Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы"

на правах рукописи УДК 577.3

Женило Светлана Валерьевна

Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих Р02-домен и цинковые пальцы

03.00.02. - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2006

Работа выполнена в МФТИ (Государственный университет), на кафедре молекулярной биофизики и в центре "Биоинженерия" РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук Прохорчук Егор Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Разин Сергей Владимирович кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

Ведущая организация: Институт обшей генетики РАН

Защита состоится 22 марта 2006 г, в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук

В Е. Браги н

g оос A

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Клетки многоклеточного организма генетически одинаковы, но в тоже время отличаются друг от друга, как структурно, так и функционально благодаря различной экспрессии генов. Многие отличия в экспрессии генов возникают в процессе развития организма и сохраняются во время митоза. Подобные стабильные изменения называются "эпигенетическими", при наследовании таких изменений не возникают мутации последовательности ДНК. Исследования последних лет были нацелены на изучение двух молекулярных механизмов, которые лежат в основе эпигенетики: метилирования ДНК и модификации гистонов. Оба этих механизма являются критическими в раннем эмбриогенезе и гаметогенезе, для тканеспецифической экспрессии генов. Также эпигенетические механизмы защищают организм от вирусных геномов, которые могли бы направить работу клетки в своих целях. Нарушения в структуре хроматина могут привести к глобальным изменениям процесса развития организма, например, может быть нарушена инактивация Х-хромосомы, геномный импринтинг, могут развиваться различные заболевания.

Известно, что метилирование ДНК часто связано с подавлением транскрипции. Метилирование промоторных участков вызывает сильное и наследуемое подавление транскрипции определенных генов (Bird A., Genes Dev, 2002). Понимание механизма метил-чувствительной репрессии пришло в связи с открытием белков, которые могут распознавать метилированую ДНК и подавлять транскрипцию. У позвоночных белки, содержащие метил-ДНК-связывающий домен (MBD домен), представляют большой класс белков (MBD1, МеСР2, МВ02, MBD3, MBD4), которые могут связываться с одиночными метилироваными СрС парами и которые участвуют во многих процессах: в контроле стабильности генома, раннем эмбриональном развитии, созревании нейронов, дифференцировке Т клеток и др. Но с другой стороны MBD белки не являются единственными, распознающими метилированую ДНК; белок Kaiso взаимодействует с метилироваными COCO с помощью трех цинковых пальцев, а не за счет MBD домена. Кроме этого Kaiso может взаимодействовать и с неметилированой последовательностью TCCTGCNA (Daniel J.M. et al., Nucleic Acids Res, 2002). На данный момент возможно существование и других метил-ДНК связывающихся белков, так как по нашим данным в

клеточных линиях, в которых отсутствуют МВ01, МВ02, Меср2 и Ка^эо по-прежнему наблюдаются белки с метил-специфической активностью.

4

Цель и задачи исследования. Основной целью данной диссертационной работы являлось определение новых метил-ДНК связывающих белков и их характеристика: •используя поиск по базе данных найти гомологи метил-ДНК связывающего белка Kaiso •определить способность найденных белков связываться с метилированой ДНК т vitro и In vivo

•выяснить являются ли найденные белки метил-ДНК-зависимыми репрессорами транскрипции, если являются, то определить домены данных белков, ответственных за репрессию

-определить картину экспрессии найденных белков в различных тканях мыши и клеточных линиях.

Научная новизна и практическая ценность работы. Основной проблемой в области изучения метил-ДНК связывающих белков является тот факт, что при удалении гена dnmt-1, который поддерживает метилирование ДНК во время митоза, происходит значительное уменьшение метилированой ДНК и наступает смерть эмбриона в середине гестации. С другой стороны делеция известных метил-ДНК-связывающих белков (MBD2, МеСР2, Kaiso) не приводит к нарушениям в эмбриональном развитии. Это говорит о том, что возможно данные метил-ДНК связывающие белки взаимозаменяемы. С другой стороны, недавно была получена мышь, в которой путем генетического нокаута удалили гены этих трех метил-ДНК-связывающихся белков. Никаких аномалий при эмбриональном развитии такого животного не наблюдалось. Поэтому, вероятно, что данные белки являются не единственными белками, которые могут воспринимать метилированую ДНК. Данная работа направлена на поиски новых метил-ДНК связывающих белков, которые, возможно, помогут решить данную проблему; и в работе были найдены два новых белка ZBTB4 и ZBTB38, гомологичных Kaiso, обладающих метил-ДНК связывающей активностью in vliro и in vivo.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 18-ой Международной конференции "Epigenetic bases of genome «programming" (Капри, Италия, 2005) и на межлабораторном семинаре, проведенном в центре "Биоинженерия" РАН первого ноября 2005 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы доклада на одной конференции и одна статья в международном реферируемом журнале.

•• %*г/"•/Г'* 1ЯЦМ111 > МЦПЛ ГМ^Ч/КУНи ни эо С I ршшцол,

включает / таблиц и "^£_рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 4О источников.

Результаты исследования Два новых белка ZBTB4 и ZBTB38, гочолог ичных Kaiso, узнают метилированию ДНК In vitro. Используя в качестве основы для сравнения последовательность из 78 аминокислот, включающей три цинковых пальца Kaiso был проведен поиск по базе данных NCBI, RefSeq проект (hUp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/HsBlast.html ). Были найдены два белка: ZBTB4 и ZBTB38. ZBTB4 - новый не охарактеризованный белок, а ZBTB38 - это человеческий аналог крысиного белка Zenon, который был получен из одногибридной системы при взаимодействии с промотором гена тирозин гидрокснлазы (Kiefer H. et al., Mol. Cell Biol., 2005). Гомология между цинковыми пальцами Kaiso и ZBTB4 составляет 62%, а между Kaiso и ZBTB38 - 65% (рис I)

Kaiso ZBTB4 ZBTB38

CIVCKRSYVCLTSLRRHFNIh SWEKKYE CRYCEKVPPLAEÏRTKHEIHrfrGERRYdCLACGKSFIMYQFMSSHIKfiVJi CAACERSYVTLSSUOUJSHVH SWRRKYÍ CRYCEKVFALAEYRTKHEVWb TGERRYC CI FCWETFVTYYNUCTHQRAPU CVVCI0<5YVTLS6bRRHAyV№WRRTYE^HYCKKVFALAEYRTRHEIWlfrQERRYqCIFCLETFMTYYILKNHQKfiFIj

В

Kaiso ШШГ

(674 aa)

ZBTB4

(1013 aa)

ZBTB38 ГИКЕ

31Ж

Ulli (1195 88)

гомологичные цинковые пальцы

I цинковые пальцы глутамин-богатый домен

85 пролин-богатый домен В ВТВ/РОг

Рвс.1 2ВТВ4 и ¿ВТВ38 содержат цинковые пальцы, гомологичные КаЬо. А. Выравнивание участка Ка^о, содержащего три цинковых пальца, с гВТВ4 и гВТВ38. Три цинковых пальца выделены. Аминокислоты, совпадающие у трех белков, отмечены звездочками. В. Структура Каюо, гВТВ4, гВТВ38. Белки выровнены по трем цинковым пальцам. ВТВ домен ¿ВТВ4 содержит вставку.

Участок с наибольшей гомологией включает первые два цинковых пальца, третий цинковый палец наименее консервативен. Все три белка: Ка1зо, гВТВ4, гВТВ38 - на Ы-конце содержат РОг/ВТВ домен, хотя у 2ВТВ4 РОг/ВТВ домен прерывается 60 аминокислотами, в основном серинами и аланннами. 1ВТВА и гВТВ38 в отличие от Ка1зо включают в себя дополнительные цинковые пальцы на С-конце, а в гВТВ4 ещё присутствуют два пролин-богатых участка и один глутамин-богатый (Рис.1 В).

ZBTB38

ZBTB4

Kaiso

28.2 •

—г-

25

20

15

10

Nucleotide substitutions (xlOO)

■d

Bos taurus Rottusnorvtgicut Musimatlus Homo sapiens Callus gallus Xenopvi laevis Dame reno

— Katlusnorveglcus

— Mus muiculuj

— Cams ¡(¡miliaris

~ Homo sapiens

Fugu mbnpes Musmusculus Raitusnorvegicus Homo sapiens Bos taurus Xenopus laevis fugurubnpes Donioreno

—l

0

Рис.2 Филогенетическое дерево для Kaiso, ZBTB4, ZBTB38 семейств.

При исследовании баз данных геномов позвоночных оказалось, что у всех организмов есть Kaiso и, по крайней мере, один из ZBTB4 или ZBTB38. Филогенетическое дерево было построено на основании сравнения полноразмерных белков (Рис.2). Например, в геноме рыбы fugu rubripes был найден только ZBTB4, в то время как в другом виде рыб Danio rerlo мы смогли обнаружить ZBTB38. Поскольку геномные проекты для некоторых организмов ещё не закончены (Bos Taurus, Canis Familiarls, Gallus gallus), то, возможно, что в этих организмах могут присутствовать дополнительные гены данных семейств.

® 3t £2 ® X Q

О 00 CO ^ О СО СО V/ 5 iu« м аммшим

I -8 Ё fc & I fc fc ^MNN KBS meCpG

^¡¿NNJSiNN ^

oo

в Ф 3t £2

® - ^ «see zbtb4

ш

ЙЙЙ1

яцаш __ щщц

M- M+ KBS проб«

конкурент

COCO 1МСОЮО »СШ.Ш

конкурент fl) ^ _

i p -

метилированая прооа

метилированая прооа

конкурент

метилированая проба метилированая проба

Рис. 3 Цинковые пальцы ОДю, 2ВТВ4, гВТВ38 были экспрессированы в кроличьих ретикулоцитных лизатах. Полученные белки инкубировали с меченой (А.метилированой или неметилированой пробой; В. с пробой КВБ) и разделяли полученные комплексы в 6% акриламидном геле. С. гВТВ4 связывает метилированую и полуметнлированую ДНК. К комплексу цинковые пальцы гВТВ4 с метилированой пробой добавляли в качестве конкурента немеченую пробу указанной последовательности. О. Эксперимент выполнен как в пункте С, в качестве белка взяты цинковые пальцы гВТВ38.

Для проверки связывания найденных белков с метилированой ДНК были синтезированы In vitro цинковые пальцы ZBTB4 и ZBTB38, гомологичные цинковым

пальцам Kaiso (поскольку именно данный домен отвечает у Kaiso за связывание с метилированой ДНК).

Затем методом задержки ДНК белковых комплексов в геле с неметилированой и метилированой СО-богатой пробой (длиной 161 пар нуклеотидов) было покачано, что ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированой пробой, но не с неметилированой, так же как и цинковые пальцы Kaiso (рис.ЗА). Поскольку цинковые пальцы Kaiso могут взаимодействовать не только с метилированой ДНК, но и с сайтом KBS (TCCTGCCA) (Daniel J.M et al, Nucleic Acids Res 2002), то было проверено' могут ли цинковые пальцы ZBTB4 и ZBTB38 также связываться с KBS сайтом; в качестве контроля был взят мутированый сайт KBS (TCC£GCCA), с которым Kaiso не имеет сродства. В результате эксперимента по задержке подвижности в геле оказалось, что цинковые пальцы ZBTB4, как и Kaiso, обладают сродством не только к метилированой CG-богатой пробе, но и к KBS, в то время как ZBTB38 связался только с метилированой ДНК (рис.ЗВ). Причем связывание ZBTB4 с KBS как видно на рисунке ЗВ с более низким сродством чем с метилированой пробой.

Таким образом, можно сделать вывод, что цинковые пальцы ZBTB4, также как и у Kaiso, могут связывать не только метилированую ДНК, но и последовательность ТССТОССА, хотя и с меньшим сродством; в то время как ZBTB38 не может взаимодействовать с KBS сайтом.

При более детальном исследовании взаимодействия ZBTB4 и ZBTB38 с метилированой ДНК было выяснено, что эти два белка не взаимодействуют как с неметилироваными олигонуклеотидами, так и с олигонуклеотидами, содержащими метилирование цитознны а следующих последовательностях шСрА и CpmCpTpGpG, где тС - метилирований цитозин. Стоит заметить, что если компетиюром я пляс гея олигонукпеотид с одним метилированым CpG, то и ZBTB4 и ZBTB38 связываются с ним (рис.ЗС, D).

Кроме этого ZBTB4 обладает аффииостыо к полуметилированой ДНК, хотя и меньшей, чем к полностью метилированой ДНК. Данные результаты позволяют сделать вывод, что ZBTB4 и ZBTB38 связывают метилированые CpG пары, но не другие метилирование последовательности; а также показывают различие между Kaiso и данными белками: для связывания Kaiso необходимы, по крайней мере, два метилированых CpG (Prokhortchouk A, Genes&Dev, 2001), в то время как вновь открытым белкам достаточно одной метилированой CpG пары.

ZBTB4 и ZBTB38 связывают метилированую ДНК in vivo. Следующим этапом в характеристике данных белков является проверка, могут ли они связывать метилированую ДНК in vivo. Хорошую модельную систему для этого представляют импринтироваиые гены, в которых есть участок ДНК, который гипо- или гиперметилирован в зависимости от происхождения данного аллеля (то есть материнский он или отцовский). В таком качестве мы выбрали H19/IGF2 локус на 7-ой хромосоме мыши и область, называемую "дифференциально метилированый район" (DMR), который метилирован на отцовском аплеле и неметилирован на материнском аллеле в мозге мыши (Délavai К. & Feil R., Curr. Opin. Genet. Dev, 200S). Сначала мы картировали точечный нуклеотидный полиморфизм (SNP) в выбранной области, которая имеет наибольшую плотность метилированых CpG.

Spr. (paternal) Dom. (maternal)

o J ?

????

Haelll

cl á Sf л 2

F < о з

paternal

+Hael

maternal

Рис.4 Метил-специфичное связывание Kaiso, ZBTB4 и ZBTB38 с метилированым участком DMR локуса Igf2/H 19 На диаграмме представлены два аллеля материнский (Domesticus) и отцовский (Spretus ) с картированым сайтом НаеШ на материнском аллеле, закрашенные кружочки и не закрашенные представляют метилированые и неметилированые участки соответственно Верхняя панель. хроматин иммунопреципитация с антителами, указанными на рисунке Преиммунная сыворотка получена из животного, в котором получали антитела на ZBTB4, No Ab -иммунопреципитация проведена без добавления антител, No DNA -без ДНК, Input -нанесён 1% Input. ПЦР продукты были разделены в 1% агарозном IxTBE геле. Нижняя панель: ДНК была выделена из агарозного геля (см. верхнюю панель) и рестрицирована НаеШ. Рестрицированые фрагменты были разделены в 1% IxTBE агарозном геле.

Благодаря этому полиморфизму в линии мышей Domeslicus появляется сайг рестрикции Haelll, а в линии Spretus данный сайт отсутствует. Был выделен хроматин из мозга химерной мыши Sd7, у которой отцовская хромосома от Spretus мыши, а материнская от Domesticus мыши (Fome Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1997). Методом хроматин нммунопреципитации показано, что Kaiso, ZBTB4 и ZBTB38 связаны в основном с метилировании отцовским DMR участком, но не с неметелированым материнским (рис.4). В качестве контроля была использована контрольная иммунопреципитация с антителами к CTCF, который, как известно, связывается с неметилированым материнским аллелем.

Известно, что в ядрах мышиных клеток перицентромерные области различных хромосом агрегируют и образуют структуры, называемые хромоцентрами, содержащие большие и малые сателлитные повторы, которые метилированы. Эти структуры хорошо детектируются с помощью микроскопа, поскольку они хорошо окрашиваются специальным красителем DAPI. Так для МеСР2 и MBD1 было показано, что при трансфекции данные белки локализуются на хромоцентрах У нас возник вопрос будут ли ZBTB4 и ZBTB38 также находиться на хромоцентрах при экспрессии в мышиных клетках Для ответа на поставленный вопрос были получены конструкции, в которых клонированы полноразмерные кДНК ZBTB4 и ZBTB38 в одной рамке считывания с красным флуоресцентным белком mRFPl С данными конструкциями была посишлепа транзиторная трансфекция в мышиную линию клеток NIH313, и проведено иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к данным белкам (рис 5А) В обоих случаях видно, что сигнал от данных белков, как флуоресценция от RFP, так и окрашивание антителами, совпадает с хромоцентрами, покрашенными DAPI. Следующий вопрос, который возник, достаточно ли Kaiso подобного домена "цинковые пальцы", который, как показано выше, взаимодействует с метилированой ДНК, чтобы связываться с хромоцентрами. Используя цинковые пальцы ZBTB4, ZBTB38 в одной рамке считывания с mRFPl мы показали, что эти белки колокализуются с хромоцентрами при трансфекции в те же клетки (рис 5В), то есть цинковых пальцев достаточно для того, чтобы эти белки локализовались в хромоцентрах. Для того чтобы понять, за счЬт чего ZBTB4, ZBTB38 в клетках оказываются на хромоцентрах, а именно, влияет ли то, что ДНК в хромоцентрах метилирована на локализацию данных белков, были использованы клетки с нарушением метилирования. Это мышиные эмбриональные фибробласты, у которых удален каталитический домен ДНК-мегил трансферазы-1 В данных клетках значительно понижен уровень метилирования ДНК (но вей же остаточное мешлирование присутствует благодаря de novo метилтрансферазам DNMT3a,3b),

Но, поскольку, удаление Dnmt-1 летально для клеток, так как клетки умирают по р53 зависимому пути (Jackson-Grusby et al., Nat. Genetics,2001), то мы использовали клетки, в которых отсутствуют и Dnmt-1 и р53 (клетки были любезно предоставлены профессором Бёрдом (Adrian Bird), которые жизнеспособны, в качестве контроля использовали мышиные эмбриональные фибробласты с удаленным геном р53.

rfp-zbt^4 •: • rfp-zbtb4

pi o-zbtb4 • -.

dapi dapi .

RFP-ZBTB38 1 r x i . RFP-ZBTB38 1 i /

PI a-ZBTB38 /i. . **> ■

DAPI * . • \ • f * * . * * DAPI i

RFP-ZBTB4 RFP-ZBTB4(ZF)

a

« •

. * " »

• «

DAPI DAPI

>

V ■ «

RFP-ZBTB38 RFP-ZBTB36(ZF

• ■»» • 4 * V'« 4't •

DAPI ' DAPI Л. A •

- . . - «-

Рис.5 ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированой ДНК в клетках. A.RFP-ZBTB4 и RFP-ZBTB28 были транзиторно трансфецированы в NIH3T3. Трансфецированые клетки были зафиксированы и окрашены либо преиммуной сывороткой (PI), либо антителами к данным белкам: a-ZBTB4 и a-ZBTB38. Затем клетки были обработаны вторичными антителами, коньюгироваными с Alexa Fluor® 488, которые флуоресцируют в том же диапазоне, что и GFP. Сигнал после окрашивания антителами к ZBTB4 и ZBTB38 совпадает с флуоресценцией RFP и хромоцентрами, окрашенными DAPI. В. Цинковые пальцы ZBTB4 и ZBTB38 достаточны для связывания с хромоцентрами. В клетки NÎH3T3 были трансфецированы RFP-ZBTB4, RFP-ZBTB4 (ZF) -цинковые пальцы ZBTB4 с RFP, RFP-ZBTB38, RFP-ZBTB38 (ZF).

При трансфекции в контрольные клетки RFP-ZBTB4 и RFP-ZBTB38 эти белки были локализованы в хромоцентрах. При трансфекции в (dnmtl-/-,p53-/-) клетки ZBTB4 и

I

ZBTB38 в 60% клеток оказываются распределенными диффузно по всему ядру и только в 30-40% клеток по-прежнему локализованы в хромоцентрах (рис.6).

RFP-ZBTB4 RFP-ZBTB4 *

DAPI DAPI

RFP-ZBTB38 RFP-ZBTB38

• »

. j -u

DAPI DAPI

69%

31%

62%

38%

Рис.6. А^Р-гВТВ4 и В ЯРР-гВТВ38 были транзиторно трансфецированы в с1птИ-/-,р53-Л клетки, в которых нарушено метилирование. Трансфецированые клетки были зафиксированы и окрашены ОАР1. На рисунках А и В представлены по два типа клеток I тип клеток: гВТВ4 (А) и гВТВ38 (В) уходят с хромоцентров в клетках с нарушенным

метилированием ДНК. II тип клеток, в которых и ZBTB4 (А) и ZBTB38 (В) по-прежнему остаются на хромоцентрах,

Аналогичная ситуация наблюдалась при трансфекции в эти же клетки другого метил-ДНК связывающего белка МеСР2. Возможно, что данные белки могут также узнавать саму структуру гетерохроматина, а не только статус метилирования ДНК. Тем не менее, данный эксперимент позволяет сделать вывод, что ZBTB4 и ZBTB38 связывается с метнлированой сателлитной ДНК /я vivo. И что метилирование необходимо и достаточно для локализации этих белков в хромоцентрах.

ZBTB4 и ZBTB38 являются метил-зависимымн репрессорамн. Kaiso, как и некоторые другие белки с POZ/BTB доменом и цинковыми пальцами является репрессором транскрипции. Поэтому возник вопрос, являются ли найденные ZBTB4 и ZBTB38 метил-ДНК зависимыми репрессорамн. Для ответа на данный вопрос ZBTB4 и ZBTB38 были совместно экспрессированы в клетках млекопитающих с метилированым или неметилированым репортёрным геном. Чтобы избежать репрессии за счёт эндогенного MBD2 белка, были использованы клетки mbd2-/-. Метилированая репортёрная конструкция содержит ген люциферазы под контролем SV40 промотора и включает 48 СрО пар и 11 CGCO кластеров.

Рис.7 ZBTB4 и ZBTB38 подавляют транскрипцию in vivo только на метилированых матрицах ДНК. Конструкции, с которых экспрессировались белки, были совместно транзиторно трансфецированы с метилированой, либо неметилированой SV-40 репортёрной конструкцией. Относительная репортёрная активность рассчитывалась следующим образом: уровень экспрессии с метилированого репортёра/уровень экспрессии с неметилированого репортёра* 100. На диаграмме приведены усредненные данные трёх mock Kabo ZBTB4 ZBTB3S экспериментов.

Уровень транскрипции с метилированого репортерного гена в тМ2-/- клетках составляет около 25% от неметилированой конструкции. Экспрессия гВТВ4 приводит к падению уровня транскрипции с метилированой матрицы до 2%. Что касается гВТВ38, то данный белок, как оказалось, является более слабым репрессором, уровень репрессии составляет от 7% до 15%, что сравнимо с репрессионной способностью Ка1зо (рис.7).

гвтв41 и» ■ ■■■ II I

I _1013

1 ■■ I

2 -к и 1

3 м- ■■■ |-■■ I

4 11 \■ НИ

5 II III )

210 --594

Ка|50-гомологичные ХРЧ

Рис.8 Цинковых пальцев гВТВ4 достаточно для метил-зависимой репрессии, Эксперимент с 2ВТВ4 и различными делециями проведен также как и на рисунке 7.

Чтобы узнать, какой из доменов этих белков участвует в репрессии были получены 5 различных конструкций для гВТВ4 и две для гВТВ38. Проверив данные конструкции, получилось, что в случае гВТВ4 для репрессии необходим участок, содержащий цинковые пальцы, которые взаимодействуют с метилированой ДНК (рис.8 конструкция 5). ВТВ домен и С-концевые цинковые пальцы не оказывают влияние на уровень экспрессии (конструкция 1, 4). При удалении участка с метил-ДНК связывающими пальцами, получившийся белок менял свою внутриклеточную локализацию из ядра в цитоплазму, поэтому мы присоединили к данному белку сигнал ядерной локализации,

который был обнаружен у Каюо, и белок, благодаря этому сигналу, транспортировался в ядро. Тем не менее, полученный таким образом белок не мог репрессировать транскрипцию с метилированой репортёрной конструкции.

Что же касается гВТВ38, то для того, чтобы этот белок мог проявить репрессионную способность, необходимы не только цинковые пальцы, которые связываются с метилированой ДНК, но и Ы-концевой ВТВ домен (рис.9), С-концевые цинковые пальцы практически не оказывают влияние на репрессионную способность белка.

гвтвз8гщ~ ч ■■■

6 (ИГ

331

7 II т-1

- 600

Ка1$о-гомологичные ZP's

Рис.9 Для метил-зависимой репрессии 2ВТВ38 необходимы как цинковые пальцы, так и ВТВ/РОг домен. Эксперимент с гвТБ38 и делецнями проведен также как и на рисунке 7.

Картина экспрессии 2ВТВ4 и гВТВ38. Далее была исследована картина экспрессии 2ВТВ4 и гВТВ38 с помощью нозерн блот гибридизации и РТ-ПЦР. Эти эксперименты показали, что во взрослом организме соответствующие мРНК экспрсссируются во всех

протестированных тканях, хотя и на разном уровне (рис.10). Экспрессия ZBTB38 была исследована ранее в статье Sasai N. et al. , Genes to Cells, 2005 и совпала с нашими данными РТ-ПЦР.

2 S §>

л г

В

С "С ФО)Ь:С>>.<ЛЮЮЮЮ

"8 8 ? § 1 í i ? И

CD ± з-1-JQ.SI®

5 W ^

и 4 ® £ s lu r St

' LLI Ш LU

Рис.10 ZBTB4 экспрессируется во всех протестированных тканях и органах на разном уровне. А. нозерн блот гибридизация с РНК из различных органов, на каждую дорожку нанесено по 2 мкг РНК; верхняя панель: блот был сгибридизован с полноразмерной кДНК ZBTB4; нижняя панель: блот гибридизовали с кДНК GAPDH В. РТ-ПЦР на РНК, выделенной из различных органов и эмбрионов. Уровень экспрессии ZBTB4 определяли с помощью РТ-ПЦР и нормализовали по сигналу от Rps29 транскрипта.

Выводы.

- 1. Найдены два новых гомолога Kaiso: ZBTB4 и ZBTB38, у которых гомологичны три цинковые пальца и N-концевые BTB/POZ домены.

- 2. Показано, что ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированой ДНК in vitro, причем для связывания достаточно одного метилированого CpG; кроме этого ZBTB4 имеет сродство и к неметилированому KBS сайту, также как и Kaiso.

- 3. Показано, что ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированой ДНК in vivo. Данные белки привлекаются к метилирован ым хромоцентрам и взаимодействуют с метилированым DMR локуса H19/IGF2; при отсутствии метилирования в клетках dnmtl-/- данные белки уже не связываются с хромоцентрами.

- 4. Показано, что ZBTB4 и ZBTB38 являются метилчувствительными репрессорами, причем для эффективной репрессии ZBTB4 достаточно трех цинковых пальцев, в то время как для ZBTB38 необходимы как цинковые пальцы, так и BTB/POZ домен. ZBTB4 является более сильным репрессором, чем ZBTB38

- 5. Установлено, что ZBTB4 и ZBTB38 экспрессируются во всех протестированных органах и тканях, хотя и на разном уровне.

Список публикаций

1) FilionG., Zhenilo S„ Salozhin S„ Yamada D., Prokhortchouk E. and Defossez P-A. A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription Molecular and Cellular Biology, 2006, Vol. 26 (1), 169-81.

2) Zhenilo S., Filion G., Salozhin S., Defossez P-A., Prokhorthcouk E. A family of Kaiso-like proteins that bind methylated DNA and repress transcription. Eighteen 1GB meeting, Epigenetic Bases Of Genome Reprogramming, Capri, Italy, 8-11 October, 2005, p.70

Женило Светлана Валерьевна

Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих Р02-домен и цинковые пальцы

подписано в печать 26.01.2006. Формат 60*84/16. Печать офсетная, усл. печ.л 1,0. Тираж 70экз. Заказ ф-012.

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Московский физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных издательских систем "ФИЗТЕХ ПОЛИГРАФ" 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9

) t J

1

||

I

IÍ <

I

\ (

I

\

Í - 35 73

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Женило, Светлана Валерьевна

Введение.

1.1.Метилирование генома эукариот и растений.

1.2. ДНК метилтрансферазы. Защита от de novo метилирования.

1.3. X инактивация. Геномный импринтинг.

1.4 Метилирование ДНК и заболевания.

1.5 Модификации гистонов. Связь метилирования ДНК и модификаций гистонов.

1.6 Метил-ДНК-связывающие белки.

1.7 Краткая характеристика белков семейства BTB/POZ.

2. Материалы и методы.

2.1.3. Олигонуклеоитиды для клонирования полноразмерных Kaiso, ZBTB4, ZBTB и цинковых пальцев ZBTB4 и ZBTB38 для имуннофлуоресценции.

2.1.4.0лигонуклеотиды для анализа результатов по иммунопреципитации хроматина методом ПЦР.

2.1.5. Олигонуклеотиды, использованные для РТ-ПЦР.

2.1.6. Олигонуклеотиды для получения NLS Kaiso.

2.2. Полноразмерные кДНК Kaiso, ZBTB4, ZBTB38.

2.3. Полимеразная цепная реакция.

2.3. Трансформация E.coli и выделение плазмидной ДНК.

2.4. Получение компетентных клеток.

2.5. Клонирование ПЦР-продукта.

2.6. Получение радиоактивно меченых ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле.

2.7. Исследование ДНК-белкового взаимодействия методом задержки подвижности в геле ДНК-белкового комплекса.

2.8.Иммунопреципитация хроматина.

2.9. Нозерн блот гибридизация и количественный РТ-ПЦР.

2.10. Клеточные линии и временная трансфекция.

2.11. Метил-зависимый репрессионый тест.

2.12. Иммунофлуоресценция и микроскопия.

2.13. Клонирование цинковых пальцев Kaiso, ZBTB4, ZBTB38 для in vitro трансляции.

2.14. Клонирование полноразмерных Kaiso, ZBTB4, ZBTB38 и цинковых пальцев данных белков для иммунофлуоресценции.

2.15. Клонирование делений ZBTB4 и ZBTB38 для метил-зависимого репрессионого теста.56 '

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Два новых белка ZBTB4 и ZBTB38, гомологичных Kaiso, узнают метилированую ДНК in vitro.

3.2. ZBTB4 и ZBTB38 связывают метилированую ДНК in vivo.

3.3 ZBTB4 и ZBTB38 являются метил-зависимыми репрессорами.

3.4. Картина экспрессии ZBTB4 и ZBTB38.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Женило, Светлана Валерьевна

Выводы.

-найдены два новых гомолога Kaiso: ZBTB4 и ZBTB38, у которых гомологичны три цинковые пальца и N-концевые BTB/POZ домены

- показано, что ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированой ДНК in vitro, причем для связывания достаточно одного метилированого CpG; кроме этого ZBTB4 имеет сродство и к неметилированому KBS сайту, также как и Kaiso

- показано, что ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированой ДНК in vivo. Данные белки привлекаются к метилированым хромоцентрам и взаимодействуют с метилированым DMR локуса H19/IGF2; при отсутствии метилирования в клетках dnmtl-/- данные белки уже не связываются с хромоцентрами

- показано, что ZBTB4 и ZBTB38 являются метилчувствительными репрессорами, причем для эффективной репрессии ZBTB4 достаточно трех цинковых пальцев, в то время как для ZBTB38 необходимы как цинковые пальцы, так и BTB/POZ домен. ZBTB4 является более сильным репрессором, чем ZBTB38

-установлено, что ZBTB4 и ZBTB38 экспрессируются во всех протестированных органах и тканях, хотя и на разном уровне

Благодарности

Хочу выразить благодарность своему научному руководителю Прохорчуку Егору Борисовичу за чуткое руководство и возможность работать над интересными темами. Также хочу поблагодарить тех, кто оказал неоценимую помощь: Саложина Сергея, Прохорчук Анну, Айтхожину Дану. Выразить благодарность Мазуру Александру и Дееву Игорю за обсуждение и критику работы.

Отдельно поблагодарить за предоставленные клеточные линии профессора Бёрда и за предоставление мыши - доктора Вольфом Райком, доктора Дефоссеза за предоставленные антитела.

Хочу поблагодарить кафедру биофизики за возможность выбирать лабораторию, особо хочу выразить благодарность Заседателеву Александру Сергеевичу.

Заключение

Основным вопросом в области изучения метил-ДНК связывающих белков, как уже упоминалось выше, является тот факт, что животные, у которых удалены гены известных метил-ДНК-связывающих белков: МВЭ2, МеСР2, Ка1зо, МЬс11,- нормально проходят стадию эмбрионального развития. с

03 1— п

03 ф

0) 'ли

9490 7460

4400

2370 с Ф 0) о. сп Л сп си

I * '! ^

О) с и щт ся 13 Е хГ

-Ш с ф о 03 о. ф о

У> 3 Е со н са N

1350

2370

1350 В

100 г сл

00 .си ю к ш щ ю ю ю г

Ш ш ш

Рисунок 20. /ВГВ4 экспрессируется во всех протестированных тканях и органах на разном уровне. А. нозерн блот гибридизация с РНК из различных органов, на каждую дорожку нанесено но 2 мкг РНК; верхняя панель: блот был егибридизован с полноразмерной кДНК гВТВ4; нижняя панель: блот гибридизовали с кДНК САРОН В. РТ-ПЦР на РНК, выделенной из различных органов и эмбрионов. Уровень экспрессии ХВТВ4 определяли с помощью РТ-ПЦР и нормализовали по сигналу от Крэ29 транскрипта.

В то время как уменьшение метилированых цитозинов по пятому положению в геноме в результате нокаута гена метил-ДНК-трансферазы dnmt-1 приводит к смерти эмбриона в середине гестации. Одним из возможных объяснений является взаимозаменяемость данных метил-ДНК-связывающих белков. Однако, недавно было показано, что мышь, в которой путем генетического нокаута удалили гены этих трех метил-ДНК-связывающихся белков, развивалась нормально в течение всего эмбрионального периода. Фенотип такой взрослой мыши был практически такой же как и у мыши нокаутной по МеСР2 гену, т.е. с симптомами характерными для Ретт синдрома. Более того в лаборатории профессора Берда (Adrian Bird) на основе siRNA была получена клеточная линия фибробластов из клеток хвоста мыши (нокаутной по Mbd2, МеСР2, Kaiso генам), в которой отсутствовал белок Mbdl (Helle Jorgensen&Adrian Bird, personal communication). Поэтому, вероятно, что данные белки являются не единственными белками, которые могут воспринимать метилированую ДНК.

В данной работе на основе поиска по базе данных данных NCBI, RefSeq проект были найдены два белка, гомологичные Kaiso: ZBTB4 и ZBTB38. Эти белки имеют три гомологичных цинковых пальца и похожую доменную структуру всего белка : на N-конце все три белка содержат BTB/POZ домен. ZBTB4 и ZBTB38 более схожи друг с другом, чем с Kaiso. Возможно эти семейства генов являются результатом двух расхождений от одного общего гена: первое привело к происхождению Kaiso-предшественника и ZBTB4/ZBTB38-npefliuecTBeHHHKa. гВТВ4/гВТВ38-предшественник в свою очередь привел к образованию ZBTB4 и ZBTB38. Данная работа показала, что все три белка связываются с метилированой ДНК. Этот факт говорит в пользу того, что вероятно, общий предшественник данных генов также был наделен этим свойством взаимодействовать с метилированой ДНК, и такая способность связывать метилированую ДНК с помощью цинковых пальцев должна существовать в целом ряде организмов. Практически во всех видах позвоночных были найдены ортологи ZBTB4 и ZBTB38, таким образом можно выделить два семейства: одно содержит ZBTB4, другое ZBTB38. И хотя у некоторых организмов и не были идентифицированы гены того или иного семейства, скорей всего это связано с незаконченностью геномых проектов для данных видов.

Эксперименты по задержке подвижности комплексов белок-ДНК показали, что ZBTB4, также как и Kaiso, обладает сродством к нескольким последовательностям ДНК. In vitro, три цинковых пальца ZBTB4, гомологичные цинковым пальцам Kaiso, могут взаимодействовать как с метилированой ДНК, так и с неметилированым KBS сайтом. Кроме этого, ZBTB4 содержит ещё три дополнительных цинковых пальца (рис.8), которые возможно могут участвовать в распознавании ещё какой-либо последовательности. Такая картина имеет место для ZBTB38 ( 105). Zenon является крысиным гомологом ZBTB38. Как было показано в работе (105) Zenon связывается с неметилированой ДНК, а точнее с Е-боксом CACCTG. Таким образом, и ZBTB4, и ZBTB38 связываются не только с метилированой ДНК, но и с определенными неметилироваными последовательностями.

Если же рассматривать только свойства данных белков связывать метилированую ДНК, то ZBTB4 и ZBTB38 ведут себя также как и MBD белки: связывают метилированые CpG in vitro, привлекаются на хромоцентры в мышиных клетках и подавляют транскрипцию с метилированой матрицы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Женило, Светлана Валерьевна, Москва

1. Reference List

2. Walsh,С.P., Chaillet,J.R. & Bestor,T.H. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. Nat. Genet. 20, 116-117 (1998).

3. Jones,P.A. & Baylin,S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat. Rev. Genet. 3,415-428 (2002).

4. Bird,A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).

5. Klose,R.J. & Bird,A.P. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators. Trends Biochem. Sci. 31, 89-97 (2006).

6. Prokhortchouk,A. et al. The pi20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. Genes Dev. 15, 1613-1618(2001).

7. Лыоин Б.М. Гены, издательство МИР, (1987).

8. Tariq,M. & Paszkowski,J. DNA and histone methylation in plants. Trends Genet. 20, 244-251 (2004).

9. Lander,E.S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860921 (2001).

10. Bird,A.P. & Wolffe,A.P. Methylation-induced repression—belts, braces, and chromatin. Cell 99,451-454(1999).

11. Venter,J.C. et al. The sequence of the human genome. Science 291, 1304-1351 (2001).

12. Jones,P.A. DNA methylation errors and cancer. Cancer Res. 56,2463-2467 (1996).

13. Beaujean,N. et al. Non-conservation of mammalian preimplantation methylation dynamics. Curr. Biol. 14, R266-R267 (2004).

14. Santos,F., Hendrich,B., Reik,W. & Dean,W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo. Dev. Biol. 241, 172-182 (2002).

15. Lucifero,D., Mann,M.R., Bartolomei,M.S. & Trasler,J.M. Gene-specific timing and epigenetic memory in oocyte imprinting. Hum. Mol. Genet. 13, 839-849 (2004).

16. Adams,R.L. & Lindsay,! 1. What is hemimethylated DNA? FEBS Lett. 320,243-245 (1993).

17. Adams,R.L. DNA methylation. The effect of minor bases on DNA-protein interactions. Biochem. J. 265, 309-320 (1990).

18. Adams,R.L. Eukaryotic DNA methyltransferases—structure and function. Bioessays 17, 139-145 (1995).

19. Bestor,T.II. Activation of mammalian DNA methyltransferase by cleavagc of a Zn binding regulatory domain. EMBOJ. 11,2611-2617 (1992).

20. Li,E., Bestor,T.H. & Jaenisch,R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69,915-926 (1992).

21. Lei,H. ei al. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. Development 122, 3195-3205 (1996).

22. Fuks,F., Hurd,P.J., Deplus,R. & Kouzarides,T. The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. Nucleic Acids Res. 31, 2305-2312(2003).

23. Tatematsu,K.I., Yamazaki,T. & Ishikawa,F. MBD2-MBD3 complex binds to hemi-methylated DNA and forms a complex containing DNMT1 at the replication foci in late S phase. Genes Cells 5, 677-688 (2000).

24. Howell,C.Y. et al. Genomic imprinting disrupted by a maternal effect mutation in the Dnmtl gene. Cell 104, 829-838 (2001).

25. Ratnam,S. et al. Dynamics of Dnmtl methyltransferase expression and intracellular localization during oogenesis and preimplantation development. Dev. Biol. 245, 304-314 (2002).

26. Okano,M., Bell,D.W., Haber,D.A. & Li,E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99, 247-257 (1999).

27. Gowher,! 1. & Jeltsch,A. Enzymatic properties of recombinant Dnmt3a DNA methyltransferase from mouse: the enzyme modifies DNA in a non-processive manner and also methylates non-CpG correction of non-CpA. sites. J. Mol. Biol. 309, 1201-1208 (2001).

28. Xu,G.L. et al. Chromosome instability and immunodeficiency syndrome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene. Nature 402, 187-191 (1999).

29. Bourc'his,D. & Bestor,T.H. Meiotic catastrophe and retrotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature 431, 96-99 (2004).

30. Webster,K.E. et al. Meiotic and epigenetic defects in Dnmt3L-knockout mouse spermatogenesis. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 102, 4068-4073 (2005).

31. Okano,M., Xie,S. & Li,E. Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 26, 2536-2540 (1998).

32. Hermann,A., Schmitt,S. & Jeltsch,A. The human Dnmt2 has residual DNA-(cytosine-C5) methyltransferase activity. J. Biol. Chem. 278,31717-31721 (2003).

33. Gidekel,S. & Bergman,Y. A unique developmental pattern of Oct-3/4 DNA methylation is controlled by a cis-demodification element. J. Biol. Chem. 277,34521-34530 (2002).

34. Rand,E., Ben Porath,I., Keshet,I. & Cedar,H. CTCF elements direct allele-specific undermethylation at the imprinted HI9 locus. Curr. Biol. 14, 1007-1012 (2004).

35. Morey,C. el al. The region 3' to Xist mediates X chromosome counting and 113 Lys-4 dimethylation within the Xist gene. EMBOJ. 23, 594-604 (2004).

36. Clerc,P. & Avner,P. Multiple elements within the Xic regulate random X inactivation in mice. Scmin. Cell Dev. Biol. 14, 85-92 (2003).

37. Morey,C. et al. The region 3' to Xist mediates X chromosome counting and H3 Lys-4 dimethylation within the Xist gene. EMBO J. 23, 594-604 (2004).

38. Ogawa,Y. & Lee,J.T. Xite, X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol. Cell 11,731-743 (2003).

39. Heard,E. et al. Methylation of histone H3 at Lys-9 is an early mark on the X chromosome during X inactivation. Cell 107, 727-738 (2001).

40. O'Neill,L.P. et al. A developmental switch in H4 acetylation upstream of Xist plays a role in X chromosome inactivation. EMBOJ. 18,2897-2907 (1999).

41. Costanzi,C., Stein,P., Worrad,D.M., Schultz,R.M. & Pehrson,J.R. Histone macroll2Al is concentrated in the inactive X chromosome of female preimplantation mouse embryos. Development 127,2283-2289 (2000).

42. Heard,E. et al. Methylation of histone 113 at Lys-9 is an early mark on the X chromosome during X inactivation. Cell 107, 727-738 (2001).

43. Cohen,D.E. & Lee,J.T. X-chromosome inactivation and the search for chromosome-wide silencers. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 219-224 (2002).

44. Reik,W. & Walter,J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat. Rev. Genet. 2, 21-32 (2001).

45. Klenova,E.M., Morse,H.C., III, Ohlsson,R. & Lobanenkov,V.V. The novel BORIS + CTCF gene family is uniquely involved in the epigenetics of normal biology and cancer. Semin. Cancer Biol. 12, 399-414 (2002).

46. Schoenherr,C.J., Levorse,J.M. & Tilghman,S.M. CTCF maintains differential methylation at the Igf2/H19 locus. Nat. Genet. 33, 66-69 (2003).

47. Rand,E., Ben Porath,I., Keshet,I. & Cedar,H. CTCF elements direct allele-specific undermethylation at the imprinted HI9 locus. Curr. Biol. 14, 1007-1012 (2004).

48. Schoenherr,C.J., Levorse,J.M. & Tilghman,S.M. CTCF maintains differential methylation at the Igf2/H19 locus. Nat. Genet. 33, 66-69 (2003).

49. Nicholls,R.D. & Knepper,J.L. Genome organization, function, and imprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2, 153-175 (2001).

50. Robertson,K.D. DNA methylation and human disease. Nat. Rev. Genet. 6,597-610 (2005).

51. Chan,A.O. el al. CpG island methylation in aberrant crypt foci of the colorectum. Am. J. Pathol. 160,1823-1830(2002).

52. Sherr,C.J. Cancer cell cycles. Science 21 A, 1672-1677 (1996).

53. Esteller,M. et al. Hypcrmethylation of the DNA repair gene 0(6)-methylguanine DNA methyltransferase and survival of patients with diffuse large B-cell lymphoma./. Natl. Cancer Inst. 94,26-32 (2002).

54. Rozenblum,E. et al. Tumor-suppressive pathways in pancreatic carcinoma. Cancer Res. 57, 1731-1734(1997).

55. Steenman,M.J. et al. Loss of imprinting of IGF2 is linked to reduced expression and abnormal methylation of 1119 in Wilms' tumour. Nat. Genet. 7,433-439 (1994).

56. Martin,C. & Zhang,Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).

57. Schneider,R. et al. Histone H3 lysine 4 methylation patterns in higher eukaryotic genes. Nat. Cell Biol. 6, 73-77 (2004).

58. Zegerman,P., Canas,B., Pappin,D. & Kouzarides,T. Histone H3 lysine 4 methylation disrupts binding of nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) repressor complex. J. Biol. Chem. Ill, 11621-11624 (2002).

59. Peters,A.H. et al. Partitioning and plasticity of repressive histone methylation states in mammalian chromatin. Mol. Cell 12, 1577-1589 (2003).

60. Garcia-Cao,M., 0'Sullivan,R., Peters,A.H., Jenuwein,T. & Blasco,M.A. Epigenetic regulation of telomere length in mammalian cells by the Suv39hl and Suv39h2 histone methyltransferases. Nat. Genet. 36, 94-99 (2004).

61. Fischle,W. et al. Regulation of HP 1-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature (2005).

62. Mutskov,V. & Felsenfeld,G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. EMBOJ. 23, 138-149 (2004).

63. Lindroth,A.M. et al. Dual histone 113 methylation marks at lysines 9 and 27 required for interaction with CHROMOMETHYLASE3. EMBOJ. 23, 4286-4296 (2004).

64. Fuks,F. et al. The methyl-CpG-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation. J. Biol. Chem. 278,4035-4040 (2003).

65. Meehan,R.R., Lewis,J.D., McKay,S., Kleiner,E.L. & Bird,A.P. Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs. Cell 58, 499-507(1989).

66. Lewis,J.D. et al. Purification, sequence, and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA. Cell 69, 905-914 (1992).

67. Stancheva,I., Collins,A.L., Van,d.V., 1, Zoghbi,H. & Meehan,R.R. A mutant form of MeCP2 protein associated with human Rett syndrome cannot be displaced from methylated DNA by notch in Xenopus embryos. Mol. Cell 12,425-435 (2003).

68. Guy,J., Hendrich,B., Holmes,M., Martin,J.E. & Bird,A. A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nat. Genet. 27,322-326 (2001).

69. Martinowich,K. el al. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation. Science 302, 890-893 (2003).

70. Klose,R.J. et al. DNA binding selectivity of MeCP2 due to a requirement for A/T sequences adjacent to methyl-CpG. Mol. Cell 19, 667-678 (2005).

71. Fujita,N. et al. Mechanism of transcriptional regulation by methyl-CpG binding protein MBD1. Mol. Cell Biol. 20, 5107-5118 (2000).

72. Jorgensen,H.F., Ben Porath,I. & Bird,A.P. Mbdl is recruited to both methylated and nonmethylated CpGs via distinct DNA binding domains. Mol. Cell Biol. 24, 3387-3395 (2004).

73. IIendrich,B. & Bird,A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins. Mol. Cell Biol. 18, 6538-6547 (1998).

74. Sarraf,S.A. & StanchevaJ. Methyl-CpG binding protein MBD1 couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to DNA replication and chromatin assembly. Mol. Cell 15, 595-605 (2004).

75. Fujita,N. el al. Methyl-CpG binding domain 1 (MBD1) interacts with the Suv39hl-HPl heterochromatic complex for DNA methylation-based transcriptional repression.J. Biol. Chem. 278, 24132-24138 (2003).

76. Zhao,X. et al. Mice lacking methyl-CpG binding protein 1 have deficits in adult neurogenesis and hippocampal function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 6777-6782 (2003).

77. IIendrich,B-, Guy,J., Ramsahoye,B., Wilson,V.A. & Bird,A. Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development. Genes Dev. 15,710-723 (2001).

78. Sansom,O.J. et al. Deficiency of Mbd2 suppresses intestinal tumorigenesis. Nat. Genet. 34,145-147 (2003).

79. Hutchins,A.S. et al. Gene silencing quantitatively controls the function of a developmental trans-activator. Mol. Cell 10, 81-91 (2002).

80. Lee,P.P. et al. A critical role for Dnmtl and DNA methylation in T cell development, function, and survival. Immunity. 15, 763-774 (2001).

81. Wade,P.A. et al. Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation. Nat. Genet. 23, 62-66 (1999).

82. Wong,E. et al. Mbd4 inactivation increases Cright-arrowT transition mutations and promotes gastrointestinal tumor formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 1493714942 (2002).

83. Hendrich,B. et al. Genomic structure and chromosomal mapping of the murine and human Mbdl, Mbd2, Mbd3, and Mbd4 genes. Mamm. Genome 10, 906-912 (1999).

84. Klug,A. & Schwabe,J.W. Protein motifs 5. Zinc fingers. FASEBJ. 9, 597-604 (1995).

85. Pavletich,N.P. & Pabo,C.O. Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a ZÍÍ268-DNA complex at 2.1 A. Science 252, 809-817 (1991).

86. Yokono,M., Saegusa,N., Matsushita,K. & Sugiura,Y. Unique DNA binding mode of the N-terminal zinc finger of transcription factor Spl. Biochemistry 37, 6824-6832 (1998).

87. Isalan,M. & Choo,Y. Engineered zinc finger proteins that respond to DNA modification by Haelll and Hhal methyltransferase enzymes. J. Mol. Biol. 295,471-477 (2000).

88. Isalan,M., Klug,A. & Choo,Y. Comprehensive DNA recognition through concerted interactions from adjacent zinc fingers. Biochemistry 37, 12026-12033 (1998).

89. Laity,J.H., Dyson,H.J. & Wright,P.E. DNA-induced alpha-helix capping in conserved linker sequences is a determinant of binding affinity in Cys(2)-His(2) zinc fingers. J. Mol. Biol. 295, 719-727 (2000).

90. Nagaoka,M., Nomura, W., Shiraishi,Y. & Sugiura,Y. Significant effect of linker sequence on DNA recognition by multi-zinc finger protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 1001-1007(2001).

91. Dovat,S. et al. A common mechanism for mitotic inactivation of C2H2 zinc finger DNA-binding domains. Genes Dev. 16, 2985-2990 (2002).

92. Jantz,D. & Berg,J.M. Reduction in DNA-binding affinity of Cys2I lis2 zinc finger proteins by linker phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 7589-7593 (2004).

93. Hyre,D.E. & Klevit,R.E. A disorder-to-order transition coupled to DNA binding in the essential zinc-finger DNA-binding domain of yeast ADR1. J. Mol. Biol. 279, 929-943 (1998).

94. Collins,T., Stone,J.R. & Williams,A.J. All in the family: the BTB/POZ, KRAB, and SCAN domains. Mol. Cell Biol. 21,3609-3615 (2001).

95. Daniel,J.M. & Reynolds,A.B. The catenin pl20(ctn) interacts with Kaiso, a novel BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Mol. Cell Biol. 19, 3614-3623 (1999).

96. Spring,C.M. et al. The catenin pl20(ctn) inhibits Kaiso-mediated transcriptional repression of the beta-catenin/TCF target gene matrilysin. Exp. Cell Res. 305,253-265 (2005).

97. Kim,S.W. el al. Non-canonical Wnt signals are modulated by the Kaiso transcriptional repressor and pl20-catenin. Nat. Cell Biol. 6, 1212-1220 (2004).

98. Rodova,M., Kelly,K.F., VanSaun,M., Daniel,J.M. & WerIe,M.J. Regulation of the rapsyn promoter by kaiso and delta-catenin. Mol. Cell Biol. 24, 7188-7196 (2004).

99. Prokhortchouk,A. et al. Kaiso-deficient mice show resistance to intestinal cancer. Mol. Cell Biol. 26, 199-208 (2006).

100. Yoon,H.G., Chan,D.W., Reynolds,A.B., Qin,J. & Wong,J. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso. Mol. Cell 12, 723-734 (2003).

101. Ruzov,A. et al. Kaiso is a genome-wide repressor of transcription that is essential for amphibian development. Development 131, 6185-6194 (2004).

102. Kim,S.W. et al. Isolation and characterization of XKaiso, a transcriptional repressor that associates with the catenin Xpl20(ctn) in Xenopus laevis. J. Biol. Chem. 277, 8202-8208 (2002).

103. Forne,T. et al. Loss of the maternal H19 gene induces changes in Igf2 methylation in both cis and trans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 10243-10248 (1997).

104. Kiefer,H. et al. ZENON, a novel POZ Kruppel-like DNA binding protein associated with differentiation and/or survival of late postmitotic neurons. Mol. Cell Biol. 25, 1713-1729 (2005).

105. Ramsahoye,B.H. et al. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 52375242 (2000).

106. DeIaval,K. & Feil,R. Epigenetic regulation of mammalian genomic imprinting. Curr. Opin. Genet. Dev. 14, 188-195 (2004).

107. Lehnertz,B. et al. Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochromatin. Curr. Biol. 13, 1192-1200 (2003).

108. Jackson-Grusby,L. et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nat. Genet. 27, 31-39 (2001).

109. Sasai,N., Matsuda,E., Sarashina,E., Ishida,Y. & Kawaichi,M. Identification of a novel BTB-zinc finger transcriptional repressor, CIBZ, that interacts with CtBP corepressor. Genes Cells 10, 871-885 (2005).

110. По материалам диссертации опубликованы

111. FilionG., Zhenilo S., Salozhin S., Yamada D., Prokhortchouk E. and Defossez P-A. A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription. Molecular and Cellular Biology, 2006, Vol. 26(1), 169-81.