Глипролины меланокортинового ряда: процессы биодеградации и взаимодействия с мембранами клеток мозга

Вьюнова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Глипролины меланокортинового ряда: процессы биодеградации и взаимодействия с мембранами клеток мозга
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Глипролины меланокортинового ряда: процессы биодеградации и взаимодействия с мембранами клеток мозга"

На правах рукописи

Вьюнова Татьяна Владимировна

ГЛИПРОЛИНЫ МЕЛАНОКОРТИНОВОГО РЯДА: ПРОЦЕССЫ БИОДЕГРАДАЦИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МЕМБРАНАМИ КЛЕТОК

МОЗГА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2008 ци»э

003454284

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: академик РАН, доктор химических наук, профессор

Мясоедов Николай Федорович

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор

Цетлин Виктор Ионович

Ведущая организация: Российский Химико-Технологический Университет им. Д.И.Менделеева

Защита состоится «8» декабря 2008 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте \vww.mitht ги

доктор химических наук, профессор Степанов Александр Евгеньевич

Автореферат разослан «7» ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, к. х. н.

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ"

Актуальность исследования

Одной из актуальных задач современных медицины и биотехнологии является создание высокоэффективных лекарственных средств, характеризуемых не только широким спектром действия и минимальным числом побочных эффектов, но и простотой синтеза биологически активных соединений, составляющих препарат, а также возможностью организации массового производства различных лекарственных форм на их основе Начальным этапом в решении поставленной проблемы является установление истинной причины возникновения и развития конкретного заболевания. В последние годы основным фактором, провоцирующим появление болезни, все в большем числе случаев склонны считать нарушение баланса во взаимодействии систем клеточных химических регуляторов. Совершенствование биотехнологических методов исследования в медицине и биологии позволило не только установить своеобразие регуляторных пептидных пулов, присутствующих в различных тканях, но и обнаружить изменения характерного пептидного состава в случае патологии. Как следствие - все чаще в терапии и профилактике довольно многих заболеваний в качестве лекарственных препаратов используют различные белки и пептиды. В основном пептидосодержащие лекарственные средства представляют собой экстракты из материалов различного биологического происхождения - органов свиньи, лосося, других рыб и млекопитающих. Из более чем 200 запатентованных на сегодняшний день препаратов, всего лишь несколько десятков являются синтетическими аналогами, либо продуктами модификации эндогенных регуляторных пептидов. В их числе семакс и селанк, относящиеся к классу глипролинов. Данные нейропептиды содержат PGP С-концевую последовательность (глипролины) и синтезированы на основе фрагмента АКТГ(4-10) и тафтсина, соответственно.

Особенностью пептидных регуляторов является не только полифункциональность, но и довольно быстрая их деградация во внутренних средах организма. В большинстве случаев часть образованых в результате протеолиза коротких фрагментов обладает собственной биологической активностью Так, не только синтетический аналог АКТГ(4-10) - семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), но и ряд фрагментов этого пептида, также относящихся к семейству глипролинов меланокортинового ряда, обладают

* В руководстве работы принимал участие д х н Шевченко В П

Список принятых сокращений АА, АК - арахидоновая кислота, АААА - амино-ацилариламидаза (Е С 3 4 112), AA-Gly - N-арахидоноил-глицин, AA-Phe - >)-арахидоноил-Ь-фенилаланин, AA-Pro - N-арахидоноил-пролин, BGE - глутамилэндопептидаза Bacillus mtermedius, CBR - каннабиноидный рецептор, DR - дофаминовый рецептор, HTR - серотониновый рецептор, MC1R - MC5R - рецепторы меланокортинов, VR — ванилоидный рецептор

А ('

широким спектром действия, спосбны улучшать внимание, память и способность к обучению, положительно влияют на общее состояние организма Несмотря на успешное широкое клиническое применение семакса, механизм его действия остается не ясным. Кроме того, практически не изучены процессы, лежащие в основе действия его коротких производных. Исследование таких процессов на молекулярном уровне, в микро- и нано- молярных концентрациях, требует применения комплексного биотехнологического подхода - использования знаний по физиологии и биохимии, аналитической химии и радиохимии. Разработанный нами метод биосинтеза позволяет приблизить способ получения изучаемых пептидов к процессу их образования в организме, упрощает синтез биологически активных соединений, имеющих в структуре не только пептидные, но и иные составляющие - например, пептиолипинов Таким образом, изучение молекулярных механизмов действия искусственных аналогов нейропептидов представляет огромный теоретический и практический интерес, позволит не только охарактеризовать процессы, лежащие в основе биологической активности исследуемой группы коротких пептидов, но и приблизиться к пониманию общих закономерностей пептидной регуляции.

Работа выполнена при частичной поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов «Ведущие научные школы» № НШ-2150.2003.4, НШ-5638 2006 4, НШ-3626 2008 4 и Государственных контрактов «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» и «Синтез и исследования фармакологически важных пептидов, включая изотопно-модифицированные».

Цель работы

Исследовать ключевые моменты механизма биологического действия семакса и его производных (глипролинов меланокортинового ряда), включающие ограниченный пептидолиз с образованием укороченных форм и специфическое связывание с плазматическими мембранами.

В задачи настоящего исследования входило:

1. Изучение процесса биодеградации глипролинов меланокортинового ряда (начиная с гептапептида семакса) при взаимодействии с плазматическими мембранами клеток мозга крысы, определение интенсивности протеолитических процессов в различных тканях мозга, а также последующий анализ условий, необходимых для снижения активности мембранных ферментов протеолиза

2. Поиск центров специфического связывания глипролинов на плазматических мембранах клеток мозга крысы, включая характеристику обнаруженных мест взаимодействия.

3. Разработка биотехнологического способа синтеза меченых тритием и немеченых пептидов с применением ферментов различной степени специфичности

4. Изучение влияния коротких пептидов (продуктов N-концевого протеолиза семакса, содержащих PGP С-концевую последовательность), а также N-ацилпептидов и N-ациламинокислот на специфическое связывание глипролинов с мембранами мозга крысы.

5. Исследование конкуренции за места связывания глипролинов со стороны некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов.

6. Изучение взаимодействия с мембранами мозга крысы ряда ацилированных производных семакса, а также их влияния на специфическое связывание глипролинов.

Научная новизна

В работе впервые удалось установить существование положительной корреляции между наличием и плотностью специфических мест связывания глипролинов и их концентрацией в различных отделах головного мозга крысы На плазматических мембранах мозжечка и гиппокампа крысы было установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания семакса, пентапептида HFPGP и арахидоноил-семакса, на плазматических мембранах базальных ядер -трипептида Pro-Gly-Pro. Впервые изучено влияние ряда коротких пептидов, N-ацилпептидов и N-ациламинокислот, а также некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов на специфическое связывание меченых семакса и пентапептида с мембранами гиппокампа крысы. Установлено, что многие эффекторные молекулы известных нейрорецепторов, имеющие в своей структуре похожие на PGP фрагменты, способны значительно вытеснять трипептид с мест специфических связывания.

Разработан биотехнологический способ синтеза коротких пептидных и комбинированных молекул, а также их радиоактивно-меченых аналогов, из соответствующих модифицированных пептидов, при помощи высокоспецифических ферментов различного типа.

Несомненный научный интерес представляют обнаруженные в данном исследовании особенности и общие характеристики процессов взаимодействия глипролинов меланокортинового семейства, а также их ацилированных производных, с плазматическими мембранами мозга крысы

В совокупности, полученные данные позволили сформулировать новую гипотезу, объясняющую один из возможных молекулярных механизмов действия семакса, эффективность которого связана, по-видимому, с действием целой группы коротких биологически активных пептидов и аминокислот - продуктов деградации семакса.

Практическая значимость работы

Разработанный и описанный в работе биотехнологический способ получения представляет собой перспективный метод получения коротких пептидных и комбинированных молекул, а также их радиоактивно-меченых аналогов, и, благодаря высокой специфичности фермента, позволяет проводить реакции с большим количеством исходного реагента сразу (с очень высоким выходом 96% - 100%), использовать в качестве субстрата различные соединения на основе Glu - содержащих пептидов, избегая образования множественных побочных продуктов. При помощи данного метода была синтезирована группа меченных и немеченных пептидов, необходимых для изучения механизмов действия глипролинов радиолигандным методом анализа.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на российских и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе: II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 8th ECNP Regional Meeting (Moscow, 2005), VI симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2007), IV международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008), конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 статей в российских и зарубежных журналах, 5 публикаций представлено в тезисах материалов российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания синтеза объектов и методов их исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц и 23 рисунка Библиографический список включает 222 наименования.

Объекты и методы исследования

Меченые по С-концевому пролину пептиды ([3H]PGP, [3H]Phe-Pro-Gly-Pro, [3H]His-Phe-Pro-Gly-Pro, [3H]Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, [3H]Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) с молярной радиоактивностью 56 Ки/ммоль и радиохимической чистотой не менее 95% синтезированы в ИМГ РАН в лаборатории изотопно-меченых физиологически активных

веществ из соответствующих защищенных пептидов и [3Н]пролина, либо получены путем биосинтеза с использованием глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius (MEROPS ID SOI 443). Анализ и очистку меченых препаратов проводили высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Химически синтезированный [3H]PGP обладал молярной радиоактивностью 130 Ки/ммоль и радиохимической чистотой пе менее 95%, [3H8]apaxHflOHonji-MEHFPGP - 110 Ки/ммоль Соответствующие немеченые пептиды синтезированы в ИМГ РАН. Ацил-аминокислоты и ацил- пептиды (AA-PGP, AA-TA-PGP, AA-His, AA-Phe, AA-Pro, АА-Met) синтезированы в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в лаборатории оксилипинов по методу, описанному авторами (Безуглов В В и соавт , 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Вопрос о механизме действия семакса не решен до настоящего времени, однако, физиологические эффекты гептапептида (в частности, его влияние на процессы восприятия информации и консолидации памятного следа) предполагают существование специфических мест связывания семакса на цитоплазматической мембране клеток мозга. Ранее уже предпринимались попытки обнаружить такие места связывания (Арефьева И А. и др., 1992; Долотов OB и dp, 2004), однако в этих исследованиях авторы использовали меченый семакс, в котором тритиевая метка содержалась во всех аминокислотах пептида Такой радиоактивный лиганд не является оптимальным для легкогидролизуемых пептидов, поскольку различить связывание нативного семакса и его гидролитических фрагментов с изучаемым гипотетическим рецептором практически невозможно. Поэтому в данном исследовании использовали пептиды, меченные тритием по С-концевому пролину. Такой вариант локализации метки позволяет исключить ряд проблем, связанных с деградацией и значительно снизить погрешности в количественном определении изучаемого пептида Кроме того, локализация метки в С-концевом пролине позволила разработать метод получения коротких фрагментов семакса и ряда радиоактивно меченых пептидов при помощи ферментов. Все полученные таким способом глипролины меланокортинового ряда обладают одинаковой удельной активностью, что ценно при проведении сравнительных экспериментов

1. Биодеградация глипролинов

1.1. Деградация глипролинов под действием мембранных ферментов

Биодеградация нейропептидов является, одновременно, и процессом образования более коротких и, зачастую, биологически активных молекул. Семакс подвергается значительному протеолизу (рис. 1): уже через 20 мин инкубирования с плазматическими

мембранами мозга крысы при 30°С остается не более 30% интактного пептида. В течение первых 10 мин инкубирования основными продуктами деградации являются короткие М-концевые фрагменты (из трех и менее аминокислот), тогда как в следующие 10 минут заметно увеличивается лишь содержание тетрапептида РЬе-Рго-01у-Рго.

Чтобы воспрепятствоватоь быстрому разрушению иитактной молекулы под действием протеолитических ферментов, необходимо было подобрать особые условия инкубирования.

Доля от количества меченого гептапептида, %

время, мин

Рисунок 1. Содержание некоторых пептидных фрагментов семакса в фильтрате инкубационной смеси через 10, 20 и 30 мин. после начала инкубирования с плазматическими мембранами мозга крысы (8т-7 (Ме101иН18Р11еРго01уРго), вет-б (аиН^РЬеРгоауРго), 8ет-5 (НкРЬеРго01уРго), 8ет-4 (РЬеРгоС1уРго), 8ет-3 (РгоауРго)).

1.2. Введение дополнительных компонентов инкубационного буфера, снижающих протеолиз гептапептида

Наиболее известными способами снижения активности протеолитических ферментов являются: изменение рН, температурь! или введение ингибиторов (Варфоломеев С.Д., 1999). Снижение температуры инкубирования до 0-4°С резко повысило стабильность пептида, хотя и замедлило кинетические параметры взаимодействия (рис. 2). В этих условиях, даже по истечении 4 ч степень деградации [3Н]семакса не превышала 15%. Поиск эффективных ингибиторов протеолиза, не влияющих на процессы взаимодействия глипролинов с местами связывания на мембранах, позволил определить комбинацию ингибиторов (Рерз1аипеА 10 ткМ + Васкгасте 10 ткМ + АЕВЭР 100 ткМ). позволяющую проводить инкубирование семакса при температуре 30°С.

Таким образом, эксперименты по изучению биодеградации семакса и производных пептидов позволили установить, что основными продуктами деградации гептапептида являются, по-видимому. С- концевые фрагменты семакса, несущие меченый атом.

Данное предположение подтверждает и тот факт, что высокую эффективность в отношении пептидаз проявили соединения, способные подавлять активность именно "Ы-концевых протеолитических ферментов (Рапкоу У А ег а1, 1986)

so М i ...... i ....... i ..... . —L-T-J—Ц_1———1—Ц_1—Ц

О 30 60 90 120 150 180 210 240 Время, мин

Рисунок 2. Изменение относительного содержания нативного [3Н]семакса в процессе инкубирования с плазматическими мембранами мозга крысы при температуре 4° С

2. Биотехнологический способ получения радиоактивно меченых пептидов (обладающих равной удельной радиоактивностью), а также их немеченых

аналогов

В последние годы появляется все больше публикаций, демонстрирующих, что так называемые белки-предшественники нейропептидов обладают собственной биологической активностью, зачастую, отличной от действия образуемого гормона (Paterson АС etal, 2002, Salas МА etal, 1997). (Долгое время считалось, что предшественники не имеют в организме иной роли, кроме участия в качестве субстрата в процессе образования нейропептидов.) В то же время к физиологическим свойствам большинства нейропептидов тоже можно добавить функцию предшественника малых активных молекул Изучение механизма их действия требует получения достаточного для работы количества пептидов.

Довольно часто синтезы коротких аминокислотных последовательностей (три- или тетра- пептидов) осуществляют конденсацией из нескольких аминокислотных фрагментов, используя в качестве катализаторов различные протеиназы, например, хемотрипсин, бромелаин, или папаин (Shen H.Y etal, 1996, 2005, Clapes Р etal,1995, Tian G.L etal, 2005; Fite M etal, 2002) Другой метод получения (более крупных пептидов) объединяет технологии рекомбинантных ДНК, для наработки про-белка в клетках (Ecoli), методы химической очистки, для выделения пептида, а также использование ряда протеиназ, для процессинга аминокислотной последовательности и получения необходимых фрагментов Более сложный вариант метода подразумевает химический синтез модифицированного предшественника и использование

специфических ферментов для получения строго определенных продуктов протеолиза (ЗсИеПепЬегдег V йа1,1992,1993).

Группа изучаемых глипролинов меланокортинового ряда представляет собой достаточно небольшие пептиды, наиболее длинный из которых (гептапептид семакс), является синтетической молекулой. Характер проводимых экспериментов требует от получаемых соединений практически полного отсутствия побочных продуктов, в том числе - следовых количеств реагентов и солей различных металлов. Меченые пептиды должны обладать очень высокой степенью радиохимической чистоты и одинаковой удельной радиоактивностью, а способ их получения, по возможности, должен быть максимально приближенным к процессу образования описанных глипролинов в организме. Всем этим требованиям вполне удовлетворяет биотехнологический способ получения.

2.1. Синтез пептидов при помощи мембранных аминопептидаз

Поскольку при взаимодействии семакса с мембранами мозга крысы образуются преимущественно С- концевые фрагменты, в качестве действующего агента для биотехнологического получения коротких пептидов глипролинового ряда были выбраны ферменты, относящиеся к классу мембранных аминопептидаз (амино-ацилариламидаза (Е.С. 34.11.2) (АААА) и лейцинаминопептидаза (Е.С. 34.11.1) (ЛАП)). В качестве субстрата использовали семакс. По результатам сравнения протеолитической активности выбранных ферментов (данные получены с применением метода ВЭЖХ) установлено, что наилучшими рабочими параметрами в данных условиях обладает АААА, при этом дальнейший протеолиз пептида (на примере БеггИ) протекает менее интенсивно

В качестве субстрата для получения меченых глипролинов, обладающих равной удельной радиоактивностью, использовали гептапептид, содержащий тритиевую метку в С-концевом пролине. Поскольку АААА не является высокоспецифическим ферментом, в результате протеолиза семакса образуется полный набор С-концевых фрагментов, от С1и-Н1Э-№е-Ргси31у-[3Н]Рго до Рго-С1у-[3Н]Рго и отдельных аминокислот. Количественное содержание того или иного фрагмента зависит от времени инкубирования субстрата.

Оценку чувствительности фермента к модификациям субстрата проводили, используя в качестве исходного реагента смесь: 25% [3Н]Рго-семакса (56 Ки/ммоль) и 75% меченого гептапептида, окисленного по сере в метионине Анализ реакционной смеси методом ВЭЖХ показал, что количество [3Н-Рго]Згт>-4 мало (~ 4%), а количество не подвергшегося протеолизу окисленного [3Н-Рго]5т-7 - значительно (~ 85%). Лишь десятикратное увеличение количества фермента в смеси (с 018 ед. до 18 ед активности) позволило получить (даже из сульфоксида семакса) ряд меченых по С-

концевому пролину пептидов, обладающих равной удельной радиоактивностью. Однако, использование данного фермента для получения большого количества пентапептида (как наиболее интересного из группы) осложнено методическими трудностями, связанными с подбором условий и времени выделения необходимого соединения в достаточном количестве, обилием побочных продуктов деградации. Поэтому потребовался фермент, осуществляющий протеолитическое расщепление семакса строго на ди- (Met-Glu) и пеита- (His-Phe-Pro-Gly-Pro) пептиды Такой фермент был найден: это глутамилэндопептидаза Baallusintermedius(MEROPSID 301 443)

2.2. Синтез HFPG[3H]P при помощи глутамат-специфичной иептидазы

Данная высокоселективная сериновая протеиназа распознает в аминокислотной последовательности белка остаток глутаминовой кислоты, что позволяет, используя меченный семакс в качестве субстрата, получать дипептид ME и меченный пентапептид HFPG[3H]P, без образования побочных продуктов (рис.3).

Таблица 1 Использование глутамат специфичной пептидазы для получения His-Phe-Pro-Gly-Pro и His-Phe-Pro-Gly-[3H]Pro (37°С, рН 8 94)

Исходное соединение Конечное соединение Время, мин Выход, %

Семакс His-Phe-Pro-Gly-Pro 180 100

N-арахидоноил-семакс His-Phe-Pro-Gly-Pro 180 100

M et-GI u-H i s-Phe-Pro-Gly-I^H] Pro Hi s-Phe-Pro-Gly-[JH] Pro 180 98*

Mef-Glu-His-Phe-Pro-Gly-[JH]Pro, окисленный по сере в метионине H i s-Phe-Pro-Gly-[3H] Pro 300 96

* - анализ реакционной смеси приведен на рисунке 3

2577mv

I (

II 11 > I

I <

/ i

__________

UV100 ______— U-------

Rat _| _______^_i_ _______i_ . . r r __r___r

2 3 4 5 в 7 i io 7l 12~ 13 U 15 ie 17 1» ^19 Г мпя

Рисунок 3 Анализ методом ВЭЖХ реакционной смеси после протеолиза меченого семакса глутамат-специфичной пептидазой 1

1 Условия хроматографического разделения колонка $ирегсоа1 АВ2+Виз (4 6\250 мм, 5 мкм), градиент МеОН (0 -40%) в {(/ЧНЛНгРа+НзРО, (50 тМ, рН 28)} Скорость подачи элгоента 1 мл/мин

Выход пентапептида остается очень высоким (около 100%) как при инкубировании смеси в соотношении фермент/субстрат = 1/100 (в течение 3 час.), так и в соотношении 1/10000 (через 22 час. инкубирования). При использовании в качестве исходного реагента окисленного по сере семакса, а также арахидоноил-семакса, действие фермента осталось столь же эффективным (выход Sm-5 достигал 96 и 100%, соответственно), а в качестве второго продукта протеолиза удалось выделить арахидоноил - дипептид (АА-МЕ) (табл 1).

Таким образом, использование высокоспецифичного фермента позволяет (в данных условиях) эффективно осуществлять протеолитическое расщепление производных семакса по остатку Glu, вне зависимости от N-концевых модификаций пептида Это позволило разработать способ получения радиоактивно меченых пептидов и их производных, используя в качестве субстрата различные, в том числе и модифицированные белки и пептиды с заведомо известным сайтом расщепления, не опасаясь образования побочных продуктов Зачастую, биосинтез характеризуется как более простой и быстрый путь получения комплексных соединений (например, арахидоноил-пептидов), чем химический синтез.

3. Изучение взаимодействия глипролинов с плазматическими мембранами мозга

Механизм действия большинства нейропептидов включает этап специфического связывания с рецептором, либо с определенной белковой структурой на плазматической мембране клетки-мишени, и последующие усиление и передачу полученного сигнала внутрь клетки Для пептидных регуляторов характерны специфическая локализация и определенная плотность рецепторов, обладающих сродством к изучаемому лиганду, а также индивидуальный набор мембранных протеолитических ферментов (в зависимости от типа клеток) (Kitabgi Р., 2006). Стоит также отметить, что для ряда рецепторов (например, тахикинина, брадикинина) было показано, что совместная экспрессия (Okamoto A. et.al., 1994) или тесная ассоциация рецептора и пептидазы чрезвычайно важны для его функционирования и последующей ресенситизации (Deddish Р.А et.al., 2002; Erdos E.G et.al., 2001) В связи с этим, основными задачами на данном этапе изучения стали: определение существования мест специфического связывания, их локализация по отделам мозга, а также характеристика обнаруженных центров для каждого из глипролинов.

3.1. Изучение специфического связывания [3Н]семакса

В недавнем исследовании (Шевченко К. В. и др., 2006) приведены данные о распределении семакса в мозжечке, базальных ганглиях, коре и гиппокампе мозга крыс после интраназального введения пептида, меченного тритием по С-концевому пролину. В работе показано, что уже через 2 мин после введения концентрация семакса в

мозжечке и гиппокампе примерно в 2 раза выше, чем в базальных ганглиях и в коре Это дало основания предположить, что наблюдаемые закономерности связаны с локализацией мест специфического связывания преимущественно в этих отделах мозга.

Действительно, проведенные нами исследования показали, что семакс специфически связывается с мембранами гиппокампа (рис. 4) и мозжечка, а в базальных ганглиях и коре мозга мест специфического связывания не обнаружено (табл. 2). Равенство значений констант ассоциации лиганд-рецепторного комплекса позволяет предположить, что места специфического связывания семакса в гиппокампе и мозжечке имеют одинаковую природу.

О 60 100 150 200 250 300 _концентрация [^Н]семакса, нМ_

Рисунок 4 Специфическое связывание [3Н] семакса с мембранами гиппокампа крысы

при температуре 30°С

Таблица 2. Характеристика связывания [3Н] семакса в отделах мозга крысы

Отдел мозга Специфическое связывание Константа связывания, нМ Число мест связывания, пмоль/мг белка

Мозжечок есть 104±10 0 89 ± 0 03

Базальные ганглии не обнаружено - -

Кора не обнаружено - -

Гиппокамп есть 106±3 1.5±02

Поскольку присутствие в инкубационном буфере комбинации ингибиторов могло оказать влияние на точность определения параметров специфического связывания семакса, необходимо было удостовериться в отсутствии побочных эффектов со стороны ингибиторов, то есть охарактеризовать взаимодействие гептапептида с мембранами без каких-либо дополнительных компонентов в реакционной смеси. Проведение

экспериментов при температуре инкубации 0 - 4° С показало, что специфическое связывание [3Н]семакса обратимо и насыщаемо при концентрации выше 300 нМ, Kd=100 ± 19 нМ и Втах = 2,26 пмоль/мг белка. Константа связывания Kd при 30°С оказалась близка по значению к величине, полученной при 4°С. Это свидетельствует об отсутствии прямого влияния ингибиторов на процессы взаимодействия гептапептида с местами специфического связывания на плазматических мембранах мозга крысы.

3.2. Изучение специфического связывания других [^Рго-глипролинов

Проведенные эксперименты позволили установить наличие в головном мозге крысы мест специфического связывания пентапептида и PGP (табл. 3). Сходство физиологических эффектов рассматриваемых глипролинов, а также характеристик центров специфического взаимодействия (например, константы связывания) позволяют сделать предположение о единой природе этих мест для гепта- и пента- пептидов

Таблица 3 Характеристики мест специфического связывания глипролинов

Пептид Отдел мозга крысы Константа связывания Kd, нМ Число мест связывания Втах, пмоль/мг белка

MEHFPGP гиппокамп, мозжечок 106±3 1.5 ±0.2

EHFPGP Специфическое связывание не обнаружено

HFPGP гиппокамп, мозжечок 82 ± 8 16.6 ± 1,1

FPGP Специфическое связывание не обнаружено

PGP базальные ядра 37 ±2 0,86 ±01

Об этом же косвенно свидетельствуют единая локализация центров связывания пептидов в мозге и не слишком значительное различие в значениях М, при этом сродство Бет-б к гипотетическим рецепторам, по-видимому, выше

Концентрация пептида, нМ

Рисунок 5. Специфическое связывание PG[3H]P с мембранами клеток базальных ядер.

Необходимо отметить ряд общих для всех изучаемых глипролинов характеристик: высокая чувствительность к присутствию в инкубационном буфере таких растворителей, как EtOH и DM SO, нестойкость гипотетических рецепторов при хранении мембранных препаратов (не более 3-5 дней). При этом сам факт замораживания на свойства мембранных препаратов практически не влияет (рис. 5).

4. Изучение особенностей специфического связывания семакса и пентапептида с плазматическими мембранамн мозга крысы

Довольно часто пептиды одного семейства взаимодействуют с одними и теми же типами рецепторов, хотя и с разной степенью сродства (Roselli-Rehfuss L. et.al., 1993; Suzuki I. et.al., 1996; Mountjoy K.G. et.al., 1994). Это обусловлено существованием в структуре таких лигандов близких по строению участков связывания, образованных вследствие частичного совпадения аминокислотных последовательностей у родственных пептидов. Поскольку исследуемые глипролины представляют собой довольно небольшие и родственные молекулы, в их структуре возможно достаточно точно определить минимальную аминокислотную последовательность, ответственную за специфическое взаимодействие с гипотетическим рецептором.

Рисунок 6. Влияние коротких пептидов на специфическое связывание [3Н] семакса (50 нМ) с мембранами гиппокампа крысы Для выполнения поставленной задачи были синтезированы различные немеченые фрагменты глипролинов, включая продукты не только Ы-, но и С- концевого протеолиза, а также трипептид РРв, формирующий центральную часть молекул Зт-7 и Эп-б. На рис. 6 показано, каким образом данные пептиды влияют на специфическое связывание семакса с мембранами гиппокампа крысы.

Все используемые в эксперименте пептиды, в той или иной степени, способны конкурировать с семаксом за места связывания на мембранах. При этом наибольшей эффективностью обладают фрагменты, состоящие из пяти аминокислотных остатков:

ЕНРРв, НРРЗР (вытесняют семакс с мест специфического связывания даже эффективнее, чем немеченый гептапептид).

По результатам экспериментов с меченым £>ет-5, среди пептидов удалось выделить три группы отличных по активности молекул: фрагменты, не оказывающие никакого влияния на специфическое связывание пентапептида (даже при концентрации 50 мкМ) -это РвР, РРБР и РРС; пептиды, способные вытеснять с мест специфического связывания до 60-66% Эт-б (при 50 мкМ) - это семакс и фрагмент МЕН РРС; а также фрагменты, активно конкурирующие с Эет-б за места взаимодействия на мембранах -ЕИРРв (около 35%) и ЕНРРвР (до 15%) (рис.7).

Рисунок 7. Влияние коротких пептидов на специфическое связывание [3Н]пентапептида (30 нМ) с мембранами гинпокампа крыс

Таким образом, минимальная аминокислотная последовательность, необходимая для создания специфического взаимодействия глипролинов меланокортинового ряда с гипотетическими рецепторами на мембранах гиппокампа крысы, вероятнее всего, представляет собой пентапегггид НРРСР. В связи с этим, особый интерес представляет изучение взаимного влияния данных пептидов на специфическое взаимодействие их меченых аналогов (рис. 8). Нами было показано, что в представленном диапазоне концентраций немеченых пептидов, пентапептид (НРРСР) вытесняет практически полностью, а семакс (МЕНРРвР) - лишь наполовину. При этом, указанные немеченые пептиды способны вытеснить около 90% специфически связанного [3Н-Рго]ап-7.

Рисунок 8. Влияние гепта- и пента- пептидов на специфическое связывание

МЕНРИЗ[3Н]Р(50 нМ) и НРРС[3Н]Р(ЗОнМ) соответственно 7 + 7* - специфическое связывание МЕНРРС[3Н]Рв присутствии ¡Зт-7, 5 + 7* - специфическое связывание МЕНРРО[3Н]Р в присутствии Эт-б, 7 + 5* - специфическое связывание НРРС[3Н]Р в присутствии 8т-7, 5 + 5* - специфическое связывание НРРС[3Н]Р в присутствии 5эт-5.

5. Описание возможного механизма взаимодействия семакса с плазматическими мембранами клеток-мишеней мозга

Как было показано выше, инкубирование глипролинов с мембранами клеток мозга крысы сопровождается образованием набора фрагментов, способных, в ряде случаев, конкурировать за места специфического связывания нативного пептида. Если воспрепятствовать протеолизу изучаемого пептида (введением ингибиторов), то кривые кинетической и концентрационной зависимостей связывания меченого пептида имеют «классический» вид кривых насыщения. В противном случае, попытка построить графики кинетической зависимости связывания [3Н]семакса с плазматическими мембранами переднего мозга крысы в присутствии и в отсутствие избытка немеченого пептида приводит к получению колоколообразных кривых зависимостей с максимумом на 30 мин инкубирования (рис. 9). Эффект повышения связывания [3Н]семакса на 30 мин инкубирования возникает и в условиях, когда немеченый пептид вносят после получасового инкубирования с [3Н]семаксом. При совмещении кривых II и III, видно, что участки подъемов на графиках попадают в один и тот же временной интервал. Интересно отметить, что подобные «колоколообразные» кривые обнаруживают и при изучении кинетики связывания других коротких пептидов, например дерморфина.

О 20 40 60 80

Время, мин.

Рисунок 9. Кинетическая зависимость связывания [3Н]семакса, меченного по С-

концевому пролину, с плазматическими мембранами переднего мозга крысы I - общее связывание; II - Связывание в присутствии избытка (0,1 мМ) немеченого семакса; III - связывание после внесении избытка (0,1 мМ) немеченого семакса через 30 мин. после начала инкубирования [3Н]семакса. 1-6 - описание участков приведено в тексте. На врезке показано содержание пептидных фрагментов семакса в фильтрате -инкубационной смеси через 10, 20 и 30 мин. после начала инкубирования (см. рис.1).

Участок (1). В первые минуты после начала инкубирования, нейропептид специфически связывается на плазматических мембранах гиппокампа с высокой скоростью ассоциации, но параллельно идущий процесс деградации семакса приводит к уменьшению количества нативного пептида в инкубационной смеси и, как следствие -снижению скорости ассоциации меченого гептапептида. Кривая связывания на графике идет вниз, поскольку количество [3Н]еемакса падает, а образующийся гексапептид EHFPG[3H]P не способен в данных условиях к специфическому взаимодействию на мембранах. При инкубировании в присутствии немеченого пептида (кривая II),

активность протеолитических ферментов уравновешивается высокой концентрацией семакса (как следствие - пик на кривой получается более пологий).

Участок (2). Примерно к 15-20-й минуте инкубирования накапливается некоторое количество пентапептида НРРС[3Н]Р (обладающего большим, чем у семакса числом мест специфического связывания на мембранах гиппокампа), что соответствует подъему на графике кривой общего связывания (при избытке немеченого гептапептида это происходит быстрее).

Участок (3). Параллельно, в инкубационной смеси также накапливается довольно много тетрапептида РРС[3Н]Р (способного, вероятно, и к необратимому связыванию и к открыванию дополнительных мест связывания семакса и пентапептида).

Максимум на графике кривой общего связывания приходится на 30 минуту инкубирования (участок 4), когда одновременно детектируют некоторое количество (связанных на мембранах) [3Н]тетрапептида, [3Н]пентапептида и [3Н]семакса (в комплексе с гипотетическими рецепторами пептиды не доступны для ферментов деградации), а также трипептида РС[3Н]Р, специфическое взаимодействие которого с мембранами базальных ядер, по-видимому, и составляет разницу между амплитудами пиков кривых I и II. Отметим, что такой разницы не существует при инкубировании семакса с мембранами только гиппокампа

Дальнейший ход кривой I вниз (участок 5) обусловлен, по-видимому, процессом деградации трипептида и других пептидных фрагментов Наряду с этим, диссоциация [3Н] семакса и [3Н] пентапептида приводит к образованию дополнительных количеств РРС[3Н]Р, НРРЭ[3Н]Р и РС[3Н]Р. Как следствие - небольшой рост кривой общего связывания, своего рода «вторая волна» специфических взаимодействий.

Таким образом, сочетание процессов протеолиза гептапептида, а затем и других коротких пептидов - фрагментов семакса, и их специфического взаимодействия на мембранах лежит, по-видимому, в основе молекулярного механизма действия нейропептида Отметим, что под действием протеолитических ферментов может происходить образование не только глипролинов, рассмотренных в данной работе, но и других пептидных фрагментов обладающих, возможно, собственной биологической активностью (например, актона меланокортинов-МЕНР)

6. Изучение влияния некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов на специфическое связывание пента- и три- пептидов с плазматическими мембранами мозга крысы

Большое число и разнонаправленность биологических эффектов, наблюдаемых после введения глипролинов, отражает регуляторную природу данных пептидов и свидетельствует, по-видимому, об изменении активности целого ряда других

медиаторных систем организма. Известно, например, о влиянии семакса на нейрохимические показатели дофамин- и серотонин- эргических систем, способности увеличивать скорость оборота серотонина (Себенцова ЕА и др, 2006; Еремин КО и др., 2005), активировать гены раннего ответа (в том числе, с-Л«) в ядрах ряда нейронов (Умрюхин П.Е. и др., 2001), влиять на уровень цАМФ, концентрацию ионов Са2+ в цитоплазме (Асташкин ЕИ и др., 2000) Вероятно, активация данных систем происходит за счет включения внутренних биохимических каскадных процессов и не является следствием прямого специфического взаимодействия глипролинов с соответствующими рецепторами. Так, для выяснения такой возможности было исследовано влияние некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов на специфическое связывание пента- и три- пептидов с плазматическими мембранами мозга крысы. Были использованы агонисты и антагонисты каннабиноидных (СВ1, СВ2), ванилоидного, глутаматного, ЫМОЛ, дофаминовых (Б1, 02), серотониновых (5НТ2, 5НТЗ), адрено- (альфа, бета), ацетилхолинового, опиоидных и меланокортинового рецепторов, а также рецептора гамма-аминомасляной кислоты.

6.1. Изучение особенностей взаимодействия Рго-С1у-[3Н]Рго с плазматическими мембранами базальных ядер крысы

Таблица 4. Специфическое связывание РО[3Н]Р в присутствии 10 мкМ некоторых эффекторных молекул известных рецепторов

Вносимый агонист/антагонист % от специфического связывания Тип рецептора

GABA 49 GABA

SR141716A (SRI) 29 СВ1

SR144528 (SR2) 10 СВ2

WIN -10 СВ1, CB2

СР5594 -25 CB1, CB2

МК801 -26 NMDA

NMDA -27 NMDA

Capsazepine -12 VR1

Cyproheptadine •18 5HT2

Yohimbine -19 alfa-adreno

Nicotin -17 AchR (nicotine)

Naloxon 82 any opioid R

ACTH (4-10) 102 MCR

Таблица 5. Специфическое связывание НРРО[3Н]Р в присутствии ЮмкМ некоторых эффекторных молекул известных рецепторов

Вносимый агонист/антагонист % от специфического связывания Тип рецептора

SR141716A (SRI) 40 CBI

SR144528 (SR2) 49 СВ2

WIN 56 СВ1.СВ2

СР5594 49 CBI, СВ2

МК801 86 NMDA

NMDA 73 NMDA

Capsazepine 64 VR1

Haloperidol 84 D2, D3, D4

Isoproterenol 44 ß-adreno

Yohimbine 48 Alfa-adreno

Naloxon 99 Any opioidR

АСТЩ4-10) 84 MCR

Перечень использованных в работе эффекторных молекул известных рецепторов SRI (SR 141716А) - селективный ингибитор каннабиноидного рецептора первого типа, SR2 (SR 144528) - селективный ингибитор каннабиноидного рецептора второго типа, WIN, СР5594 -неселективные агонисты каннабиноидных рецепторов, Capsazepme - селективный ингибитор ванилоидного рецептора, МК801 - селективный антагонист NMDA рецепторов, блокирующий ионный канал, Spiperone - селективный антагонист дофаминового рецептора второго типа, антагонист alp - адрено, 5-НТ2А и 5-НТ1 серотониновых рецепторов, Haloperidol -антагонист дофаминовых рецепторов второго и третьего типов, Ritanserine - селективный антагонист 5-НТ2А серотониновых рецепторов, GABA - у-аминомасляная кислота, Cyproheptadine - антагонист 5-НТ2/5-НТ1 серотониновых, HI гистаминовых рецепторов, Yohimbine - селективный антагонист а2- адрено рецепторов. Isoproterenol - селективный антагонист Р- адрено рецепторов, Naloxon - антагонист р, к, 8 и а опиоидных рецепторов, Tropisetron - селективный антагонист 5-НТЗ рецепторов

Из всего набора соединений только фрагмент АКТГ(4-10), налоксон и гамма-аминомасляная кислота практически не оказывали влияния на связывание трипептида. Все другие соединения в той или иной степени уменьшали специфическое связывание PGP (табл. 4). Однако это, по-видимому, не свидетельствует о способности трипептида специфически связываться со всеми типами рецепторов за исключением меланокортинового и опиоидных рецепторов, а также рецепторов к гамма-

аминомасляной кислоте. Скорее наоборот, полученные данные показывают, что многие молекулы, имеющие в своей структуре похожие на PGP фрагменты, способны вытеснять его со специфических мест связывания.

6.2. Изучение особенностей взаимодействия His-Phe-Pro-GIy-[3H]Pro с плазматическими мембранами гиппокампа крысы

Практически все соединения снижали специфическое связывание HFPGP (табл. 5) Полученные данные показывают, что многие эффекторные молекулы известных рецепторов, по-видимому, содержат в своей структуре фрагменты, пространственно похожие на HFPGP и способны вытеснять его со специфических мест связывания. Это не исключает и возможности пентапептида взаимодействовать с соответствующими рецепторами на мембранах гиппокампа, хотя и с менее высокой степенью сродства.

7. Изучение взаимодействия ацилированных пептидов и аминокислот с центрами специфического связывания глипролинов на плазматических мембранах гиппокампа крысы

Последнее время, все больший интерес вызывают эндогенные аминокислоты, ацилированные жирными кислотами, в частности - арахидоновой. Арахидоновая кислота (АА), входящая в состав фосфолипидов плазматических мембран, является биологически активным соединением, служит предшественником эйкозаноидов, которые образуются почти во всех клетках организма.

Так, менее десяти лет назад в организме млекопитающих были найдены глицин и аланин, ацилированные арахидоновой кислотой (Huang S М etal, 2001, Burstein SH. etal, 2000) Известно о существовании ациламинокислот у обитающих на суше (Kawazoe R etal, 1991) и морских бактерий (Vagi Н, 1997). На примере AA-Gly следует подчеркнуть, что ни АА, ни Gly (в качестве самостоятельных соединений) не демонстрируют эффектов, свойственных пептолипину AA-Gly ( Wiles A L. et al, 2006).

Изучение различных свойств синтетических аналогов арахидоноил-аминокислот позволит, по-видимому, в будущем включить ацильные производные не только аминокислот, но и пептидов, в ряд новых полифункциональных регуляторов биологической активности организма (Безуглов В В И др, 2006). Одним из подобных перспективных соединений является арахидоноил-семакс, в состав которого входят семакс и АА-кислота, присоединенная с N-конца.

7.1. Изучение взаимодействия [^АА-семакса с плазматическими мембранами гиппокампа крысы

Нам удалось обнаружить существование мест специфического связывания [3Н]АА-семакса (рис. 10) на мембранах мозжечка и гиппокампа крысы в присутствии гептапептида (Kd = 51 ± 3 нМ, Вшах = 35 ± 1 пмоль/мг белка). Связывание пептолипина

обусловлено, по-видимому, специфическим взаимодействием пептидного участка молекулы. АА-семакс (в концентрации 50 мкМ) способен наполовину блокировать специфическое связывание семакса и пентапептида (47% и 46% соответственно), в то время как ацил- аминокислоты и ацил- пептиды (АА-РвР, АА-ТА-РОР, АА-№э, АА-РЬе, АА-Рго, АА-Ме1) не влияют па специфическое связывание семакса и пентапептида, а лишь на 10-20% увеличивают число неспецифических взаимодействий. Это подтверждает ведущую роль крупного пептидного фрагмента (пентапептида) в образовании специфического взаимодействия АА-семакса на мембранах гиппокампа.

Рисунок 10. Специфическое связывание [3Н]АА-семакса с мембранами гиппокампа

крысы

Большее число мест специфического связывания, а также меньшее значение Кс1 для пептолипина (чем для семакса или пентапептида) обусловлено, по-видимому, тем, что комбинированная молекула, за счет присутствия жирной кислоты в составе соединения, использует для специфического взаимодействия не только места связывания пептида. Причём дополнительное место взаимодействия может быть расположено как на белке, так и в мембране. Выяснение этого требует проведения отдельных экспериментов, что вероятно, будет являться одним из предметов дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что семакс (при инкубировании с плазматическими мембранами клеток мозга крысы) подвергается значительному протеолизу с образованием преимущественно С-концевых фрагментов пептида. Определена комбинация ингибиторов протеаз, присутствие которой гарантирует сохранение достаточного количества интактного семакса в течение всего времени инкубирования.

2. Установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания семакса (Kd = 106 ± 3 нМ) и пентапептида HFPGP (Kd = 82 ± 8 нМ) на плазматических мембранах мозжечка и гиппокампа, на плазматических мембранах базальных ядер мозга установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания трипептида PGP (Kd = 37 ± 2нМ).

3. Разработан биотехнологический способ получения коротких пептидов (производных семакса), меченных тритием по С-концевому пролину, а также их немеченых аналогов. Метод основан на применении высокоспецифичного фермента (глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins) и позволяет получать пептиды (в данном случае, HFPGP) с высоким выходом и без образования побочных продуктов

4 Установлено, что инкубирование глипролинов с мембранами клеток мозга крысы сопровождается образованием набора фрагментов, способных в ряде случаев конкурировать за места специфического связывания интактного пептида Так, пептиды EHFPG и HFPGP вытесняют меченый семакс с мест специфического связывания даже эффективнее, чем немеченый MEHFPGP.

5. Показано существование конкуренции за места специфического связывания пентапептида HFPGP и трипептида PGP со стороны некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов (канабиноидных, ванилоидного, адрено- и ДР)-

6. На мембранах мозжечка и гиппокампа крысы обнаружены места специфического связывания меченного по арахидоновой кислоте [3Н]АА-семакса и определены характеристики центров специфического взаимодействия (Kd = 51 ± 3 нМ, Втах = 35 ± 1 пмоль/мг белка).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вьюнова Т.В., Шевченко К В, Шевченко В П., Бобров МЮ, Безуглов В В, Мясоедов Н Ф Изучение особенностей связывания нейропептида семакс, меченного по концевому остатку пролина, с плазматическими мембранами мозга крыс // Нейрохимия. - 2006. - № 1. - С. 290 - 295.

2. Вьюнова Т.В, Шевченко KB, Шевченко В П, Бобров МЮ, Безуглов В В, Мясоедов Н Ф Специфическое связывание семакса в различных отделах мозга крыс // ДАН. -2006. -Т 410 - № 1.-С. 1-2.

3. Безуглов В. В, Грецкая Н М, Блаженова А В, Андрианова Е Л, Акимов М Г, Бобров М Ю, Назимов И В, Кисель М А , Шарко О Л., Новиков А В, Краснов Н В, Шевченко В П, Шевченко К В, Вьюнова Т В, Мясоедов Н Ф Арахидоноиламинокислоты и арахидоноилпептиды: синтез и свойства // Биоорган хим. - 2006 - Т. 32. - №3 - С. 258 - 267

4. V'unova T V, Shevchenko К. V, Shevchenko V P, Bobrov Л/ Yu, Bezuglov V V, Myasoedov N. F. Studies of peculiarities of binding of the Semax neuropeptide, with a labeled terminal proline residue to plasma membranes of rat brain // Neurochemical J. -2007.-Vol 1.-№1.-P. 37-42.

5. Вьюнова ТВ, Шевченко KB, Шевченко ВП, Безуглов ВВ, Мясоедов Н.Ф Взаимодействие трипептида Pro-Gly-Pro. меченного по С концевому остатку пролина, с плазматическими мембранами мозга крыс // ДАН. - 2008 - Т 419. - № 1. -С. 136-137

6. V'unova T. V, Shevchenko К V, Shevchenko V P., Bobrov M Yu, Bezuglov V V, Myasoedov N. F Binding of regulatory neuropeptide [3H]-Semax (MEHFPGP), labeled in terminal Pro, to plasma membranes of the rat forebrain // European Neuropsychopharmacology Meeting - 2005. - P. 68

7. Вьюнова T В , Шевченко К. В , Шевченко В П, Бобров MЮ, Безуглов В В , Мясоедов НФ Изучение особенностей связывания нейропептида семакс, меченного по концевому остатку пролина, с плазматическими мембранами мозга крыс // Тезисы II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. - 2005. - С-Пб. - С. 38.

8. Вьюнова ТВ, Шевченко KB, Шевченко В.П, Безуглов ВВ, Мясоедов НФ Биотехнологический способ получения коротких пептидов и их радиоактивно меченых аналогов. // Тезисы VI симпозиума "Химия протеолитических ферментов" - 2007 - Москва - С. 54.

9. Вьюнова ТВ, Шевченко KB, Шевченко В П, Безуглов В В, Мясоедов Н.Ф Семакс как лекарственный препарат и источник уникального регуляторного комплекса // Тезисы IV-ro международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии» - 2008. - Судак, Украина - С. 86

10. Вьюнова ТВ, Шевченко К.В, Шевченко В П, Безуглов В В, Мясоедов H Ф. Нейропептиды - индивидуальные регуляторы и предшественники комплекса биологически активных молекул. // Тезисы конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». - 2008. - С-Пб. - С. 26.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Вьюнова, Татьяна Владимировна

Список принятых сокращений.

Введение.

Цель работы.

Научная новизна.

Практическая ценность работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Эндогенные регуляторные пептиды: роль и функции в организме.

1.1. Регуляторы пептидной природы.

1.2. Один пептид — несколько функций, одна функция — несколько пептидов.

2. Общие черты молекулярного механизма действия пептидных регуляторов.

2.1. Биосинтез и биодеградация пептидов.

2.2. Лиганд-рецептроные взаимодействия, способы исследования.

2.3. Радиолиганд-рецепторный метод анализа.

2.4. Связь внутриклеточной сигнализации и пептидной регуляции, роль ионов Са2+.

3. Регуляторные пептиды и лекарства на их основе.

3.1. Преимущества лекарств на основе регуляторных пептидов.

3.2. Проблемы создания лекарств на основе регуляторных пептидов.

3.3. Возможные способы ведения препаратов на пептидной основе.

3.4. Интраназальное введение лекарств.

4. Характеристика семейства меланокортинов.

4.1. Эндогенные регуляторные меланокортины (АКТГ, МСГ, эндорфины).

4.2. Рецепторы меланокортинов, общая характеристика.

4.3. Основные физиологические эффекты меланокортинов.

4.4. Возможные синтетические модификации меланокортинов.

4.4.1 Введение Э-аминокислот.

4.4.2 Точечные аминокислотные замены.

4.4.3. Циклизация молекул.

4.4.4. Замена С- и М-концевых участков молекулы.

4.4.5 Введение в структуру Рго- содержащих участков.

5. Семакс как лекарственный препарат и пептидный регулятор.

5.1. Физиологические свойства семакса.

5.1.1 Ноотропные эффекты.

5.1.2. Нейропротекторные и нейротрофические эффекты.

5.1.3. Противоишемическое влияние.

5.1.4. Офтальмологические эффекты.

5.1.5. Противоязвенный эффект.

5.1.6. Коррекция постреанимационных и мнестических нарушений.

5.1.7. Профилактические эффекты.

5.2. Регуляторный гептапептид и его фрагменты.

5.2.1. Семакс и его биодеградация.

5.2.2. Свойства фрагментов семакса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глипролины меланокортинового ряда: процессы биодеградации и взаимодействия с мембранами клеток мозга"

1. Биодеградация глипролинов.73

1.1. Деградация глипролинов под действием мембранных ферментов.73

1.2. Введение дополнительных компонентов инкубационного буфера, снижающих протеолиз семакса.75

Заключение.77

2. Биотехнологический способ получения радиоактивно меченых пептидов (обладающих равной удельной радиоактивностью), а также их немеченых аналогов.77

2.1. Синтез пептидов при помощи различных ферментов протеолиза.79

2.1.1 Синтез немеченых пептидов.79

2.2.3 Синтез пептидов на основе модифицированного [3Н]семакса.81

2.2. Синтез HFPG[JH]P при помощи глутамат-специфичной пептидазы.83

2.2.1 Синтез пентапептида на основе семакса, меченного тритием по С-концевому пролину.83

2.2.2 Синтез распределено меченных ди- и пента- пептидов.84

2.2.3 Синтез пентапептида на основе модифицированного [3Н]семакса.84

2.3. Сравнительный анализ радиоактивно меченых пентапептидов, синтзированных различными способами.86

Заключение.88

3. Изучение взаимодействия глипролинов с плазматическими мембранами клеток мозга крысы.89 i

3.1. Изучение специфического связывания [ Н]гсптапептида.90

3.1.1. Локализация мест специфического связывания [ Н]семакса.90

3.1.2. Взаимодействие [3Н]семакса с мембранами переднего мозга крысы в различных условиях инкубирования.92

3.2. Изучение специфического связывания

HFPG[3H]P.94

3.3. Изучение специфического связывания PG[3H]P.95

3.4. Изучение специфического связывания EHFPG[3H]P и FPG[3H]P.96

3.5. Некоторые характеристики центров специфического связывания глипролинов на плазматических мембранах мозга крысы.97

Заключение.99

4. Изучение особенностей специфического связывания семакса и пентапептида HFPGP с плазматическими мембранами мозга крысы.101

4.1. Изучение особенностей взаимодействия 13Н1семакса с плазматическими мембранами гиппокампа крысы.102

4.2. Изучение особенностей взаимодействия HFPG[ Н]Р с плазматическими мембранами гиппокампа крысы.103

4.3. Сравнение степени сродства гепта- и пента- пептидов к местам их специфического связывания на плазматических мембранах гиппокампа крысы

105

Заключение.107

5. Описание возможного механизма взаимодействия семакса с плазматическими мембранами клеток-мишеней мозга.108

7.Изучение влияния некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов на специфическое связывание пента- и три- пептидов с плазматическими мембранами мозга крысы.112

6.1. Изучение особенностей взаимодействия Pro-GIy-[ Н]Рго с плазматическими мембранами базальных ядер крысы.113

6.2. Изучение особенностей взаимодействия HFPG[3H]P с плазматическими мембранами гиппокампа крысы.115

Заключение.117

7. Изучение взаимодействия ацилированных пептидов и аминокислот с центрами специфического связывания глипролинов на плазматических мембранах гиппокампа крысы.117

7.1. Изучение взаимодействия [3Н]АА-семакса с плазматическими мембранами гиппокампа крысы.121

7.2. Изучение влияния АА-семакса и ацил-аминокислот и ацил-пептидов на специфическое связывание семакса и пентапептида с плазматическими мембранами гиппокампа крысы.122

Заключение.123

Заключение.124

ВЫВОДЫ.126

Список литературы.128

Список принятых сокращений

АКТГ - адренокортикотропный гормон

МСГ (a-, ß-, у-) - меланоцит-стимулирующие гормоны (a-, ß-, у-) ПК С - протеинкиназа С

Семакс (semax, Sem, Sm-7, MEHFPGP) - гептапептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro

ФС - фосфатидилсерин

ЭР - эндоплазматический ретикулум

РКС - протеинкиназа С (кальций-зависимая протеинкиназа)

АА, АК - арахидоновая кислота

АС - аденилатциклаза

AA-Gly - N-арахидоноил-глицин

AA-Phe - И-арахидоноил-Ь-фенилаланин

АА-Рго - N-арахидоноил-пролин

BDNF — мозговой фактор роста нервов

BGE - глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius

CBR - каннабиноидный рецептор

DAG - диацилглицерол

DMSO - диметилсульфоксид (ДМСО) - растворитель, формула - (CH3)2SO

DR — дофаминовый рецептор

ЕЮН - этиловый спирт

HTR - серотониновый рецептор

1Р3 — инозитолтрифосфат

MC1R - MC5R - рецепторы меланокортинов

NGF — фактор роста нервов

PCI — РС7 - группа субтилизин/кексин - подобных конвертаз

Pi — остаток фосфорной кислоты

Sm-5, HFPGP - пентапептид His-Phe-Pro-Gly-Pro

Sm-4, FPGP - тетрапептид His-Phe-Pro-Gly-Pro Sm-3, PGP - трипептид Pro-Gly-Pro TNF ~ фактор некроза опухоли VR - ванилоидный рецептор

Введение

Одной из актуальных задач современных медицины и биотехнологии является создание высокоэффективных лекарственных средств, характеризуемых не только широким спектром действия и минимальным числом побочных эффектов, но и простотой синтеза биологически активных соединений, составляющих препарат, а также возможностью организации массового производства различных лекарственных форм на их основе. Начальным этапом в решении поставленной проблемы является установление истинной причины возникновения и развития конкретного заболевания. В последние годы основным фактором, провоцирующим появление болезни, все в большем числе случаев склонны считать нарушение баланса во взаимодействии систем клеточных химических регуляторов. Совершенствование биотехнологических методов исследования в медицине и биологии позволило не только установить своеобразие регуляторных пептидных пулов, присутствующих в различных тканях, но и обнаружить изменения характерного пептидного состава в случае патологии. Как следствие — все чаще в терапии и профилактике довольно многих заболеваний в качестве лекарственных препаратов используют различные белки и пептиды. В основном пептидосодержащие лекарственные средства представляют собой экстракты из материалов различного биологического происхождения - органов свиньи, лосося, других рыб и млекопитающих. Из более чем 200 запатентованных на сегодняшний день препаратов, всего лишь несколько десятков являются синтетическими аналогами, либо продуктами модификации эндогенных регуляторных пептидов. В их числе семакс и селанк, относящиеся к классу глипролинов. Данные нейропептиды содержат PGP С-концевую последовательность (глипролины) и синтезированы на основе фрагмента АКТГ(4-10) и тафтсина, соответственно.

Особенностью пептидных регуляторов является не только полифункциональность, но и довольно быстрая их деградация во внутренних средах организма. В большинстве случаев, часть образованых в результате протеолиза коротких фрагментов обладает собственной биологической активностью. Так, не только синтетический аналог АКТГ(4-10) — семакс (Ме^Ии-Из-РЬе-Рго-Иу-Рго), но и ряд фрагментов этого лекарственного препарата, также относящихся к семейству глипролинов меланокортинового ряда, обладают широким спектром действия, спосбны улучшать внимание, память и способность к обучению, положительно влияют на общее состояние организма. Несмотря на успешное широкое клиническое применение гептапептида, механизм его действия остается не ясным. Кроме того, практически не изучены процессы, лежащие в основе действия его коротких производных. Исследование таких процессов на молекулярном уровне, в микро- и нано- концентрациях, требует применения комплексного биотехнологического подхода - использования знаний по физиологии и биохимии, аналитической химии и радиохимии. Разработка методов биосинтеза позволяет приблизить способ получения изучаемых пептидов к процессу их образования в организме, упрощает синтез биологически активных соединений, имеющих в структуре не только пептидные, но и иные составляющие - например, пептиолипинов.

Таким образом, изучение молекулярных механизмов действия искусственных аналогов нейропептидов представляет огромный теоретический и практический интерес, позволит не только охарактеризовать процессы, лежащие в основе биологической активности исследуемой группы коротких пептидов, но и приблизиться к пониманию общих закономерностей пептидной регуляции.

Цель работы

В задачи настоящего исследования входило:

3. Разработка биотехнологического способа синтеза меченых тритием и немеченых пептидов с применением ферментов различной степени специфичности.

Научная новизна

В работе впервые удалось установить существование положительной корреляции между наличием и плотностью специфических мест связывания глипролинов и их концентрацией в различных отделах головного мозга крысы. На плазматических мембранах мозжечка и гиппокампа крысы было установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания семакса, пентапептида HFPGP и арахидоноил-семакса, на плазматических мембранах базальных ядер - трипептида Pro-Gly-Pro. Впервые изучено влияние ряда. Установлено, что многие эффекторные молекулы известных нейрорецепторов, имеющие в своей структуре похожие на PGP фрагменты, способны значительно вытеснять трипептид с мест специфического связывания.

В совокупности, полученные данные позволили сформулировать новую гипотезу, объясняющую один из возможных молекулярных механизмов действия семакса, эффективность которого связана, по-видимому, с действием целой группы коротких биологически активных пептидов и аминокислот — продуктов деградации семакса.

Практическая ценность работы

Работа выполнена при частичной поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов «Ведущие научные школы» № НШ-2150.2003.4, НШ-5638.2006.4, НШ-3626.2008.4 и Государственных контрактов «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» и «Синтез и исследования фармакологически важных пептидов, включая изотопно-модифицированные».

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Вьюнова, Татьяна Владимировна

ВЫВОДЫ

2. Установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания семакса (Kd = 106 ± 3 нМ) и пентапептида HFPGP (Kd =82 + 8 нМ) на плазматических мембранах мозжечка и гиппокампа; на плазматических мембранах базальных ядер мозга установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания трипептида PGP (Kd = 37+2 нМ).

3. Разработан биотехнологический способ получения коротких пептидов (производных семакса), меченных тритием по С-концевому пролину, а также их немеченых аналогов. Метод основан на применении высокоспецифичного фермента (глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius) и позволяет получать пептиды (в данном случае, HFPGP) с высоким выходом и без образования побочных продуктов.

4. Установлено, что инкубирование глипролинов с мембранами клеток мозга крысы сопровождается образованием набора фрагментов, способных в ряде случаев конкурировать за места специфического связывания интактного пептида. Так, пептиды EHFPG и HFPGP вытесняют меченый семакс с мест специфического связывания даже эффективнее, чем немеченый MEHFPGP.

6. На мембранах мозжечка и гиппокампа крысы обнаружены места специфического связывания меченного по арахидоновой кислоте [ Н]АА-семакса и определены характеристики центров специфического взаимодействия (Kd = 51+3 нМ, Вшах = 35 ± 1 пмоль/мг. белка).

Заключение

Полученные в данной работе результаты позволили впервые охарактеризовать процессы взаимодействия глипролинов меланокортинового ряда с плазматическими мембранами мозга крысы. Обнаружены и охарактеризованы центры специфического связывания гепта-, пента- и три-пептидов (меченных тритием по С- концевому пролину) на плазматических мембранах различных отделов мозга крысы.

Изучение процессов деградации и образования глипролинов выявило существенные отличия в динамике и распределении продуктов протеолиза семакса в мозге лабораторных животных. Это позволило предположить существование причинно-следственной связи между накоплением продуктов биодеградации гептапептида в различных тканях и повышенной плотностью мест специфического связывания некоторых глипролинов на плазматических мембранах строго определенных отделов мозга крысы. Данные процессы могут лежать и в основе нейропротекторного действия семакса и его производных, их влияния на синтез моноаминов, экспрессию нейротрофинов, активацию других внутриклеточных процессов.

Используя биотехнологический подход, удалось разработать более простой и быстрый, по сравнению с химическим, метод синтеза широкого ряда молекул на основе пептидов, содержащих Glu. Предложенная схема с использованием высокоспецифических ферментов (глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius) позволяет осуществлять протеолиз довольно больших количеств субстрата с выходом порядка 96%, без образования побочных продуктов.

Изучение влияния различных фрагментов семакса, включая продукты N- и С- концевого протеолиза, на специфическое связывание глипролинов позволило определить пеитапептид, как минимальную аминокислотную последовательность, необходимую для обеспечения специфического взаимодействия семакса на мембранах гиппокампа и мозжечка. Анализ полученных результатов позволяет прийти к выводу о единой природе центров специфического связывания на плазматических мембранах гиппокампа и мозжечка и о более высоком их сродстве к пентапептиду. Некоторые агонисты и антагонисты канабиноидных и адрено- рецепторов, как оказалось, способны конкурировать за места связывания пентапептида. Иной локализацией в мозге обладают места специфического связывания трипептида, вероятно, что с этим может быть связано отсутствие у данного глипролина нейропротекторных свойств.

В работе впервые были исследованы процессы взаимодействия ряда синтетических ацильных производных аминокислот и пептидов с мембранами мозга крысы, влияние подобных соединений на специфическое

3 3 связывание МЕНРРО[ Н]Р и НРРО[ Н]Р. Обнаружены и охарактеризованы места специфического связывания АА-семакса на мембранах гиппокампа и мозжечка, а также представлены данные, свидетельствующие о вероятном взаимодействии арахидоноил — гептапептида с центрами специфического связывания семакса (входящего, в частности, в структуру молекулы пептолипина). Широкое изучение различных свойств синтетических аналогов арахидоноил-аминокислот и пептидов позволит, по-видимому, в будущем включить пептолипины в ряд новых полифункциональных регуляторов биологической активности организма.

В совокупности, полученные данные позволили сформулировать новую гипотезу молекулярного механизма действия семакса - ноотропного глипролина меланокортинового ряда. Вероятно, в основе реализации столь широкого набора физиологических эффектов препарата лежит активация сразу нескольких регуляторных систем организма под действием группы коротких биологически активных пептидов и аминокислот (фрагментов семакса), образующихся в результате протеолиза вводимого гептапептида.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Вьюнова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Гомазков O.A. Функциональная биохимия регуляторных пептидов. — Москва: Наука, 1992. 160 с.

2. Чалисова Н.И., Пеннияйнен В.А. Модулирующая роль незаменимых и заменимых аминокислот в органотипической культуре тканей у крыс разного возраста // Рос. физиол. журн. 2003. - Т. 89. - № 5. - С. 591 - 597.

3. Чалисова Н.И., Пеннияйнен В.А., Ноздрачев А.Д. Регулирующее действие аминокислот в органотипической культуре лимфоидных тканей с различной степенью зрелости // Докл. АН. 2003. - Т. 389. - № 2. - С. 117119.

4. Van Wimersma Greidanus Т.В., Bohus В., de Wied D. Hormones, homeostasis and the brain. Progress in Brain Research // Eisevier. 1975. - Vol. 42. - P. 135 - 141.

5. Агимарин И.П. В кн.: Чтения имени А. Д. Сперанского, 12 января 1984 г. // М.: изд. Института патофизиологии АМН СССР, 1984. С. 2 - 8.

6. Ашмарин И.П. Регуляторные пептиды сильногои быстрого действия // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1988. - Вып. 3. -С. 3-8.

7. Арион В.Я. В кн.: Медиаторы иммунной системы. // М.: ВИНИТИ, 1981. — Т. 9.-С. 11-50.

8. Ашмарин И.П., Обухова М.С. Регуляторные пептиды, функционально-непрерывная совокупность. // Биохимия. 1986. - Т. 51. - Вып. 4. — С. 531545.

9. Ашмарин И. П. Регуляторные пептиды, происхождение и иерархия // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1982. - Т. 18, № 1. - С. 310.

10. Клуша В.Е. Пептиды — регуляторы функций мозга. Рига: Зинатне, 1984. - 182 с.

11. Обухова М.Р. Регуляторные пептиды // БМЭ, 1988. Т. 29. - С. 312.

12. Усенко А.Б., Емельянова Т.Г., Мясоедов Н.Ф. Дерморфины природные опиоиды с уникальной первичной структурой, определяющей специфику их биологической активности // Известия АН, серия биологическая. — 2002. -№ 2. -С. 192-204.

13. Герштейн Л.М., Доведова E.JI., Узбеков М.Г., Голикова Т. Л., Сергутина A.B., Ашмарин. И.П. II Нейрохимия. 1984. Т. 3, № 3. - С. 236—243.

14. Хугаева В.К., Александрии В.В. Зависимость терапевтического эффекта пептидного препарата семакс от степени тяжести ишемии мозга // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1997. -Т. 4. - С. 39 -47.

15. Гривенников И.А., Долотов О.В., Голъдина Ю.И Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих // Молекулярная биология. 1999. - Т. 33. - № 1. - С. 1 - 7.

16. Полунин Г.С., Нуриева С.М., Баяндин Д.Л., Шеремет Н.Л., Андреева Л.А. Определение терапевтической эффективности нового отечественногопрепарата "семакс" при заболеваниях зрительного нерва // Вестник офтальмологии. 2000. - № 1. - С. 18 - 20.

17. Королева М.В., Мейзеров Е.Е., Незавибатъко В.Н., Каменский А.А., Дубьтин В.А. Влияние гептапептида семакс на электроэнцефалограмме человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 1996. -№ 1.-С. 48-52.

18. Castro M. G., Tomasec P., et.al. Mitogenic effects and nuclear localisation of procorticotrophin-releasing hormone expressed within stably transfected fibroblast cells (CHO-KI) // Molecular and Cellular Endocrinology. 1995. Vol. 107.-P. 17-27.

19. Wang Т. C., Koh T. J., Varro A., Cahill R. J., Dangler C. A., Fox J. G. & Dockray G. J. Processing and proliferative effects of human progastrin in transgenic mice // Journal of Clinical Investigation. 1996. - Vol. 98. — P. 918 -1929.

20. Karelin A.A., Blishchenko E.Yu., Ivanov V.T. A novel system of peptidergic regulation.// FEBSLett. 1998. - Vol. 428. - P. 7 - 12.

21. Karelin A. A., Blishchenko E.Yu., Ivanov V.T. Fragments of functional proteins: role in endocrine regulation // Neurochem. Res. 1999. - Vol. 24(9). - P. 1117 -1124.

22. Slominski A., Wortsman J., Luger T., Paus R., and Solomon S. Corticotropin releasing hormone and proopiomelanocortin involvement in the cutaneous response to stress // Physiol Rev. 2000. - Vol. 80. - P. 979 - 1020.

23. Villeneuve P., Seidah N.G., Beaudet A. Immunohistochemical distribution of the prohormone convertase PC5 -A in rat brain // Neuroscience. 1999. - Vol. 92.-P. 641 -654.

24. Zakarian S., Smyth D. G. Distribution of beta-endorphin-related peptides in rat pituitary and brain // Biochem. J. 1982. - Vol. 202. - P. 561 - 571.

25. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N. Degradation of ACTH/MSH(4-10) and its synthetic analog semax by rat serum enzymes: an inhibitor study // Peptides. 1993. - Vol. 14(3). - P. 491 - 495.

26. Vanderheyden M., Bartunek J., Goethals M. Brain and other natriuretic peptides: molecular aspects // Eur J Heart Failure. — 2004. — Vol. 6. — P. 261268.

27. Chini В, Parenti M. G-protein coupled receptors in lipid rafts and caveolae: how, when and why do they go there? // J Mol Endocrinol. 2004. - Vol. 32. -P. 325 -338.

28. Sydnor K.L., Sayers G. Biological half-life of endogenous ACTH // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1953. - Vol. 83. - P. 729 - 733.

29. Никифорович Г.В. и др. Конформации пептидных биорегуляторов. — Москва: Медицина, 1983. 192 с.

30. Dores R.M., Rubin D.A., Quinn T.W. Is it possible to construct phylogenetic trees using polypeptide hormone sequences? // Gen-Compar-Endocrinol. -1996.- Vol. 103.-№ 1.- P. 1 12.

31. Schwyzer R. Molecular mechanism of opioid receptor selection // Biochemistry. 1986. - Vol. 25. - P. 6335 - 6342.

32. Mandrika I., Petrovska R., WikbergJ. Melanocortin receptors form constitutive homo- and heterodimers // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2005. — Vol. 326.-P. 349-354.

33. Okamoto A., Lovett M., Payan D.G., Bunnett N.W. Interactions between neutral endopeptidase (EC 3.4.24.11) and the substance P (NK1) receptor expressed in mammalian cells // Biochem J. 1994. - Vol. 299. - P. 683 - 693.

34. Deddish P.A., Marcic В., Tan F., Jackman H.L., Chen Z.Z., Erdos E.G. Neprilysin Inhibitors Potentiate Effects of Bradykinin on B2 Receptor // Hypertension. 2002. - Vol. 39. - P. 619 - 623.

35. Erdos E.G., Marcic B.M. Kinins, receptors, kininases and inhibitors—where did they lead us? // Biol Chem. 2001. - Vol. 382. - P. 43 - 47.

36. Косинский Ю.А.и др. Предсказание структуры комплексов белок-лиганд от компьютерной модели к биологической функции. //Рос. хим. журнал. -2006. Vol. 1. - № 2. - С. 36 - 44.

37. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Меченные тритием липофильные соединения. Москва: Наука, 2003. — 246 с.

38. Dairaghi D.J., Oldham E.R., Bacon К.В., Schall T.J. Chemokine receptor CCR3 function is highly dependent on local pH and ionic strength // J Biol Chem. 1997. Vol. 272. - P. 28206 - 28209.

39. Kolena J., Jezova M., Vranova J., Scsukova S. Structure-stabilizing effect of albumin on rat ovarian LH/hCG receptors // Biochim Biophys Acta. 1999. -Vol. 1416 (1-2).-P. 208-216.

40. Saylor D.L., Speth R.C., Rowe B.P. Effects of peptidase inhibitors on binding at angiotensin receptor subtypes in the rat brain // Biochem Pharmacol. 1993. — Vol. 45(10).-P. 2109-2114.

41. Huang S. С., Talkad V.D., Fortune K.P., Jonnalagadda S., Severi C., Delle Fave G., Gardner J.D. Modulation of cholecystokinin activity by albumin // Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. - Vol. 92. - P. 10312 -10316.

42. Laduron P.M. Criteria for receptor sites in binding studies // Biochem Pharmacol. 1984. - Vol. 33(6). - P. 833 - 839.

43. Гуревич К. Г. Закономерности и возможные механизмы действия сверхмалых доз биологически активных веществ // Вестн. моек. ун. сер. 2. химия. 2001. - Т. 42. - № 2. - С. 131-134.

44. Гуревич К.Г. Вероятностное описание системы "лиганд-рецептор" // Биофизика. 1999. - Т. 44. - № 6. - С. 1022 - 1027.

45. Варфоломеев С.Д., Гуревич КГ. Биокинетика. Практический курс. — Москва: Фаир, 1999. 720 с.

46. Шпаков А. О. и др. Сравнительное исследование молекулярных механизмов влияния природных и синтетических поликатионных пептидов на активность аденилатциклазной сигнальной системы // Цитология. 2006. - Т. 48. - № 5. - С. 450 - 459.

47. Луценко В.К. Молекулярная патофизиология. Москва: МАИК, 2004. — 270 с.

48. Imtiaz M.S., Zhao J., Hosaka К., von der WeidP.Y., Crowe M., van Helden D. Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization // Biophys J. 2007. - № 9.

49. Nunez-Molina A., Amzica F. The mechanisms behind the generation of the slow oscillations found in EEG recordings during sleep // Rev Neurol. 2004. - Vol. 39. -№7.-P. 628 -633.

50. Hosoi N., Sakaba T., Neher E. Quantitative analysis of calcium-dependent vesicle recruitment and its functional role at the calyx of Held synapse //J Neurosci. 2007. - № 27. - P. 14286 - 14298.

51. Bernardi P., Rasola A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection // Subcell Biochem. 2007. - Vol. 45. - P. 481 - 506.

52. Kajstura J., Cigola E., Malhotra A., Li P., Cheng W., Meggs L.G., Anversa P. Angiotensin II induces apoptosis of adult ventricular myocytes in vitro // J Mol Cell Cardiol. 1997. - Vol. 29. - P. 859 - 870.

53. Foster T.C. Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain // Aging Cell. 2007. - Vol. 6. - P. 319 - 325.

54. Kraus M., Wolf B., Wolf B. Crosstalk between cellular morphology and calcium oscillation patterns. Insights from a stochastic computer model // Cell Calcium.- 1996.-Vol. 19. P. 461 -472.

55. Thomas A.P., Bird G.S., Hajnôczky G., Robb-Gaspers L.D., Putney J.W. Jr. Spatial and temporal aspects of cellular calcium signaling // FASEB J. 1996. -Vol. 13.-P. 1505- 1517.

56. Rooney T.A., Sass E.J., Thomas A.P. Characterization of cytosolic calcium oscillations induced by phenylephrine and vasopressin in single fura-2-loaded hepatocytes//J Biol Chem. 1989. - Vol. 264. - № 29. - P. 17131-17141.

57. Takano H., Pascual O., Haydon P.G. Bidirectional astrocyte-neuron communication: the many roles of glutamate and ATP // Novartis Found Symp.- 2006. Vol. 276. - P. 208 - 217.

58. James G., Pugh M., Butt A. Glutamate and ATP mediate glial calcium signalling in isolated intact rat optic nerves //J Anat. 2002. - Vol. 200. - № 2. -P. 207.

59. Reichardt L.F. Neurobiology: signals that make waves // Nature. 2003. - № 6.-Vol. 426.-P. 25-26.

60. Haydon P.G., Carmignoto G. Astrocyte control of synaptic transmission and neurovascular coupling 11 Physiol Rev. 2006. - Vol. 86. - P. 1009 - 1001.

61. Хавинсон ВХ., Малинин В.В., Чалисова Н.И., Григорьев Е.И. Тканеспецифическое действие пептидов в культуре тканей крыс разного возраста. // Успехи геронтологии. 2002. - Т. 3. - с. 278 - 280.

62. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики. -СПб.: Наука, 2000. 158 с.

63. Morozov V.G., Khavinson V.Kh. Natural and synthetic thymic peptides as therapeutics for immune dysfunction // Int. J. Immunopharmac. 1997. - Vol. 19.-№9/10.-P. 501 - 505.

64. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Levitzkaya N.G., Nezavibatko V.N. N-terminal degradation of ACTH(4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes // Biochem Biophys Res Commun. 1991. - Vol. 176(2). -C. 741-746.

65. Gozes I., et.al Pharmaceutical VIP prospects and problems. // Curr. Med. Chem. 1999.-Vol. 6.-P. 1019-1034.

66. Jinfa Ying, Xuyuan Gu§, Minying Cai, Matthew Dedek, Josef Vagner, Dev B. Trivedi Melanotropin peptide analogues selective for the human melanocortin-4 receptor // J Med Chem. 2006. - Vol. 16. - № 49. - P. 6888 - 6896.

67. Агимарин И.П., Андреева JT.A. и др. Ноотропный аналог адренокортикотропина 4-10 семакс. // Журнал ВНД. - 1997. - Т. 47. - № З.-Р. 420-430.

68. Maggio Е.Т., Ramnarayan К. Recent developments in computational proteomics // Trends Biotechnol. 2001. - Vol. 19. - P. 266 - 272.

69. Schreiner S.L. Target-oriented and diversity-oriented organic synthesis in drug discovery //Sctenct ZS1. 2000. - Vol. 2. - P. 1964-1969.

70. Соловьев B.H., Фирсов A.A., Филов B.A. Фармакокинетика: Руководство. -М.: Медицина, 1980.

71. Emerich D.F. et. al. Central analgesic actions of loperantide following transient permeation of the blood-brain barrier with Cereport (RMP-7) // Brain Res. — 1998.-№801.-P. 259-266.

72. Bickel U. et.al. Delivery of peptides and proteins through the blood-brain barrier // Adv. Drug. 2001. - № 46. - P. 247 - 279.

73. Becker-Hapak M. et. al. TAT-mediated protein transduction into mammalian cells 11 Methods. 2001. - № 24. - P. 247 - 256.

74. Ugwoke M.I. et al. The biopharmaceutical aspects of nasal mucoadhesive drug delivery. // Pharm. Pharmacol. 2001. - Vol. 53. - P. 3 - 21.

75. Law S.L. et al. Preparation of desmopressin-containing Hposomes for intranasal delivery // J. Control. Rel. 2001. - Vol. 10. - P. 375 - 382.

76. Dahlin M., Bjork E. Nasal administration of a physostigmine analogue (NXX-066) for Alzheimer's disease to rats // Int. J. Pharm. 2001. - Vol. 212. - P. 267 -274.

77. Ginkel F. W. et. ah Cutting edge: the mucosal adjuvant cholera toxin redirects vaccine proteins into olfactory tissues // J. Immunol. 2000. - Vol. 165. - P. 4778 - 4782.

78. Варпаловская И. Лекарственные препараты для интраназального применения // Медлайн Экспресс. 2001. - № 15. - С. 16 - 19.

79. Ворпаловская И. Лекарственные препараты для интраиазального введения // Ремедиум. 1999. - № 9. - С. 22 - 24.

80. Grigorakis S.I., Anastasiou Е., Dai К., Souvatzoglou A., Alevizaki М. Three mRNA transcripts of the proopiomelanocortin gene in human placenta at term // European Journal of Endocrinoloyn. 2000. - № 142. - P. 533 - 536.

81. EberleA.N. The melanotropins. Basel: Karger, 1988.

82. Jackson S., Lowry P.J. Distribution of adrenocorticotrophic and lipotrophic peptides in the rat // J Endocrinol. 1980. - Vol. 86. - № 2. - P. 205 - 219.

83. Civelli 0., Birnberg N., Herbert E. Detection and quantitation of proopiomelanocortin mRNA in pituitary and brain tissues from different specits // Journal of Biological Chemistry. 1982. - Vol. 257. - P. 6783 - 6787.

84. Tonnaer J.A., Weigant V.M., De Long W., De Wied D. Central effects of angiotensins on drinking and blood pressure: structure-activity relationships //Brain Res. 1982. - Vol. 236. - P. 417 - 428.

85. Banks W.A., Kastin AJ. Opposite direction of transport across the blood-brain barrier for Tyr-MIF-1 and MIF-1: comparison with morphine // Peptides. — 1994.-Vol. 15.-P. 23 -29.

86. Nakanishi S., Inoue A., Kita T., Nakamura M., Chang A.C.Y., Cohen S.N., Numa S. Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin precursor // Nature (Land). 1979. - Vol. 278. P. 423 - 427.

87. Chang A.C.Y., Cochet M, Cohen S.N. Structural organization of human genomic DNA encoding the pro-opiomelanocortin peptide // Proc Natl Acad Sci USA. 1980. - Vol. 77. - P. 4890 - 4894.

88. Drouin J., Goodman H.M. Most of the coding region of rat ACTH/0-LPH precursor gene lacks intervening sequences // Nature (Land). — 1980. № 288. — P. 610-613.

89. Kraus J., Buchfelder M., and Holt V. Regulatory elements of the human proopiomelanocortin gene promoter // DNA Cell Biol. 1993. Vol. 12. - P. 527 -536.

90. Seidah N.G., Day R., Marcinkiewicz M., Benjannet S., Chretien M. Mammalian neural and endocrine pro-protein and pro-hormone convertases belonging to the subtilisin family of serine proteinases // Enzyme (Basel). — 1991.-Vol. 45.-P. 271 -284.

91. Seidah N.G., Chretien M. Pro-protein convertases of subtilisin/kexin family // Methods Enzymol. 1994. - Vol. 244. - P. 175 - 188.

92. Malide D., Seidah N.G., Chretien M., Bendayan M. Electron microscopy immunocytochemical evidence for the involvment of the convertase PCI and PC2 in the processing of prrinsulin in pancreatic p-cells // J Cytochem. — 1995. -Vol. 43.-P. 11 19.

93. Benjannet S., Rondeau N., Day R., Chretien M., Seidah N.G. PCI and PC2 are proprotein convertases capable of cleaving proopiomelanocortin at distinct pairs of basic residues//Proc N Acad Sci USA. 1991. - Vol. 88.-P. 3564-3568.

94. Marcinkiewicz M., Day R., Seidah N.G., Chretien M. Ontogeny of the prohormone convertasis PCI and PC2 in the mouse hypophysis and their colocalization with corticotropin and a-melanotropin // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. - Vol. 90. - P. 4922 - 4926.

95. Day R., Schafer M.K., Watson S.J., Chretien M., Seidah N.G. Distribution and regulation of the prohormone convertases PCI and PC2 in the rat pituitary // Mol Endocrinol. 1992. - Vol. 6. - P. 485 - 497.

96. Peytremann A., Nicholson W.E., Brown R.D., Liddle G.W., Hardman J.G. Comparalive effecls of angiotensin and ACTH on cyclic AMP and steroidogenesis in isolated bovine adrenal cells // Journal of Clinical Investigation. 1973. - Vol. 52. - P. 835 - 842.

97. Cone R., Lu D., Koppula S. Vage D. Klungland H., Boston B. et. al. The melanocortin receptors: agonists, antagonists and the hormonal control of pigmentation // Recent Progress in Hormone Research. 1996. - Vol. 51. - P. 287-318.

98. Розен В.Б. Основы эндокринологии. // Москва: Изд. МГУ, 1994. 384 с.

99. Eberle A., Kriwaczek V.M., Schwyzer R. Mechanism of melanotropin action // Bull Schweiz Akad Med Wiss. 1978. - Vol. 34. - P. 99 - 111.

100. Chhajlani V., Muceniece R., Wikberg J.E. Molecular cloning of a novel human melanocortin receptor //Biochem Biophys Res Commun. 1993. - Vol. 196. -P. 866- 873.

101. Mountjoy K.G., Robbins L.S., Mortrud M.T., Cone R.D. The cloning of a family of genes that encode the melanocortin receptors // Science (Wash DC). -1992. Vol. 257. - P. 1248 - 1251.

102. Konda Y., Gantz I.f DelValle J., Shimoto Y., Miwa H., Yamada T. Interaction of dual intracellular signaling pathways activated by the melanocortin-3 receptor//J Biol Chem. 1994.-Vol. 269.-P. 13162- 13166.

103. Chhajlani V., Wikberg J.E. Molecular cloning and expression of the human melanocyte stimulating hormone receptor cDNA // FEBS Lett. 1992. - Vol. 309.-P. 417-420.

104. Rana B.K. New insights into G-protein-coupled receptor signaling from the melanocortin receptor system // Mol Pharmacol. 2003. - Vol. 64. - P.l - 4.

105. Abdel-Malek Z.A. Melanocortin receptors: their functions and regulation by physiological agonists and antagonists // Cell Mol Life Sci. 2001. - Vol. 58. -P. 434-441.

106. Kalden D.H., Scholzen T., Brzoska T., Luger T.A. Mechanisms of the antiinflammatory effects of a-MSH. Role of transcription factor NF-kB andadhesion molecule expression // Ann NY Acad Sci. 1999. - Vol. 885. - P 254 -261.

107. Penhoat A., Jaillard C., Saez J.M. Corticotropin positively regulates its own receptors and cAMP response in cultured bovine adrenal cells // Proc Natl Acad Sci. 1989. - Vol. 86. - P. 4978 - 4981.

108. Wakamatsu K., Graham A., Cook D., Thody A.J. Characterisation of ACTH peptides in human skin and their activation of the melanocortin-1 receptor // Pigment Cell Res. 1997. - Vol. 10. - P. 288 - 297.

109. Wikberg J.E., Mutulis F., Mutule /., Veiksina S., Lapinsh M., Petrovska R., Prusis P. Melanocortin receptors: ligands and proteochemometrics modeling // Ann NY Acad Sci. 2003. - Vol. 994. - P. 21 - 26.

110. Buggy J.J. Binding of a-melanocyte-stimulating hormone to its G-protein-coupled receptor on B-lymphocytes activates the Jak/STAT pathway // Biochem J.- 1998.-Vol. 331.-P. 211 -216.

111. Wikberg J.E., Muceniece I., Mandrika L, Prusis P., Lindblom J., Post C., Skotmer A. New aspects , in the melanocortins and their receptors // Pharmatti Res. 2000. - Vol. 42. - P. 393 - 420.

112. Suzuki L, Cone R.D., Im S., Nordlund J., Abdel-Malek Z.A. Binding of melanotropic hormones to the melanocortin receptor MC1R on human melanocytes stimulates proliferation and melanogenesis // Endocrinology. — 1996. — Vol. 137.-P. 1627- 1633.

113. Mountjoy K.G., Bird I.M., Rainey W.E., Cone R.D. ACTH induces up-regulation of ACTH receptor mRNA in mouse and human adrenocortical cell lines // Mol Cell Endocrinol. 1994. - Vol. 99. - P. 17 - 20.

114. Mountjoy K.G., Mortrud M.T., Low M.J., Simerly R.B., Cone R.D. Localization of the melanocortin-4 receptor (MC4-R) in neuroendocrine and autonomic control circuits in the brain // Mol Endocrinol. 1994. - Vol. 8. - P. 1298 - 1308.

115. Griffon N., Mignon V., Facchinetti P., Diaz J., Schwartz J.C., Sokolojf P. Molecular cloning and characterization of the rat fifth melanocortin receptor // Biochem Biophys Res Commun. 1994. - Vol. 200. - P. 1007 - 1014.

116. Chhajlani V. Distribution of cDNA for melanocortin receptor subtypes in human tissues // Biochem Mol Biol Int. 1996. - Vol. 38. - P. 73 - 80.

117. Abdel-Malek Z., Scott M.C., Suzuki I., Tada A., Im S., Lamoreux L., Ito S., Barsh G., Hearing V.J. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation // Pigment Cell Res. 2000. - Vol. 13. - P. 156 - 162.

118. Szardenings M., Muceniece R., Mutule L, Mutulis F., Wikberg J.E. New highly specific agonistic peptides for human melanocortin MC(1) receptor // Peptides.- 2000. Vol. 21. - P. 239 - 243.

119. Hunt G., Donatien P.D., Tunec J., Todd C., Kyne S., Thody A.J. Cultured human melanocytes respond to MSH peptides and ACTH // Pigment Cell Res.- 1994. Vol. 7. - P. 217 - 221.

120. Labbe О., Desarnaud F., Eggerickx D., Vassart G., and Parmentier M. Molecular cloning of a mouse melanocortin 5 receptor gene widely expressed in peripheral tissues // Biochemistry. 1994. - Vol. 33. - P. 4543 - 4549.

121. Starowicz К and Przewlocka B. The role of melanocortins and their receptors in inflammatory processes, nerve regeneration and nociception // Life Sci. -2003. Vol. 73. - P. 823 - 847.

122. Becher E., Mahnke K., Brzoska Т., Kalden D.H., Grabbe S., and Luger T.A. Human peripheral blood-derived dendritic cells express fimctional melanocortin receptor MC-1R // Ann NY Acad Sci. 1999. - Vol. 885. - P. 188- 195.

123. Catania A., Gatti S., Colombo G., Lipton J.M. a-Melanocyte stimulating hormone in modulation of inflammatory reactions // Pediat Endocrinol Rev. -2003.-Vol. l.-P. 101 108.

124. Murphy J. V., Miller R.E. The effect of ACTH on avoidance conditioning in the rat // J. Сотр. Physiol. Psychol. 1955. - V. 48. - P. 47 - 49.

125. DeWied D. Influence of anterior pitutary on avoidance learning and escape behavior // American Journal of Physiology. 1964. - V. 7. - P. 307- 314.

126. Bohus В., Endroczi E. The influence of pitutary-adrenocortical function on the avoiding conditioned reflex activity in rats // Acta Physiological Academiae Scientiarum Hungaricae. 1965. - Vol. 26. - P. 183 - 189.

127. Amir S., Galina Z.H., Blaiz R., Brown Z.W., Amit Z. Opiate receptors may mediate the suppressive but not the excitatory action of ACTH on motor activity in rats // Eur. J. Pharmacol. 1980. - Vol. 66. - P. 307 - 313.

128. Kshatri A.M., Foster P.A. Adrenocorticotropic hormone infusion as a novelxtreatment for postdural puncture headache // Reg. Anesth. 1997. - Vol. 22. -P. 432 - 434.

129. LiX.C., Li H.D., Zhao B.Y. Serotonin of hippocampus and hipotalamus taking part in the analgesic effect of adrenocorticotropic hormone in rats // Zhongguo YaoLiXueBao.-1990.-Vol. 11.-№ l.-P. 89-92.

130. Plantinga L.C., Verhaagen J., Edwards P.M., Hali M., Brakkee J.H., Gispen W.H. Pharmacological evidence for the involvement of endogenous a-MSH-like peptides in peripheral nerve regeneration // Peptides. 1995. - Vol. 16. - № 2. -P. 319-324.

131. Richter-Landsberg C., Jastorff B. The role of с AMP in nerve growth factor-promoted neurite outgrowth in PC 12 cells // The Journal of cell biology. — 1986.-Vol. 102. -№3.- P. 821 -829.

132. Strand F.L., Lee S.J., Lee T.S., Zuccarelli L.A., Ките J., Williams KA. Non-corticotrophic ACTH peptides modulate nerve development and regeneration // Rev. Neurosci. 1993. - Vol. 4. - № 4. - P. 391 - 363.

133. Wikberg J.E.C. Melanocortin receptors: perspectives for novel drugs I I Eur. J. Pharmacol. 1999. - Vol. 375. - № 1-3. - P. 295 - 310.

134. Huszar D., et.al. Targeted disruption of the melanocorticotropin-4 receptor results in obesity in mice // Cell. 1997. - Vol. 88.-P. 131-141.

135. Strader A.D., Schioth H.B., Buntin J.D. The role of the melanocortin system and the melanocortin 4 receptor in ring dove (Streptopelia risotia) feeding behavior // Brain Res. 2003. - Vol. 960. - № 1-2. - P. 112 - 121.

136. Глазова H. JO., Левицкая H. Г., Андреева Л. А., Каменский А. А., член-корреспондент РАН Мясоедов Н. Ф. Ноотропные эффекты нового аналога фрагмента актг(5-10) гексапептида актг(5-7) // Доклады академии наук. - 1999.-Т. 367. -№ 1.-С. 137- 140.

137. Патент HOUGHTEN PHARMACEUTICALS: US5420109. Novel chemical entities. - 1995.

138. Schioth H.B., Muceniece R., Wikberg J.E.S. Characterization of the binding of MSH-B, HP-228, GHRP-6 and 153N-6 to the human melanocortin receptor subtypes // Neuropeptides. 1997. - Vol. 349. - P. 359 - 366.

139. Патент RUDOLF MAGNUS INSTITUTE: W09827113. Novel chemical entities. - 1998.

140. Ivanova D.M., Vilenskii D.A., et.al. Study of the relationship between analgesic activity and structure of synthetic melanocortin analogs // Izv Akad Nauk Ser Biol. 2006. - Vol. 10. - P. 204 - 210.

141. Dunbar J.C., Lu H. Leptin-inducedincrease in sympathetic nervous and cardiovascular tone is mediated by proopiomelanocortin (POMC) products // Brain Res. 1999.-Vol. 50.-P. 215 - 221.

142. March D.J. Hollopeter, Yagaloff K.A., Fisher S.L. et al. Response of melanocortin-4 receptor-deficient mice to anorectic and orexigenic peptides // Nat. Genet. 1999. - Vol. 21. - P. 119 - 122.

143. Wessels H., Fuciarelli K., Hansen J. et al. Synthetic melanotropic peptide initiates erections in men with psychogenic dysfunction: double-blind, placebo controlled crossover study // Urol. 1998. - Vol. 160. - P. 389 - 393.

144. Патент MELACURE THERAPEUTICS: W09837097). Novel chemical entities. - 1998.

145. Безуглов В. В., Грецкая Н. М., Блаженова А. В., Андрианова Е. Л., Акимов М. Г., Бобров М. Ю., Назимов И. В., Кисель М. А., Шарко О. Л., Новиков А.

146. В., Краснов Н. В., Шевченко В. П., Шевченко К В., Вьюнова Т. В., Мясоедов Н. Ф. Арахидоноиламинокислоты и арахидоноилпептиды: синтез и свойства // Биоорганическая химия. 2006. - Т. 32. - № 3. - С. 258-267.

147. Сафарова Э.Р., Шрам С.И, Золотарев Ю.А, Мясоедов Н.Ф. Влияние пептида семакса на выживаемость культивируемых клеток феохромоцитомы крысы при окислительном стрессе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2003. Т. 135. — Р. 309 - 314.

148. Скворцова В.И, Насонов Е.Л., Журавлева Е.Ю., и др. Клинико-иммунобиохимический мониторинг факторов локального воспаления в остром периоде полушарного ишемического инсульта. // Журнал неврологии и психиатрии. — 1999. — Т. 5. С. 126 - 129.

149. Жуйкова С.Е., Сергеев В.К, Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф. Влияние семакса на индометациновое язвообразование у крыс и один из возможных механизмов его действия // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002. - Т. 133. - № 6. - С. 196 - 198.

150. Морозов В. Г., Хавинсон В. X. Пептидные биорегуляторы (25-летнии опыт экспериментального и клинического изучения). СПб.: Наука, 1996. - 74 с.

151. Dolotov О. V., Karpenko E.A., et. al. Semax, an analog of АСТЩ4-10) with cognitive effects, regulates BDNF and trkB expression in the rat hippocampus // Brain Res. 2006. - Vol. 30. - № 1117. - P. 54 - 60.

152. Sebentsova E.A., Levitskaya N.G., Andreeva L.A., Alfeeva L.Y., Kamenskii A.A., Myasoedov N.F. Effects of semax against the background of dopaminergic receptor blockade with haloperidol / Exp Biol Med. 2006. -Vol. 141.-P. 170- 174.

153. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са2+-ответы нейтрофилов человека // ДАН. -2000. Т. 374. - № 3. - С. 401 - 403.

154. Zolotarev Y.A., Dolotov O.V., Inozemtseva L.S., et.al. Degradation of the АСТЩ4-10) analog Semax in the presence of rat basal forebrain cell cultures and plasma membranes // Amino Acids. 2006. - Vol. 30. — P. 403 - 408.

155. Ашмарин И. 77., Каменский А. А., Ляпина JI. А., Мясоедов H. Ф., Самонина Г. Е. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2002. - № 1. - С. 176 - 178.

156. Еськова Т.А Модуляция пептидом Gly-Pro секреторной функции желудка собак после стресса // Эл. журнал «Исследовано в России». -http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2004/135.pdf

157. Арефьева И. А. Изучение действия аналога АКТГ и Тафтсина на клетки нервной системы млекопитающих: Дисс. канд. биол. наук. — Москва, 1992.- 244 с.

158. Dolotov О. К, Zolotarev lu.A., et. al The binding of Semax, ACTH 4-10 heptapeptide, to plasma membranes of the rat forebrain basal nuclei and its biodégradation // Bioorg Khim. 2004. - Vol. 30. - P. 241 - 246.

159. Scamuffa N., Calvo F., Chretien M., Seidah N.G., Khatib A.M. Proprotein convertases: lessons from knockouts // FASEB J. 2006. - Vol. 20. - № 12. — P. 1954- 1963.

160. BasakA. Inhibitors of proprotein convertases // J Mol Med. 2005. - Vol. 83. -№ 11.-P. 844- 855.

161. Pankov Y.A., Keda Y.M., Sazina E.T. Involvement of proteolytic enzymes in the lipotropic effect of the pituitary polypeptide hormones // Horm Metab Res.- 1986.-Vol. 18.-P. 374-377.

162. Paterson A.C., Baldwin G.S., Shulkes A. Metabolism of recombinant progastrin in sheep // Am J Physiol. Endocrinol. Metab. 2002. - Vol. 283. - № 3. - P. 449-456.

163. Salas M.A., Brown O.A., Perone M.J., Castro M.G., Goya R.G. Effect of the corticotrophin releasing hormone precursor on interleukin-6 release by humanmononuclear cells // Clin Immunol Immunopathol. 1997. - Vol. 85. - № 1. -P. 35 - 39.

164. Shen H.Y., Tian G.L., Ye Y.H. Synthesis of dermorphin-(l-4) derivatives catalyzed by proteases in organic solvents // J Pept Res. 2005. - Vol. 65. - № l.-P. 143 - 148.

165. Clapes P., Torres J.L., Adlercreutz P. Enzymatic peptide synthesis in low water content systems: preparative enzymatic synthesis of Leu.- and [Met]-enkephalin derivatives // Bioorg Med Chem. 1995. - Vol. 3. - № 3. - P. 245 -255.

166. Klein J.U., Cerovsky V. Protease-catalyzed synthesis of Leu-enkephalin in a solvent-free system // Int J Pept Protein Res. 1996. - Vol. 47. - № 5. - P. 348 -352.

167. Shen H.Y., Tian G.L., Ye Y.H. Synthesis of dermorphin-(l-4) derivatives catalyzed by proteases in organic solvents // J Pept Res. — 2005. — Vol. 65. № l.-P. 143 - 148.

168. Fite M., Clapes P., Lopez-Santin J., Benaiges M.D., Caminal G. Integrated process for the enzymatic synthesis of the octapeptide PhAcCCK-8 // Biotechnol Prog. 2002. - Vol. 18. - № 6. - P. 1214 - 1220.

169. Schellenberger V., Pompejus M., Fritz H.J. Peptide production by a combination of gene expression, chemical synthesis, and protease-catalyzed conversion // Int J Pept Protein Res. 1993. - Vol. 41. - № 4. - P. 326 - 332.

170. Schellenberger V., Tegge W., Klöppel KD., Frank R. Proteinase-catalyzed conversion of a substance P-precursor peptide // Int J Pept Protein Res. — 1992. Vol. 39. - № 5. - P. 472 - 476.

171. Rebrikov D.V., Akimkina T.V., Shevelev A.B., Demidyuk I.V. et. al. Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase. Molecular cloning and nucleotide sequence of the structural gene //J Protein Chem. 1999. - Vol. 18. - № l.-P. 21 -27.

172. Kitabgi P. Prohormone convertases differentially process pro-neurotensin/neuromedin N in tissues and cell lines // J Mol Med. — 2006. — Vol. 84. № 8. - P. 628 - 634.

173. Шевченко К В., Алфеева JI. Ю., Шевченко В. П., Нагаев И. Ю., Мясоедов Н. Ф. Распределение семакса в различных отделах мозга крыс при интраназальном введении // Доклады Российской академии наук. 2006. -Т. 409. - №. 3. - С. 428-429.

174. Зайцев С.В., Ярыгин КН., Варфоломеев С.Д. Наркомания. Нейропептид-морфиновые рецепторы. Москва: МГУ, 1993. -251 с.

175. MoulikS., Speth R.C., Rowe В.P. Differential loss in function of angiotensin II receptor subtypes during tissue storage // Life Sci. 2000. — Vol. 66. - № 16. — P. 233 - 237.

176. Zachariah N.Y., Chakmakjian Z.H. Stability of estrogen- and progesterone-receptor concentrations in human uterus tissue // Clin Chem. — 1983. — Vol. 29. № 6. - P. 1070- 1072.

177. Iversen L.H., Thorlacius-Ussing O. Short-time stability of markers of coagulation and fibrinolysis in frozen plasma // Thromb Res. — 1996. — Vol. 81. -№ 2.-P. 253-261.

178. Васягин А.И., Шафранский Ю.И., Исаев B.A., Светова Ю.Б., Жаров Е.И. Коррекция гипоксических состояний с помощью ПНЖК // Всес. Конф. "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний": Тез. Докл. -Гродно. 1991.-С. 7.

179. Кольман Я., Рём К. Наглядная биохимия. Москва: Мир, 2000. - 370 с.

180. Пампура А.Н., Погомий Н.Н., Чебуркин А.А., Святкина О.Б., Исаев В.А. Опыт применения ПНЖК омега-3 у детей с атопическим дерматитом // Лечащий врач, 2000. - № 7. - С. 42-43.

181. Гомберг М.А., Соловьев A.M., Аковбян В.А. Атопический дерматит. //РМЖ. 1998. - Т. 6. - № 20. - С. 171.

182. Samuelson В. The Leicotrienes: a new group of biologically active compounds including // Trends in Pharmacol.Sci. 1980. - Vol. 1. - P. 227 - 230.

183. Pound Eric M., Kang JingX., Leaf A. J. Partitioning of polyunsaturated fatty acids, which prevent cardiac arrhythmias, into phospholipid cell membranes // Lipid Res. 2001. - Vol. 42. - № 3. - P. 346 - 351.

184. Huang S. M, Bisogno Т., et.al. Identification of a New Class of Molecules, the Arachidonyl Amino Acids, and Characterization of One Member That Inhibits Pain //Journal of Biological Chemistry. 2001. - Vol. 276. - № 46. - P. 42639- 42644.

185. Kawazoe R., Okuyama H., Reichardt W., Sasaki S. Phospholipids and a novel glycine-containing lipoamino acid in Cytophaga johnsonae Stanier strain C21 // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 5470 - 5475.

186. Yagi H., Corzo G., Nakahara T. N-acyl amino acid biosynthesis in marine bacterium, Deleya marina //Biochim Biophys Acta. 1997. - Vol. 19. - № 336. -P. 28-32.

187. Burstein S.H., Rossetti R.G., Yagen В., Zurier R.B. Oxidative metabolism of anandamide //Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2000. - Vol. 61. - № 1-2. -P. 29-41.

188. Wiles A.L., Pearlman R.J., Rosvall M., Aubrey K.R., Vandenberg R.J. N-Arachidonyl-glycine inhibits the glycine transporter, GLYT2a // J Neurochem.- 2006. Vol. 99. - P. 781 - 786.

189. R.B. Regulation of anandamide tissue levels by N-arachidonylglycine // Biochem Pharmacol. 2002. - Vol. 1. - № 64. - P. 1147 - 1150.

190. Milman G., Maor K, et. al. N-arachidonoyl L-serine, an endocannabinoid-like brain constituent with vasodilatory properties // Proc Natl Acad Sci US A.-2006. Vol. 14. - № 103. - P. 2428 - 2433.

Информация о работе

Вьюнова, Татьяна Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Глипролины меланокортинового ряда: процессы биодеградации и взаимодействия с мембранами клеток мозга - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы