Характеристика нового ЦИС - элемента регуляции транскрипции генов млекопитающих вида (GCC)4

Орлов, Сергей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика нового ЦИС - элемента регуляции транскрипции генов млекопитающих вида (GCC)4
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика нового ЦИС - элемента регуляции транскрипции генов млекопитающих вида (GCC)4"

Па прааах рукописи

ОРЛОВ Сергей Владимирович

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО ЦИС-ЭЛЕМЕНТА РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ВИДА (ССС)4

Специальность 03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт— Петербург 1999

Работа выполнена в отделе биохимии Научно—исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор — академик РАМН Б. И. Ткаченко).

Научный руководитель:

доктор биологических наук А. П. Перевозчиков.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. А. Поспелов, доктор биологических наук Л. В. Пучкова

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится "......"....................... 1999 г. в ...... часов на

заседании Диссертационного совета К 001.23.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Научно—исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться и научной библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

Автореферат разослан "....."........................... 1999 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета К 001.23.01,

доктор биологических наук О. Г. Куликова

т, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Регуляция экспрессии генов эухариот и значительной мере осуществляется на стадии транскрипции, затратили отдельные гены, группы или множества генои, обусловливающих жизнедеятельность клеток на разных стадиях клеточного цикла, в процессах клеточной дифферсиецировки, морфогенеза и физиологической активности организма. Согласно современным представлениям, наиболее значимым уровнем регуляции транскрипции генои является инициация транскрипции.

Основными механизмами регуляции инициации транскрипции являются взаимодействия факторов белковой природы (транскрипционных факторов) со специфическими последовательностями ДНК (цис— элементами) в составе регуляторных районов генов (Mitchell and Tjian, 1989), изменение степени метилирования ДНК, и особенности промоторных областей (Bird, 1991), а также изменения структуры хроматина, связанные с модификациями гистонов (Steger and Workman, 1998). Детальный анализ модульной структуры регуляторных районов эукариотических генои является лидирующим направлением в изучении механизмов регуляции генной экспрессии. Работа в этом направлении, в значительной степени, сводится к выявлению цис—элементов, взаимодействующих с отдельными белками — факторами регуляции транскрипции, характеристике этих факторов, клонированию и изучению кодирующих эти факторы генов (Mitchell and Tjian, 1989). Описаны сотни факторов регуляции транскрипции (Вингендер, 1997), интенсивно ведутся поиски новых. Значительное внимание уделяется ДНК—белковым и белок-белковым взаимодействиям соответственно между цис—элементами в составе промоторов, энхансеров и транскрипционными факторами или между совместно связывающимися с ДНК факторами транскрипции (Carey, 1998). Исследования в этой области привели к возникновению представлений об иерархичной организации цис—элементов в регуляторных районах генов эукариот. Близко расположенные сайты связывания транскрипционных факторов объединены в композитные цис—элементы, которые, в свою очередь, формируют энхансерные или промоторные области (Kel, 1995, 1997). В этой связи, весьма актуальным представляется поиск и описание новых цис—элементов эукариот, изучение транскрипционных факторов,

взаимодействующих с ними, а также выяснение их возможного вклада в

-----функционирование композитных цис—элементов в составе рс1улягорных

областей генов, транскрибируемых РНК—полимеразои II.

Существенный прогресс в разработке алгоритмов компьтерного аналn:ia последовательностей ДНК. и накопление значительного объема известных нуклеотидных последовательностей в базах данных Genbank и EMBL data base привели к появлению новых методов поиска и изучения регуляторных районов генов и входящих в их состав цис—элементои па основе статистического анализа нуклеотидных последовательностей (Prcstridgc, 1995, 1996). Активность выявленных таким образом потенциальных цис— элементов необходимо подтверждать экспериментальными методами.

В результате компьютерного анализа банков генов приматов, грызунов и вирусов (EM13L dala base, 1993, 1997) в регуляторных областях ряда генов млекопитающих и вирусов семейства Hcrpesviridae обнаружены триплетные повторы (С}СС)п, где п—3—30, что позволило рассматривать последовательности (GCC)3 как потенциальные цис—элементы (GCC-элеменгы), способные взаимодействовать с ядерными белками млекопитающих и модулировать транскрипцию генов—мишеней.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение триплетных повторов (GCC)n (д>3) как цис—элементов регуляции транскрипции, а также исследование ядерных белков человека и мыши, способных специфично взаимодействовать с последовательностями (GCC)J 4- В качестве объекта экспериментальных исследований GCC— элемента был выбран промотор гена рибосомного белка мыши L32 (rpL32), содержащий последовательность GC(GCC)4 вблизи точки инициации транскрипции (—19...—4). Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи: 1. Показать способность потенциального GCC—элемента промотора гена rpL32 связываться с ядерными белками мыши и человека и изучить роль контекстных последовательностей при этих взаимодействиях. Проанализировать белок—связывающие свойства GCC—элемента в сравнении с уже известными GC—богатыми цис—элементами для факторов транскрипции семейств Egr/Wtl и Spl.

2. Выявить функциональную активность ССС—элемента и регуляции транскрипции и зависимости от его локачизации относительно других регуляторных участков.

3. Охарактеризовать ядерные белки, взаимодействующие с областью промотора гена гр!_32 (—24...+ 11). Изучить их распределение в тканях млекопитающих.

Основные положения, пыносимые на защиту

1. В промоторе гена рибосомного белка мыши Ь32 идентифицирован и охарактеризован цне—элемент вида (ССС)А (—19...—4), взаимодействующий с ядерными белками клеток млекопитающих и являющийся функционально активным и регуляции транскрипции.

2. Промотор гена грЬ32 содержат композитный цис—элемент и области —24...+11 н. п. относительно точки инициации транскрипции, состоящий из вСС—элемента и полипиримидиноиого блока.

3. Охарактеризованы ядерные белки млекопитающих, взаимодействующие с композитным цне—элементом промотора грЬ32. Полученные данные свидетельствуют, что по меньше!! мере, некоторые из них (ССОВР—20), являются факторами транскрипции, специфически взаимодействующими с ■ вСС—элементом, и модулирующими транскрипцию с промоторов, содержащих этот элемент.

Научная новизна работы

Впервые показана функциональная активность последовательностей (ОСС)14 как нас—элементов рефляции транскрипции в клетках млекопитающих. В промоторе гена мыши грЬ32 охарактеризован композитный цис—элемент синершчного типа, состоящий из ССС— элемента и нолипиримидиновой последовательности. Полученные результаты указывают на существование в клетках млекопитающих, по меньшей мере, нескольких белков (СССВР—20 и др.), которые специфически взаимодействуют с триплетными повторами (ССС)п и модулируют активность промоторов, содержащих эти триплетные повторы. Изучено тканесиецифическое распределение белков, взаимодействунлцих с композитным цис—элементом промотора грЬ32.

Теоретическое и практическое значение работы _____

Изучение ДНК—белковых взаимодействий мевду ядерными белками млекопитающих и промотором гена rpL32 позволило описать новые ОС-богатый и полипиримидиновый элементы регуляции транскрипции, образующие в промоторе гена rpL32 композитный цис-улеменг вблизи точки инициации транскрипции. Показана зависимость транскрипционных эффектов, опосредуемых GCC—элементом, от его локализации относительно других регуляторных последовательностей. Полученные данные являются существенным вкладом в представления о роли кооперативных белок-белковых взаимодействий между транскрипционными факторами, связывающимися с близко расположенными регуляторными последовательностями, в формировании интегрального транскрипционного ответа. Локализация GCC—элемента в регуляторных районах ряда генов человека указывает на возможное участие белков, взаимодействующих с GCC—элементом, в координированной регуляции экспрессии этих генов.

Для выделения исследуемых ДНК,—белковых комплексов предложен метод, основанный на последовательном применении аффинной хроматографии на ДНК—сорбенте и препаративной гель-ретардации. Данный подход является оригинальным и может быть рекомендован для выделения других ДНК— связывающих белкой.

Материалы диссертации используются в курсах лекций для магистрантов биолого—почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: IXth Intern. Congress of Virology, Glasgow Scotland, 8—13 august 1993; 2-й Симпозиум "Липопротеидм и атеросклероз", Санкт-Петербург, 1995; 4-я Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 21-26 мая, Санкт-Петербург: 1996; 5-я Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 25 -30 мая, Санкт-Петербург, 1997; 8th European Students Conference of the Chante (for students and young doctors), October 15th - 18th, Berlin, Germany, 1997; 6-я Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 18 — 22 мая, Санкт-Петербург, 1998; Human Genome Meeting, 27-30 March 1999, Brisbane, Australia.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методой исследования, результатов, обсуждения результатон, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена па 98 стр. машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 6 таблицами. Список литературы содержит 232 библиографических источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Мыши-гибриды СВЛ/С57Ш получены из питомника "Раниолово", РАМП, СПб; абортивный материал плода человека (4—5 недель) — ТМО №1 г. Санкт-Петербурга; перевивные линии клеток: мышиные фибробласты (N111 ЗТЗ), фибробласты легкого человека (диплоидные культивируемые клетки человека), человеческие клетки HeLa — из Института гриппа МЗ России и Института цитологии (ИНЦ) РАН, СПб; клетки гепатомы человека (HepG2) — получены из Американской коллекции клеточных культур (АТСС), Национальные институты здоровья, NIH). В работе использованы бактериальные клеточные линии: Escherichia coli, К12, штаммы: НВ101, JM103, XLl-bluc. Клонированный ген белка L32 большой субъединицы рибосом мыши (ipL32) получен от Н. В. Томилина (ИНЦ РАН, СПб); экспрессионный вектор гена Egrl предоставлен J. Miibrandt (Washington University, St. Louis, США; Плазмида, содержащая открытую рамку считывания, кодирующую белок CCGBP—20 (EST клон ID269133), получена от I.M.A.G.E. Consorcium через фирму Research Genetics. В экспериментах использованы плазмиды (Pharmacia), содержащие промотор ранних генов цитомегало вируса человека (CMV), минимальный промотор гена тимидинклшазы (TIC) вируса простого герпеса 1-го типа (HSV1), бактериальные гены cat, lacZ. Синтетические олигонуклеотиды, использованные а работе, были приготовлены В. В. Константиновым (Институт особо чистых биопрепаратов, СПб), В. М. Башковым (ИНД РАН, СПб) или получены от DNA Agency, Inc. и от Life Technologies, Inc. (G1BCO). В работе использовали реактивы, реагенты, препараты ферментов производства фирм: Sigma, Serva, Boehriiiger Mannheim, Pharmacia, Fluka, Flow, CalBiochem, Биопол, Сибэнзим и др.; пластик, расходный материал — фирм: Flow, Costar, Nunc, Sarstedt, Пластполимер; эмбриональная сыворотка теленка, среды — фирм: Flow, Life Technologies, Inc. (GIBCO);

радиоактивные изотопы: дезоксинуклеозидтрнфосфаты, меченые по а —положению или у-положеншо |32Р|, - получены от В/О "Изотоп", СПб; ["Cl-хлорамфепикол — получен от фирмы Amersham.

Все генно-инженерные манипуляции проводили но стандартным протоколам. Ядерные экстракты из культивируемых клеток приготавливали как описано (Andrews and Faller, 1991). Ядерные экстракты из тканей мыши и эмбрионов человека получали согласно (Roy et al., 1991). В ряде случаев проводили дополнительное концентрирование белков на сухом сефздексе G10 или ультрафидьтрацией на картриджах фирмы Bio—Rad (Minicent—10 filters) с использованием центрифугирования. Концентрацию белков в ядерных экстрактах определяли по методу Брсдфорд.

В экспериментах по гель—ретардации использовали синтетические диуцепочечные олигокуклеотидные копии цис—элементов GCC, Egr, Sp, API, полипиримидикового элемента промотора гена rpL32 (—4...+11), а также фрагменты промотора гена rpL32 (—48...+91) и (—24...+11). Олигонуклеотиды метили [ot32P]dCTP или [anP]dGTP посредством фрагмента Кленоиа ДНК—полимеразы 1, а также [у12Р|АТР посредством полинуклеотидкиназы фага Т4. Фрагмент промотора rpL32 (—48...+91) метили в реакции замещакнцего синтеза с помощью ДНК-полимеразы фага Т4. Ретардацию выполняли как описано (Schreiber et al, 1989). Реакцию связывания проводили в буфере, содержащем 100 мМ NaCl; 10% глицерин; 10,5 мМ HEPES, рН7,9; 0,8 мМ Na2EDTA; 0,15 мМ Na2EGTA; 0,8 мМ DTT; 0,15 мМ PMSF; 6 мМ MgCl,; 0,15 мг/мл ДНК спермы лосося; 8000 — 50000 имп/мин меченого олигонуклеотида или фрагмента (2 — 5 нг); 4—10 мкг ядерных белков. В экспериментах по конкуренции добавляли указанные количества немеченных олигонуклеотидов. Связывание вели 20 мин при комнатной температуре, пробы разделяли электрофорезом в 5% неденатурирующем полиакриламидном геле при 160—200V в течение 3—5 час. Гель, приготовленный на трис—борагном буфере, фиксировали в 10% этаноле + 10% уксусной кислоте, высушивали и радиоавтографировали.

Лигандный блоттинг (Southwestern assay) проводили как описано (Zerler et al, 1992). Белки ядерных экстрактов (100 мкг) разделяли электрофорезом в 10% полиакриламидном денатурирующем геле, ренатурировали вымачиванием в буфере для ренатурацик в течение двух часов и

электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio— Rad). Мембрану инкубировали 3 час в Southwestern буфере при комнатной температуре. Реакцию связывания проводили в 3 мл Southwestern буфера с (0,5 — 2)*10'' имп/мин меченого одигопуклеотида в течение 3 — б час при комнатной температуре. Отмывку мембраны проводили 4 раза по 30 мин в Southwestern буфере и 1 раз а буфере для отмывки в течение 30 мин. Мембрану высушивали и радиоавтографиро1шш. Буфер для ренатурации имел сосгав: 60 мМ NaCl; 10 мМ HEPES, рН 7,9; 20 мМ Na.EDTA; 0,1 мМ DDT; 0,3% тритон X—100. Southwestern буфер имел состав: 5% обезжиренное сухое молоко, 60 мМ NaCl; 10 мМ HEPES, рН 7,9; I мМ Na2EDTA. Буфер для отмывки имел состав: 100 мМ NaCl; 10 мМ HEPES, рН 7,9; 1 мМ Na;EDTA.

Выделение белков, взаимодействующих с фрагментом промотора гена rpL32 (—24...+11), проводили методом аффинной хроматографии. В качестве лиганда использовали иммобилизованный на целлюлозе указанный фрагмент промотора гена rpL32. Олигонуклеогидную копию используемого участка промотора (20 и моль) фосфорилировали полинуклеотидкиназой фага Т4 и подвергали полимеризации в реакции лигирования. Процесс полимеризации контролировали электрофорезом и агарозном геле, добиваясь образования фрагментов 100—30 н. п., состоящих из 3—4 мономеров исходного олнгонуклеотида. Присоединение получепных лигандов к целлюлозе проводили методом конденсации под воздействием водорастворимого карбодиимида (1—этил—3—(3—диметиламинопропил)— карбодилмид). Аффинную хроматографию проводили как описано (Briggs et al., 1986). Связавшиеся с сорбентом белки элюировали буфером, содержащем 2М NaCl. Собранные фракции концентрировали в 30 — 100 раз ультрафильтрацией с использованием картриджей фирмы Bio—Rad (предел пропускания 10 кД). ДНК—связывающую активность в собранных фракциях тестировали на нитроцеллюлозной мембране методом дот—анализа с использованием в качестве зонда радиоактивно меченого фрагмента промотора rpL32 (—24...+11). Фракции, содержащие ДНК—связывающую активность, использовали для препаративной гель—ретардации. Разделение сформированных ДНК—белковых комплексов проводили с помощью прибора для препаративного гель—электрофореза, предоставленного

Калиновским В. Г1. (НИИ онкологии iim. H. П. Петрова, МЗ России, СПб).---

Разделение проводили в 5% неденатурирующем полиакриламидном геле, фракции объемом по 2 мл собирали по мере выхода компонентов из гелевой колонки в перпендикулярно направленный поток буфера (скорость потока буфера 12 мл/час). Наличие во фракциях ДНК—белковых комплексов определяли измерением их радиоактивности на жидкостном сцинтилля— ционном счетчике ß—излучения. Фракции, содержащие исследуемые ДНК— связывающие белки, анализировались методами гель—ретардации, дот-анализа и SDS—электрофореза.

Культивирование эукариотических клеток проводили на среде DM ЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Временную трансфекцию клеток препаратами плазмидной ДНК выполняли методом кальций—фосфатной преципитации. CAT—тест проводили с использованием меченого 114С)— хлорамфеникола, разделяя продукты ацетилирования методом тонкослойной хроматографии с последующим выявлением радиоактивных зон авторадиографией. Зоны, соответствующие хлорамфениколу и его ацетилированным пробам, вырезались и их радиоактивность измерялась на жидкостном сцинтилляторном счетчике.

Тотальную РНК выделяли обработкой клеток гуанидинизотиоцианатом с последующей депротеинизацией экстракциями смесью фенол:хлороформ. Примесь хромосомной ДНК удаляли обработкой препаратов РНК ДНКазой 1 (Boehringer Mannheim, RNase free).

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора "SuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis" фирмы Life Technologies Inc. (G1BCO) согласно инструкции фирмы—производителя. В качестве затравки синтеза кДНК использовали специфичный праймер, применяемый впоследствии для амплификации ДНК методом PCR.

Праймеры для PCR подбирали с помощью программы PRIMER, разработанной Прутским В. и Сокуром О. (Институт гриппа, МЗ России, СПб).

Открытую рамку считывания гена ccgbp—20 амплифицировали с использованием праймеров 5' TCAGAATGGAGCGATTTG 3' и 5' GGTAACCTCCTAGTCAAC 3'. PCR проводили с помощью термостабильной ДНК—полимеразы Taq (для выявления специфической мРНК гена ccgbp—20

методом RT—PCR) или с использованием термостнбильпой иолимеразы Pwo, обладающей 3'—5' экзонуклеазной (корректорской) активностью (для амплификации франгмента гена ccgbp—20 с целью его последующего суб клонирования).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЩДОВАНИЯ Область промотора гена rpL32 (—24...+11) содержит композитный цис—элемент, состоящий из GCC—элемента (—19...—4) и полипиримидинопого блока (—4...+11), ткансслецифичсски взаимодействующий с ядерными белками человека и мыши.

Белок-связывающие свойства GCC—элемента промотора гена rpL32 и фланкирующих его последовательностей изучали методом гель—ретардации с использованием радиоактивно меченой синтетической копии фрагмента промотора гена rpL32 (—24...+ 11): 5'

CITGCGCGCCGCCGCCGCCTCTTCCTTCTl'CCTCG 3' (GCC-злемент подчёркнут) и ядерных белков клеток млекопитающих. На рис. 1 представлены результаты ДНК—белковых взаимодействий указанного фрагмента промотора rpL32 с ядерными белками клеток HepG2 (гепатомные клетки человека). Специфичность ДНК—белковых комплексов была продемонстрирована и экспериментах по конкуренции с немеченым гомологом (рис. 1а). Немеченые олигонуклеогдцные копии исследуемого GCC—блока — (GCC),— также в значительной мере вытесняли меченый фрагмент промотора rpL32 из ДНК—белковых комплексов (рис., 16). Более слабое истощение полос задержки избытками олигонуклеотидной копии GCC—элемента по сравнению с фрагментом промотора rpL32 (—24...+11) может объясняться участием фланкирующих GCC—элемент последовательностей во взаимодействиях с GCC—фактором, или существованием дополнительных белков, входящих в состав исследуемых ДНК—белковых комплексов и связывающих полипиримидиновую область (—4...+11) промотора гена rpL32. Роль полипиримидинового блока в формировании исследуемых ДНК-белковых комплексов изучали методом конкурентного истощения ДНК—белковых комплексов в экспериментах по гель-ретардации с использованием молярных избытков олигонуклеотидной копии полипиримидинового элемента (5' TCTTCCTTCTTCCTCG 3').

--£» &----------.----------------

»>»1.» (НИ), ,,>1>г ( -.з...

где, 6К, 1*1? Ъ<и1 и 1 I к: 1 I к1Л

'•Зас ^ - >

* яс. з ■<* з

Рис. 1. ДНК-белковые взаимодействия ядерных белков клеток НерС2 с фрагментом промотора грЬ32 (-24...+11): а- 1- без добавления белков; 2- без конкуренции; 3-5- конкуренция с молярными избытками фрагмента промотора грЬ32 (-24...+11); О- 1- без добавления белков; 5- без конкуренции; 2-4- конкуренция с 6СС-элеыенгоы; 6-8- конкуренция с полипиримидиновым элементом. К-специфичные ДНК-белковые комплексы; НС- не связавшаяся ДНК. Цифрами над дорожками обозначены молярные избытки конкурентов.

Полиниримидиновый элемент вытеснил фрагмент промотора гена гр1.32 (—24...+11) из ДНК—белковых комплексов (рис. 16). Эффективность конкуренции полипиримидинового участка с фрагментом промотора (—24...+11) за связывание с ядерными белками клеток НерС2 оказалась сравнимой с конкуренцией, обусловленной вСС—элементом (рис. 1). Следовательно, обе субпоследователькости, входящие в состав фрагмента промотора гена грЬ32 (—24...+11), — ОСС—элемент и полипиримидиновый блок — вносят вклад во взаимодействия с ядерными белками человека, , причем аффинность каждой из составляющих ниже аффинности целого фрагмента. Подобные ДНК—белковые взаимодействия характерны для композитных цис—элементов синергичного типа (Кель и др., 1997). Белок— связывающие свойства полипиримидиновой последовательности и ОСС— элемента промотора гена грЬ32 подтверждены в экспериментах по гель-ретардации с использованием в качестве зондов олигонуклеотндных копий указанных элементов.

Рис. 2. Взаимодействие фрагмента промотора гена гр1,32 (-24...+11) с ядерными белками: а- белки клеток НеЬа: 1- без инкубации с ядерными белками; 2, 5- без добавления конкурента; 3, 4~ конкуренция с молярными избытками немеченого фрагмента промотора гена грЬ32 (-24...+11); 6-8- конкуренция с молярными избытками олигонуклеотидной копии ССС-элемента (вСС) ; б- белки фибробластоп легкого человека: 1- без инкубации с ядерными бедками; 2, 9- без добавления конкурента; -3 - 8— конкуренция с молярными избытками олигонуклеотидной копии ССС-элемента (вСС)( (по 2 дорожки); в- белки клеток соединительной ткани эмбрионов человека: 1— без инкубации с ядерными белками; 5- без добавления конкурента; 4 - 2- конкуренция, соответственно, с молярными избытками фрагмента промотора гена грЬ32 (-24...+11); 6 - 8 - конкуренция с молярными

избытками 5СС-элемента (ССС)(. К- специфичные ДНК-белковые комплексы, НС- не связавшаяся ДНК. Цифрами над дорожками обозначены молярные избытки конкурентов.

На рис. 2 представлены результаты экспериментов по связыванию фрагмента промотора грЬ32 (—24...+11) с ядерными белками клеток НеЬч (рис. 2а), человеческих фибробластов (рис. 26) и ядерными белками, выделенными из эмбрионов человека (4 — 5 недель) (рис. 2в). Различие в числе и подвижноетях выявляемых методом гель—ретардации полос задержки указывает на определенную тканеспецифичность ядерных белков, образующих соответствующие ДНК—белковые комплексы. Эксперименты по гель—ретардации, проведенные с ядерными белками из тканей мыши, вы—

вили _тканеспецифичный характер распределения исследуемых белков. Добавление в реакцию связывания избытка немеченой олигонуклеотидной копии собственно ОСС—элемента вело к истощению полос задержки, образуемых фрагментом промотора грЬ32, в экспериментах с ядерными белками фибробластов легкою человека (рис. 26), клеток Нер02 (рис. 16) и человеческих эмбрионов (рис. 2в), но не влияло на взаимодействие с ядерными белками клеток НеЬа (рис. 2а). Неспособность олигонуклеотидной копии вСС—элемента конкурировать с фрагментом промотора грЬ32 за связывание с ядерными белками клеток НеЬа может объясняться либо отсутствием белка, взаимодействующего с ОСО элементом (ОСС—фактора), в клетках НеЬа, либо существованием другого (других) белка(ов), препятствующих взаимодействию ОСС—фактора с исследуемым участком промотора. Против первой возможности свидетельствуют результаты экспериментов по гель—ретардации с меченой олигонуклеотидной копией ОСС—элемента и ядерными белками клеток НеЬа, выявившие образование специфичного, быстро мигрирующего ДНК-белкового комплекса. Присугетвие ОСС- фактора в клетках ПеЬа подтверждено также методом лигацдного блотгинга (см. ниже). Следовательно, ядерные белки клеток НеЬа, взаимодействующие с ОСС-элсментом, не входят в состав ДНК—белкового комплекса, формирующегося на промоторе гена грЬ32, в отличие от ядерных белков фибробластов и клеток Нер02,

Последовательность ОСС—элемента высоко гомологична (р азличие в одной нуклеотидной паре) хорошо изученным цис—элементам, взаимодействующим с факторами транскрипции семейства Egr и йр!. Проведенное нами сравнение свойств ОСС—элемента с цис—элементами факторов транскрипции семейств Egr/Wtl и ЭрI показало существование незначительного одностороннего перекрывания специфичности между ОСС—фактором и факторами семейства Egri и отсутствие перекрывания с факторами семейства Эр!.

Взаимодействие фрагмента промотора гр132 (—24...+II) с ядерными белками фибробластов зависит от ионов 7.п:'

Известно, что многие ОС—богатые цис—элементы взаимодействуют с транскрипционными факторами, содержащими цинк—фингерные ДНК—

123 45 12 3-46

Рис. 3. Зависимость образовании ДНК-белковых комплексов о® ионов йп2*: а- связывание ядерных белков фибробластов легкого человека с фрагментом промотора грЬ32 (-24...+11): 1- без добавления ядерных белков; 2- без добавления о-фенантролина; 3— с добавлением о-фенантролина до концентрации 5 мМ; 4- с добавлением 5 мМ гпС12 и 5 мМ о-фенантролина; 5- с добавлением 5 мМ ЕСТА; б- связывание ядерных белков клеток НеЬа с полипиримидиновым элементом; 1- без добавления ядерных белков; 2- без добавления о-фенантролина; 3- с добавлением о -фенантролина до концентрации Ь мМ ; 4- с добавлением 5 мМ 2пС12 и 5 мМ о-фенантролина; 5- с добавлением 5 мМ ЕйТА. Хелатиругацие агенты добавляли в реакционную смесь непосредственно перед внесением радиоактивно меченой ДНК. В пробы 4 после 20 мин инкубации добавляли гпС12 и дополнительно инкубировали 15 мин. К- специфические ДНК-белковые комплексы, К'- неспецифичные ДНК-белковые комплексы; НС- не связавшаяся ДНК.

связывающие домены. На рис. За представлены данные экспериментов по связыванию фрагмента промотора гена грЬ32 (—24...+11) с ядерными белками фибробластов легкого человека в присутствии о—фенантролина, специфически удаляющего ионы 7л1!> из металлопротеинов. Присутствие о—фенантролина и реакционной среде угнетало ДНК—белковые взаимодействия. Добавление в реакционную смесь Zn2+ частично восстанавливало образование соответствующих комплексов. Введение в

------реакционную среду другого агента, связывающего двувалентные катионы

—ЕйТА, приводило к значительно меньшему угнетению снизывания, что согласуется с меньшей способностью ЕО'ГА хелатировать Хп21. Полученные данные свидетельствуют, что в образовании исследуемых комплексов участвуют гп"—зависимые (предположительно цинк—фингерные) белки. Аналогичные результаты получены в экспериментах с ядерными белками клеток НеЬа и НерС2.

Введение о—фенантролина в реакцию связывания ядерных белков клеток Не1л с полипиримидиновым элементом также угнетало образование ДНК-белковых комплексов (рис. 36). Следовательно, ДНК—связывающие свойства белков, взаимодействующих с полипиримидиновым блоком промотора гена грЬ32, зависят от ионов цинка. Нельзя также исключить возможную цинк—фингерную природу в СС—фактора.

В состав ДНК—белкового комплекса, образуемого фрагментом промотора грЬ32 (—24...+11), входит несколько белков.

Белки, способные взаимодействовать с исследуемой областью промотора грЬ32, изучали методом лигандного блоттинга (рис. 4). Фрагмент промотора грЬ32 (—24...+11) взаимодействует с тремя полипептидами из ядерных экстрактов клеток НеЬа (молекулярные массы соответственно ~18, 28 и 50 кД); в тех же условиях ССС~элемент связывается только"'с одним нолипептидом молекулярной массой 18—20 кД (рис. 4а,б). Эффективность взаимодействия оценивали по интенсивности соответствующих полос, выявляемых на автографе. Более низкое сродство ядерного белка молекулярной массой 18—20 кД к вСС—элементу по сравнению с фрагментом промотора гена гр£32 (—24...+ 11) указывает на вклад фланкирующих ОСС— элемент последовательностей и ДНК—белковые взаимодействия между вСС—фактором и ОСС—элементом. Аналогичные эксперименты, проведенные с использованием ядерных белков фибробластов легкого человека, показали, что при тех же условиях эксперимента только один полипептид молекулярной массой 28 — 31 кД взаимодействует с фрагментом промотора грЬ32 (—24...+11) (рис. 4в). Эксперименты по лигандному блоттингу, проведенные с ядерными белками фибробластов человека и олигонуклеотидной копией ОСС—элемента, дали отрицательные результаты, несмотря.на присутствие ОСС—фактора в исследуемых клетках (см, выше). Вместе с тем, нельзя исключить участие именно ОСС—элемента во

Рис. 4. Лигандный блоттинг ядерных белков с фрагментом промотора гр!32 (-24...+11) и GCC-элементом: а- связывание с фрагментом промотора гена rpL32: 1, 2- ядерные белки клеток HeLa (по 150 мкг на дорожку); б- связывание с олигонуклеотидной копией GCC-элемента: 1, 2- ядерные белки клеток HeLa (по 150 мкг на дорожку), 3- белки экстракта клеток Е. coli (200 мкг) (отрицательный контроль); в- связывание с фрагментом промотора гена rpL32: 1, 2- ядерные белки фибробластов легкого человека; 1- 100 мкг; 2- 200 мкг. Справа указаны позиции белков со стандартными массами в килодальтонах (весовые маркеры). Стрелками слева указаны белки/ связывающиеся с

соответствующими лигандами.

взаимодействии с полипептидом 28—30 кД, т. к. аффинность GCC—элемента и окружении фланкирующих последовательностей выше аффинности собственно GCC—последовательности (см. данные по связыванию с ядерными белками клеток HeLa). Отсутствие взаимодействий ядерных белков фибробластов с GCC—элементом в условиях лигандного блоттинга объясняется, по -видимому, необратимой инактивацией исследуемых белков в результате электрофоретического разделения в денатурирующих условиях. Низкая эффективность ренагурации ядерных белков фибробластов человека (в отличие от ядерных белков клеток HeLa), взаимодействующих с

фрагментом промотора rpL32 (—24...+ 11), выявлена в экспериментах _по_ денатурации/ренатурации с использонанием гуанидингидрохлорвда.

Полученные результаты подтверждают существенные различия в полипептидном составе ДНК—белковых комплексов, формируемых фрагментом промотора гена rpL32 (—24...+11), в клетках HeLa и в фибробластах. Дальнейший анализ белков, взаимодействующих с фрагментом промотора гена rpL32 (—24...+11), потребовал очистки исследуемых ДНК—белковых комплексов. В качестве источника ядерных белков были выбраны клетки гепатомы человека HepG2. Предварительный анализ, проведенный методами гель—ретардации и лигандного блоттинга, показал сходство изучаемых белков в клетках HepG2 и в фибробластах легкого человека. Выделение белков, взаимодействующих с фрагментом промотора rpL32 (-24...+11), проводили методами аффинной

хроматографии на ДНК—сорбенте и препаративной гель—ретардации. Общая схема очистки приведена на рис. 5а. На рис. 56 представлена электрофореграмма разделения ДНК—белковых комгшексов в ходе препаративной гель—ретардации. Первый пик (фракции 4—9) соответствует несвязанной ДНК, тогда как фракции 21—23 и 24—27 соответствуют двум ДНК—белковым комплексам (Rf=0,35 и Rf=0,31), характерным для клеток HepG2 и фибробластов (см. выше). Фракции 21—27 концентрировали и тестировали методом гель—ретардации. Все проанализированные пробы содержали специфическую ДНК—связывающую активность. Белковый состав частично очищенных комплексов изучали методом SDS— электрофореза с последующим выявлением белковых полос окраской серебром (рис. 5в). В результате выявлено несколько полипептидов с молекулярными массами 43, 40, 28, 20, 18 кД, входящих, с высокой долей вероятности, в исследуемые ДНК—белковые комплексы. GCC"элемент действует как позитивный или негативный регулятор транскрипции в зависимости от его локализации относительно других регуляториых последовательностей.

Выявление белок—связывающей активности последовательности (GCC)^ поставило вопрос о ее роли в регуляции экспрессии гена rpL32. Регулятор— ные свойства GCC—элемента были изучены методом функционального титрования, или конкуренции ¡n vivo. Этот подход основан на введении в клетки наряду с генетической конструкцией, содержащей ген—репортер под

ргу-риыэ ^уи »уутокнсрбз

| (тмплу

0лиг<ч<у«я»?гиа»8я копия <Я>агмоига . *1 11.

Еумобитжзю»» оя яа ц^лпгогте»

м«".«« i Я N¡101

ев^ьшим« с фрагмента;« )»«5М«<9ра грШ (• 2*.., /> 11)

Препарат иомзя гень-гкячардзция

' Не СЗЯЭзЗгЗКСЗ

фр-згм^стсм ги'пматооа теиэ -тА-ЗЗ Ь2Л. . * ТП

5'ИХ' . .. ■

| «ТО! Л ' * зжвс -{ !!« 5 *

5 га.«. ? ■ 8 (:«г -

3 |!ИЯ? < у

4 ж* ?. /

А / \

» м . п.. п и» и г-> <5 п_(

Рис. 5. Выделение ДНК-белковых комплексов, образованных фрагментом промотора хр132 (-24...+11) и ядерными белками клеток НерС2: а- схема очистки белков, взаимодействующих с фрагментом промотора грЬ32 (-24 ...+11); б- электрофореграмма разделения ДНК-белковых комплексов методом препаративной гель-ретардации; в- анализ полипептидного состава выделенных ДНК-белковых комплексов методом ЭПЭ-электрофореза. Справа - маркеры молекулярных масс. Полипептиды с молекулярными массами 65-70 кД представляют собой неспецифическую примесь, попавшую в образец в ходе концентрирования.

контролем исследуемого промотора, избытка копий изучаемого элемента й а1., 1993). При этом большинство молекул соответствующего фактора транскрипции в клетке взаимодействует с введенными копиями и, в результате дефицита транскрипционного фактора на тестируемом

а---------------------------- б

Рис. 6. Определение функциональной активности GCC-элемента в составе промотора гена rpl.32 и в составе ТК-промотора методом САТ-теста: а-клетки линии NIH 313 котрансфецировали кальций-фосфатным методом плазмидой рРСТ-1 (содержит ген-репортер cat под контролем промотора грЬ32)и плазмидой pUC18, или

производными pUC18, содержащими копии GCC-элемента, либо фрагмент промотора rpL32 (-24...+11): 1- плазмида рРСТ-1 без добавления специфического конкурента; 2- 6-кратный молярный избыток GCC-элемента по отношению к GCC-элементу промотора rpL32; 3- 40-кратный избыток GCC-элемента; 4- 80-кратный избыток GCC-элемента; 5- 40-кратный избыток 'фрагмента промйтора rpL32 (-24...+11); б- клетки линии NIH ЗТЗ

трансфецировали плазмидами pTKcat (столбец 1) или pTKCCCcat (столбец 2).

промоторе, активность последнего изменяется. На рис. 6а представлены результаты функционального титрования промотора гена rpL32 в клетках NIH ЗТЗ. Присутствие молярных избытков GCC-элемента в клетках приводило к уменьшению активности промотора rpL32. Следовательно, в составе промотора гена rpL32 в клетках NIH ЗТЗ GCC—элемент функционирует как позитивный регулятор транскрипции. Для изучения возможной зависимости свойств GCC-элемента от характера фланкирующих последовательностей и от его локализации относительно других регуляторных участков, олигонуклеотидная копия GCC—элемента была встроена в минимальный промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса 1-го типа (ТК—лромотор), сцепленного с геном-

репортером cat. Добавление GCC—элемента к ТК—промотору приводило к резкому (приблизительно в 2.8 раза по сравнению с исходным ТК— промотором) снижению его активности в клетках NUI ЗТЗ (рис. бб). Следовательно, в составе ТК—промотора GCC—элемент функционирует как негативный регулятор транскрипции. Способность функционировать в качестве активатора или репрессора транскрипции в зависимости от фланкирующих последовательностей и, возможно, в зависимости от локализации относительно других регуляторных участков генома указывает на широкие функциональные возможности GCC—элемента в регуляции транскрипции генов млекопитающих.

ДНК—связывающий белок CCGBP—20 угнетает активность промотора гена rpL32.

В 1996 - 1997 гг. Diessler с соавт. выделили из клеток HeLa ядерный белок CCGBP—20, специфически взаимодействующий с GCC/CCG —повторами в 5'—нетранслируемой области гена FMR1 человека, и клонировали последовательность кДНК, кодирующую этот белок. Молекулярная масса CCGBP—20 совпадает с массой полипептида р20, обнаруженного нами ранее в клетках HeLa и специфически взаимодействующего с GCC—элементом промотора гена rpL32 (см. выше). В связи с вышесказанным, представлялось интересным изучить возможное участие белка CCGBP—20 в регуляции транскрипции гена rpL32. Для решения поставленной задачи клетки линий NHI ЗТЗ и HepG2 ^трансформировали плазмидами pPCTl (содержит ген-репортер cat под контролем промотора гена rpL32) и

Рис. 7. Изучение влияния экспрессии белка CCGBP-20 на активность промотора гена rpL32 в клетках NIH ЗТЗ методом САТ-теста.

рРСТ-1 pPCT-1+pCMVcbpl

вектором экспрессии гена CCGBP—20. Анализ продуктов экспрессии гена-репортера (САТ-тест) показал существенное угнетение активности промотора rpL32 в присутствии белка CCGBP—20 как в клетках мыши (NIH ЗТЗ) (рис. 7), так и в клетках человека (HepG2).

Следовательно, белок CCGBP—20 в этих клетках может функционировать в качестве репрессора транскрипции rpL32 (в отличие от эндогенного GCC— фактора клеток NIH ЗТЗ, активирующего транскрипцию гена rpL32 (рис. 6а)). Вместе с тем, остается неясным, возможно ли прямое

взаимодействие между GCC—элементом промотора rpL32 и белком CCGBP—20, т. к. по данным Deissler с соавг. указанный белок эффективно взаимодествует только с достаточно протяженными повторами (GCC)n, (и>8). Анализ экспрессии гена CCGBP—20 методом RT—PCR выявил присутствие специфичной мРНК в клетках HeLa и HepG2, но не в фибробластах легкого человека.

Отсутствие экспрессии гена CCGBP-20 в фибробластах (несмотря на присутствие (GCC)4—связывающих белков (рис. 26)) указывают на существование дополнительных факторов, способных взаимодействовать с последовательностью (GCC)4, отличающихся по свойствам от белка CCGBP—20.

ВЫВОДЫ

1. В промоторе гена rpL32 мыши идентифицирован новый GC—богатый цис—элемент, вида (GGC)4, отличающийся от известных цис—элементов регуляции транскрипции млекопитающих.

2. Установлено, что участок промотора гена rpL32 —24...+11 н. п. относительно точки инициации транскрипции представляет собой композитный цис—элемент, состоящий из GCC—элемента и полипиримидинового блока.

3. Выявлено тканеспецифическое распределение ядерных белков человека и мыши, взаимодействующих с участком промотора гена rpL32 (—24...+11).

4. Показано, что ДНК—связывающая активность ядерных белков человека, взаимодействующих с фрагментом промотора ipL32, зависит от ионов Zn2t.

5. Определены молекулярные массы ядерных белкой из различных клеточных линий человека, взаимодействующих с участком промотора rpL32 (—24... +11). Показано, что в клетках IleLa с GCC—элементом взаимодействует белок молекулярной массой 18-20 кД.

6. Установлено, что GCC—элемент действует как активатор или репрессор транскрипции в зависимости от локализации относительно других регу— ляторных районов генов. В промоторе rpL32 мыши GCC—элемент функционирует как позитивный регулятор транскрипции.

7. Показано, что белок CCGBP—20 проявляет свойства фактора транскрипции и негативно регулирует активность промотора гена rpL32 в клетках мыши (NIH ЗТЗ) и человека (HepG2).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Perevozchikov A., Orlov S., Golabev D. Homology of herpesviruses and human genes is probably involved in the formation of atherosclerotic plaques (ASP).— lXth Intern. Congress of Virology, Glasgow Scotland, 8-13 august 1993, Abstracts, W12-4.

2. Перевозчиков А. П., Орлов С. В., Кутейкин К. Б. Идентификация нового GC-элемента в промоторе гена мышиного рибосомного белка L32 и 3'—концевом районе гена аполипопротеина А—1 человека, способного in vitro к связыванию с белками клеток мыши и человека // Доклады Академии Наук. 1994,- Т. 338,- N 3, С. 411-415.

3. Орлов С. В., Кутейкин К. Б., Курышев В. Ю., Диже Э. Б., Перевозчиков А. П. Характеристика нового GC—элемента в регуляторных районах гена аполипопротеина А—I человека и гена рибосомного белка L32 мыши. // 2-й Симпозиум "Липопротеиды и атеросклероз", тезисы докладов, Санкт-Петербург, 1995, С. 74.

4. Перевозчиков А. П., Орлов С. В., Курышев В. Ю., Диже Э. Б., Кутейкин К. Б., Голубев Д. Б. Характеристика (GGC)n—элемента, входящего в состав композитных элементов, обнаруженных в регуляторных областях ряда генов человека, важных для развития атеропатий. 4—я Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 21— 26 мая, Санкт-Петербург: 1996, С. 76.

5. Орлов С. В., Кутейкин К. Б., Курышев В. 10., Диже Э. Б., Шпакович В.

М., Перевозчиков А. П. Функциональная активность GCC—элемента, входящего в состав районов гомологии генов человека и герпесвирусов. 5—я Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 25 - 30 мая, Санкт-Петербург, 1997, С. 155.

6. Orlov S., Kutcikin К., Kuryshev V., Dizlie Е., Perevozchikov A. Functional activity of a novel GCC—element found in homologous regulatory regions of human and herpesviral genes. 8"' European Students Conference of the Charite (for students and young doctors), Octobcr 15th — 18th, Berlin, Germany, 1997, P. 15.

7. Перевозчиков А. П., Орлов С. В., Кутейкин К. Б., Диже Э. Б., Шпакович В. М. Сравнительное исследование факторов транскрипции опухолевых клеток человека, взаимодействующих с GCC—элементом. 6—я Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 18 - 22 мая, Санкт-Петербург, 1998, С. 7.

8. Орлов С. В., Кутейкин К. Б., Диже Э. Б., Перевозчиков А. П. Изучение нового фактора транскрипции, взаимодействующего с GC—богатыми цис-элементами, обнаруженными в регуляторных районах ряда генов млекопитающих и герпесвирусов. // Труды победителей конкурса грантов 1998 г. для молодых ученых Санкт-Петербурга. СПб, 1998, С. 170.

9. Орлов С. В., Кутейкин К. Б., Диже Э. Б., Курышев В. Ю., Шпакович В. М., Перевозчиков А. П. Изучение взаимодействий ядерных белков клеток млекопитающих с GCC—элементом, входящим в состав композитного цис—элемента промотора гена рибосомного белка мыши L32 // Биохимия, 1999, Т. 64, N.2, С. 111-117.

10,Orlov S. V., Kutcikin К. В., Dizhe Е. В., Perevozchikov А. P. The triplet repeats (GCC)„ (n=3—4) are capable of acting as regulatory elements within mammalian genes // Human Genome Meeting, 27—30 March 1999, Brisbane, Australia, Abst. 185.

П.Орлов С. В., Диже Э. Б., Кутейкин К. Б., Курышев В. Ю., Перевозчиков А. П. Функциональная активность GCC—элемента, входящего в состав регуляторных районов ряда генов млекопитающих // Доклады Академии Наук, 1999, Т. Збб, N. 2, С. 262-265.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлов, Сергей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- «

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Основные понятия об инициации траскрипции генов эукариот РЖ-полимеразой П.

2.2. сайг-сшщфические транскрипционные факторы.

2.3. ДНК-связьюающие белки, юаимодействующие с gc-богатыми цис-элементами.

2.3.1. Белки семейства Spl.

2.3.2. Белки семейства Egrl.

2.3:3. Белки семейства АР-2.

2.3.4. Белок CCGBP-20.

2.4. Структурно-функциональные свойства протяженных повтоюв (GCC\.

2.5. Промотор rpL32.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.—

3.1. Материалы исследования.

3.2. Плазмйды.

3.3. Генно-инженерное конструирование.

3.4. Получение ядерных экстрактов.

3.5. Гель-ретардация.

3.6. лигандныйблоттинг.

3.7. Аффинная хроматография ядерных белков.

3.8. Препаративная гель-ретардация.

3.9. Генетическая трансформация клеток и анализ продуктов экспрессии генов-репортеров.

3.10. Выделение РНК и реакция обратной транскрипции.

3.11. полимеразная цепная реакция (PCR).*.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. GCC-элеменг промотора RPL32 специфически взаимодействует с ядерными белками мыши и человека.

4.2. область промотора гена RPL32 (-24. +11) содержит композитный цис-элеменг, состоящий из GCC-элемента (-19. .-4) иполипиримидиновогоблока (-4. .+11).

4.3. взаимодействие фрагмента промотора гена rpl32 (-24.+11) с ядерными белками тканеспецифично.

4.4. взаимодействие фрагмента промотора RPL32 (-24.+11) с ядерными белками фибюбластов легкого человека и клеток HEPG2 зависит от ионов ZN2+.

4.5. В состав ДНК-бежового комплекса, образуемого фрагментом промотораRPL32 (-24. .+11), входит несколько белков.

4.6. GCC-элемент может действовать как позитивный или негативный регулятор транскрипции в зависимости от его локализации относительно других регуляторных последовательностей.

4.7. GCC-фактор проявляет перекрестную специфичность с факторами семейства egr но не с белками группы SpI.

4.8. ДНК-связывающий белок CCGBP-20 угнетает активность промотора гена RPL32. ген CCGBP-20 экспрессируется в клетках HELA и HEPG2, но не активен в фибробластах легкого человека.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика нового ЦИС - элемента регуляции транскрипции генов млекопитающих вида (GCC)4"

Актуальность проблемы Регуляция экспрессии генов эукариот в значительной мере осуществляется на стадии транскрипции, затрагивая отдельные гены, группы или множества генов, обусловливающих жизнедеятельность клеток на разных стадиях клеточного цикла, в процессах клеточной дифференецировки, морфогенеза и физиологической активности организма. Согласно современным представлениям, наиболее значимым уровнем регуляции транскрипции генов является инициация транскрипции.

Основными механизмами регуляции инициации транскрипции являются взаимодействия факторов белковой природы (транскрипционных факторов) со специфическими последовательностями ДНК (цис-элементами) в составе регуляторных районов генов (Mitchell P.J., 1989; Latchman D.S., 1991), изменение степени метилирования ДНК, в особенности промоторных областей (Bird А., 1992; Razin А., 1998), а также изменения структуры хроматина, связанные с модификациями гистонов (Steger D., 1998; Brownell J.E., 1996; Turner В.М., 1995). Детальный анализ модульной структуры регуляторных районов эукариотических генов является лидирующим направлением в изучении механизмов регуляции генной экспрессии. Работа в этом направлении, в значительной степени, сводится к выявлению цис-элементов, взаимодействующих с отдельными белками - факторами регуляции транскрипции, характеристике этих факторов, клонированию и изучению кодирующих эти факторы генов (Mitchell P.J., 1989). Описаны сотни факторов регуляции транскрипции (Вингендер Э., 1997), интенсивно ведутся поиски новых. Значительное внимание уделяется ДНК-белковым и белок-белковым взаимодействиям соответственно между цис-элементами в составе промоторов, энхансеров и транскрипционными факторами или между совместно связывающимися с ДНК факторами транскрипции (Carey М., 1998). Исследования в этой области привели к возникновению представлений об иерар-хичной организации цис-элементов в регуляторных районах генов эукариот. Близко расположенные сайты связывания транскрипционных факторов объединены в композитные цис-элементы, которые, в свою очередь, формируют энхансерные или промоторные области (Kel O.V., 1995). В связи с вышесказанным, весьма актуальным представляется поиск и описание новых цис-элементов эукариот, изучение транскрипционных факторов, взаимодействующих с ними, а также выяснение их возможного вклада в функционирование композитных цис-элементов в составе регуляторных областей генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II.

Существенный прогресс в разработке алгоритмов компьтерного анализа последовательностей ДНК и накопление значительного объема известных нуклеотидных последовательностей в базах данных Gen bank и EMBL data base привели к появлению новых методов поиска и изучения регуляторных районов генов на основе статистического анализа их нуклеотидных последовательностей (Prestridge D. S., 1995; Prestridge D. S., 1996). Активность выявленных таким образом потенциальных цис-элементов необходимо подтверждать экспериментальными методами.

В результате компьютерного анализа банков генов приматов, грызунов и вирусов (EMBL data base, 1993, 1997) в регуляторных областях ряда генов млекопитающих и вирусов семейства Herpesviridae обнаружены триплетные повторы (GCC)n, где п=3-30, что позволило рассматривать последовательности (GCC)34 как потенциальные цис-элементы (GCC-элементы), способные взаимодействовать с ядерными белками млекопитающих и модулировать транскрипцию генов-мишеней (Perevozchikov А., 1993; Golubev D.B., 1996).

Дели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение триплетных повторов (GCC)n (п>3) как цис-элементов регуляции транскрипции, а также исследование ядерных белков человека и мыши, способных специфично взаимодействовать с последовательностями (GCC)34- В качестве объекта экспериментальных исследований GCC-элемента выбран промотор гена рибосомного белка мыши L32 (rpL32), содержащий последовательность GC(GCC)4 вблизи точки инициации транскрипции (-19.-4) (см. обзор литературы).

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1. Показать способность потенциального GCC-элемента промотора гена rpL32 связываться с ядерными белками мыши и человека и изучить роль контекстных последовательностей при этих взаимодействиях. Проанализировать белок-связывающие свойства GCC-элемента в сравнении с уже известными гомологичными цис-элементами для факторов транскрипции семейств Egr/Wtl и Spl.

2. Выявить функциональную активность GCC-элемента в регуляции транскрипции в зависимости от его локализации относительно других регуляторных участков.

3. Охарактеризовать белки, взаимодействующие с GCC-элементом промотора гена tpL32. Изучить их распределение в тканях млекопитающих

Основные положения, выносимые на защиту

1. В промоторе гена рибосомного белка мыши Ь32 идентифицирован и охарактеризован дис-элемент вида (ОСС)4, взаимодействующий с ядерными белками клеток млекопитающих и являющийся функционально активным в регуляции транскрипции.

2. Промотор гена грЬ32 содержит композитный цис-элемент в области -24.+11 н. п. относительно точки инициации транскрипции, состоящий из (ЮС-элемента и полипи-римидинового блока.

3. Охарактеризованы ядерные белки млекопитающих, взаимодействующие с композитным цис-элементом промотора грЬ32. Полученные данные свидетельствуют, что по меньшей мере, некоторые из них (<ХХЗВР-20), являются факторами транскрипции, специфически взаимодействующими с (ЗСС-элементом, и модулирующими транскрипцию с промоторов, содержащих этот элемент.

Научная новизна работы. Впервые показана функциональная активность последовательностей ((ЗСС)34 как цис-элементов регуляции транскрипции в клетках млекопитающих. В промоторе гена гр!32 охарактеризован композитный цис-элемент синергичного типа, состоящий из (ЮС-элемента и полипиримидиновой последовательности. Получены данные о ядерных белках, взаимодействующих с вСС-элементами. Изучено тканеспецифическое распределение белков, взаимодействующих с композитным цис-элементом промотора грЬ32. Полученные результаты указывают на существование в клетках человека, по меньшей мере, нескольких белков (СХХтВР-20 и др.), которые специфически взаимодействуют с триплетными повторами (СгСС)п и модулируют активность промоторов, содержащие эти триплетные повторы. Теоретическое и практическое значение работы. Изучение ДНК-белковых взаимодействий между ядерными белками млекопитающих и промотором гена грЬ32 позволило описать новые ОС-богатый и полипиримидиновый элементы регуляции транскрипции, образующие в промоторе гена грЬ32 композитный цис-элемент вблизи точки инициации транскрипции. Показана зависимость транскрипционных эффектов, опосредуемых (ЗСС-элементом, от его локализации относительно других регуляторных последовательностей. Полученные данные являются существенным вкладом в представления о роли кооперативных белок-белковых взаиодействий между транскрипционными факторами, связывающимися с близко расположенными регуляторными последовательностями, в формировании интегрального 6 транскрипционного ответа. Локализация вСС-элемента в регуляторных районах ряда генов человека указывает на возможное участие белков, взаимодействующих с СгСС-элементом, в координированной регуляции экспрессии этих генов.

Для выделения исследуемых ДНК-белковых комплексов предложен метод, основанный на последовательном применении аффинной хроматографии на ДНК-сорбенте и препаративной гель-ретардации. Данный подход является оригинальным и может быть рекомендован для выделения других-ДНК-связывающих белков.

Материалы диссертации используются в курсах лекций для магистрантов биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Орлов, Сергей Владимирович

6. Выводы

1. В промоторе гена грЬ32 мыши идентифицирован новый ОС-богатый цис-элемент, вида (ОСС)4, отличающийся от известных цис-элементов регуляции транскрипции млекопитающих.

2. Установлено, что участок промотора гена грЬ32 -24.+11 н. п. относительно точки инициации транскрипции представляет собой композитный цис-элемент, состоящий из ОСС-элемента и полипиримидинового блока.

3. Выявлено тканеспецифическое распределение ядерных белков человека и мыши, взаимодействующих с участком промотора гена грЬ32 (-24.+11).

4. Показано, что ДНК-связьгоающая активность ядерных белков человека, взаимодействующих с фрагментом промотора грЬ32, зависит от ионов Ъй*.

5. Определены молекулярные массы ядерных белков из различных клеточных линий человека, взаимодействующих с участком промотора грЬ32 (-24 .+11). Показано, что в клетках НеЬа с ОСС-элементом взаимодействует белок молекулярной массой 18-20 кД.

6. Установлено, что ОСС-элемент действует как активатор или репрессор транскрипции в зависимости от локализации относительно других регуляторных районов генов. В промоторе грЬ32 ОСС-элемент функционирует как позитивный регулятор транскрипции.

7. Показано, что белок ССОВР-20 проявляет свойства фактора транскрипции и угнетает активность промотора гена грЬ32 в клетках мыши (№Н ЗТЗ) и человека (Нер02).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлов, Сергей Владимирович, Санкт-Петербург

1. Вингендер Э. 1997. Классификация транскрипционных факторов. Молекулярная Биология 31, N.4:584-600.

2. Горман К. 1988. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих, С. 403-463, в книге Клонирование ДНК, под ред. Д. Гловера, М. Мир, 1988.

3. Дин П., Джонсон В, Мидл Ф. Аффинная хроматография, методы. М. Мир, 1988.

4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М. Мир, 1991.

5. Маниатис Т., Френч Э., and Сембрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984.

6. Орлов C.B., Кутейкин К.Б., Курышев В.Ю., Диже Э.Б., Перевозчиков А.П.

7. Характеристика нового GC-элемента в регуляторных районах гена аполипопро-теина A-I человека и гена рибосомного белка L32 мыши. // 2-й Симпозиум «Ли-попротеиды и атеросклероз», тезисы докладов, Санкт-Петербург, 1995, С. 74.

8. Федоров СЛ., Татосян А.Г., Смирнова Т.А., Калиновский В.П., Князев П.Г., Сейц И.Ф. 1984. Выделение неинтегрированных форм провирусной ДНК онкогенных вирусов методом препаративного электрофореза. Экспериментальная онкология 6, N.2:39-41.

9. Agellon L.B., Zhang P., Jiang С., et al. 1992. The CCAAT/enhancer binding protein trans-activates the human cholesteryl ester transfer protein gene promoter. Journal of Biological Chemistry 267, N.31:22336-22339.

10. Alam J., Zhining D. 1992. Distal API binding sites mediate basal level enhancement and TPA induction of the mouse heme oxygenase-1 gene. Journal of Biological Chemistry 267, N.30:21894-21900.

11. Amin C., Wagner A.J., Hay N. 1993. Sequence-specific transcriptional activation by Мус and repression by Max. Mol.Cell.Biol. 13, N.1:383-390.

12. Andrews N.C., Falier D.V. 1991. A rapid micropreparation technique for extraction of DNA binding proteins from limiting numbers of mammalian cells. Nucleic Acids Research 19, N.9:2499

13. Angel P., Ymagawa M., et al. 1987. Phorbol ester inducible genes contain a common cis-element recognized by a TPA-modulated trans-acting factor. Cell 49:729-739.

14. Ashley C.T., Warren S.T. 1995. Trinucleotide repeat expansion and human disease. Ann.Rev.Genet. 29:703-728.

15. Atchson M.L., Meyuhas O., Perry R. 1989. Localization of transcriptional regulatory elements and nuclear factor binding sites in mouse ribosomal protein gene rpL32. Mol.Cell.Biol. 9, N.5:2067-2074.

16. Ben-Hattar J., Beard P., Jiricny J. 1989. Cytosine methylation in CTF and Spl recognition sites of an HSV tk promoter, effects on transcription in vivo and on factor binding in vitro. Nucleic Acids Research 17:10179-10190.

17. Bickmore W.A., Oghene 1С, Little M.H., et al. 1992. Modulation of DNA binding specificity by alternative splicing of the Wilms' tumor wtl gene transcript. Science 257:235-237.

18. Bird A. 1992. The essentials of DNA methylation. Cell 70:5-8.

19. Brandeis M., Frank D., Keshet I., Siegfried Z., et al. 1994. Spl elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature 371:435-438.

20. Briggs M. R., Kadonaga J. Т., Bell S. P., Tjian R. 1986. Purification and biochemical characterization of the promoter- specific transcription factor, Spl. Science 234:47-52.

21. Brownell J.E. 1996. Linking histone acetylation to chromatin assembly and gene activation. Curr.Opin.Genet.Dev. 6:176-184.

22. C.Kingsley, A.Winoto. 1992. Cloning of GT-box binding protein: a novel Spl multigene family regulating T-cell receptor gene expression. Mol.Cell.Biol. 12, N.10:4251-4261.

23. Call KM., Glaser T., Ito C.Y., Buckler A.J., et aL 1990. Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms'tumor locus. Cell 60:509-520.

24. Cao X.M., Koski R.A., Gashler A., McKiernan M., et aL 1990. Identification and characterization of the Egr-1 gene product, a DNA-binding zinc finger protein induced by differentiation and growth signals. Mol.Cell.Biol. 10:1931-1939.

25. Carey M. 1998. The enhanceosome and transcriptional synergy. Cell 92:5-8.

26. Caskey C.T., Pizzyti A., Fu Y.-H., et al. 1992. Triplet repeat mutations in human diease. Science 256, N.8:784-789.

27. Chavrier P., Zerial M., Lemaire P., Almendral J., et al. 1988. A gene encoding a protein with zinc fingers is activated during G0/G1 transition in cultured cells. EMBO J. 7:29-35.

28. Chen J.-L., Attardi L.D., Verrijzer C.P., Yokomori K., et al. 1995. Assembly of recombinant TFHD reveals differential coactivator requirements for distinct transcriptional activators. Cell 79, N.1:93-105.

29. Chen H., Li B., Workman J. L. 1994. A histone-binding protein, nucleoplasmin, stimulates transcription factor binding to nucleosomes and factor-induced nucleosome disassembly. EMBO J. 13:380-390.

30. Chen X., Mariappan S. V., Catasti P., Ratliff R., et al. 1995. Hairpins are formed by the single DNA strands of the fragile X triplet repeats: structure and biological implications. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92:5199-5203.

31. Chiang C. M., Roeder R. G. 1995. Cloning of an intrinsic human TFIID subunit that interacts with multiple transcriptional activators. Science 267:531-536.

32. Chiang S. Y., Welch J. J., Rauscher F. J. 3., Beerman T. A. 1996. Effect of DNA-binding drugs on early growth response factor-1 and TATA box-binding protein complex formation with the herpes simplex virus latency promoter. J Biol Chem 271:23999-24004.

33. Christy B., Nathans D. 1989. Functional serum response elements upstream of the growth factor-inducible gene zif268. Mbl.Cell.Biol. 9:4889-4895.

34. Christy B.A., Lau L.F., Nathans D. 1988. A gene activated in mouse 3T3 cells by serum growth factors encodes a protein with "zinc finger" sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7857-7861.

35. Chung S., Perry R. 1989. Importance of introns for expression of mouse ribosomal protein gene rpL32. Mol.Cell.Biol. 9, N.5:2075-2082.

36. Corden J.L. 1990. Tails of RNA polymerase II. Trends Biochem.Sci. 15:383-387.

37. Courey A.J., Tjian R. 1988. Analysis of Spl in vivo reveals multiple transcriptional domains including a novel glutamine-rich activation motif. Cell 55:887-898.

38. Crosby S.D., Puetz J.J., Simburger K.S., Fahrner T.J., et al. 1991. The early response gene NGFI-C encodes a zinc finger transcriptional activator and is a member of the GCGGGGGCG (GSG) element-binding protein family. Mol.Cell.Biol. 11:38353841.

39. Currie R.A., Eckler R.IL 1992. Characterization of a high affinity octamer transcriptional factor binding site in the human lipoprotein lipase promoter. Archives of Biochemistry and Biophysics 298, N.2:630-639.

40. Darlow J. M., Leach D. R. 1998. Evidence for two preferred hairpin folding patterns in d(CGG).d(CCG) repeat tracts in vivo. J.Mol.Biol. 275:17-23.

41. Darlow J. M., Leach D. R. 1998b. Evidence for two preferred hairpin folding patterns in d(CGG).d(CCG) repeat tracts in vivo. J Mol Biol 275:17-23.

42. Darlow J. M., Leach D. R. 1998a. Secondary structures in d(CGG) and d(CCG) repeat tracts. J Mol Biol 275:3-16.

43. Day M.L., Fahrner T.J., Aykent S., Milbrandt J. 1990. The zinc finger protein NGFI-A exists in both nuclear and cytoplasmic forms in nerve growth factor-stimulated PC12 cells. Journal of Biological Chemistry 265:15253-15260.

44. Deissler H., Behn-Krappa A., Doerfler W. 1996. Purification of nuclear proteins from human HeLa cells that bind specifically to the unstable tandem repeat (CGG)n in the human FMR1 gene. Journal of Biological Chemistry 271, N.8:4327-4334.

45. Deseombes P., Schibler H. 1990. A liver-enriched transcriptional inhibitory protein, LIP, are translated from the same mRNA. Cell 67, N.3:569-580.

46. Deshamps B.J., Lawless D.E., Carr F.E., Wang C.W. 1992. Rat hepatonuclear factor PS1 regulates tissue-specific activity of the S14 promoter in vitro. Journal of Biological Chemistry 267, N.35:25167-25171.

47. Diamond F.C., Miner I.N., Yoshimaga S.K., Yamamoto K.R. 1990. Transcription factor interactions: selectors if positive or negative regulation from a single DNA element. Science 249:1266-1272.

48. Donaldson L.W., Petersen J.M., Graves B.J., et al. 1994. Secondary structure of the ETS domain places murine Ets-1 in the superfamily of winged helix-turn-helix DNA-binding proteins. Biochemistry 33, N.46:13509-13516.

49. Dudov K., Perry R. 1984. The gene family encoding the mouse ribosomal protein L32 contains a uniquely expressed intron-containing gene and unmutated processed gene. Cell 37, N.6:457-468.

50. Dudov K., Perry R. 1986. Properties of a mouse ribosomal protein promoter. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, N.12:8545-8549.

51. Dynan W.S. 1983. Promoters for housekeeping genes. Trends Genet. 2:196-197.

52. Dynan W.S., Tjian R, 1983. The promoter-specific transcription factor Spl binds to upstream sequences in the SV40 early promoter. Cell 35:79-87.

53. Emili A., Greenblatt J., Ingles C. J. 1994. Species-specific interaction of the glutamine-rich activation domains of Spl with the TATA box-binding protein. Mol.Cell Biol. 14 :1582-1593.

54. Faisst S., Meyer S. 1992. Compilation of vertebrate encoded transcription factors. Nucleic Acids Research 20:3-26.

55. Farnham P.J., Schimke R.T. 1986. In vitro transcription and delimination of promoter elements of the murine dihydrofolate reductase gene. Mol.Cell.Biol. 6:23922401.

56. Felsenfeld G. 1992. Chromatin as an essetial part of transcriptional mechanism. Nature 355:219-224.

57. Flanagan J.R., Becker K.G., Ennist K.L., et al. 1992. Cloning of a negative transcription factor that binds to the lupstream conserveed region of Moloney murine leukemia virus. Mol.Cell.Biol. 12:38-44.

58. Fraizer G.C., Wu Y-J., Hewitt S.M., et al. 1994. Transcriptional regulation of the human Wilms' tumor gene (Wtl). Cell type-specific enhancer and promiscuous promoter. Journal of Biological Chemistry 269, N.12:8892-8900.

59. Fu Y. H., Kuhl D. P., Pizzuti A., Pieretti M., et al. 1991. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell 67:1047-1058.

60. Gashler A.L., Swaminathan S., Sukhatme V.P. 1993. A novel repression module, an extensive activation domain, and a bipartite nuclear localization signal defined in the immediate-early transcription factor Egr-1. Mol.Cell.Biol. 13:4556-4571.

61. Gashler, A. and V.P. Sukhatme. 1995. Early growth response protein 1 (Egr 1): prototype of a zinc-finger family of transcription factors., p. 191-224. In AnonymousProgress in nucleic acids research and molecular biology, Vol.50, academic press,

62. Gessler M., Poustka A., Caveiiee W., Neve R.L., et al. 1990. Homozygous deletion in Wilms tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping. Nature 343:774-778.

63. Gill G., Pascal E., Tseng Z. H., Tjian R. 1994. A glutamine-rich hydrophobic patch in transcription factor Spl contacts the dTAFIIl 10 component of the Drosophila TFHD complex and mediates transcriptional activation. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:192-196.

64. Godde J. S., Kass S. U., Hirst M. C., Wolffe A. P. 1996. Nucleosome assembly on methylated CGG triplet repeats in the fragile X mental retardation gene 1 promoter. J Biol Chem 271:24325-24328.

65. Golubev D.B., Perevozchikov A.P. 1996. The role of herpes virus in etiopathogenesis of atherosclerosis. Russian Medical Journal 1:8-15.

66. Haber D.A., Sohn R.L., Budkler A.J., Pelletier J., et al. 1991. Alternative splicing and genomic structure of the Wilms' tumor gene WT1. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9618-9622.

67. Haeffler LP., Meyer T.E., Yun Y., et al. 1988. cAMP responsive DNA binding protein: structure based on a cloned placental cDNA. Science 242:1430-1432.

68. Hagen G., Mutter S., Beato M., Suske G. 1992. Cloning by recognition site screening of two novel GT box binding proteins: a family of Spl related genes. Nucleic Acids Research 20:5519-5525.

69. Hagen G., Denning J., Preib A., Beato M., et al. 1995. Functional analysis of the transcription factor Sp4 reveal properties distinct from Spl and Sp3. Journal of Biological Chemistry 270, N.42:24989-24994.

70. Hagen G., Muller S., Beato M., Suske G. 1994. Spl-mediated transcriptional activation is repressed by Sp3. EMBO J. 13:3843-3851.

71. Hamilton T. B., Barilla K. C., Romaniuk P. J. 1995. High affinity binding sites for the Wilms' tumour suppressor protein WT1. Nucleic.Acids.Res. 23:277-284.

72. Hansen R. S., Gartler S. M., Scott C. R., Chen S. H., et al. 1992. Methylation analysis of CGG sites in the CpG island of the human FMR1 gene. Hum Mol Genet 1:571-578.

73. Hariharan N., Kettey D.E., Perry R.P. 1991. d, a transcription factor that binds to downstream elements in several polymerase II promoters, is a functionally versatile zinc finger protein. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9799-9803.

74. Harrington M.A., Jones P.A., Hasayashi I., Karin M. 1988. Cytosine methylation does not effect binding of transcription factor Sp-1. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:20662070.

75. Heitz D., Rousseau F., Devys D., Saccone S., et al. 1991. Isolation of sequences that span the fragile X and identification of a fragile X-related CpG island published erratum appears in Science 1991 Apr 26;252(5005):494., Science 251:1236-1239.

76. Herms J., Zurmohle U., Schlingensiepen R., Brysch W., et al. 1994. Developmental expression of the transcription factor zif268 in rat brain. Neurosci.Lett. 165:171-174.

77. Hewitt S. 1996. Differential function of Wilms' tumor gene WT1 splice isoforms in transcriptional regulation. Journal of Biological Chemistry 271 (15):8588-8592.

78. Hoeller M., Westin G., Jiricny J., Schaffner W. 1988. SP1 transcription factor binds DNA and activates transcription even when the binding site is CpG methylated. Genes&Dev. 2:1127-1135.

79. Hornstra L K., Nelson D. L., Warren S. T., Yang T. P. 1993. High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome. Hum Mol Genet 2:1659-1665.

80. Huang H.-C., Sundseth R., Hansen Ü. 1990. Transcription factor LSF binds two variant bipartite sites within the SV40 late promoter. Genes&Dev. 4:287-298.

81. Huff V. 1994. Parental origin of WT1 mutations and mental retardation in WAGR syndrome. Nature Genetics 8, N.1:13-14.

82. Imataka H., Sogawa K., Yasumoto K,, Kikuchi Y., et al. 1992. Two regulatory proteins that bind to the basic transcription element (BTE), a GC box sequence in the promoter region of the rat P-4501Al gene. EMBO J. 11:3663-3671.

83. Imataka H., Nakayama K., Yasumoto K., Mizuno A., et al. 1994. Cell-specific translational control of transcription factor BTEB expression. The role of an upstream AUG in the 5'-untranslated region. J.Biol.Chem. 269:20668-20673.

84. Ionat C., Rahmsdorf H.I., Park K-K., et al. 1990. Antitumor promotion and antiinflammation: down-modulation of API (Fos/Jun) activity by glucocorticoid hormone. Cell 62:1189-1204.

85. Jackson S.P., Tjian R. 1988. O-glycosylation of eukaryotic transcription factors: implications for mechanisms of transcriptional regulation. Cell 55:125-133.

86. Jackson S.P., Tjian R. 1989. Purification and analysis of RNA polymerase II transcription factors by using wheat germ agglutinin affinity chromatography. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1781-1785.

87. Ji J., Clegg N. J., Peterson K. R., Jackson A. L., et al. 1996. In vitro expansion of GGC:GCC repeats: identification of the preferred strand of expansion. Nucleic Acids Res 24:2835-2840.

88. Johnson J. L., McLachlan A. 1994. Novel clustering of Spl transcription factor binding sites at the transcription initiation site of the human muscle phosphofractokinasePl promoter. Nucleic.Acids.Res. 22:5085-5092.

89. Jones C., Penny L., Mattina T., et al. 1995. Association of a chromosome deletion syndrome with a fragile site within the proto-oncogene CBL2. Nature 376, N.6536:145-149.

90. Joseph L.J., Le Beau M.M., Jamieson G.A., Acharya S., et al. 1988. Molecular cloning, sequencing, and mapping of EGR2, a human early growth response gene encoding a protein with "zinc-binding finger" structure. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7164-7168.

91. Kadonaga J.T., Carner K.R., Masiarz F.R., Tjian R. 1987. Isolation of cDNA encoding transcription factor Spl and functional analysis of the DNA binding domain. Cell 51:1079-1090.

92. Kadonaga J.T., Courey A.J., Ladika J., Tjian R. 1988. Distinct regions of Spl modulate DNA binding and transcriptional activation. Science 242:1566-1570.

93. Kageyama R., Merlino G.T., Pastan L 1989. Nuclear factor ETF specifically stimulates transcription from promoters without a TATA box. Journal of Biological Chemistry 264, N.26:15508-15514.

94. Kageyama R., Pastan I. 1989. Molecular cloning and characterization of a human DNA binding factor that repress transcription. Cell 59, N.5:815-825.

95. Kaizumi S., Suzuki K., Otsuka F. 1992. A nuclear factor that recognizes the metal responsive elements of human metallothionein Ha gene. Journal of Biological Chemistry 267, N.26:18659-18664.

96. Kang S., Ohshima K., Shimizu M., Amirhaeri S., et al. 1995. Pausing of DNA synthesis in vitro at specific loci in CTG and CGG triplet repeats from human hereditary disease genes. J Biol Chem 270:27014-27021.

97. Karin M. 1991. Signal transduction and gene control. Current Opinion in Cell Biology 3:467-473.

98. Karlseder J. 1996. Interaction of Spl with growth- and cell cycle-regulated transcription factor E2F. Moll.Cell Biol. 16:1659-1667.

99. Keinberg J.A., Sariola H.» Loring J.H., et al. 1993. WT-1 is required for early kidney development. Cell 74:679-691.

100. Kel O.V., Romaschenko A.G., Kel A.E., Wingender E., et al. 1995. A compilation of composite regulatory elements affecting gene transcription in vertebrates. Nucleic Acids Research 23, N.20:4097-4103.

101. Kettani A., Kumar R. A., Patel D. J. 1995. Solution structure of a DNA quadruplex containing the fragile X syndrome triplet repeat. J Mol Biol 254:638-656.

102. Kikuchi Y., Sogawa K., Watanabe N., Kobayashi A., et al. 1996. Purification and characterization of the DNA-binding domain of BTEB, a GC box-binding transcription factor, expressed in Escherichia coli. JJBiochem. 119, N.2:309-313.

103. Knight S. J., Flannery A. V., Hirst M. C., Campbell L., et al. 1993. Trinucleotide repeat amplification and hypermethylation of a CpG island in FRAXE mental retardation. Cell 74:127-134.

104. Kobayashi A., et al. 1995. Analysis of functional domains of GC-box-binding protein, BTEB. J.Biochem. 117:91-95.

105. Koyano-Nakagawa N., Nishida J., Baldwin D., et al. 1994. Molecular cloning a novel human cDNA encoding a zinc finger protein that binds to the interlenkin-3 promoter. Mol.Cell.Biol. 14, N.8:5099-5107.

106. Kunsch C., Lang R. K., Rosen C. A., Shannon M. F. 1994. Synergistic transcriptional activation of the IL-8 gene by NF- kappa B p65 (RelA) and NF-IL-6. J Immunol 153:153-164.

107. Kutoh E., Schwander J. 1993. Sp-1 interacts with the consensus sequence for EGR-1 gene product with a cellular factor(s) and activates the transcription through this element. Biochemical and Biophysical Research Communications 194, N.3:1475-1482.

108. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

109. Larsson S.H., Charlien J.-P., Migagawa K., Engelkamp D., et al. 1995. Subnuclear localization of WT1 in splicing or transcription factor domains is regulated by alternative splicing. Cell 81, N.3:391-401.

110. Latchutan D.S. 1991. Eukariotic transcription factors. Acad. Press., Cambridge.

111. Lavedan C., Grabczyk E., Usdin K., Nussbaum R. L. 1998. Long uninterrupted CGG repeats within the first exon of the human FMR1 gene are not intrinsically unstable in transgenic mice. Genomics 50:229-240.

112. Lavrovsky I., Schwartzman MX., Abraham N.G. 1993. Novel regulatory sites of the human heme oxygenase 1 promoter region. Biochemical and Biophysical Research Communications 196, N.1:336-341.

113. Lemaire P., Revelant O., Bravo R., Charnay P. 1988. Two mouse genes encoding potential transcription factors with identical DNA- binding domains are activated by growth factors in cultured cells. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4691-4695.

114. Lemaire P., Vesque C., Schmitt J., Stunnenberg H., et at. 1990. The serum-inducible mouse gene Krox-24 encodes a sequence-specific transcriptional activator. Mol.Cell.Biol. 10, N.7:3456-3467.

115. Levi G., Topilko P., Schneider-Manoury S., Lasagna M., et al. 1996. Defective bone formation in Krox-20 mutant mice. Development 122, N.l: 113-120.

116. Li B., Adams C. C., Workman J. L. 1994. Nucleosome binding by the constitutive transcription factor Spl. J.Biol.Chem. 269:7756-7763.

117. Lim R.W., Varaum B.C., Herschman H.R. 1987. Cloning of tetradecanoyl phorbol ester-induced 'primary response' sequences and their expression in density-arrested Swiss 3T3 cells and a TPA non-proliferative variant. Oncogene 1:263-270.

118. Liu F., Green M.R. 1994. Promoter targeting by adenovirus E1A through interaction with different cellular DNA-binding domains. Nature 368:520-525.

119. Logan T., Pyre J., Hall D.J. 1993. Physical characteristics of a factor related to the c-myc/insulin promoter binding protein ZF87/PUR-1. Biochemical and Biophysical Research Communications 192, N.3:1204-1209.

120. Lucibello F.C., Slater E.P., Joass K.H., et al. 1990. Mutual transrepression of c-Fos and the glucocorticoid receptor involvement of a functional domain in Fos which in absent in FosB. EMBO J. 9:2827-2834.

121. Macleod D., Charlton J., Mullins J., Bird A. P. 1994. Spl sites in the mouse aprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island. Genes Dev. 8:2282-2292.

122. Majello B., De Luca P., Hagen G-, Suske G., et al. 1994. Different members of the Spl multigene family exert opposite transcriptional regulation of the long terminal repeat of HIV-1. Nucleic.Acids.Res. 22:4914-4921.

123. Majello B., De Luca P., Suske G., Lania L. 1995. Differential transcriptional regulation of c-myc promoter through the same DNA binding sites targeted by Spl-like proteins. Oncogene 10:1841-1848.

124. Majumdar K. C., Shetty S., Wadhwa R., Bhaskar S., et al. 1996. Detection and purification of sequence-specific DNA binding protein. Anal.Biochem. 241:23-29.

125. Malik K.T.A., Poirier V., Ivins S.M., Brown K.W. 1994. Autoregulation of the human WT1 gene promoter. FEBS Letters 349, N.1:75-78.

126. Mariappan S. V., Catasti P., Chen X., Ratliff R., et al. 1996. Solution structures of the individual single strands of the fragile X DNA triplets (GCC)n.(GGC)n. Nucleic.Acids.Res. 24:784-792.

127. Masquilier D., Sassone-Corsi P. 1992. Transcriptional cross-talk: nuclear factors CREM and CREB bind to API sites and inhibit activation by Jun. Journal of Biological Chemistry 267, N31:22460-22466.

128. Milbrandt J. 1987. A nerve growth factor-induced gene encodes a possible transcriptional regulatory factor. Science 238:797-799.

129. Mitchell P.J., Timmons P.M. 1991. Transcriptin factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mous embriogenesis. Genes Dev. 5:105-119.

130. Mitchell P.J., Tjian R. 1989. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence- specific DNA binding proteins. Science 245:371-378.

131. Moffett P., Bruening W., Nakagama H., Bardeesy N., et al. 1995. Antagonism of WT1 activity by protein self-association. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92, N.24:11105-11109.

132. Montalvo E. A., Cottam M., Hill S., Wang Y. J. 1995. YY1 binds to and regulates cis-acting negative elements in the Epstein-Barr virus BZLF1 promoter. J.Virol. 69, N.7:4158-4165.

133. Morris J.F., Madden S.L., Tounay O.E., Cook D.M., et al. 1991. Characterization of the zinc finger protein encoded by the WT-1 Wilms' tumor locus. Oncogene 6, N.12:2339-2348.

134. Moser M., Imhof A., Pscherer A., Bauer R, et al. 1995. Cloning and characterization of a second AP-2 tanscription factor: AP-2 beta. Development 121, N.9:2779-2788.

135. Moura-Neto R., Dudov K., Perry R. 1989. An element downstream of the cap-site is required for transcription of the gene encoding mouse ribosomal protein L32. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3997-4001.

136. Muller H.J., Skerka C., Bialonski A., Zipfel P.F. 1991. Clone pAT 133 identifies a gene that encodes another human member of a class of growth factor-induced genes with almost identical zinc-finger domains. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10079-10083.

137. Murata Y., Kim H. G., Rogers K. T., Udvadia A. J., et al. 1994. Negative regulation of Spl trans-activation is correlated with the binding of cellular proteins to the amino terminus of the Spl trans-activation domain. J.Biol.Chem. 269:20674-20681.

138. Nagaoka M., Kuwahara J., Sugiura Y. 1993. Alteration of DNA binding specifity by nickel (II) substitution in three zinc(II) fingers of transcription factor Sp-1. Biochemical and Biophysical Research Communications 194, N.3:1515-1520.

139. Nakagama H., Heinrich G., Pelletier J., Housman D. E. 1995. Sequence and structural requirements for high-affinity DNA binding by the WT1 gene product. Mol.Cell.Biol. 15, N.3:1489-1498.

140. Nancarrow J. K., Kremer E., Holman K,, Eyre H., et al. 1994. Implications of FRA16A structure for the mechanism of chromosomal fragile site genesis. Science 264:1938-1941.

141. Nardelli J., Gibson T., Charnay P. 1992. Zinc finger-DNA recognition: analysis of base specificity by site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Research 20:4137-4144.

142. Nardelli J., Gibson T.J., Vesque C., Charnay P. 1991. Base sequence discrimination by zinc-finger DNA-binding domains. Nature 349:175-178.

143. Nguyen H. Q., Hoffman Liebermann B., Liebermann D. A. 1993. The zinc finger transcription factor Egr-1 is essential for and restricts differentiation along the macrophage lineage. Cell 72:197-209.

144. NgY V., Laverrikre J.-N., Gourdji D. 1993. Binding capacity and cw-acting efficiency of DNA regulatory sequences can be distinguished in an in vivo competition assay. Nucleic Acids Res. 21:5795-5796.

145. Nicolas, R.H. and G.H. Goodwin. 1993. Purification and cloning of transcription factors, p. 81-104. In D.S. Latchman (ed.), Transcription factors. A practical approach. Oxford University Press, Oxford.

146. Oberl I., Rousseau F., Heitz D., Kretz C., et al. 1991. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science 252:10971102.

147. Oostra B. A., Hoogeveen A. T. 1997. Animal model for fragile X syndrome. Ann Med 29:563-567,

148. Oulad Abdelghani M., BouiUet P., Chazaud C., DollO P., et al. 1996. AP-2.2: a novel AP-2-related transcription factor induced by retinoic acid during differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Exp.Cell Res. 225:338-347.

149. Pardy K., Adan R.A.H., Carter D.A., et al. 1992. Identification of a cis-acting element involved in cyclic 3',5-adenosine monophosphate regulation of bovine vasopressin gene expression. Journal of Biological Chemistry 267, N.30:21746-21752.

150. Park K., Atchison M.L. 1991. Isolation of candidate repressor/activator, NF-E1 (YY1, d), that binds the immunoglobulin k 3'enhancer and the immunoglobulin heavy-chain m El site. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9804-9808.

151. Parrish J. E., Oostra B. A,, Verkerk A. J., Richards C. S., et al. 1994. Isolation of a GCC repeat showing expansion in FRAXF, a fragile site distal to FRAXA and FRAXE see comments. Nat.Genet. 8:229-235.

152. Pascal E., Tjian R. 1991. Different activating domains of Spl govern formation of multimers and mediate transcriptional synergism. Genes&Dev. 5:1646-1656.

153. Patwardhan S., Gashler S., Siegel M„ Chang L., et al. 1991. EGR3, a novel member of the Egr family of genes encoding immediate-early transcription factors. Oncogene 6:917-928.

154. Pavletich N.P., Pabo C.O. 1990. Zinc finger DNA recognition: crystal structure of a zif268-DNA complex at 2.1 A. Science 252:809-817.

155. Perevozchikov A., Orlov S., and Golubev D. 1993. The homology of herpesviruses and human genes probably is involved in the formation of atherosclerotic plaques. IX Intern. Congress of Virology, Abstracts W12-4, Glasgow, Scotland, 8-13 August.

156. Persengiev S.P., Saffer J.D., Kilpatrick D.L. 1995. An alternatively spliced form of the transcription factor Spl containing only a single glutamine-rich transactivation domain. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92, N.20:9107-9111.

157. Pieretti M., Zhang F. P., Fu Y. H., Warren S. T., et al. 1991. Absence of expression of the FMR-1 gene in fragile X syndrome. Cell 66:817-822.

158. Pondel M.D., Murphy S., Pearson L., Craddock C., et al. 1995. Spl functions in a chromatin-dependent manner to augment human alpha-globin promoter activity. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92, N.16:7237-7241.

159. Postel E.H., Berberich S.J., Flint S.J., Ferrone C.A. 1993. Human c-myc transcription factor PuF identified as nm23-H2 nucleoside diphosphate kinase, a candidate suppressor of tumor metastasis. Science 261, N.5120:478-480.

160. Postel E.H., Mango S.E., Flint S.J. 1989. A nuclease-hypersensitive element of the human c-myc promoter interacts with a transcription initiation factor. Mol.Cell.Biol. 9, N.11:5123-5133.

161. Predki P. F., Sarkar B. 1992. Effect of replacement of zinc finger zinc on estrogen receptor DNA interactions. J Biol Chem 267:5842-5846.

162. Prestridge D. S. 1995. Predicting Pol II promoter sequences using transcription factor binding sites. J Mol Biol 249:923-932.

163. Prestridge D. S. 1996. SIGNAL SCAN 4.0: additional databases and sequence formats. Comput Appl Biosci 12:157-160.

164. Pritchard-Jones K., Fleming S., Davidson D., et al. 1990. The candidate Wilms' tumour gene is involved in genitourinary development. Nature 346:194-197.

165. Pugh B.F., Tjian R. 1990. Mechanism of transcriptional activation by Spl : evidence for coactivators. Cell 61:1187-1197.

166. Punturieri A., Shirakata Y., Bovolenta C., et al. 1993. Multiple cis-acting elements required for,proper transcription of the mouse V delta IT cell receptor promoter. J.Immunol. 150, N.1:139-150.

167. Raj G.V., Khalili K. 1994. Identification and characterization of a novel GCA/C-binding protein, GBP-i, that is rapidly inducible by cytokines. Mol.Cell.Biol. 14, N.12:7770-7781.

168. Rauscher HI F. J., Morris J. F., Tournay O. E., et aL 1990. Binding of the Wilms' tumor locus zinc finger protein to the EGR-1 consensus sequence. Science 250:259262.

169. Razin A. 1998. CpG methylation, chromatin structure and gene silencing-a three- way connection. EMBOJ 17:4905-4908.

170. Razin A. 1998. CpG methylation, chromatin structure and gene silencing a three-way connection. EMBO J. 17:4905-4908.

171. Richards R. L, Holman K., Yu S., Sutherland G. R. 1993. Fragile X syndrome unstable element, p(CCG)n, and other simple tandem repeat sequences are binding sites for specific nuclear proteins. Hum.Mol.Genet. 2:1429-1435.

172. Roy A.L., Roeder R.G. 1994. Initiator element binding protein TKI1-I: a tale of two sites. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics 31:14-19.

173. Roy R. J., Gosselin P., Guerin S. L. 1991. Biotechniques 11:770-777.

174. Rupprecht H.D., Drummond J.A., Madden S.L., et al. 1994. The Wilms' tumor suppressor gene Wtl is negatively autoregulated. Journal of Biological Chemistry 269, N.8:6198-6206.

175. Russo M.W., Matheny C., Milbrandt J. 1993. Transcriptional activity of the zinc finger protein NGFI-A is influenced by its interaction with a cellular factor. Mol.Cell.Biol. 13:6858-6865.

176. Russo M.W., Sevetson B.R., Milbrandt J. 1995. Identification of NAB1, a repressor of NGFI-A- and Krox20-mediated transcription. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92, N.15:6873-6877.

177. Schneider-Maunoury S., Topilko P., Seitandou T., Levi G., et al. 1993. Disruption of Krox-20 results in alteration of rhombomeres 3 and 5 in the developing hindbrain. Cell 75:1199-1214.

178. Schreiber E., Matthias P., Muller M.M., Schaffner W. 1989. Rapid detection of octamer binding proteins with "mini-extracts", prepared from small number of cells. Nucleic Acids Research 17:6419

179. Schule R., Rangazajan P., et al. 1990. Functional antagonism between oncoprotein c-Jun and the glucococorticoid receptor. Cell 62:1217-1226.

180. Sengupta P. K., Lavelle D., DeSimone J. 1994. Increased binding of Spl to the gamma-globin gene promoter upon site-specific cytosine methylation. Am. J.Hematol. 46:169-172.

181. Shao Z., Robbins P. D. 1995. Differential regulation of E2F and Spl-mediated transcription by G1 cyclins. Oncogene 10:221-228.

182. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. 1996. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver stained polyacrylamide gels. Anal.Biochem. 68:850-858.

183. Shi Y., Berg J.M. 1996. DNA unwinding induced by zinc finger protein binding. Biochemistry 35:3845-3848.

184. Shi Y., Seto E., Chang L.S., Shenk T. 1991. Transcriptional repression by YY1, a human GLI-Kruppel-related protein, and relief of repression by adenovirus El A protein. Cell 67:377-388.

185. Shimizu M., Gellibolian R., Oostra B. A., Wells R. D. 1996. Cloning, characterization and properties of plasmids containing CGG triplet repeats from the FMR-1 gene. J Mol Biol 258:614-626.

186. Siomi H., Siomi M. C., Nussbaum R L., Dreyfuss G. 1993. The protein product of the fragile X gene, FMR1, has characteristics of an RNA-binding protein. Cell 74:291298.

187. Smale S.T., Baltimore D. 1989. The initiator as a transcriptional control element. Cell 57:103-113.

188. Sogawa K., Imataka H., Yamasaki Y., Kusume H., et al. 1993. cDNA cloning and transcriptional properties of a novel GC box-binding protein, BTEB2. Nucleic Acids Research 21:1527-1532.

189. St-Arnaud R., Moir J.M. 1993. Wnt-1-inducing factor-1: a novel G/C box-binding transcription factor regulating the expression of Wnt-1 during neuroectodermal differentiation. Mol.Cell.Biol. 13, N.3:1590-1598.

190. Steger D., Workman J.L. 1998. Remodeling chromatin structures for transcription: what happens to the histones? BioEssays 18 (11):875-884.

191. Stern S., Tanaka M., Herr W. 1989. The Oct-1 homoeodomain directs formation of a multiprotein- DNA complex with the HSV transactivator VP16. Nature 341:624-630.

192. Suggs S.V., Katzowitz J.L., Tsai-Morris C., Sukhatme V.P. 1990. cDNA sequence of the human cellular early growth response gene Egr-1. Nucleic Acids Research 18:4283

193. Sukhatme V.P., Cao X.M., Chang L.C., Tsai-Morris C.H., et al. 1988 A zinc finger-encoding gene coregulated with c-fos during growth and differentiation, and after cellular depolarization. Cell 53:37-43.

194. Sutcliffe J. S., Nelson D. L., Zhang F., Pieretti M., et al. 1992. DNA methylation represses FMR-1 transcription in fragile X syndrome. Hum Mol Genet 1:397-400.

195. Sutherland G. R. 1979. Heritable fragile sites on human chromosomes I. Factors affecting expression in lymphocyte culture. Am J Hum Genet 31:125-135.

196. Swiatek P.J., Gridley T. 1993. Perinatal lethality and defects in hidbrain development in mice homozygous for a target mutation of the zinc finger gene Krox 20. Genes&Dev. 7, N.11:2071-2084.

197. Swimoff A.H., Milbrandt J. 1995. DNA-binding specificity of NGFI-A and related zinc finger transcription factors. Mol.Cell.Biol. 15, N.4:2275-2287.

198. Trifonov E.N. 1996. Interfering contexts of regulatory sequence elements. International Workshop on Computational Analysis of Eukaryotic Transcriptional Regulatory Elements, p. 26. Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg.

199. Tsai-Morris C.H., Cao X.M., Sukhatme V.P. 1988. 5' flanking sequence and genomic structure of Egr-1, a murine mitogen inducible zinc finger encoding gene. Nucleic Acids Research 16:8835-8846.

200. Tsukiyama T., Becker P.B., Wu C. 1994. ATP-dependent nucleosome disruption at a heatshock promoter mediated by binding of GAGA transcription factor. Nature 367:525-531.

201. Turner B.M. 1995. Histone acetylation in chromatin and chromasomes. Semin.Cell Biol. 6:229-236.

202. Verkerk A. J., Pieretti M., Suteliffe J. S., Fu Y. H., et al. 1991. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell 65:905-914.

203. Vlach J., Garcia A., Jacque J. M., Rodriguez M. S., et al. 1995. Induction of Spl phosphorylation and NF-kappa B-independent HIV promoter domain activity in T lymphocytes stimulated by okadaic acid. Virology 208:753-761.

204. Wang Z.Y., Qiu Q.Q., Deuel T.F. 1993. The Wilms' tumor gene product WT1 activates or suppresses transcription through separate functional domains. Journal of Biological Chemistry 268, N.13:9172-9175.

205. Wang Z-Y., Qiu Q-Q., Enger K.T., Deuel T.F., 1993. A second transcriptionally active DNA-binding site for the Wilms tumor gene product, wtl. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90, N.19:8896-8900.

206. Wang Z.-Y., Madden S. L., Denel T. F., Rauscher mF. J. 1992. The Wilms' tumor gene product Wt-1, represses transcription of the platelet-derived growth factor A-chain gene. Journal of Biological Chemistry 267, N.31:21999-22002.

207. Waters C.M., Hancock D.C., Evan G.I. 1990. Identification and characterisation of the egr-1 gene product as an inducible, short-lived, nuclear phosphoprotein. Oncogene 5:669-674.

208. Weinmann R. 1992. The basic RNA polymerase II transcriptional machinery. Gene Expression 6:3300-3309.

209. Weis L., Reinberg D. 1992. Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. FASEB J. 6:3300-3309.

210. Wilkinson D.G., Bhatt S., Chavrier P., Bravo R., et al. 1989. Segment-specific expression of a zinc-finger gene in the developing nervous system of the mouse. Nature 337:461-464.

211. Williams J.L., Garcia J., Harrich D., et al. 1990. Lymphoid specific gene expression of the adenovirus early region 3 promoter is mediated by NFl-kB binding motifs. EMBO J. 9, N.13:4435-4442.

212. Williams T. 1988. Cloning and expression of AP-2, a cell-typr-specific transcription factor that activates inducible enchancer elements. Genes Dev. 2:1557-1569.

213. Williams T., Tjian R. 1991. Analysis of the DNA-binding and activation properties of the human transcription factor AP-2. Genes Dev. 5 (4):670-682.

214. Williams T., Tjian R. 1991. Analysis of the DNA binding and activation properties of the human transcription factor AP2. Genes&Dev. 5:670-682.

215. Wingender E., Dietze P., Karas H., Knoppel R. 1996. TRANSFAC: a database on transcription factors and their DNA binding sites. Nucleic Acids Research 24:238-241.

216. Worrad D. M., Ram P. T., Schultz R, M. 1994. Regulation of gene expression in the mouse oocyte and early preimplantation embryo: developmental changes in Spl and TATA box- binding protein, TBP. Development 120:2347-2357.

217. Yang-Yen H.-F., Chambard I.-L., et al. 1990. Transcriptional interference between c-Jun and glucocorticoid receptor: mutual inhibition of DNA-binding due to direct protein-protein interection. Cell 62:1205-1215.

218. Yano-Yanagisawa H., Li Y., Wang H., Kohwi Y. 1995. Single-stranded DNA binding proteins isolated from mouse brain recognize specific trinucleotide repeat sequences in vitro. Nucleic Acids Research 23:2654-2660.

219. Zerler 1VL, Christy R.J., Uang R.C.C. 1992. Nuclear protein binding to the 5'enhancer region of the intracisternal particle long terminal repeat. Journal of Biological Chemistry 267, N.29:21200-21206.

220. Zhao Y., Cheng W., Gibb C. L., Gupta G., et al. 1996. HMG box proteins interact with multiple tandemly repeated (GCC)n (GGC)m DNA sequences. J.Biomol.Struct.Dyn. 14:235-238.

221. Zhu Q. S., Heisterkamp N., Groffen J. 1990. Unique organization of the human BCR gene promoter. Nucleic Acids Research 18:7119-7125.

Информация о работе

Орлов, Сергей Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 1999
ВАК 03.00.04

Диссертация

Характеристика нового ЦИС - элемента регуляции транскрипции генов млекопитающих вида (GCC)4 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы