧЭ мин. на заседании Диссертационного» Совета по защите докторских диссертаций Д.200.30.01 при Институте биологии гена по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан « »_ 1995 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета по защите

докторских диссертаций Я

кандидат фарм. наук \/ и/^^ Л. Грабовская

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В основе иммунной зашиты организма леккг способность клеток одного типа распознавать и уничтожать клетки другого типа, оказывающих неблагоприятное воздействие на данный организм.

Защита организма от трансформированных и инфицированных вирусом клеток осуществляется цитолитическнми лимфоцитами. Эти клетки взаимодействуй1 с КМ (клетки-мишени) с последующей секрецией в зону контакта или экспрессией на клеточной поверхности цитотоксических белков. Взаимодействие этих белков с КМ приводит к запуску процессов, обусловливающих лизис клеток.

В. последнее время пристальное внимание ученых привлекает лечение злокачественных заболеваний методом адаптивной иммунотерапии. Стимуляция лимфоцитов периферической крови ИЛ-2 приводит к образованию ЛАК-клеток (лимфокин-активированнкх киллеров). Эти клетки обладают высокой противоопухолевой активностью in vitro и in vivo. Клинические испытания, проведенные профессором Розенбергом и др. исследователями, показали, что терапия ЛАК-клетквми не ограничивается их применением в медицинской практике, они такие служат удобннм объектом для изучения механизма цитотоксичности, опосредованной действием цитолитических лимфоцитов.

В настоящее время механизм цитолитического действия ЛАК-клеток интенсивно изучается. В Институте биологии гена РАН было установлено, что в процессе культивирования лимфоцитов- в присутствии ИЛ-2 наблвдается изменение цитотоксической активности ЛАК-клеток.. Цитотоксичность ЛАК-клеток характеризуется двумя максимумами, развивающимися на 4-ые и 6-ые сутки инкубации с ИЛ-2. Эти изменения цитотоксичности коррелируют с изменением фенотипа ЛАК-клеток: 1-ый максимум цитотоксичности соответствует активности ЕКК (естественные киллерные клетки), появление 2-го максимума связано с развитием субпопуляции ЛАК-клеток с фенотипом, характерным для ЦТЛ (цитолитические Т-лимфоциты). Были выделены и охарактеризованы цитотоксические белки ЛАК-клеток как ассоциированные с мембранами, так и секретируемые в зону контакта при взптиодействии ЛАК-клеток с КМ, причем было установлено, что ЛАК-клетки с различным ■ фенотипом секретируют различнее цитотоксические белки. Однако, до настоящего времени практически не изучаются процессы, участвующие в регуляции шгготоксического

действия ЛАК-клеток.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧА ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы - наметить подход к изучению регуляторных процессов, участвущих в модуляции цитотоксической активности ЛАК-клеток. Конкретными задачами Сыли: исследование регуляторяой роли ионов кальция в процессе активации . цитолитических лимфоцитов, изучение состава щгготоксических белков при кальций-зависимом и кальций-независимом механизмах секреции. Изучение активкруизего влияния на цитотоксичность секретируемых ЛАК-клетками белков-модуляторов 'цитотоксичности - виг-эстераз. Поиск ингибиторов ЛАК-клеток:

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИИ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Установлено, что цитолитическое действие ЛАК-клеток в отсутствии экзогенного кальция связано, не только с действием ыембраносвязанных белков, но такие и с секрецией растворимых цитотоксических белков. Охарактеризованы белки, секретироввнные по

кальций-независимому механизму, определена молекулярная масса етих белков, показано, что взаимодействие ЛАК-клеток с КМ модифицирует состав секретированных белков. Установлена способность ЛАК-клеток осуществлять секрецию непрерывного типа через аппарат Гольдки. Исследовании роль гранулярных • вгг-встераз в процессе цитолиза. Показано, что виг-встеразы не обладают прямым цитотоксическим действием, а участвуют в модуляции цитотоксичвского действия ЛАК-клаток. Показано, что основной белок крупного рогатого скота -фетуин обладает ингибирувдим действием на цитотоксическую активность ЛАК-клеток.

Работа относится ■ к фундаментальным исследованиям. Она расширяет современное представление о механизме действия цитолитических лимфоцитов. Полученные данные представляют такке практический интерес. Описание цитотоксических белков, а тайке белков, принимающих участие в регуляций процесса цитолиза, открывает перспективу получения их в гомогенном состоянии, что позволит использовать их в клитической практике.' АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертации докладывались на 16-ой конференции ФЕБО (Москава,1984), на совещании "Механизмы интерфазной гибели клеток" (Пущино-на-Оке, 1984), на всесоюзном' совещании "Актуальные вопросы клеточной, биологии" (Ленинград, 1984), 14-ом Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), IV- совещании УКЛА симпозиума' по молекулярной и клеточной биолпш (Лос-Анжелес, 1988), 2-ой Международной конференции по фактору некроза опухолей и связанным цитокинам (Нала, Калифорния, 1989),

Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкоСиологик (Львов, 1990), симпозиуме "Структура и функция регуляторнкх полипептидов" (Москва, 1992), на 8-ом Международном иммунологическом конгрессе (Будапешт, 1992). ПУБЛИКАЦИИ. По теме работы имеется 5 публикаций. 'ОБЪЕМ РАБОТЫ. Работа изложена на 89 страницах машинописного текста. Она включает: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсувдение результатов, выводы и сшсок циторовннной литературы. Диссертация содержит 18 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. РАЗЛИЧНЫЕ ПУТИ СЕКРЕЦИИ РАСТВОРИМЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ БЕЛКОВ ЛАК-КЛЕТОК.

В настоящее время установлено, что лизйс клеток может осуществляться по кальций-зависимому и кальций-нвзаЕисимому механизмам. Кальций зависимый-механизм опосредован экзоцитозом содержимого цитолитических гранул, кальций-независимый механизм обычно связывают с активностью белков, ассоциированных с мембраной лимфоцита, хотя не исключена возможность секреции растворимых цитотоксических белков в отсутствии экзогенного.кальция.

Мы исследовали возможность выделения эффекторными лимфоцитами растворимых цитотоксических белков по кальций-независимому пути. С этой целью инкубировали ЛАН-клеткл, полученные на 4-ые и 6-ые сутки культивирования с ИЛ-2, с НМ (линия клеток КБ62) в присутствии 4 мМ еста е течение 18 часов, затем отделяли смесь клеток центрифугированием и исследовали белковый состав полученного супернатанта (Эп). Такой подход позволяет выяснить, как отличаются белки, секретируемые различными субпопуляциями ЛАК-клеток. На рис.1 приводятся цитотоксическая и вгг-эстеразная активность Эп ЛАК-клеток, полученного в отсутствии и в присутствии еста. Как видно из приведенных результатов еста ингибирует активность маркеров цитолитических гранул - ВГГ- эстераз не * 90%^чте свидетельствует о практически полном блокировании секрета! лимфоцитами содержимого цитолитических гранул. Несмотря на прекращение секреции гранулярных белков, Бп ЛАК-клеток с фенотипом СД1&+СД8+СДЗ-, а танке СДЗ+СДВ+СД16- обладал штотоксичностью е присутствии еста, хотя активность его снижалась на 20£ по сравнена с Бп, полученным по кальций-независимому пути.

Далее мы охарактеризовали белки, секретированные по калызЖ

А В

ЦИТОТОКСИЧНОСТИ % ЦИТОТОКСИЧНОСТИ .00 405 щл

ОО 405 nm

во

30

А

il

0.4

cois* r coa*

во

o.i 80

тЬ

й

0.4

0.2

COie* 1 С08«

Рис.1 Цитотоксическая и BLT-эстеразная активность Sn ЛДК-клвток, полученного в отсутствии EGTA (А> И в присутствии EGTA (Б). □ - цитотоксическая активность ■ - BLT-эстеразная активность

-независимому пути и сравнили состав этих белков с белками, секретировачными по кальций-зависимому пути. •

Эп, полученному в присутствии и в отсутствии еста, подвергли стандартному хроматографическому разделению на колонку беле Тоуорваг1 (рис.2). Из анализа балков, полученных по кальций-зависимому механизму видно, что МК-клетки с ЦГЛ-подобным фенотипом (СДЗ+СД8+СД16-). секретируют белки элширующиеся во ФРМ2 при концентрации НаС1 0,09 М. Ранее было установлено, что цитотоксичность ФР N1 связана с присутствием цитотоксических белков с мол. массой 30,40 кД, а цитотоксичность ФР N2 с действием белков с мол. массой 75,38,22 нД

В присутствии ЕСТа полностью ингибируется секреция белков ФР N1 ЛАК-клеток с ЦГЛ - подобным фенотипом (СДЗ+СД8+СД16-), в. тоже самое время ЕйТА вызывает секрекцию белков ФР N2 этих клеток и не оказывает влияния на секрецию белков -ФР N2 й ЛДК-клетках с Ж-подобным фенотипом (СД16+СД8+СДЗ-).

Электрофоретичесзшй анализ втих фракций (рис.3) с последующим электроблоттингом и элпцией белков с мембраны показал, что как клетки с фенотипом СД16+СД8+СДЗ-, так и клетки с фенотипом СДЗ+СД8+СД16- в присутствии ЕСТА секретируют белки с мол.массой 75,35,22 *Ц.

Таким образом ЕСТА не только не припятствует выделению лимфоцитами цитотоксических белков, но и модифицирует состав этих белков.

1. В присутствии ЕСТА ингибируется секреция белков Р30,Р40,Р38 обычно секретируемых по кальций-зависимому пути.

2. Секреция белков Р75 и Р22 для клеток с фенотипом СД16+СД8+СДЗ-не зависит от присутствия ионов кальция, но при связывании кальция стимулируется секреция Р35 - нового белка для этих клеток.

3. Отсутствие ионов кальция стимулирует для клеток с фенотипом СДЗ+СД8+СД1 в- секрецию белков Р75,Р35,Р22, не выделяемых этими клетками в присутствии ионов кальция.

4. В примутствиии ЕСТА исчезает зависимость состава секретируемых белков от фенотипа ЛАК-клеток.

Известно, и было нами показано, что в присутствии еста блокируется экзоцитоз цитолитических гранул, секреция цитотоксических белков, связанная с непрерывной секрецией через аппарат Гольдки или специфический протеолиз белков, ассоциированных с мембраной.

Поскольку цитолитические лимфоциты индуцируют цитолиз при

Рис.2 Анализ фракций супернатаята JIAK-клеток с фенотипы СДЗ*- и ОД 16+ , полученных в отсутствии ЕСТА (А) и в присутствии EGTA (В). Разделение проводили на колонке DEAE Toyopearl 6503 (1x4см), уравновешенной Q,01M трио HCl, pH 8,0 в градиенте концентрации Nací.

- концентрация НаС1

■ * цитотокиснчость фэнотшт 0Д16+ -.-.- цитотоксичность фенотипа СДЗ+

Рис.3 Электрофоре тический анализ Бп ЛАК-клеток, с фенотипом СДЗ+ и СД16+, полученных в присутствии ЕБТЙ. ----- СДЗ+ , - - СД1&*

контакте о КМ и в цитоплазме лимфоцитов обнаружены цитологические гранула, принято считать, что • для ЦГЛ характерна секреция прерывистого типа и взаимодейстьвие с КМ служит сигналом для экзоцитоза белков цитолитических гранул. Однако, не исключено, что ЦГЛ могут осуществлять и неперерывную секреции, так как-морфологические исследования ультраструктуры лимфоцитов свидетельствуют о присутствии активного аппарата Гольджи в цитоплазме цитолитических лимфоцитов.

Для проверки этого предположения мы инкубировали лимфоциты в Оессывороточной среде в присутствии КМ в течение 18 часов и исследовали цитотоксичность и белковый состав полученного Бп. Такие Бп обладали низкой цитолитической активностью, цитотоксичность белков, секретированных - ЛДК-кпетками с фенотипом СДЗ+СД8+СД16-составляла 7*, цитотоксичность белков, секретированных

ЖК-клетками с фенотипом СД16+СД8+СДЗ- - 13%. Однако, после концентрирования и хроматографического разделения на колонке 1)ЕАЕ

Тоуореаг1, С КОЛОНКИ ВЛШрОВЭЛИСЬ ббЛКИ С ВЫСОКОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ

(рис.4). Цитотоксичность белков, секретированных клетками с фенотипом СДЗ+СД8+СД16- предсталена белками ФР N2, елшрущимися при той же ионной силе, что и белки, секретируемые в присутствии КМ и белки ФР N3. Клетки с фенотипом СД16-ЮДВ+СДЗ- секретируют цитотоксические белки, элшрующиеся во ФР 3. Не было обнаружено оелков, элшрувдихся во ФР N1 .

Электрофоретический анализ атих фракций показал, что в состав ФР N2 входят цитотоксические белки с мол.массой 70, 50 , 38 , 22 кД. Белковый состав ФР N3 не зависит от изменения фенотипа ЛАК-клеток, во ФР N3 элширувтся белки с мол.массой 70, 50, 38 и 17 кД (рис.5)'.

Анализируя полученные ' данные можно отметить, что белки секретируюшдеся во ФР N2 практически совпадают с белками, полученными как при секреции в отсутствии стимуляторов, так и при секреции в присутствии КМ, за исключением необходимой модификации, при взаимодействии с КМ не секретируется белок Р50. На основании а тих результатов можно предположить, что белки ФР N2 выделяются по типу непрерывной секреции при участии аппарата Гольдки, тогда как белки, злюирукщиеся во ФР N1 Р40, РЗО, или входят в состав цитолитических гранул, или являются продуктом регулируемого протеолиза белков, ассоциированных с мембраной лимфоцита.

Таким образом для, ЛАК-кпеток возможно осуществление секреции двух типов: непрерывной через аппарат Гольдки и быстрого экзоцитоза

А(280)

0.05

NaCl (М)

пкТ iöö

0.026

50-

g

й о н

Рис.4 Хроматографическое разделение Sn JlAK-клеток, полученного через 18 час. инкубирования с ИЛ-2 в отсутствии КМ, на колонке DEAE Tyopearl 650S (1x4СМ.), уравновешенной 0.01М трис. HCl, pH 8,0 в градиенте концентрации NaCl.

-- А (280нм), —- концентрация NaCl,

----- цитотоксичностьСДЗ* -х-х- цитотоксичность СД16+

761 во' 40) зо! £2Í ; 14 ' ко

Rio. 5 Анализ цнтотоксичаской активности волков ФР № (а) и ФР N3 (ö) so результатам алектрофореза в шшакрал-амидном геле о гоаледуицаг переносом на иммобалон я алпщва».

цитолитических гранул. Исследуя различные пути секреции, мы показали, что:

1. Цитотоксичность ЛАК-клеток в отсутствии экзогенного кальция связана не .только с действием мембраносвязанных белков, но также и с секрецией растворимых цитотоксических белков.

2. JIAK-клетки способны осуществлять как экзощггоз гранул, так секрецию непрерывного типа через аппарат Гольда: .3. Взаимодействие лимфоцитов с КМ оказывает регуляторнсе действие на состав секретируемых белков.

2. РАЗЛИЧНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ БЕЛКОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К КЛЕТКАМ-МИШЕНЯМ. Поскольку один из путей осуществления цитолиза - выделение в зону контакта цитотоксических белков, исследовали как изменяется специфичность по отношению к КМ этих ' секр^ткрованных цитотоксических белков.

Из результатов, приведенных в таблице 1, можно видеть, что NK-резистентная линия клеток L929 является более хорошей КМ, чем NK - чувствительная линия К562 для цитотоксических белков, секретированных как ЛАН-клетками с фенотипом СД16+СД8+СДЗ-, так и лимфоцитами с фенотипом СДЗ+СД8+СД16-. .Через 48 часов цитотоксичность для клеток линии К562 не превышает 7 %, цитотоксичность для линии L929 составляет 25%.

Таблица 1.

фенотип СД16+СД8+СДЗ- фенотип СДЗ+СД8+СД16-КМ ■ '

Sn Sn КОНЦ. Sn Sn конц.

К562 7« 23« 5« 20%

L929 25* 50« 37« 60Х

Концентрирование ■ Sn в 10 раз приводит к увеличен» цитотоксического действия секретированных белков как в отношенгат линии клеток К562, так и L929. Лизис клеток К562 через 46 час. взаимодействия белков о КМ увеличивается на 18%. Скорость цитолиза клеток L929 увеличивается при концентрированном Sn до 50%.

После стандартного, хроматографического разделения на колонке DEAE Тоуореаг 1 Sn ЛАК-клвток, полученных на 5-ые сутк: культивирования с ИЛ-2, можно видеть, что при использовании ь

качестве КМ линии 1-929 (рис.7), цитотоксичностью обладали о елки ФР N1^2,N3, влшрующиеся при концентрации хлористого натрия 0;0,12 и 0,35 соответственно. В отношении клеток К562 активна была только ФР N3 (рис.6). В предыдущих исследованиях было установлено, что цитотоксичность ФР N1 была связана с секрецией белков с мол. массой • 40 и 30 кД, цитотоксичность ФР N2 опосредована белками с мол .массой 70 , 38, 22 кД. Элекхрофоретический анализ ФР N3 позволил

установить, что в состав этой фракции входят цитотоксические белки с мол.массой 70,50,17 цД (рис.8).

Как видно из результатов, приведенных в таблице 2, при концентрировании белков ФР N1 в 20 раз и белков ФР N2 в 10 раз цитотоксическое действие этих белков значительно усиливается. Концентрированные белки способны лизировать клетки линии К562 на 30-508. .

Таким образом цитотоксические белки ФР КЗ обладают большим сродством к линии клеток К562, белки ФР N1 и ФР N2 меньшим, т.к. их цитотоксичность в отношении линии клеток К562 проявляется только

Таблица 2.

КМ ФР N1 ФР N1 конц. ФР N2 ФР Ы2 конц.

В562 ------30« ------50*

1929 30* 70* 45* 60*

при концентрировании.

Как видно из рис.6 при концентрации ЫаС1 о,ЗМ. Элюируются белки, обладающие Ш-Т-эстеразной активностью:

Из результатов, приведенных на рис.9 видно, что с увеличением концентрации белка ФР N4 пряпопропорционально увеличивается скорость гидролиза вьт-эстераз, но цитотоксичность по отношению к КМ не превышает 3-4*. Полученные нами вгг-встеразы не обладают цитотоксическим действием на трансфрыированнные клетки.

Известно, что белки цитолитических гранул перфорин И ыт-эстаразы обладают непрямым цитотоксическим действием, т.е. их роль заключается в модуляции цитолитической активности других белков. На рис.10 приводится цитотоксическая активность неконцентрированного Бп на линию клеток К562. Добавление

A(280 nm) NaCI (M>

Рис.6 Храматографическое разделение Sn ЛАК-клетак, полученных на 5-ые сутки культивирования с ШГ-2, КМ-К562, на колонке deae Tyopeari 650S (1х4см.), уравновешенной 0,1М трис HCl, pH 8,0.

- А (280 нм), --- концентрация NaCl

----- цитотоксичность

A(280nm) NaCI (M)

Рис.7 Хроматографичвсхое разделение Sn JIAK-клвток, полученных на 5-ые сутки культивирования с M-2.KM-I.929, на колонке BEAE Tyopearl 650S (1х4см.), уравновешенной О, 1Ы трио HCl, рЕ 8,0,

--А (280нм), - - - концентрация NaCl,

-•-в- цитотоксичность,- )=== BLT-эстеразная активность.

Рис.8 Анализ цитотоксической активности белков ФР N3

ш результатам электрофореза в ПАДГ с шследущим переносом на иммобилон и алшцией.

- А(А05нм)

Рис. 9 Цитотоксическая и вит-эстеразная активность ФР N4.

-«- цитотоксическая активность, вит-аст.активность -<-

протеаз приводит к увеличению цитотоксичнасти на 20* через 24-48час инкубации с КМ, аналогичному увеличению цитотоксического действия (рис.10) при концентрировании Бп, т.е. виг-эствразы оказывают активирующее влияние на цитотоксичноеть белков, секретирова-ШШ1 ЛАК-клетками,

Нижеприведенные результаты демонстрирует неоднозначность действия Ы_т-встераз на цитотоксичность ' цитолитических фракций Оелков. Цитолиз клеток К562, индуцированный взаимодействием с белками неконцентрироЕаннйо ФР N1, медленно развивается ео времени, в присутствии вът-эстераз цитотоксичность через 48 час. увеличивается на .16* (рис.11), т.е. В1Т-эстеразы активируют процесс с низкой цитотоксичностыо, проявляющейся через 48 час. инкубации белков с КМ.

При исследовании цитотоксического действия, опосредованного белками ФР N2 когда лизис клеток обусловленн суммой дискретных цитолитических процессов, мокно Евдеть, что ВИ-эстеразк изоирательно действуют на процессы, протекающие с различной скоростью (рис.12). Лизис клеток, достигающий максимального значения через 6 час. практически полностью ингибируется в присутствии ВГГ-эстераз. Действие ы_Т-эстераз на процессы, обуслоЕленнне медленно развивающейся цитотоксичностью, также не однозначно : цитотоксичность через 24 час. увеличивается на 9?, а через 48 часов частично ингабируется. На основании приведенных результатов мокно сделать ряд обобщений :

1. Штотоксические белки, секретируемые ЛАК-клетками, отличаются строгой специфичностью по отношению к КМ. Они обладают болев низким сродством к м-чувствительным, чем ык-резистентным км.

2. виг-эстеразы, секретированные ЛАК-клетками, не ооладают прямым иитотоксическим действием на клетки, а участвуют в модуляции процесса цитолиза, опосредованного действием цитотоксических белкоЕ, заключающемся как в активации, так и в ингибированш: цитотоксичности эффекторных белков.

3. ИНГИБЙРОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ ЛАК-КЛЕТОК БЕЛКАМИ ИЗ СЫВОРОТКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА. ,

Из результатов исследований • активности £п ЛАК-клеток было обнаружено, что цитотоксичность £г значительно колеоалась для ЛАК-клеток, полученных от разных доноров, в токе самое время злектрофоретический состав белков показал, чта количство оелка с мол. массой изменялось в различных Би. Причем, высоко?

Ряс. 10 Цитотоксичаская активность 5г< ЛАК-клеток на КМ (К562) в присутствии вцт-астераз из цитологических гранул.

-. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ Эп

---цитотоксичность Бп в присутствии вит.

24

I

¿8

время (час.) Рис. 11. Цитотоксическая активность ФРШ

(КМ— Н582) я_» в отсутствии и

«_. в присутствии ВЬТ—эстераа

^

Л 10

0

1 7 5 0 I

о н о н X 3

70_ 60_ БОЛО.

за гсх ю

2-4

время!

Рис. 12. Влияние ВЬТ—эстераз на цитотоксичность ФР N2 (КМ-К562).

цитотоксичность ФР N2;

цитотоксичность ФР N1 в присутствии ВЬТ- этераз.

цитотоксичности Эп соответствовало малое количество белка и наоборот.

В таблице 3 приведены даннные цитотоксической активности б и и ФР N1 и N2, для характеристики белков, входящих в состав Бп использовали стандартную хроматографию на юеае тоуореага. Из результатов видно, что при значительном различии исходной активности Бп ЛАК-клеток, цитотоксичность фракций N1. и N2 имела сравниемые значения. Часто исходная цитотоксичность Зп падала до нуля, а после разделения появлялась стандартная активность фракций. Различия в исходной активности Бп могут быть связаны с различной концентрацией секретируемых цитотоксических белков у- различных доноров и с присутствием ингибиторных белков, которые могли быть удалены при хроматографическом разделении.

Таблиц'а 3.

Цитотоксическая активность С£ц.)

N эксперимента Супернатант <№N1 ФРМ2

1 0 1.8 0.66

2 62.5 7.2 . 0.54

3 137.5 2.0 0.66

4 50.0 2.2 0.96

5 0 2.2 1.8

Для проверки последнего предположения определили ингибирувдую активность цитотоксического действия йп в каждой фракции, элшрующейся с колонки. На рис. 13 приведены результаты ионообменной хроматографии Зп ЛАК-клеток и ингибирувдей активности фракций. Из приведенных результатов видно, что наибольшей ингабирующей активностю обладают белки, элшрувдиеся при ионной силе 0.19 М ЫаС1 Электрофоретический анализ этой фракции показал присутствие белка с мол.массой 67 кД. Дальнейшая очистка этой фракции позволила получить белок в гомогенном состоянии. Мы исследовали ингабируддую активность полученного белка цитотоксичности Бп (рис.14), из приведенных даннных видно, что этот белков ингибирует цитотоксичность ЙП по отношению к КМ 1929.

В ИБХ РАН была определена М-концевая последовательность этого Оелка.Сравнение этой последователности с банком данных первичных структур показало его идентичность с сывороточным белком фетутггж -гликопротеином с мол.массой 67 кД, который в большом количестве со-

А 280 пш 0.05

N301 (М)

оЖ

0.02Е

100

60

90 (гл!)

Рис. 13 Результаты шноойменной хроматографии 5п ЛДК-клеток и ингибирунщая активность фракций, получанных с колонки.

А ( 280 нм )

- концентрация ЯаИ

-I- ингибирущая активность фракций

к

о §

га и

о &

<5

Рио.14 Сравнение инпюирухщэй активности коммерческого фзтуина(2) в балка о мол.массой 67 (1 .

даркится в фатальной сыворотке крупного рогатого скота. Для сравнения исследовали способность коммерческого фетуина ингибировать цитотоксическую активность. Оказалось, что этот белок обладает ингибирухщей активностью и в тех же концентрациях что и выделенный нами белок из Sn ЛАК-клеток (рис.14).

Таким образом, нами был выделен белок из Sn ЛАК-клеток, ингибирущий цитотоксичность и была установлена структурная и функциональная аналогия между этим белком и фетуином из сыворотки крупного рогатого скота. Можно предположить, что различным содержанием фетуша в супернатантах можно объяснить расхождения в исходной цитотоксической активности в различных экспериментах. Условия культивирования ЛАК-клеток исключает загрязнение ' Sn фетуином, т.к. клетки многократно отмываются средой не содержащей сыворотки. С целью определения источника фетуина в Sn ЛАК-клеток нами были' получены антитетла к коммерческому фетуину. С помощью иммуноферментного анализа было показано, что a/t связываются с мембраной ЛАК-клеток. Возможны два объяснения этого являения. С одной стороны это может быть неспецифическое связывание за счет гидрофобного взаимодейсьтвия и достаточно прочное, потому мы не можем полность отделиться от него путем многократного отмывания ЛАК-клеток и в процессе стимуляции фетуин продолжает десорбироваться с мембран лимфоцитов..С другой стороны возможно, на поверхности ЛАК-клеток имеется' рецептор, обеспечивающий прочное связывание этого белка с мембраной. Если это предположение верно,то аналоги этого белка должны встречаться не только в сыворотке крупного рогатого скота, но и сыворотке других видов животных.

В ИБХ РАН был выделен белок из сыворотки человека по ряду свойсте аналогичный альбумину, но имеющий небольшие отличия в первичной структуре. Исследуя ингибирущую активность, мы установили что ингибирушцая. активность альбумина из сыворотки человека проявляется в тех же концентрациях, что л фетуин . Это позволяет считать этот белок модулятором цитотоксичности.

Из результатов, приведенных выше можно сделать вывод, что в сыворотке крупного рогатого скота и человека присутствует белок с одинаковой мол. массой 67 кД, но различной первичной структурой, одинаковой способностью ингибировать как цитотоксичность белков, секретированных ЛАК-клетками, так и гомогенного препарата TNF. Эти данные позволили нам предположить, что роль этих белков in vivo заключается в поддержании определенного уровняактивности цитотокси-ческих клеток

вывода.

1. Установлено, что цитолитическое действие ЛАК-клеток в отсутствии экзогенного кальция связано, не . только с действием мембраносвязанных белков, so также и с секрецией растворимых цитотоксичкских белков.

2. Охарактеризованы белки, секретированные по кальций-независимому механизму, определена молекулярная масса этих белков, показано, что взаимодействие ЛАК-клеток с клетками-мишенями модифицирует состав-секретируемых белков.

3. Уствановлена способность ЛАК-клеток осуществлять секрецию непрерывного типа через аппарат Гольджи.

4. Исследована роль гранулярных BLT-эстераз в процессе цитолиза.Показано, что ВГГ-эстеразы не обладают прямым цитотоксическим действием, а участвуют в модуляции цитотоксического дествия ЛАК-клеток.

5. Показано, что основной белок сыворотки крупного рогатого скота -фетуин обладает инпгбируадим действием на цитотоксическую активность ЛАК-клеток.

По материалам диссертации опубликованы следутяцте работы:

1. С-ащенко Л.П.,Гнучев Н.В..Лукьянова Т.И..Кабанова О.Д.,Редченко И.В., Влищенко У.Ю., Сатпаев Д.К., Хайдуков С.И.,Чертов О.Ю., Лука-нидин Е.М.- Влияние Ш-2 на щтоштичвскую активность,экспрессии поверхностиных маркеров и секрецию цитотоксических белков ЛАК-кле— ток - Эксперим.онкология, 1992,т.14, с. 54-58.

2. Sashchenko L.P.,Gnuchev N.V..Redchenko I.Yu.,Kabanova O.D.,Lurj-ianova Т. I. , B1 ishchenko L.Yu.,Satpasv D.K.,Chertov O.Yu.-Contribution of membrane-associated cytotoxic to cytolysis of L929 and K562 target cells mediated by LAK cells with different phenotypes т Im.Letters, 1994,v.39, p.243-247.

3.Satpaev D.K.,Blishchenko L.Yu, ,Chsrtov O.Yu., Sashchenko

L.P..Lukjianova Т.I..Kabanova O.D.,Gnuchev N.V.,- Novel cytotoxic proteins isolation from human LAK cells - 9-ЫЙ РОССИСКО-ГершНСКИЙ симпозиум по химии белков и пептидов,Пущино,июль 1994.

4. Гнучев Н.В.,Сащенко Л.П.,Лукьянова- Т.И:.Кабанова О.Д..Влищенко Е.Ю. .Сатпаев Д.К.,Чертов О.Ю.-Характеристика цитотоксических белков,секретируемых киллерами из селезенки голых мышей -ДАН РАН, 1994, т.338, N5. стр.236-239.

5. Blishchenko L.Yu.,Ermolaeve U.Y.,Satpaev D.K.,Chertov O.Yu.,Sashchenko L.P., Kabanova O.D.,Lukjianova T.I.,Gnuchev N.V.-Inhibitor! effekt of kalf fetuin on cytotoxic activiti of LAK cells derived factor and tumor nekrosis factoi—In.Letters, 1994,v.42,p.97