Глипролины и их комплексные соединения с гепарином как физиологические модуляторы функции противосвертывающей системы организма

Оберган, Тамара Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Глипролины и их комплексные соединения с гепарином как физиологические модуляторы функции противосвертывающей системы организма
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Глипролины и их комплексные соединения с гепарином как физиологические модуляторы функции противосвертывающей системы организма"

На правах рукописи

ОБЕРГАН ТАМАРА ЮРЬЕВНА

ГЛИПРОЛИНЫ И ИХ КОМПЛЕКСНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ С ГЕПАРИНОМ КАК ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДУЛЯТОРЫ ФУНКЦИИ ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА

специальность - 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ БЕСПЛАТНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР

Работа выполнена в лаборатории защитных систем крови им. проф. Б.А.Кудряшова кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится 1 ноября 2004 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В .Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 30 сентября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ляпина Л.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Титов С.А.

кандидат биологических наук, Романова Е.П.

доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Актуальной проблемой современной физиологии крови является исследование механизмов регуляции нормального функционирования системы гемостаза.

противосвертывающей (ПСС) систем. В этих реакциях естественными гуморальными агентами ПСС служат гепарин и активаторы плазминогена.

Известно, что в нормальном функционировании гемостаза принимают участие и физиологически активные регуляторные пептиды (в том числе глипролины PG, PGP, GP), механизм действия которых окончательно не расшифрован (Абрамова и др., 1996; Ашмарин и др., 1996; Ашмарин и др., 1998).

В настоящее время особое внимание уделяется изучению механизма действия на гемостаз природных глипролинов и веществ, созданных на их основе. Одним из вероятных предшественников природных глипролинов является основной структурный белок - коллаген, который при физиологических условиях подвергается протеолизу под влиянием ферментов, таких как трипсин, химотрипсин, пепсин, эластаза, металлопротеиназы. Это может привести к образованию полипетидов и простейших пептидов, содержащих пролин, глицин и оксипролин (Hashimoto et al., 1995; Bon et al., 1997; Lazareva et al., 1997; Rothman et al., 1997).

Известно, что естественный антикоагулянт - гепарин - способен в силу своих структурных особенностей взаимодействовать с различными белками и пептидами (Ляпина и др., 2000; Kudrjashov et al., 1986; Hirsh et al., 2001) с образованием комплексов, обладающих фибринолитическим и антикоагулянтным действием (Ашмарин и др., 1996). С другой стороны, глипролины входят в гепаринсвязывающую область коллагена и вполне вероятно, что они способны взаимодействовать с гепарином с образованием комплексных соединений. В литературе имеются сообщения, что комплексные соединения высоко- (ВМГ) и низкомолекулярного (НМГ) гепарина с олигопептидами (с тафцином, тимозином) ингибируют первичный и плазменный гемостаз (Ляпина и др., 1990; Ашмарин и др.. 1991)..

В настоящее время в медицинской практике в качестве антикоагулянтов используются коммерческие препараты гепарина животного происхождения, которые имеют тенденцию к ограничению в связи с возможностью развития различных побочных эффектов при их применении (геморрагии, тромбоцитопения, остеопороз и др.) (Бокарев, 2002; Makarov et al., 2004). Поэтому весьма актуален поиск агентов, обладающих регуляторными функциями, способными нормализовать в организме свертывание крови при ее нарушениях. В то же время известно, что многие биологически активные вещества из высших растений активно участвуют в процессах гемокоагуляции и фибринолиза. Имеются сообщения о наличии в некоторых растениях гепариноподобных полисахаридов, обладающих антикоагулянтным действием (Ляпина и др., 2001; Щербак и др., 2001; Кузнецова и др., 2003). Исходя из этого, растения могут быть перспективным источником для создания эффективных средств коррекции нарушений гемостаза.

Принимая во внимание эти данные, а также то обстоятельство, что в литературе нет систематизированных данных о взаимодействии гепарина с пролинсодержащими пептидными фрагментами коллагена, изучение регуляторной роли глипролинов и их комплексных соединений на состояние системы гемостаза в организме является актуальной проблемой физиологии.

Цель настоящего исследования - изучить основные закономерности регуляторного действия глипролинов и их комплексных соединений с гепарином на функциональное состояние свертывающей и противосвертывающей систем организма.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние на антикоагулянтную и фибрин олитичес кую активность крови линейных и циклических глипролинов (PG, PGP, c-PG) в разных дозах и при разных способах введения животным (внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, интраназально).

2. Доказать взаимодействие глипролинов с разными видами гепаринов (ВМГ и НМГ), получить их комплексные соединения и установить антикоагулянтные, фибринолитические, антифибринстабилизирующие и антитромбоцитарные эффекты этих препаратов в условиях in vitro и in vivo.

3. Исследовать коррелирующую роль различных пептидных соединений при нарушениях свертывания крови на моделях животных с депрессией функции противосвертывающей системы (возрастные изменения организма) и тромбообразования.

Научная новизна исследования: Впервые изучен ряд линейных и циклических глипролинов и их комплексов с разными формами гепаринов (ВМГ, НМГ животного и растительного происхождения), среди которых выявлены соединения, обладающие in vitro сочетанными антикоагулянтными, фибриндеполимеризационными, антифибринстабилизирующими и

антитромбоцитарными свойствами. Обнаружено наличие у данных соединений собственной неферментативной фибринолитической активности.

В экспериментах на животных изучено регуляторное влияние этих соединений на систему гемостаза и впервые показана важная роль гепарина как составной части комплексов с глипролинами для реализации высокой фибриндеполимеризационной, антикоагулянтной и антитромбоцитарной активности крови.

Впервые установлено, что глипролины и их комплексы с гепарином стимулируют секрецию тканевого активатора плазминогена (тАП), способствуют снижению уровня антиплазминов и увеличению уровня гепарина в кровотоке.

Методами ИК-спектрофотометрии, перекрестного электрофореза и электрофореза в полиакриламидном геле получены доказательства взаимодействия гепарина с глипролинами с образованием новых комплексных соединений, обладающих высокой антитромботической активностью.

Теоретическая и практическая значимость работы:

В эксперименте определена физиологическая роль глипролинов и их комплексных соединений с гепарином, участвующих в регуляции жидкого состояния крови. Показано, что такие соединения создают в организме антикоагулянтный, фибринолитический фон, защищая его от возникновения внутрисосудистых сгустков крови при их провокации.

Результаты работы существенно дополняют современные представления о механизмах антикоагулянтного и фибринолитического действия глипролинов. Усиление противосвертывающих свойств глипролинов в комплексах с гепарином свидетельствует о важности обоих компонентов для этого процесса.

Установлено, что антикоагулянтное действие глипролинов и растительного гепарина сопоставимо с действием гепарина животного происхождения, что создает реальную перспективу получения новых антикоагулянтов.

Предложен способ получения препарата из корней пиона Paeonia suffruticosa с антикоагулянтным действием (патент № 2068702 от 22.03.95).

Существенное значение может иметь выявленная нами функциональная противосвертывающая активность глипролинов и их комплексных соединений с гепарином для проявления антитромботического действия в организме и для восстановления регуляторных взаимоотношений свертывающей и ПСС при депрессии функции ПСС (при возрастных изменениях организма).

Данные, полученные при пероральном и интраназальном применении глипролинов и их комплексов, свидетельствующие о сохранении противосвертывающих эффектов, позволяют рекомендовать их для профилактики и борьбы с тромбообразованием на его начальных стадиях.

Апробация работы: Основные результаты работы были представлены на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (28 июня 2004 г.). Отдельные фрагменты работы доложены на II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995); на XIII meeting of Inemational Society of Haematology (Istanbul, 1995); на XIII International Congress on fibrinolysis and thrombolysis (Barcelona, 1996); на III Всероссийской конференции «Тромбозы и геморрагии» (Москва, 1997); на International Congress on Atherothrombosis and Hemostasis (Italy, 2002); на Международной конференции, посвященной 10-летию со дня основания Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудистой стенки им. Шмидта-Кудряшова (Москва, 2003); на 8-th Annual Congress of European Hematology Association (France, 2003).

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 157 страницах и

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы (105 отечественных и 145 иностранных источников), иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использованы: линейные глипролины - дипептид Pro-Gly (PG) и трипептид Pro-Gly-Рго (PGP), синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН; циклический L-пролилглицин (cPG), предоставленный Институтом фармакологии РАМН; высокомолекулярный гепарин (ВМГ) фирмы "Serva" (США), М.в. 10 кДа; низкомолекулярный гепарин (НМГ) фирмы "Celsus" (США), М.в. 4,4 кДа; низкомолекулярный гепариноподобный агент из растений и комплексные соединения указанных пептидов с гепаринами.

Гепариноподобный антикагулянт из растений (растительный антикоагулянт -Раст.АК) получали из корней пиона P.suffruticosa по нашему методу (патент № 2068702).

Комплексы пептидов с гепаринами животного и растительного происхождения получали в чистой системе при весовом соотношении компонентов 1:1 по разработанному нами методу.

Опыты проведены на белых лабораторных крысах-самцах двух возрастных групп: 2-3 мес. (масса тела 180-220 г) и 9-11 мес. (350-420 г). Всего в работе использовано 625 животных.

Исследуемые препараты вводили разными способами: внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, интраназально. Контрольные животные вместо препаратов в тех же условиях получали 0,85%-й физиологический раствор NaCl. Было выполнено несколько серий экспериментов: однократное, многократное, хроническое введение препаратов здоровым животным и в условиях моделирования депрессии функции противосвертывающей системы (ДПСС) и тромбообразования.

Используемые модели: ДПСС при возрастных изменениях организма (использовались животные в возрасте 9-11 мес); тромбообразование (искусственное образование тромбов у здоровых животных по методу Wessler (1959) с нашей модификацией).

Для анализа физико-химических свойств препаратов использовали: 1. Электрофоретические методы: пересекающийся электрофорез (Barrowcliffe, 1980) с целью доказательства комплексообразоваия между пептидами и гепарином; электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии

додецилсульфата натрия (Eaton et al., 1991) - для анализа гомогенности гепариноподобного антикоагулянта из пиона и установления его молекулярной массы; электрофорез на бумаге - для определения электрофоретической подвижности опытных образцов.

2. Спектральные методы: инфракрасная спектроскопия - для характеристики полученных препаратов - на приборе ИКС-29 (Орлов, Осипова, 1988); масс-спектрометрия - для определения в гепариноподобном антикоагулянте из пиона содержания серы, азота и углерода в водных 0,4%-х растворах образцов по методу Танцырева, Лялина (1991).

Антикоагулянтную активность крови оценивали по тесту АЧТВ (при помощи диагностических наборов фирмы «Медио Лаб», Россия) и тромбиновому времени общепринятыми методами (Долгов и др., 1990; Баркаган и др., 1999; Козлов и др., 2003).

Концентрацию гепарина определяли по методу Шестакова (1975).

Определяли активность фактора XIIIa in vitro и in vivo (Баркаган и др., 1999).

Для оценки фибринолитической системы использованы методы определения: общей фибринолитической активности, активности плазмина и тканевого активатора плазминогена по зонам лизиса на стандартных прогретых и непрогретых фибриновых пластинах (Андреенко, 1981); суммарной фибринолитической активности и фибриндеполимеризационной способности глипролинов и их комплексных соединений с гепарином растворять нестабилизировнный фактором ХШа фибрин (Kudrjashov, Lyapina, 1986), а2-антиплазминов в плазме крови (с использованием хромогенного субстрата S-2251 (Баркаган и др., 1999)).

Агрегационную активность тромбоцитов изучали на богатой тромбоцитами плазме фотометрическим методом Born (1962) в модификации Берковского (2001) на агрегометре 230LA НПФ Биола (Россия), используя в качестве индуктора агрегации АДФ (в конечной концентрации 15 мкМ).

Статистическую обработку результатов проводили, используя t-критерий Стьюдента, операции выполняли на PENTIUM с помощью пакета статистических программ BIOSTAT (изд. «Практика», 1998).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование противосвертываюших эффектов

линеиных

ииклическихглипролинов.

В условиях in vitro в диапазоне концентраций от 10-11 до 10-3 М нами исследовались глипролины PG, PGP, c-PG и составляющие их аминокислоты Р и G на наличие антикоагулянтных, фибринолитических, антитромбоцитарных свойств и антифибринстабилизирующей активности плазмы крови.

Как видно из рис. 1-А, все пептиды обладали умеренной антикоагулянтной активностью: время образования сгустка по тесту АЧТВ увеличивалось по сравнению с контролем в диапазоне концентраций от 10-8 до 10-3 М для PG и PGP на 10-23% (р<0,05). Для c-PG достоверное возрастание АЧТВ на 20-10% (р<0,05) происходило во всем диапазоне исследуемых концентраций (10-11 - 10-3М).

Рис.1. Антикоагулянтные и фибринолитические свойства глипролинов в условиях in vitro.

Примечание: здесь и далее статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля **-р<0,01; *-р<0,05

У всех исследованных пептидов выявлена дозозависимая фибринолитическая активность, которая в основном обусловлена

фибриндеполимеризационными свойствами пептидов (неферментативный фибринолиз - НФ). Так, PG при концентрациях от 10-9 до 10-3 М вызывал увеличение НФ на 16-24% по сравнению с контролем; PGP при концентрациях от 10-5 до 10-3 М - на 12-20%; c-PG при концентрациях от 10-6 до 10-3 М - на 16-20% (во всех случаях р<0,05) (рис1-Б).

Добавление пептидов в концентрации 10-4 М к нормальной плазме крови приводило к снижению активности фактора фактора ХШа: пептиды PG и PGP уменьшали этот показатель по сравнению с контролем на 39 и 50% соответственно (р<0,01), a c-PG - на 20% (р<0,05).

При исследовании влияния пептидов на агрегацию тромбоцитов установлено следующее: в широком интервале концентраций препаратов - от 10-11 до 10-3 М - добавление к плазме PG, PGP и c-PG с последующей стимуляцией смеси раствором АДФ, приводило к достоверному снижению агрегации тромбоцитов по сравнению с контролем на 50-87%, 46-69% и 4080% соответственно.

При этих же условиях отдельные аминокислоты Р и G не изменяли антикоагулянтные и фибринолитические свойства плазмы крови, не влияли на активность фактора ХШа и агрегацию тромбоцитов (различия по сравнению с контрольными значениями были недостоверны, р>0,2).

Таким образом, пептиды в условиях in vitro обладали антитромбоцитарными, антикоагулянтными, неферментативными

фибринолитическими и антифибринстабилизирующими свойствами.

Для выявления действия глипролинов на параметры гемостаза в условиях in vivo была исследована дозозависимость противосвертывающих эффектов линейных глипролинов PGP и PG при дозах 200 мкг/кг, 1 мг/кг и 1,5 мг/кг (рис. 2).

Внутривенное введение PGP в дозе 200 мкг/кг усиливало фибринолитическую активность плазмы, а именно суммарную фибринолитическую активность (СФА) и НФ на 52 и 43% соответственно, активность тканевого активатора плазминогена (ААП) - на 110% по сравнению с контролем (р<0,01). При этом наблюдалось снижение активности фактора ХШа плазмы - на 31% (р<0,01) и тенденция к уменьшению агрегации тромбоцитов - на 17% (р>0,05).

Рис.2. Неферментативный фибринолиз (НФ), активность тАП (ААП), антикоагулянтная активность (АЧТВ) и агрегация тромбоцитов через 10 мин после внутривенного введения животным PGP и PG в дозах 200 мкг/кг, 1 мг/кг и 1,5 мг/кг

Антикоагулянтная активность плазмы крови (по тесту АЧТВ) практически не изменялась по сравнению с контролем (р>0,2). Увеличение дозы пептида до 1 мг/кг приводило к усилению СФА, НФ, ААП по сравнению с контролем - до 173, 158 и 250% соответственно. Активность фактора ХШа и агрегация тромбоцитов составила 61% и 73% соответственно при этой дозе пептида. Одновременно происходило повышение антикоагулянтного фона плазмы: время образования сгустка (по АЧТВ) увеличилось по сравнению с контролем на 42% (р<0,01). При дозе пептида 1,5 мг/кг происходило дальнейшее увеличение антикоагулянтного и фибринолитического фона плазмы крови животных, а именно: СФА составила 200%, НФ - 180%, ААП - 300%, АЧТВ.- 170%, активность фактора ХШа -52%, агрегация тромбоцитов - 21% по сравнению с контролем (во всех случаях р<0,01).

Подобная картина установлена и при внутривенном введении пептида PG в тех же дозах, однако антикоагулянтная и антитромбоцитарная активности проявлялись уже при дозе 200 мкг/кг.

Динамика действия глипролинов была исследована при однократном внутривенном введении Рв (1 мг/кг массы тела) через 10 мин (1-я серия) и 30 мин (2-я серия) после инъекции раствора пептида.

Как видно из рис.3, в 1-й серии эксперимента (через 10 минут) происходило достоверное возрастание антикоагулянтной активности плазмы (по АЧТВ) на 26% (р<0,01) и увеличение уровня гепарина в плазме крови опытных животных на 55% (р<0,05) по сравнению с контролем. При этом возрастание СФА - на 80% происходило как за счет повышения НФ - на 69%, так и за счет увеличения ААП - на 126% (во всех случаях р<0,01). В этих условиях снижались активность фактора ХШа - на 30% (р<0,01), агрегация тромбоцитов - на 25% (р<0,05), и уровень антиплазминов - на 28% (р<0,01) по сравнению с контролем.

Во 2-й серии эксперимента (к 30-й минуте наблюдения) СФА, ААП, АЧТВ и уровень гепарина снижались по сравнению с 1-й серией и в то же время превышали контрольные значения: СФА составляла 170% (р<0,01), ААП -177% (р<0,01), АЧТВ - 114% (р<0,05), уровень гепарина - 128% (р<0,05) по сравнению с контролем, НФ оставался на прежнем уровне - 168% (р<0,01). Активность фактора ХШа и уровень антиплазминов составляли 80% от контрольных значений в обоих случаях (р<0,05). При этом агрегация тромбоцитов достоверно не отличалась от контрольных значений (р>0,2).

Таким образом, пептиды при их однократном внутривенном введении способствовали усилению антикоагулянтного и фибринолитического плазмы, который был пропорционален дозе вводимых пептидов и достигал максимального значения в первые 10 минут, сохраняя активность и через 30 минут после введения.

РисЗ.Суммарная фибринолитическая активность (СФА), антикоагулянтная активность (АЧТВ), уровень гепарина (Ур.геп.), активность фактора ХШа (ФХШа) и агрегация тромбоцитов (АТ) плазмы крови животных через 10 и 30 минут после внутривенного введения PG (1 мг/кг).

Таблица 1.

Изменение противосвертывающих свойств плазмы крови при разных способах введения глипролинов животным (на примере PG) в дозе 1 мг/кг

Примечание: стрелками показано увеличение (|) или уменьшение(Х) абсолютных значений показателей по сравнению с соответствующими контрольными значениями, принятыми за 100%; статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля, ** -р<0,01; * -р<0,05

При других способах введения (внутрибрюшинном, пероральном, интрана-зальном) в разных условиях эксперимента наблюдалось аналогичное действие пептидов, т.е. достоверное увеличение антикоагулянтного и фибринолитического потенциала плазмы крови животных (табл. 1).

Следовательно, глипролины участвуют в регуляции функции ПСС, так как при всех способах введения глипролинов животным усиливался антикоагулянтный, фибринолитический фон и антифибринстабилизирующие свойства плазмы крови.

Тот факт, что глипролины обладают собственной неферментативной фибринолитической активностью, т.е. способностью растворять нестабилизированный фибрин даже в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза, обуславливает антикоагулянтные и антифибринстабилизирующие свойства этих пептидов.

Поскольку по данным литературы известно, что глипролины в значительном количестве включены в гепаринсвязывающую область коллагена и учитывая, что при появлении пептидов в кровотоке одновременно повышается уровень гепарина, мы предположили, что в реализации противосвертывающих эффектов пептидов также имеет место и взаимодействие пептидов с гепарином.

Ранее была установлена способность некоторых регуляторных пептидов образовывать комплексные соединения с высокомолекулярным (ВМГ) и низкомолекулярным (НМГ) гепарином (Ашмарин и др., 1996). При этом комплексные соединения приобретают новые или усиливают уже существующие противосвертывающие свойства (Ляпина и др., 2000).

В последующей серии экспериментов мы изучали влияние полученных нами комплексных соединений глипролинов с разными формами гепарина (ВМГ и НМГ) на функциональное состояние системы гемостаза.

Изучение комплексных соединений глипролинов с ВМГ,

Факт комплексообразования между ВМГ и глипролинами (на примере пептида Рв) был доказан методом пересекающегося

электрофореза. Как видно рис.4, при передвижении в электрическом поле гепарина и пептида в месте их контакта наблюдалось исчезновение окраски красителем (0, 033% раствор Азура А) на кислые группы

гепарина, что свидетельствовало о взаимодействии между ВМГ и пептидом.

По разработанному нами методу был получен комплекс ВМТ-Рв (1:1 по весу), для которого была проведена инфракрасная спектроскопия (ИК-спектроскопия), что дало возможность установить участие тех или иных химических групп компонентов в комплексообразовании.

Исследование структурных особенностей комплекса проводилось на основании сопоставления ИК-

Рис.4. Пересекающийся электрофорез ВМГ и пептида Рв в присутствии 0,033%-го раствора красителя «Азур А»

спектра комплекса со спектрами исходных веществ - ВМГ и Рв. Как видно из рис. 5, общий вид спектра комплекса, особенно в области 1400 - 900 см-1 носил индивидуальный характер и отличался от РЖ-спектров составных компонентов, что говорило о существовании нового соединения. При этом в спектре комплекса обнаружено снижение уровня интенсивности 8О3-

Рис.5. ИК-спектры ВМГ, пептида Рв и комплексного соединения ВМГ-Рв.

связей (исчезновение или уменьшение колебаний в области 1240, 1150, 1050, 800 и 600 см-1), исчезновение полос поглощения в области 1380-1240 см-1 (которые соответствовали колебаниям -СН и С=О групп гепарина). Снижался уровень колебаний свободных и ионизированных карбоксильных групп (1580 и 1410 см-1) и усиливалась широкая полоса в области 3600-3200 см"1.

Анализ полученного спектра комплекса и данные пересекающегося электрофореза позволяют говорить, что в комплексообразовании принимают участие NH-группировки пептида (связь PG с гепарином осуществляется по N-концу пептида) и кислые (сульфо- и карбоксильные) группы гепарина. Как следует из данных литературы (Шрайнер и др., 1983), наличие широкой полосы в области 3600-3200 см"1 указывает на образование комплексных соединений, где возникновение комплексов обусловлено наличием водородных и ионных связей.

В следующей серии опытов (рис.б-А) в условиях in vitro комплекс ВМГ-PG в диапазоне концентраций от 10-8 до 10-4 М обладал антикоагулянтной активностью, практически близкой к антикоагулянтным свойствам эквивалентных концентраций ВМГ и заметно превышающей те же свойства пептида PG (при концентрациях от 10-7 до 10-4 М антикоагулянтная активность комплекса составила 300-600%, a PG -180-350% по сравнению с контролем). По-видимому, антикоагулянтная активность комплекса обусловлена действием гепарина.

Наряду с этим установлено, что комплекс при концентрациях от 10-8 до 10-4 М проявлял фибриндеполимеризационную активность (НФ), превышающую таковую пептида PG (в диапазоне всех исследуемых концентраций НФ пептида составил не более 60% от такового комплекса) (рис.б-Б).

_Концентрации комплекса. М

—♦—Комплекс —PG —а—ВМГ —х— Контроль

Б.Фибриндеполимеризационная ----

активность г

80 - / / **

Ъ во 2 е 40 ** . * *

1 20

F—-%-Г^ —£

-20

Ю"9 10"8 10'7 10"6 Ю-5 104

Концентрации комплекса, М

Комплекс -»- PG -ft- ВМГ

Рис.6. Антикоагулянтная и фибриндеполимеризационная активность комплекса ВМГ-PG и его составных частей в эквивалентных концентрациях in vitro.

В отличие от комплекса и PG, гепарин не оказывал воздействия на нестабилизированный фибрин (зоны лизиса не обнаруживались).

Также обнаружено, что при концентрации комплекса 10-5 М, и эквивалентных концентраций гепарина и пептида, происходило достоверное уменьшение активности фактора ХШа на 40, 30 (в обоих случаях р<0,01) и 25% (р<0,05) соответственно по сравнению с контролем.

Инкубация плазмы, богатой тромбоцитами с различными концентрациями комплекса (10-9 - 10-6 М) приводило к снижению степени агрегации тромбоцитов на 27-19% (р<0,05). При этом антитромбоцитарные свойства комплекса не превышали таковые эквивалентных концентраций пептида, тогда как добавление к нормальной плазме эквивалентных концентраций гепарина не вызывало изменения агрегации тромбоцитов (различия по сравнению с контролем были недостоверны, р>0,5).

Таким образом, в условиях in vitro комплекс ВМГ с пептидом PG обладал антикоагулянтной и неферментативной фибринолитической активностью, сравнимой или превышающей таковые эквивалентных концентраций составляющих компонентов, снижал агрегацию тромбоцитов, блокировал способность фактора ХШа стабилизировать фибрин.

Рис.7. Суммарная фибринолитическая активность (СФА), неферментативный фибринолиз (НФ), активность тканевого активатора плазминогена (ААП), уровень антиплазминов (анти-пл.), антикоагулянтная активность (АЧТВ), уровень фактора ХШа (ФХШа) и агрегация тромбоцитов (АТ) плазмы крови животных через 10 минут после внутривенного введения комплекса БМГ-РО (1:1 по весу) в дозе 1 мг/кг и его составных частей в эквивалентных дозах.

В экспериментах in vivo, после однократного внутривенного введения животным комплекса ВМГ-PG (в дозе 1 мг/кг) и его составных частей в эквивалентных дозах, установлено достоверное повышение антикоагулянтного и фибринолитического потенциала плазмы крови крыс, а именно: СФА, НФ и ААП составили 186, 152 и 279% соответственно по сравнению с контролем, АЧТВ - 201%; произошло снижение агрегации тромбоцитов, уровня антиплазминов и активности фактора ХШа - на 35, 42 и 60% соответственно по сравнению с контрольной группой животных (во всех случаях р<0,01) (рис.7).

При других способах введения (внутрибрюшинном, пероральном, интра-назальном) также наблюдалось усиление антикоагулянтной и фибринолитической активностей плазмы крови животных.

Известно, что ВМГ обладает рядом побочных эффектов, которые отсутствуют у низкомолекулярных форм гепарина. Однако широкое применение НМГ животного происхождения затруднено в связи со сложностью его получения и высокой себестоимостью. В последнее время в литературе сообщалось о наличии гепариноподобных агентов в растениях (в бурых водорослях, таволге вязолистной, корнях пиона Марьин корень) (Кузнецова и др., 2003; Кудряшов и др., 1990; Ляпина и др., 2000).

Учитывая вышеизложенное, в следующей серии экспериментов нами были изучены комплексные соединения НМГ животного и растительного происхождения с глипролинами.

Изучение комплексных соединений глипролинов с НМГ животного и растительного происхождения.

Низкомолекулярный гепариноподобный антикоагулянт растительного происхождения был выделен из экстракта корней пиона Paeonia suffruticosa. Очистка антикоагулянта проводилась с помощью гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-50. Была собрана и лиофильно высушена фракция, имеющая высокую антикоагулянтную активность (in vitro время образования сгустка по тесту АЧТВ превышало контрольные значения в 2 раза и выше); препарат этой фракции показал присутствие в целевом продукте гепарина. Степень очистки препарата - 205 раз.

По данным электрофореза в полгиакриамидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и Р-меркаптоэтанола установлено, что препарат из пиона гомогенен и его молекулярная масса составляет 5-6 кДа (рис.8). Очищенный антикоагулянт окрашивался подобно гепарину 0,033%-ным

раствором Азура А, а его электрофоретическая подвижность соответствовала электрофоретической подвижности НМГ.

Рис.8. Электрофорез в геле полиакриламида коммерческих ВМГ, НМГ и полученного нами растительного антикоагулянта (Раст.АК).

Вторично-эмиссионным масс-спектро-метрическим методом было показано, что в опытном образце из пиона содержание серы (S), азота (N) и углерода (С) превышало их количество в коммерческом препарате НМГ фирмы "Celsus", но достоверных отличий по сравнению с НМГ не было (р>0,2), тогда как по сравнению с ВМГ фирмы "Serva", содержание S и N в растительном антикоагулянте было меньше (достоверность отличий относительно проб ВМГ -р<0,05)(Табл.2).

Таблица 2.

Масс-спектрометрический анализ содержания ионов серы (S), азота (N) и углерода (С) в препаратах растительного антикоагулянта из пиона и коммерческих ВМГ и НМГ (Mim)

Исследуемый препарат Содержание

S (132Л19) N(114/119) С (112/119)

Коммерческий гепарин фирмы "8ет"-ВМГ 0.095±0.007* 0.097±0.006* 0.058±0.002

Коммерческий гепарин фирмы "Сек^-ИМТ 0.064±0.005* 0.068±0.008# 0.048±0.003

Растительный антикоагулянт из пиона 0.07Ш.009* 0.074±0.005# 0.054±0.007

Примечание:* -р<0,05- достоверность отличий относительно соответствующих проб коммерческого НМГ # -р<0,05-достоверность отличий относительно соответствующих проб коммерческого ВМГ

Сопоставление ИК-спектров растительного антикоагулянта (Раст.АК), коммерческих ВМГ и НМГ в области длин волн 4200-400 см"1 выявило сходство между Раст.АК и НМГ животного происхождения (рис.9).

На основании анализа полученных данных можно заключить, что исследованные физико-химические параметры целевого продукта из пиона свидетельствуют о его аналогии с НМГ животного происхождения.

Рис.9. ИК-спектры препаратов ВМГ, НМГ животного происхождения и растительного антикоагулянта

(Растительный АК)

3000 2000 1400 Частота, см"1

Нами были получены комплексы PG с растительным антикоагулянтом (PacT.AK-PG) и с коммерческим НМГ (HMT-PG) (1:1 по весу). При исследовании влияния полученных комплексов на параметры системы гемостаза выявлено наличие антикоагулянтных и фибринолитических свойств и одинаковая направленность этих эффектов у исследованных препаратов.

Как видно из табл.3, в условиях in vitro в диапазоне концентраций от 10-9 до 10-4 М комплекс Раст.АК-PG обладал антикоагулянтной активностью, превышающей таковую эквивалентных концентраций растительного антикоагулянта, а комплекс НМГ-PG - сравнимую с активностью НМГ.

Таблица 3.

Показатели гемостаза при действии комплексов НМГ-PG и Раст-АК-PG (1:1 по весу) и их составных частей в эквивалентных _ концентрациях в условиях in vitro_

Препараты Концентрации, при которых обнаружен эффект, М

Антикоагулянтная активность Неферментативный фибринолиз Активность ФХШа

Pacr.AK-PG от 10'9 до Ю-4 от 10'8 до 10"4 от 10"5 до 10"4

НМГ-PG от 10"8до КГ4 от 10'8 до 10"4 от 10"5 до 10"4

Раст.АК от 10"7 до 10"4 нет эффекта ю-4

НМГ от 10"7 до 10"4 нет эффекта ю-4

PG от Ю-8 до КГ4 от Ю-7 до 10"4 10"4

Составные компоненты комплексов выявляли достоверное отличие от контроля в более узком диапазоне концентраций: растительный антикоагулянт и НМГ - от 10-7 до 10-4 М, Рв - от 10-8 до 10-4 М.

Фибринолитическая активность комплексов и Рв, как и в случае с ВМГ-Рв, главным образом неферментативной природы, носила дозозависимый характер. Комплексы Раст.АК-Рв и НМГ-Рв обладали НФ в концентрациях от 10-8 до 10-4 М. Рв также обладал фибриндеполимеризационной активностью, но в меньшей степени, чем комплексы и в меньшем диапазоне концентраций (от 10-7 до 10-4 М). В отличие от комплексов и Рв, Раст.АК и НМГ не проявляли фибринолитической активности (зоны лизиса на нестабилизированных фибриновых пластинах не обнаруживались).

Наряду с этим было установлено, что все исследуемые препараты достоверно снижали активность фактора ХШа при добавлении к плазме здоровых крыс: комплексы Раст.АК-Рв и НМГ-Рв при концентрациях 10-5 и 10-4 М, а Раст.АК, НМГ и Рв - при концентрации 10-4 М (во всех случаях р<0,05). Таким образом, комплексы пептида Рв с НМГ и с низкомолекулярным растительным антикоагулянтом, как и комплексы пептида с ВМГ, обладали антикоагулянтными, фибринолитическими и антифибринстабилизирующими свойствами, превышающими таковые эквивалентных концентраций входящих в них компонентов.

При однократном внутривенном введении животным комплексов Раст.АК-Рв и НМГ-Рв (в дозе 2 мг/кг) и их составных частей в эквивалентных дозах обнаружено следующее (рис.10): через 10 минут после введения Раст.АК-Рв, НМГ-Рв, растительного антикоагулянта, НМГ и пептида Рв антикоагулянтная активность (по АЧТВ) плазмы крыс составила 324, 200, 152, 168 и 160% соответственно по сравнению с контролем (р<0,01), а фибринолитическая a, % ность плазмы менялась следующим образом: СФА увеличивалась на 92, 52, 36, 28 и 44% соответственно по сравнению с контролем (р<0,01); НФ возрастал на 100, 65, 47, 59 и 52% соответственно (р<0,05); ААП - на 162, 100, 75 и 68% в последних двух случаях соответственно (р<0,01). Это сопровождалось повышением уровня гепарина в кровотоке. Так, уровень гепарина в плазме животных после введения комплексов РасТАК-Рв и НМГ-Рв составил 201% (р<0,01) и 145% (р<0,05) соответственно по сравнению с контролем, после введения НМГ - 151% (р<0,05), а после введения растительного антикоагулянта и Рв - 170% в обоих случаях (р<0,05).

Рис. 10. Антикоагулянтная активность (АЧТВ), уровень гепарина (Ур.геп.), суммарная фибринолитическая активность (СФА), неферментативный фибринолиз (НФ) и активность тканевого активатора плазминогена (ААП) плазмы крови животных через 10 мин после внутривенного введения комплексов РастАК-РО и НМГ-РО (1:1 по весу) в дозе 2 мг/кг и их составных частей в эквивалентных дозах.

Таким образом, анализируя полученные данные при исследовании линейных и циклических глипролинов, их комплексов с ВМГ и НМГ животного и растительного происхождения, нами было показано, что указанные препараты участвуют в регуляции гемостаза, усиливая антикоагулянтный и фибринолитический фон плазмы крови, способствуя выбросу гепарина в кровоток и снижая агрегацию тромбоцитов.

Поскольку глипролины и их комплексные соединения с гепарином проявляют широкий спектр противосвертывающих свойств, вполне вероятно их использование при нарушениях в системе гемостаза. В следующей серии экспериментов мы изучили влияние глипролинов и их комплексов с гепарином на процесс тромбообразования у крыс, а также влияние этих препаратов на гемостаз при ДПСС.

Применение глипролинов и их комплексных соединений с гепарином для коррекции системы гемостаза при ее нарушениях у животных.

Как показали исследования, на фоне 3-кратного интраназального введения комплексов ВМГ-РО, ВМГ-РОР в дозе 1 мг/кг и их составных частей в эквивалентных дозах (500 мкг/кг), через 1 час после экспериментального тромбообразования вес образующихся тромбов в сосуде (яремной вене) на фоне введения ВМГ-РО и ВМГ-РОР составил 16 и 18% (р<0,01) соответственно по сравнению с контрольной группой (рис.11). При этом вес тромбов на фоне

предварительного введения гепарина, а также пептидов PG и PGP составил 71% (р<0,05), 34 и 32% соответственно (р<0,01).

Предварительное хроническое (5 дней) внутрибрюшинное введение комплекса BMT-PG (1 мг/кг) и его составных частей в эквивалентных дозах также выявило способность исследуемых препаратов предотвращать процесс образования тромбов, а именно: вес образующихся тромбов на фоне введения комплекса, гепарина и пептида PG составил 20, 50 и 56% соответственно по сравнению с контролем (р<0,01). Это сопровождалось снижением числа случаев тромбообразования в опытных группах по сравнению с контрольной группой на 83, 65 и 60% соответственно (р<0,01) (рис. 12). Таким образом, антитромботическими свойствами обладали и глипролины, и их комплексы с гепарином при интраназальном и внутрибрюшинном способах введения. При этом комплексы «Гепарин-пептид» проявляли наибольшую способность предотвращать тромбообразование, что доказывает их преимущества по сравнению с отдельными компонентами.

Рис. 11. Вес тромбов через 1 ч после тромбообразования на фоне 3-кратного интраназального введения животным комплексов ВМГ-PG и BMГ-PGP (1:1 по весу) в дозе 1 мг/кг и их составных частей в эквивалентных дозах.

О 005 0 1 015 0 2 0 25 0 3 0 35

Вес тромбов, г

Рис.12. Частота случаев образования тромбов через 1 ч после тромбообразования на фоне внутрибрюшинного хронического (5 дней) введения животным комплекса BMГ-PG (1:1 по весу) в дозе 1 мг/кг и его составных частей в эквивалентных дозах.

вмг-ге гс

BW Контроль

Известно, что при возрастных изменениях в крови крыс достоверно снижаются показатели антикоагулянтной и фибринолитической активности по сравнению с таковыми у животных в отсутствие ДПСС.

В настоящей работе следующую серию экспериментов проводили на животных двух возрастных групп: 3 мес. и 9-11 мес, которых условно назвали «молодые» и «старые» животные, соответственно. При сравнении двух возрастных групп животных был подтвержден факт наличия признаков депрессии ПСС у «старых» крыс: снижение СФА на 27% (р<0,01) по сравнению с группой «молодых» животных, НФ -на 20% (р<0,05), ААП - а 28% (р<0,01) и повышение агрегации тромбоцитов - на 45% (р<0,01). После этого хроническое (7 дней) пероральное введение PGP (1 мг/кг) «старым» животным приводило к активации ПСС по сравнению с контрольной группой («старые» животные, получавшие физ. раствор). Как видно из рис.13, в плазме крови крыс отмечалось повышение СФА на 52% (р<0,05), НФ - на 37% (р<0,01), ААП - на 325% (р<0,01), антикоагулянтной активности (по АЧТВ) - на 60% (р<0,01). При этом снижение активности фактора ХШа и агрегации тромбоцитов составило 24 и 60% соответственно по сравнению с контролем (в обоих случаях р<0,05).

200

I 150

1100

1 50

СФА НФ ААП АЧТВ ФХШа AT

Рис. 13. Суммарная фибринолитическая активность (СФА), неферментативный фибринолиз (НФ), активность тАП (ААП), антикоагулянтная активность (АЧТВ), активность фактора ХШа (ФХШа) и агрегация тромбоцитов (AT) плазмы крови животных после хронического (7 дней) перорального введения PGP в дозе 1 мг/кг. Примечание: "PGP" - животные (возраст 9-11 мес.) получали пептид

"Контроль " - животные (возраст 9-11 мес.) получали 0.85% NaCl "3 мес.животные" - получали 0.85% NaCl ** -р<0,01; * -р<0,05 (относительно группы «Контроль») ## -р<0,01; #-р<0,05 (относительно группы «3мес. животные»)

Итак, пептид PGP при его хроническом пероральном введении восстанавливал функциональное состояние ПСС у «старых» животных с гипокоагуляцией.

Делая заключение, необходимо сказать, что: во-первых, выявлены закономерности регуляторного действия глипролинов и их комплексных соединений с гепарином. Они заключаются в том, что при появлении в кровотоке указанных соединений усиливаются антикоагулянтная, фибринолитическая и антитромбоцитарная активность плазмы крови.

Во-вторых, эти соединения участвуют в регуляции жидкого состояния крови в организме и препятствуют начальным стадиям свертывания крови, а именно: ингибируют агрегацию тромбоцитов, активности тромбина, фактора ХШа и других факторов свертывания, усиливают выделение в кровоток тканевого активатора плазминогена, антикоагулянта гепарина и снижают активность антиплазминов.

Важной особенностью глипролинов и их комплексов с гепарином является наличие у них неферментативной фибринолитической активности, следовательно эти соединения способны препятствовать процессу превращения фибриногена в фибрин на стадии полимеризации фибрина, что, возможно, служит одним из механизмов их антикоагулянтных, антифибринстабилизирующих и антитромботических эффектов.

В-третьих, они предупреждают процесс тромбообразования и растворяют свежие венозные фибриновые сгустки. Это делает возможным применять их в перспективе как антитромботические вещества.

ВЫВОДЫ

1. Глипролины (PG, PGP, c-PG) в условиях in vitro в диапазоне концентраций

М достоверно удлиняли время свертывания крови, растворяли нестабилизированный фибрин, ингибировали активность фактора ХШа и агрегацию тромбоцитов.

2. Показано, что глипролины усиливали антикоагулянтную (на 20-40%), фибринолитическую (на 40-80%) и антифибринстабилизирующую (на 3040%) активности плазмы крови животных при разных способах введения (внутривенном, интраназальном, внутрибрюшинном, пероральном). При внутривенном введении пептидов установлена дозозависимость противосвертывающих эффектов (0,2-1,5 мг/кг) с максимальным проявлением через 10 минут после инъекции.

3. Разработан способ получения комплексов глипролинов с высоко- и низкомолекулярными формами гепарина. Спектральным и электрофоретическим анализом доказано участие сульфо- и карбоксильных групп гепарина в комплексообразовании с глипролинами. Полученные комплексы обладали в условиях in vitro фибриндеполимеризационной и антикоагулянтной активностями, превышающими в 1,5-2 раза те же активности глипролинов.

4. Комплекс PG с высокомолекулярным гепарином при разных способах введения (внутривенном, внутрибрюшинном, интраназальном) подавлял агрегацию тромбоцитов (в 1,2-1,4 раза), усиливал антикоагулянтную (в 2 раза), фибринолитическую (в 2 раза) и антифибринстабилизирующую (в 1,41,6 раза) активности плазмы крови животных. При пероральном применении комплекса достоверно увеличивались только антикоагулянтные (в 1,6 раза) и фибринолитические (в 1,8 раза) свойства плазмы.

5. На модели экспериментального тромбообразования у животных установлен высокий антитромботический эффект PG, PGP, комплексных соединений PG-гепарин, PGP-гепарин. Антитромботические свойства комплексов гепарина превышали таковые глипролинов в 2-2,8 раза.

6. PGP (пероральное ведение, 1 мг/кг, 7 дней) восстанавливал нарушенную при возрастных изменениях организма функцию противосвертывающей системы.

7. Из всех исследованных комплексов глипролинов с разными формами гепарина наибольший противосвертывающий эффект проявлял комплекс PG с низкомолекулярным гепарином растительного происхождения. Этот факт и возможность получения гепарина (патент № 2068702) из дешевого растительного сырья делает перспективным его использование в качестве эффективного антитромботического препарата.

8. Глипролины и их комплексы с разными формами природного гепарина служат физиологическими модуляторами противосвертывающей системы, участвуют в регуляции жидкого состояния крови и препятствуют развитию гиперкоагуляционных состояний в организме.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ляпина Л.А., Новиков В.Е., Пасторова В.Е., Успенская М.С., Смолина

(Оберган) Т.Ю., Ляпин Г.Ю. Антикоагулянт из экстрактов корней пионов:

получение и свойства. Известия РАН, серия биологическая 1995; № 1: 142-144.

2. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Смолина (Оберган) Т.Ю., Успенская М.С. Гепариноподобный антикоагулянт из экологически чистого растительного сырья. // Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва 1995, тезисы докл. с. 213.

3. Новиков B.C., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Успенская М.С., Смолина (Оберган) Т.Ю. Атикоагупянт.Приоритетная справка на изобретение (патент) № 2068702 с приоритет, от 23.03.1995. Зарегистрир. в Гос. реестре открытий 24.08.1995.

4. Uspenskaya M.S., Pastorova V.E., Lyapin G.Yu., Smolina (Obergan) T.Yu., Novikov V.S., Lyapina LA Antithrombotic agent of extracts from peony roots. J.of the Intern.Society on Thromb. andHaemost 1995; 73 (6): 1324.

5. Smolina (Obergan) T.Yu., Pastorova V.E., Uspenskaya M.S., Lyapin G.Yu. Antithrombotic agent from peony roots extracts. XIII-th meeting of Intern. Society of Haematology, Istanbul, September 3-8,1995, p.457.

6. Tarasov Yu., Uljanov A., Luapina L., Pastorova V., Oulianova L., Pogodina L., Smolina (Obergan) T. The fibrinolytic and antidiabetic preparation from peony roots. XIIIIntern.Congress on fibrinolysis and thrombolysis, Barselona, June 24-28, 1996, p. 60.

7. Ляпина Л.А., Аммосова Я.М., Новиков B.C., Осипова Н.Н., Смолина (Оберган) Т.Ю., Пасторова В.Е., Успенская М.С., Ляпин Т.Ю. К вопросу о природе антикоагулянта, полученного из пионов средней полосы России. Известия РАН, 1997, № 2:235-237.

8. Ляпина Л.А., Новиков B.C., Пасторова В.Е., Успенская М.С., Амосова Я.М., Осипова Н.Н., Ляпин Г.Ю., Смолина (Оберган) Т.Ю. Природа антикоагулянта из корней пионов. Четверта мiжнародна конференщя з медичноi ботанш, Кшв, 1997, Ятрохiмiя, с.408-409.

9. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Кондашевская М.В., Ульянов A.M., Тарасов ЮА, Смолина (Оберган) Т.Ю. Антитромботические эффекты препаратов из высших растений. III Всероссийская конф. «Тромбозы и геморрагии. ДВС-синдром. Проблемы лечения», Москва, 1997, с. 100-101.

10. Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Смолина (Оберган) Т.Ю., Ашмарин И.П. Антикоагулянтные и фибринолитические эффекты некоторых пролинсодержащих олигопептидов. Известия РАН, серия биологическая, 1998; 3:390-394.

11. Смолина (Оберган) Т.Ю., Пасторова В.Е., Ляпина Л.А. Комплексообразование дипептида пролил-глицина с гепарином; исследование

гемостатических свойств комплекса in vitro и при внутривенном введении. Тромбоз, гемостаз иреология, 2002; 2:38-41.

12. Lyapin G.Yu., Smolina (Obergan) T.Yu., Uspenskaya M.S. The effect of the heparin-like plant component on the fibrinolytic activity of blood plasma. Int. Congress on Athero-thrombosis andHemostasis, Assisi, Italy, April 18-20, 2002, p. 74.

13. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Смолина (Оберган) Т.Ю. Роль соединений гепарина с коллагеном и некоторыми его гепаринсвязывающими фрагментами в активации функции противосвертывающей системы. Тромбоз, гемостаз и реология, 2003; 2 (14): 57-61.

14. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Ульянов А.М., Тарасов Ю.А., Голубева М.Г., Григорьева М.Е., Смолина (Оберган) Т.Ю., Черкасова К.А. Функциональное состояние противосвертывающей и инсулярной систем при действии эндогенных модуляторов - гепаринсодержащих и пептидных регуляторов гемостаза. Вестн. Моск.ун-та, сер. Биология, 2003; 2: 15-19.

15. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Смолина (Оберган) Т.Ю., Хоменко И.П. Противосвертывающие и антитромботические свойства комплекса гепарина с дипептидом пролил-глицин. Вести. Моск.ун-та, сер. Биология, 2003; 1: 3-6.

16. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Смолина (Оберган) Т.Ю. Роль соединений гепарина с коллагеном и некоторыми его гепаринсвязывающими фрагментами в активации функции противосвертывающей системы. Тезисы международной конф., поев. 10-летию со дня основания Всерос. ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудистой стенки им. Шмидта-Кудряшова, Москва, 2003,22-24 апреля, с.61-62.

17. Lyapin G.Yu., Smolina (Obergan) T.Yu., Lyapina I.N. Potentiation of the antithrombotic action of heparin-like component from plant. 8-th Annual Congress of Europ.HematologyAssociation, France, June 12-15,2003, v.4 (suppl. 2), p. 235.

18. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Оберган Т.Ю. Соединения природных пептидов с гепарином предотвращают тромбообразование в кровотоке. Международный конгресс Тромбоз, гемостаз, патология сосудов, Санкт-Петербург, 3-5 июня, 2004, с.95.

19. Оберган (Смолина) Т.Ю. Сравнительные исследования антикоагулянтно-фибринолитических свойств комплексов дипептида Pro-Gly с низкомолекулярными гепаринами (НМГ) животного и растительного происхождения. Тромбоз, гемостаз иреология, 2004; 2: 45-50.

««2484 7

Издательство 0 0 0 "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 20.09.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 996. Тел. 939-3890, 939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Оберган, Тамара Юрьевна

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Современные представления о системе гемостаза.

1.1. Характеристика первичного (сосудисто-тромбоцитарного) гемостаза.

1.2. Характеристика плазменного гемостаза.

1.3. Физиологическая противосвертывающая система (ПСС) крови

1.3.1. Фибринолитическое звено ПСС: ферментативный фибринолиз в крови и тканях.

1.3.2. Неферментативный фибринолиз как основное гуморальное звено ПСС.

1.3.3. Антикоагулянтное звено ПСС.

1.4. Роль сосудистого эндотелия в гемостатических реакциях.

Глава 2. Коллаген и его фрагменты.

2.1. Структура и типы коллагена.

2.2. Участие коллагена в процессах гемостаза.

2.3. Вещества, способствующие гидролизу коллагена и продукты гидролиза.

2.4. Связь коллагена с гликозаминогликанами и протеогликанами экстрацеллюлярного матрикса.

Глава 3. Влияние глипролинов и их комплексов с гепарином на гемостаз.

3.1. Противосвертывающие эффекты и стабильность глипролинов

3.2. Комплексные соединения глипролинов с гепарином.

Глава 4. Применение коллагена, глипролинов и гепаринов для коррекции при нарушении гемостаза.

4.1. Применение препаратов коллагена и пролинсодержащих пептидов.

4.2. Коммерческие гепарины животного происхождения.

4.3. Противосвертывающие средства растительного происхождения

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 6. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

6.1. Исследование противосвертывающих эффектов линейных и циклических глипролинов.

6.1.1. Антикоагулянтные, фибринолитические, антифибринстабилизирующие и антитромбоцитарные эффекты глипролинов в условиях in vitro.

6.1.2. Влияние глипролинов на показатели системы гемостаза при внутривенном введении животным.

6.1.3. Дозозависимость и динамика действия глипролинов.

6.1.4. Влияние глипролинов на состояние системы гемостаза при внутрибрюшинном введении животным.

6.1.5. Состояние системы гемостаза при хроническом и многократном введении глипролинов животным.

6.2. Изучение комплексов глипролинов с ВМГ.

6.2.1. Получение комплексов глипролинов с гепарином и доказательство комплексообразования.

6.2.2. Противосвертывающие эффекты комплекса ВМГ-PG в условиях in vitro.

6.2.3. Состояние системы гемостаза при внутривенном, пероральном, внутрибрюшинном и интраназальном введении комплекса ВМГ-PG.

6.3. Изучение комплексов глипролинов с НМГ.

6.3.1. Комплекс НМГ-PG.

6.3.2. Комплекс НМГ-PG в условиях in vitro и in vivo.

6.4. Изучение комплексов глипролинов с растительным антикоагулянтом.

6.4.1. Получение, очистка и изучение противосвертывающих свойств растительного антикоагулянта.

6.4.2. Комплексы глипролинов с гепариноподобным растительным антикоагулянтом в условиях in vitro и in vivo.

6.5. Коррекция нарушений системы гемостаза применением глипролинов и их комплексных соединений с гепарином.

6.5.1. Влияние глипролинов на гемостаз при возрастных изменениях организма.

6.5.2. Исследование антитромботических эффектов глипролинов и их комплексов с ВМГ на модели тромбообразования.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глипролины и их комплексные соединения с гепарином как физиологические модуляторы функции противосвертывающей системы организма"

Актуальной проблемой современной физиологии является исследование механизмов регуляции нормального функционирования системы гемостаза.

Физиологическая регуляция жидкого состояния крови и ее свертывания, согласно теоретическим представлениям Б.А.Кудряшова, обеспечивается рефлекторно-гуморальным взаимодействием свертывающей и противосвертывающей (ПСС) систем. В этих реакциях естественными гуморальными агентами ПСС служат гепарин и активаторы плазминогена.

В настоящее время особое внимание уделяется изучению механизма действия на гемостаз природных глипролинов и веществ, созданных на их основе. Одним из вероятных предшественников природных глипролинов является основной структурный белок - коллаген, который при физиологических условиях подвергается протеолизу под влиянием ферментов, таких как трипсин, химотрипсин, пепсин, эластаза, металлопртеиназы. Это может привести к образованию полипептидов и простейших пептидов, содержащих пролин, глицин и оксипролин (Hashimoto et al., 1995; Bon et al., 1997; Lazareva et al., 1997; Rothman et al., 1997).

Известно, что естественный антикоагулянт - гепарин - способен в силу своих структурных особенностей взаимодействовать с различными пептидами и белками (Ляпина и др., 2000; Hirsh et al., 2001; Kudrjashov et al., 1986) с образованием комплексов, обладающих фибринолитическим и антикоагулянтным действием (Ашмарин И.П. и др., 1996). С другой стороны, глипролины входят в гепаринсвязывающую область коллагена и вполне вероятно, что они способны взаимодействовать с гепарином с образованием комплексных соединений.

В настоящее время в медицине в качестве антикоагулянтов используются коммерческие формы гепарина животного происхождения, который имеет тенденцию к ограничению в связи с возможностью развития различных побочных эффектов при его применении (геморрагии, тромбоцитопения, остеопороз и др.) (Бокарев, 2003; Makarov et al., 2004; Pettila et al., 2002). Поэтому весьма актуален поиск агентов, обладающих регуляторными функциями, способными нормализовать свертывание крови при ее нарушениях. В то же время известно, что многие биологически активные вещества из высших растений активно участвуют в процессах гемокоагуляции и фибринолиза. Имеются сообщения о наличии в некоторых растениях гепариноподобных полисахаридов, обладающих антикоагулянтным действием и нашедших применение в клинической практике (Ляпина и др. 2001; Щербак и др. 2001; Кузнецова и др., 2003). Таким образом, растения могут быть перспективным источником для создания эффективных средств для коррекции нарушений гемостаза.

Принимая во внимание, что известные комплексные соединения как высоко- так и низкомолекулярного гепарина с олигопептидами (с тафцином, тимозином) (Ляпина и др., 1990; Ашмарин и др., 1991) ингибируют как первичный, так и плазменный гемостаз, и учитывая то обстоятельство, что в литературе нет систематизированных данных о взаимодействии гепарина с пролинсодержащими пептидными фрагментами коллагена, мы поставили цель - изучить основные закономерности регуляторного действия глипролинов и их комплексных соединений с гепарином на функциональное состояние свертывающей и противосвертывающей систем.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние на антикоагулянтную и фибринолитическую активность крови глипролинов (PG, PGP, c-PG) в разных дозах и при разных способах введения животным (внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, интраназально).

2. Доказать взаимодействие глипролинов с разными видами гепаринов, получить их комплексные соединения и установить антикоагулянтные, фибринолитические, антифибринстабилизирующие, антитромбоцитарные эффекты этих препаратов в условиях in vitro и in vivo.

3. Исследовать коррегирующую роль различных пептидных соединений при нарушениях свертывания крови на моделях животных с депрессией функции противосвертывающей системы (возрастные изменения организма) и тромбообразования.

Научная новизна исследования. Впервые изучен ряд линейных и циклических глипролинов и их комплексов с разными формами гепаринов (ВМГ, НМГ животного и растительного происхождения), среди которых выявлены соединения, обладающие in vitro сочетанными антикоагулянтными, фибриндеполимеризационными, антифибрин-стабилизирующими и антитромбоцитарными свойствами. Обнаружено наличие у данных соединений собственной неферментативной фибринолитической активности.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Предложен способ получения препарата из корней пиона Раеоша • зийтийсоБа с антикоагулянтным действием (патент № 2068702 от 22.03.95).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (28 июня 2004 г.). Отдельные фрагменты работы доложены на II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995); на XIII meeting of Inernational Society of Haematology (Istanbul, 1995); на XIII International Congress on fibrinolysis and thrombolysis (Barselona, 1996); на III Всероссийской конференции «Тромбозы и геморрагии» (Москва, 1997); на International Congress on Atherothrombosis and Hemostasis (Italy, 2002); на Международной конференции, посвященной 10-летию со дня основания Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудистой стенки им. Шмидта-Кудряшова (Москва, 2003); на 8-th Annual Congress of European Hematology Association (France, 2003).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 173 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы (115 отечественных и 153 иностранных источников), иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Оберган, Тамара Юрьевна

выводы

1. Глипролины (PG, PGP, c-PG) в условиях in vitro в диапазоне

5 3 концентраций 10" - 10" М достоверно удлиняли время свертывания крови, растворяли нестабилизированный фибрин, ингибировали активность фактора XIHa и агрегацию тромбоцитов.

2. Показано, что глипролины усиливали антикоагулянтную (на 20-40%), фибринолитическую (на 40-80%) и антифибринстабилизирующую (на 3040%) активности плазмы крови животных при разных способах введения (внутривенном, внутрибрюшинном, пероральном, интраназальном). При внутривенном введении пептидов установлена дозозависимость противосвертывающих эффектов (в интервале доз 0,2-1,5 мг/кг) с максимальным проявлением через 10 минут после инъекции.

3. Разработан способ получения комплексов глипролинов с высоко- и Ф низкомолекулярными формами гепарина. Спектральным и электрофоретическим анализом доказано участие сульфо- и карбоксильных групп гепарина в комплексообразовании с глипролинами. Полученные комплексы обладали в условиях in vitro фибриндеполимеризационной и антикоагулянтной активностями, превышающими в 1,5-2 раза те же активности глипролинов.

6. PGP (пероральное введение, 1 мг/кг, 7 дней) восстанавливал нарушенную при возрастных изменениях организма функцию противосвертывающей системы.

8. Глипролины и их комплексы с разными формами природного гепарина служат физиологическими модуляторами противосвертывающей системы, участвуя в регуляции жидкого состояния крови и препятствуют развитию гиперкоагуляционных состояний в организме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из представленного анализа литературы и собственных экспериментальных данных следует, что простейшие природные регуляторные пептиды - глипролины PG, PGP, cPG и соединения глипролинов с гепарином в условиях in vitro обладали противосвертывающим действием: ингибировали первичный гемостаз, проявляли антикоагулянтную активность, фибриндеполимеризационное и антифибринстабилизирующее действие.

Наличие указанных свойств пептидов способствовало усилению антикоагулянтно-фибринолитической активности и антитромбоцитарных свойств плазмы крови в острых и хронических экспериментах при разных способах введения (внутривенном, внутрибрюшинном, интраназальном, пероральном) линейных и циклических глипролинов животным. Установлена дозозависимость эффектов глипролинов: при увеличении дозы вводимых веществ от 0,2 до 1,5 мг/кг массы тела происходило повышение их противосвертывающих эффектов.

Обнаружено повышение активности тканевого активатора плазминогена и снижением уровня антиплазминов.

Внутривенное введение пептида PG показало, что максимальные антикоагулянтно-фибринолитические и антитромбоцитарные эффекты проявлялись через 10 минут после введения препарата, незначительно уменьшаясь к 30 минуте эксперимента.

Доказано, что при появлении глипролинов в кровотоке увеличивался уровень гепарина в 1,55 раза по сравнению с исходным значением.

Факт появления в крови гуморальных агентов ПСС - тканевого активатора плазминогена и гепарина свидетельствовал об опосредованном действии глипролинов. С одной стороны, возможно, это обусловлено их модулирующим действием на функцию ПСС. С другой стороны, поскольку гепарин способен связываться с различными белками крови, вполне вероятно его взаимодействие с глипролинами, что и было показано в настоящей работе.

Физико-химическими методами доказано существование комплексообразования между глипролинами и гепарином. По разработанному нами методу впервые получены комплексные соединения глипролинов с высоко- и низкомолекулярными гепаринами животного происхождения, а также с низкомолекулярным гепариноподобным антикоагулянтом растительного происхождения. Растительный антикоагулянт был впервые выделен из корней пиона Р. зи^гиНсояа, очищен и охарактеризован по физико-химическим параметрам. Установлена идентичность НМГ животного происхождения и растительного антикоагулянта по данным спектральных, электрофоретических и хроматографических методов. Полученный растительный препарат, молекулярная масса которого составляла 5-6 к Да, обладал высокой антикоагулянтной активностью.

Комплексные соединения гепаринов растительного и животного происхождения с различными природными и синтетическими пептидами при введении в организм обнаруживали противосвертывающие свойства, превышающие таковые входящих в них компонентов. При внутривенном введении вышеуказанных комплексов выявлено повышение уровня гепарина в крови.

Обращает на себя внимание факт, что для усиления противосвертывающих эффектов глипролинов в кровотоке, необходимо присутствие гепарина. Эти данные свидетельствовали, что одним из возможных механизмов действия глипролинов в организме является их комплексообразование с гепарином.

Таким образом, установлено, что глипролины и их комплексные соединения с гепаринами участвуют в физиологических реакциях регуляции жидкого состояния крови в организме, действуя как прямо, так и опосредованно. Эти соединения препятствовали начальным стадиям процесса свертывания крови: ингибировали агрегацию тромбоцитов, повышали антикоагулянтные свойства плазмы, снижая активность тромбина и фактора ХШа, усиливали выделение в кровоток тканевого активатора плазминогена и уменьшали уровень антиплазминов, за счет чего в крови повышался ферментативный фибринолиз, и увеличивали неферментативный фибринолиз.

Препараты комплексов обладали сочетанными антикоагулянтными, фибриндеполимеризациоными, антифибринстабилизирующими и антиагрегационными свойствами. Наличие вышеуказанных свойств свидетельствовало о возможности антитромботического эффекта препаратов, что и было впервые установлено в данной работе на экспериментальной модели тромботического состояния по методу АУеБзЬг (введение тромбина в изолированный зажимами участок вены + стаз). Предварительное перед образованием тромбов хроническое и многократное введение глипролинов и их комплексов с ВМГ приводило к снижению числа случаев тромбообразования.

В настоящей работе также установлено коррегирующее действие глипролинов при экспериментальной депрессии функции ПСС, наблюдающейся при возрастных изменениях организма. Глипролины восстанавливали нарушенную функцию ПСС и препятствовали развитию процессов фибрино- и тромбообразования.

Итак, анализ всех полученных данных позволяет сделать заключение о перспективности применения глипролинов и их комплексных соединений с гепарином для предотвращения предтромбозов и тромбозов, что служит основанием необходимости предклинических исследований этих соединений в качестве новых антитромботических препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Оберган, Тамара Юрьевна, Москва

1. Аасрум М., Придз X. Избирательное выключение генов // Биохимия. 2002. Т.67, вып. 1.С. 30-39.

2. Абрамова М.А., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П. Пролин и простейшие пролин-содержащие фрагменты нейропептидов модулируют состояние слизистой оболочки желудка через центральный и периферический механизмы // Нейрохимия. 1996. Т. 13. С. 209-214.

3. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир. 1994. Т. 2. С. 487-512.

4. Андрианова И.В., Ионова В.Г., Демина Е.Г., Поворинская Т.Э., Орехов А.Н. Антиагрегационный и фибринолитический эффекты препаратов пролонгированного действия на основе лука, свеклы и чеснока // Тромбоз, гемостаз и реология. 2002. № 4. С. 57-60.

5. Астахова A.B. Побочные эффекты компонентов Б АД. Предостережения в отношении их использования в пред- и послеоперационный периодах // Безопасность лекарств. 2002. № 1. С. 16-23.

6. Ашмарин И.П. Прогнозируемые и неожиданные эффекты олигопептидов (глипролинов, аналогов АКТГ4.10, тафтцина и тиролиберина) // Рос. физиол. журн. им. М.И.Сеченова. 2001. Т. 87, № 11. С. 1471-1476.

7. Ашмарин И.П., Каменский A.A., Ляпина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов // Вопр. биол., мед. и фармацевт, химии. 2002. № 1. С. 24-27.

8. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Нейропептиды // В кн. Биохимия мозга / Под ред. Ашмарина И.П., Струкалова П.В., Ещенко Н.Д. С.-П.: Изд-во С-Петерб. ун-та. 1999. С. 232-266.

9. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. Регуляторная активность простейших пролинсодержащих пептидов PG, GP, PGP и GPGG и возможные источники их биосинтеза // Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 2. С. 149-155.

10. Ашмарин И.П., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е. Модуляция гемостатических реакций in vitro и in vivo представителями семейства регуляторных пептидов // Вестник РАМН. 1996. № 6. С. 50-58.

11. Ашмарин И.П., Пасторова В.Е., Ляпина Л. А. Влияние простейших пролинсодержащих пептидов на функциональную активность противосвертывающей системы и первичного гемостаза // Бюлл.экспер.биол. и медицины. 1998. Т. 125, № 5. С. 496-499.

12. Ашмарин И.П., Пасторова В.Е., Ляпина Л.А. Влияние тафцина на полимеризацию фибрина in vitro и систему гемостаза при внутривенном введении здоровым животным // Известия АН СССР. 1991. № 1.С.302-305.

13. Н.Базазьян Г.Г., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Зверева Е.Г. Влияние элеутерококка на функциональное состояние противосвертывающей системы старых животных //Физиол.журнал. 1987. Т. 73, № 10. С.1390-1395.

14. Бакаева З.В. Фрагменты глипролинов и специфика их действия на гомеостаз слизистой оболочки желудка. Автореф . . . канд.биол.наук. М. 2004. 28 с.

15. Баркаган З.С. Очерки антитромботической фармакопрофилактики и терапии. М.: Ньюдиамед. 2000. С. 40.

16. Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед. 1999. 217 с.

17. Бегуин С. Перекрестное взаимодействие между тромбоцитами и плазматическими факторами свертывания // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. 2003. № 1. С. 34-36.

18. Берковский А.Л., Васильев С.А., Жердева Л.В., Козлов A.A., Мазуров A.B., Сергеева Е.В. Пособие по изучению адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов. М.: Изд. дом «Русский врач». 2001. С. 22-28.

19. Богачева Н.В., Гарсия Дж.Г.Н., Верин А.Д. Молекулярные механизмы индуцирования тромбином проницаемости эндотелия (обзор) // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 1.С. 88-98.

20. Бокарев И.Н. Достижения и эволюция гепаринотерапии // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. 2003. № 3. С. 4-14.

21. Бокерия JI.A., Межнева В.В., Муратов P.M., Костава В.Т., Серова P.A. Новый желатино-резорциновый биологический клей «Биоклей-Лаб» для профилактики кровотечений при оперативных вмешательствах // Тромбоз, гемостаз и реология.2002. №4(12). С. 39-40.

22. Бродин C.B., Янович В.Х. Метаболизм 2-14С. глицина в тканях мозга крыс in vitro // Укр. Биохим. Журн. 1996. Т. 68, № 2. С. 34-37.

23. Бутенас С., Манн К. Свертывание крови (обзор) // Биохимия. 2002. Т.67, вып. 1. С. 5-15.

24. Васьковский Б.В., Золотарев Ю.А., Жуйкова С.Е., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Бакаева З.В. Изучение распределения 3Н. PGP в организме крыс // Вопр. биол., мед. и фарм. химии.2003. №3. С. 41-45.

25. Волынский Б.Г., Бендер К.И., Фрейдман С.Л., Богословская С.И. Растения в медицине. Саратов: Изд-во Саратов. Ун-та. 1983. 358 с.

26. Герберт И.Я. Природа и свойства антикоагулянта прямого действия из травы медуницы мягчайшей. Автореф. . канд. биол. наук. Ленинград. 1990. 28 с.

27. Голышенков С.П. Физиология крови. Система гемостаза в покое и при мышечной деятельности: Учебное пособие. Саранск: Тип. «Красный Октябрь».2004. 176 с.

28. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия мозга. М.: Медицина. 2001. 250 с.

29. Добровольский А.Б., Титаева Е.В. Система фибринолиза: регуляция активности и физиологические функции её основных компонентов (обзор)// Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 1. С. 116-126.

30. Долгов В.В., Авдеева H.A., Щетникович К.А. Методы исследования гемостаза. Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики. М. 1990. С. 9-10.

31. Жуйкова С.Е., Хропычева Р.П., Золотарев В.А., Поленов С.А., Самонина Г.Е. Новые пептидные регуляторы желудочной секреции крыс (амилин, PGP, семакс) // Эксперим. и клинич. гастроэнтерол. 2003. № 2. С. 86-90.

32. Золотарев Ю.А., Жуйкова С.Е., Ашмарин И.П., Самонина Г.Е. Метаболизм пептида PGP при разных способах введения // БЭБиМ. 2003. Т. 135, № 4. С. 422423.38.3убаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. Казань: Фэн. 2000. 364 с.

33. Козлов A.A., Берковский А.Л., Качалова Н.Д., Простакова Т.М. Пособие для врачей-лаборантов по методам исследования гемостаза. М.: Изд.дом «Русский врач». 2003. 93 с.

34. Колхир В.К., Сакович Г.С., Зюзин В.А. Растительные антикоагулянты // II Российский национальный конгр. «Человек и лекарство». Тезисы докладов. Москва. 1995. С.67-68.

35. Кондашевская М.В., Ляпина Л.А. Новые свойства комплекса гепарин-серотонин // Бюлл.экспер.биол. и медицины. 1998. Т. 126, № 10. С. 425-427.

36. Кудряшов Б.А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания. М.: Медицина. 1975. С. 198-208, 313-314.

37. Кудряшов Б.А., Аммосова Я.М., Ляпина Л.А., Осипова H.H., Азиева Л.Д., Ляпин Г.Ю., Басанова A.B. Гепарин из таволги вязолистной, его свойства // Известия РАН. Сер. биол. 1991. № 6. С. 939-943.

38. Кудряшов Б.А., Калишевская Т.М., Ляпина Л.А. Комплекс фибриногена с гепарином как естественный агент физиологической противосвертывающей системы // Вопросы мед.химии. 1968. Т. 14, вып.З. С. 277-282.

39. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А. Неферментативный фибринолиз // Биохимия животных и человека. 1982. № 6. С. 64-73.

40. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Азиева Л.Д. Содержание гепариноподобного антикоагулянта в цветках таволги вязолистной // Фармакология и токсикология. 1990. Т. 53, №4. С. 39-41.

41. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Кондашевская М.В., Ковальчук Г.А. Антикоагулянт из таволги вязолистной: его антитромботический и тромболитический эффекты // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16, Биология. 1994. № 3. С. 15-17.

42. Кудряшов Б.А., Подольская О.В., Ляпина Л.А. Образование комплекса норадреналин-гепарин и адреналин-гепарин в крови молодых людей при эмоциональном и интеллектуальном напряжении // Вопросы мед. химии. 1972. Т. 18, вып.4. С. 385-390.

43. Кузнецова Т.А., Беседнова H.H., Баркаган З.С., Момот А.П., Мамаев А.Н., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Антикоагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли Охотского моря fucus evanescens // Тромбоз, гемостаз и реология. 2003. № 4(16). С. 36-42.

44. Лайнен Г.Р. Матриксные металлопротеиназы и фибринолитическая активность клеток (обзор)// Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 1. С. 107-115.

45. Левен П.И., Дементьева И.А. Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока // Тез. докл. Всес. конф. Томск. 1989. С. 93.

46. Левина М.Н. Сравнительное исследование гепариноподобного действия сульфатированных полисахаридов из бурых морских водорослей. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Купавна. 1987. 28 с.

47. Левицкая Н.Г., Клейменов А.Н., Петросян М.Т., Розенфельд М.А., Калихевич

48. B.Н., Ардемасова З.А. Влияние низкомолекулярных пептидов на процесс перехода фибриногена в фибрин // Бюлл.экспер.биол. и медицины. 1987. № 8.1. C.190-192.

49. Левицкая Н.Г., Себенцова Е.А., Глазова Н.Ю., Воскресенская О.Г., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Каменский A.A., Мясоедов Н.Ф. Исследование нейротропной активности продуктов ферментативной деградации Семакса // Докл.биол.наук. 2000. Т. 372. С. 243-246.

50. Литвинов Р.И., Слабнов Ю.Д., Зубаиров Д.М. О механизме неферментативного фибринолиза // Вопр. мед. химии. 1981. № 4. С. 56-58.

51. Луговской Э.В. Молекулярные механизмы образования фибрина и фибринолиза. Киев: Наукова думка. 2003. 225 с.

52. Луговской Э.В., Ляпина JI.A., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г. ЫН2-концевые аминокислоты белка, полученного при растворении нестабилизированного полимерного фибрина комплексом адреналин-гепарин // Биохимия. 1979. Т.44, вып. 12. С. 1918-1922.

53. Ляпина JI.A. Противосвертывающие и гемостатические компоненты растений (обзор) // Новости науки и техники. Гематология. 1997. № 3. С. 2-6.

54. Ляпина Л.А. Физиологические растворители нестабилизированного фибрина как гуморальные агенты противосвертывающей системы. Автореф. на соиск.уч.ст. доктора биол.наук. М. 1982. 460 с.

55. Ляпина Л.А., Аммосова Я.М., Новиков B.C., Осипова H.H., Смолина Т.Ю., Пасторова В.Е., Успенская М.С., Ляпин Г.Ю. К вопросу о природе антикоагулянта, полученного из пионов средней полосы России // Известия РАН. 1997. №. 2. С.235-237.

56. Ляпина Л.А., Кондашевская М.В., Зиадетдинова Г.А., Успенская М.С. Сравнительные исследования антикоагулянтов из различных экстрактов Paeonia Anómala II Известия АН. Сер. Биологическая. 2000. № 3. С. 345-349.

57. Ляпина Л.А., Новиков В.Е., Пасторова В.Е., Успенская М.С., Смолина Т.Ю., Ляпин Г.Ю. Антикоагулянт из экстрактов корней пионов: получение и свойства // Известия РАН. Сер. биологическая. 1995. № 1. С. 142-144.

58. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Каменский A.A., Мясоедов Н.Ф., Ашмарин И.П. Комплекс гепарин-«Семакс», его влияние на антикоагулянтные и фибринолитические свойства плазмы крови животных // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. 2000. № 3. С. 33-36.

59. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Кудряшов Б.А., Зажирей В.Д., Соколова Е.А., Лившиц В.А., Ашмарин И.П. Действие пептидов тимоптина на систему гемостаза // Известия АН СССР. 1990. № 3. С. 377-381.

60. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Новиков B.C., Успенская М.С., Зиадетдинова Г.А., Ульянов A.M., Тарасов Ю.А. Антикоагулянтно-фибринолитические и гипогликемические эффекты препаратов из высших растений // Вестн. МГУ. Сер. 16. Биология. 2001. № 2. С. 3-7.

61. Ляпина JI.A., Пасторова В.Е., Смолина Т.Ю. Роль соединений гепарина с коллагеном и некоторыми его гепарин-связывающими фрагментами в активации функции противосвертывающей системы // Тромбоз, гемостаз и реология. 2003. №2 (14). С. 57-61.

62. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Смолина Т.Ю., Хоменко И.П. Противосвертывающие и антитромботические свойства комплекса гепарина с дипептидом пролил-глицин // Вестн.Моск.ун-та. Сер. Биология. 2003. № 1. С. 3-6.

63. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Ульянов A.M., Тарасов Ю.А., Ашмарин И.П. Влияние желатина и пептида Prp-Gly-Pro на состояние противосвертывающей системы и на развитие экспериментального диабета // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 2002. № 1. С. 7-10.

64. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Успенская М.С., Новиков B.C. Антикоагулянтно-фибринолитический компонент в экстрактах корней пионов // Вестн. Моск. унта. Сер. Биология 16. 1995. № 2. С. 28-31.

65. Орлов A.B., Хомутов А.Е., Мухина И.В., Зимин Ю.В. Влияние Семакса и его смеси с гепарином на работу изолированного сердца крысы после тотальной ишемии // Бюлл. экспер. биол. и медицины. 1999. Т. 28, № 11. С. 494-496.

66. Орлов Д.С., Осипова H.H. Инфракрасные спектры почв и почвенных компонентов. Метод, пособие. М.: Изд-во МГУ. 1988. 50 с.

67. Офозу Ф.А. Тромбоциты как модель регуляции свертывания крови на клеточных мембранах и её значение (обзор)// Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 1. С. 56-65.

68. Панченко Е.П., Добровольский A.B. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможность терапии. М.: «Спорт и культура». 1999. 464 с.

69. Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Ткачук В.А. Система активаторов плазминогена в ремоделировании сосудов и ангиогенезе (обзор) // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 1. С. 139-156.

70. Пархоменко А.Н., Лутай Я.М. Гепарин-индуцированная тромбоцитопения: механизмы развития, профилактика, лечение // Укр. мед.часопис. 2000. № 4. С. 68-75.

71. Пасторова В.Е., Ляпина Л.А. Антитромбоцитарная активность комплексных соединений гепарина // Атеротромбоз проблема современности. Тез. докл. Москва. 1999. С. 90-91.

72. Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Смолина Т.Ю., Ашмарин И.П. Антикоагулянтные и фибринолитические эффекты простейших пролинсодержащих пептидов // Известия АН. Сер.биол. 1998. № 3. С. 390-394.

73. Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Черкасова К.А., Ашмарин И.П. Пептиды как ингибиторы свертывающей активности тромбина и агрегации тромбоцитов // Успехи физиол. наук. 1999. Т.30, № 2. С. 80-91.

74. Патарая С.А., Преображенский Д.В., Сидоренко Б.А., Масенко В.П. Биохимия и физиология семейства эндотелинов // Кардиология. 2000. № 6. С. 78-85.

75. Патрушев Л.И. Генетические механизмы наследственных нарушений гемостаза //Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 1. С. 40-55.

76. Петросян М.Т., Розенфельд М.А., Петров А.К., Евстигнеева Р.П., Унковский В.Н. Взаимодействие синтетических пептидов с отдельными компонентами системы свертывания крови // Бюлл. экспер. биол. и медицины. 1983. T.XCV, № 2. С. 57-60.

77. Петрухина Г.Н., Макаров В.А. Участие сосудистой стенки в регуляции гемостаза // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. 2003. № 3. С. 22-35.

78. Позднякова Т.М. Механизм самосборки фибрина // Биохимия животных и человека. 1989. Т.13. С. 27-36.

79. Середенин С.Б., Гудашева Т.А., Бойко С.С., Ковалев Г.И., Воронин М.В., Яркова М.А. Эндогенный дипептид циклопролилглицин проявляет селективную анксиолитическую активность у животных с выраженной реакцией страха // БЭБиМ. 2002. Т. 133, № 4. С. 417-419.

80. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М.: Мир. 1998. Т.1. С. 59-63; Т.2. С.186-187.

81. Смолина Т.Ю., Пасторова В.Е., Ляпина Л.А. Комплексообразовние дипептида пролил-глицин с гепарином; исследование гемостатических свойств комплекса и при внутривенном введении // Тромбоз, гемостаз и реология. 2002. №2 (10). С.38-41.

82. Солнцева Е.И., Буканова Ю.В., Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А., Скребицкий В.Г. Эффекты ноотропов пирацетама и ГВС-111 на потенциалзависимые ионные каналы нейрональной мембраны // Бюлл. экспер. биологии. 1996. Т. 121, №2. С. 151-155.

83. Соловьева Н.И., Винокурова C.B., Дилакян Э.А. Коллагеназы I и IV типов и их эндогенные регуляторы в иммортализованных и трансформированных фибробластах // Вопросы мед. химии. 2001. Т. 46, № 1. С. 14-17.

84. Степанова В.В., Ткачук В.А. Урокиназа как мультидоменный белок и полифункциональный регулятор клеток (обзор) // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 1. С. 127-138.

85. Струкова С.М. Современные представления о механизмах свертывания крови // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. 2002. № 2. С. 21-26.

86. Струкова С.М., Киреева Е.Г., Спирова С.М. Иммунорегулятор агтимозин -ингибитор ферментативной активности а-тромбина // ДАН СССР. 1989. Т. 306, № 1.С. 229-232.

87. Струкова С.М., Ткачук В.А. Протеиназы системы свертывания крови и фибринолиза как клеточные регуляторы // Биохимия. 2002. Т. 67, вып.1. С. 3-4.

88. Танцырев Г.А., Ляпин Г.Ю. Вторично-эмиссионный масс-спектрометрический метод определения катионов и анионов в водных растворах // Журн. аналит. химии. 1991. Т. 46, № 9. С. 25.

89. Тарасов Ю.А., Ульянов A.M., Ляпина Л.А. Влияние препарата гепарин-аспирин на состояние противосвертывающей и инсулярной систем при инсулинзависимом диабете // Вестник Моск. ун-та. Сер. 16 Биология. 1998. № 3.С. 3-8.

90. Тимофеева Н.М., Иезуитова H.H., Громова Л.В. Современные представления о всасывании моносахаридов, аминокислот и пептидов в тонкой кишке млекопитающих // Успехи физиол. наук. 2000. Т. 31, № 4. С. 24-37.

91. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. Основы биохимии. М.: Мир. 1981. Т. 3. С. 14671497.

92. Ульянов A.M., Ляпина Л.А. Образование комплекса фибриноген-гепарин при взаимодействии комплекса адреналин-гепарин и фибриногена in vitro и in vivo // Научные доклады высш. школы. Сер. биол.науки. 1973. № 9. С. 44-49.

93. Ульянов A.M., Тарасов Ю.А. Инсулярная система животных при хроническом дефиците гепарина // Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46, № 2. С. 149-154.

94. Ульянов A.M., Тарасов Ю.А., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Успенская М.С. Влияние препарата из корней пиона на состояние инсулярной и гемостатической систем животных при развитии аллоксанового диабета // Вопр. мед. химии. 1998. Т. 44, № 3. С. 256-261.

95. Умарова Б.А., Шапиро Ф.Б., Хлгатян C.B., Струкова С.М. Включение 351-гепарина в тучные клетки крысы и выделение его в кровеносное русло // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1989. № 12. С. 648-651.

96. Харкевич Д.А. Фармакология. М.: изд-во «ГЭОТАР Медицина». 2000. С. 371374.

97. Циммерман М., Ениг В., Вутке В., Вайс X., Елькман В., Антони X., Вицлеб Э., Тевс Г., Гроте Й. Физиология человека // Пер. с англ. Под ред. Шмидта Р. и ТевсаГ./ М.: Мир. 1996. Т.2. 313 с.

98. Черкасова К.А. Механизмы регуляторного действия пролинсодержащих олигопептидов на показатели гемостаза. Автореф. дис. . . . к.б.н. М. 2002. 28 с.

99. Черкасова К.А., Ляпина Л.А., Ашмарин И.П. Сравнительное исследование действия препарата Семакс и простейших пролинсодержащих пептидов в модуляции гемостатических реакций // Бюллетень эксп. биол. и мед. 2001. Т. 132, №7. С. 20-22.

100. Шестаков В.А. Определение концентрации гепарина // Грудная хирургия. 1975. №2. С. 41.

101. Шехтер А.Б. Фибробласты // В кн.: Воспаление/ Под ред. Серова В.В., Паукова B.C. М.:Медицина. 1995. 640 с.

102. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови. Пер. с англ. Под ред. Наточина Ю.В./ М.: «Бином», С-Пб.: «Невский диалект». 2001. с. 206-213; 269-273.

103. Шрайнер Р., Фьюзон Р., Кертин Д., Моррилл Т. Идентификация органических соединений. Пер с англ./ Под ред. Руденко Б.А. М.: Мир. 1983. 704 с.

104. Щербак И.Г., Субботина Т.Ф., Фаенкова В.П., Рюмина Е.В. Турбидиметрический анализ полимеризации фибрина в плазме крови // Вопр. мед. химии. 2001. № 1. С. 21-29.

105. Яровая Г.А., Блохина Т.Б., Нешкова Е.А. Контактная система. Новые представления о механизмах активации и биорегулирующих функциях (обзор) // Биохимия. 2002. Т.67, вып. 1. С. 16-29.

106. Abildgaard U. Inhibition of the thrombin-fibrinogen reaction by heparin in the absence of cofactor// Scand. J. Haematol. 1968. V. 5, № 6. P. 432-439.

107. Akimoto K., Ikeda M., Sorimachi K. Inhibitory effect of heparin on collagen fiber formation in hepatic cells in culture // Cell Struct. Funct. 1997. V. 22, № 5. P. 533-538.

108. Andersen H., Greenberg D.L., Fujikawa K., Xu W., Chung D., Davie E.W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1999. V. 96, № 20. P. 1118911193.

109. Andrews R.K., Shen Y., Gardiner E.E., Dong J., Lopez J.A., Berndt M.C. The Glycoprotein Ib-IX-V Complex in Platelet Adhesion and Signaling // Thromb.Haemost. 1999. V. 82, № 2. P. 357-364.

110. Arocas V., Bock S.C., Raja S., Olson S.T., Bjork I. Lysine 114 of antithrombin is of crucial importance for the affinity and kinetics of heparin pentasaccaride binding // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 43809-43817.

111. Astrup T., Miillertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity // Arch.Biochem.Biophys. 1952. V. 5, № 3. P. 346-355.

112. Barnes M.J., Farndale R.W. Collagens and atherosclerosis // Exp. Gerontol. 1999. V. 34. P. 513-525.

113. Barnes M.J., Knight C.G., Farndale R.W. The use of collagen-based model peptides to investigate platelet-reactive sequences in collagen // Biopolymers. 1996. V. 40. P. 383-397.

114. Barrowcliffe T.W. Studies of heparin to antithrombin III by crossed immunoelectrophoresis // Thromb.Haemost. 1980. V. 42, № 5. P. 1434-1445.

115. Baum J., Brodsky B. Folding of peptide models of collagen and misfolding in disease // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. № 9. P. 122-128.

116. Bellamy L.J. The infrared spectra of complex molecules . V. 1. 3rd ed., Halsted Press-Willey. New York. 1975. P.78-86.

117. Bendetowicz A.V., Wise R.J., Gilbert G.E. Collagen-bound von Willebrand Factor has reduced affinity for factor VIII // J. Biol.Chem. 1999. V. 274. P. 12300-12307.

118. Bienkowski R.S., Cowan M.J., McDonald J.A., Crystal R.G. Degradation of newly synthesized collagen // J.Biol.Chem. 1987. V. 253, № 12. P. 4356-4363.

119. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.T., Usov A.I. A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. II Carbohydr. Res. 2004. V. 339, № 5. P. 511-517.

120. Bingley J.A., Gardner M.A., Stafford E.G., Mau T.K., Pohlner P.G., Tarn R.K., Jalali H., Tesar P.J., OBrien M.F. Late complication of tissue glues in aortic surgery // Ann.Thorac.Surg. 2000. V. 69, № 6. P. 1764-1780.

121. Blomback B. Fibrinogen and fibrin proteins with complex roles in haemostasis and thrombosis // Thromb.Res. 1996. V.83, № 1. P. 1-75.

122. Bon S., Coussen F., Massoulie J. Quaternary associations of acetylcholinesterase II. The polyproline attachment domain of the collagen tail // J. Biol. Chem. 1997. V. 272, №5. P. 3016-3021.

123. Born G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosinediphosphate and its reversal //Nature. 1962. V.19. P. 927-929.

124. Boullata J.I., Nace A.M. Safety issues with herbal medicine. Pharmacotherapy // 2000. V. 20. P. 257-269.

125. Chen J.H., Chen H.I., Tsai S.J. Chronic consumption of raw but not boiled Welsh onion juice inhibits rat platelet function // J. Nutr. 2000. V.130. P. 34-37.

126. Chen X.-C., Xia Lan, Hu Song, Huang Guang Inhibitory effects of Acanthopanax gracilistylus saponins on human platelet aggregation and platelet factor 4 liberation in vitro // Acta Pharmacol. 1996. V.17, № 6. P.523-526.

127. Chernousov M.A., Stahl R.C., Carey D.J. Schwann cell type V collagen inhibits axonal outgrowth and promotes Schwann migration via distinct adhesive activities of the collagen and noncollagen domaines // J. Neurosci. 2001. V. 21, № 16. P. 6125-6135.

128. Cheung W.F., van den Born J., Kuhn K., Kjellen L., Hudson B.G., Stafford D.W. ^ Identification of the endothelial cell binding site for factor IX //

129. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1996. V. 93, № 20. P. 11068-11073.

130. Chiang T.M., Cole F., Woo-Raspberry V. Cloning, characterization, and functional studies of a 47-kDa platelet receptor for Type III collagen // J.Biol.Chem. 2002. V. 277. P. 34896-34901.

131. Chiang T.M., Rinaldy A., Kang A.H. Cloning, characterization and functional studies of a non-integrin platelet receptor for type I collagen // J.Clin.Invest. 1997. V. 100. P. 514-521.

132. Chiang T.M., Wang Y.B., Kang E.S. Role of the recombinant protein of the platelet receptor for type I collagen in the release of nitric oxide during platelet aggregation // Thromb.Res. 2000. V. 100. P. 427-432.

133. Collen D. The plasminogen (fibrinolytic) sistem // Thromb.Haemost. 1999. V. 82, № 2. P. 259-270.

134. Colman R.W. Biologic activities of the contact factors in vivo. Potentiation on hypotension, inflammation, and fibrinolysis, and inhibition of cell adhesion,• angiogenesis and thrombosis // Thromb.Haemost. 1999. V. 82, № 6. P. 1568-1577.

135. Coughlin S.R. Protease-activated receptors and platelet function // Thromb.Haemost. 1999. V.82, № 2. P.353-356.

136. Coughlin S.R. Thrombin signalling and protease-activated receptors // Nature. 2000. V. 407. P. 258-264.

137. Deadman J.J., Elgendy S., Goodwin C.A. Characterization of a class of peptide boronates with neutral P1 side chains as a highly selective inhibitors of thrombin // J.Mol.Chem. 1995. V. 38. P.9-15.

138. Delacoux F., Fichard A., Cogne S., Garrone R., Ruggiero F. Unrayeling the amino acid sequence crucial for heparin binding to collagen V // J.Biol.Chem. 2000. V.275, № 38. P. 29377-29382.

139. Delacoux F., Fichard A., Geourjon C., Garrone R., Ruggiero F. Molecular features of the collagen V heparin binding site // J.Biol.Chem. 1998. V.273, № 24. P. 1506915076.

140. Denis C., Baruch D., Kielty C.M., Ajzenberg N., Christophe O., Meyer D. Localization of von Willebrand factor binding domains to endotelial extracellular matrix and to type VI collagen // Arterioscler. Thrombos. Vase. Biol. 1993. V.13. P. 398-406.

141. Dolovich L.R., Gonsberg J.S., Douketis J.D., Holbrook A.M., Cheah G. A metaanalysis comparing iow-molecular-weight heparins with unfractionated heparin in the treatment of venous thromboembolism // Arch.Intern.Med. 2000. V. 160. P. 181188.

142. Duplada B.A., Rivers C.W., Nutescu E. Dosing and monitoring of low-molecular-weight heparins in special populations // Pharmacotherapy. 2001. V.21. P. 218-234.

143. Eaton D.L., Malloy B.E., Tsai S.P., Henzel W., Drayana D. Isolation, molecular cloning, and partial characterization of a novel carboxypeptidase B from human plasma//J. Biol.Chem. 1991. V. 266. P. 21833-21838.

144. Eikelboom J.W., Anand S.S., Malmberg K., Weitz J.I., Ginsberg J.S., Yusuf S. Unfractionated heparin and low-molecular-weight heparin in acute coronarysyndrome without ST elevation: a meta-analysis // Lancet. 2000. V. 355. P. 19361942.

145. Fareed J., Jeske W., Hoppensteadt D., Clarizio R., Walegna J.M. Low-molecular-weight heparins: pharmacologic profile and product differentiation // Am.J.Cardiol.1998. V.82. P. 3L-10L.

146. Farndale R.W., Sixma J.J., Barnes M.J., de Groot P.G. The role of collagen in thrombosis and hemostasis // J.Thromb.Haemost. 2004. V. 2, № 4. P. 561-573.

147. Ferguson W.S., Finlay T.H. Localization of disulfide bond in human antithrombin III required for heparin-accelerated thrombin inactivation // Archs. Biochem. Biophys. 1983. V. 221. P. 304-307.

148. Ferry G., Lonchapt M., Pennel L., de Nanteu L.G., Canet E., Tucker G.C. Activation of MMP-9 by neutrophil elastase in an in vivo model of acute lung injure // FEBS Lett. 1997. V.402.P. 111-115.

149. Gachet C. ADP Receptors of Platelets and their Inhibition // Thromb.Haemost. 2001. V.86. P. 222-232.

150. Giesen P.L., Nemerson Y. Tissue factor on the loose // Semin.Thromb. Hemost. 2000. V. 26. P. 379-384.

151. Greinacher A. Treatment of heparin-induced thrombocytopenia // Thromb.Haemost.1999. V. 82, №2. P. 457-467.

152. Gribbon P.M., Maroudas A., Parker K.H., Winlove C.P., Reed R.K., Rubin K.// In: Connective Tissue Biology: Integration and Reductionism / 1998. Portland, London. P. 168-170.

153. Guh J.-H., Kon F.-N., Jong T.-T., Teng C.-M. Antiplatelet effect of gingerol isolated from Zingiber officinale // J. Pharm. and Pharmacol. 1995. V. 47, № 4. P. 329-332.

154. Gui T., Lin H.F., Jin D.Y., Hoffman M„ Straight D.L., Roberts H.R., Stafford D.W. Circulating and binding characteristics of wild-type factor IX and certain Gla domain mutants in vivo //Blood. 2002. V. 100. P.153-158.

155. Hainer J.W., Barrett J.S., Assaid C.A., Fossler M.J., Cox D.S., Leathers T., Leese P.T. Dosing in heavy-weight/obese patients with the LMWH, tinzaparin: a pharmacodynamic study. Thromb.Haemost. 2002; 87: 817-23.

156. Hamamoto T., Kisiel W. The effect of cell surface glycosaminoglycans (GAGs) on the inactivation of factor Vila-tissue factor activity by antithrombin III // Int. J. Hematol. 1998. V. 68, № 1. P. 67-78.

157. Heemskerk J.W.M., Bevers E.M., Lindhout T. Platelet activation and blood coagulation // Thromb.Haemost. 2002. V. 88, № 2. P.186-193.

158. Henriet P., Zhong Z.-D., Brooks P.C., Weinberg K.I., De Clerck Y.A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIPI // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97, № 18. P. 10026-10031.

159. Hiebert L.M., Wice S.M., Ping T., Herr D., Laux V. Antithrombotic efficacy in a rat model of the low molecular weight heparin, Reviparin sodium, administered by the oral route // Thromb.Haemost. 2001. V. 85. P. 114-118.

160. Hirsh J. Low Molecular Weight Heparin // Thromb.Haemost. 1993. V. 70, № 1. P. 204-207.

161. Hoffman M., Monroe D.M. A cell-based model of hemostasis // Thromb.Haemost.• 2001. V. 85. P. 958-965.

162. Hoffman S.W., Sutton R.L., Stein D.G. Neuroscience Research Communications. 1993. V.13,№2.P. 63-72.

163. Hogan K.A., Weiler H., Lord S.T. Mouse models in coagulation // Thromb. Haemost. 2002. V. 87, № 4. P. 563-574.

164. Janetzky K., Morreale A.P. Probable interaction between warfarin and ginseng // Am. J. Health Syst. Pharm. 1997. V. 54. P. 692-693.

165. Jeske W., Fareed J. In vitro studies on the biochemistry and pharmacology of low molecular weight heparins // Semin. Thromb. Hemost. 1999. V. 25, Suppl. 3. P. 27-33.

166. Jin L., Abrahams J.P., Skinner R., Petitou M., Pike R.N., Carrell R.W. The anticoagulant activation of antithrombin by heparin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94, №26. P. 14683-14688.

167. Kahn M.L., Zheng Y.W., Huang W., Bigornia V., Zeng D., Moff S., Farese R.V.Jr., Tam C., Coughlin S.R. A dual thrombin receptor system for platelet activation // Nature (London). 1998. V. 394. P. 690-694.

168. Kakutani M., Masaki T., Sawamura T. A platelet-endothelium interaction mediated by lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97, № 1. P. 360-364.

169. Karniguian A., Legrand Y.J., Lefrancier P., Caen J.P. Effect of a collagen-derived octapeptide on different steps of the platelet/collagen interaction // Thromb. Haemost. 1983. V. 32. P. 593-604.

170. Kimura Y., Okuda H., Arichi S. Effects of various ginseng saponins on 5-hydroxytryptamine release and aggregation in human platelets // J. Pharm. Pharmacol. 1998. V. 40. P. 838-843.

171. Koh T.J., Bharucha K.R. Stable orally active Heparinoid Complexes. Patent USA, 1971. № 3577534, kl. A 61k 17/18.

172. Koshelnick Y., Ehart M., Stockinger H., Binder B.R. Mechanisms of signaling through urokinase receptor and the cellular response // Thromb.Haemost. 1999. V. 82, №2. P. 305-311.

173. Kudrjashov B.A., Lyapina L.A. Nonenzymatic fibrinolysis and its role in the organism // Thrombosis and thrombolysis. Consultants burea. New York. 1986. P. 33-65.

174. Lankhof H., van Hoeij M., Schiphorst M.E., Bracke M., Wu Y.P., Ijsseldijk M.J., Vink T., de Groot P.G., Sixma J.J. A3 domain is essential for interaction of von Willebrand factor with collagen type III // Thromb.Haemost. 1996. V. 75. P. 950958.

175. Lazareva A.V., Lazarev Iu.A. Effect of chain length on formation of a double-layer structure of Z-(Gly-Pro-Gly)n-OMe oligopeptides // Biophys. 1997. V. 42, № 4. P. 806-810.

176. Leikin S., Parsegian V.A., Yang W.-H., Walfaren G.E. Raman spectral evidence for hydration forces between collagen triple helices // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94,№21. P. 11312-11317.

177. Lentini A., Ternai В., Ghosh P. Interaction of heparin and SP54 with gelatin // Int. J. Biol. Macromol. 1988. V. 10. P.113-120.

178. Lindhau U., Backstrom G., Hook M. Structure of antithrombin-binding site in heparin // Proc. Natl. Acad. USA. 1979. V. 76. P. 3198-3202.

179. Linhardt R.J., Gunay N.S. Production and chemical processing of low molecular weight heparins // Semin. Thromb.Haemostasis. 1999. V. 25. P. 5-16.

180. Lorand L. Factor XIII: structure, activation, and interactions with fibrinogen and fibrin//Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001. V. 936. P. 291-311.

181. Lukashev M.E., Werb Z. ECM signalling: orchestrating cell behavior and misbehavior // Trends Cell Biol. 1998. V. 8, № 11. P. 437-441.

182. Makarov V.A., Vasilieva T.M., Petrukhina G.N., Barkagan Z.S., Momot A.P., Rodionov S.V., Philatov A.V. The new substances for the drug influence on the hemostasis function // Thrombus, bleeding and vascular patology. 2004. V. 5. P. 48-49.

183. Mann K.G. Biochemistry and physiology of blood coagulation // Thromb.Haemost. 1999. V. 82, №2. P. 165-174.

184. Manns J.M., Brennan K.J., Colman R.W., Sheth S.B. Differential regulation of human platelet responses by cGMP inhibited and stimulated cAMP phosphodiesterases. Thromb.Haemost. 2002; 87: 873-879.

185. Matsuka Y.V., Migliorini M.M., Ingham K.C. Cross-linking of fibronectin to C-terminal fragments of the fibrinogen alfa-chain by factor XIII // J.Protein.Chem. 1997. V. 16, №8. P. 739-745.

186. Merli G., Spiro Т.Е., Olsson C.G. Treatment of venous thrombosis: a comparison of efficacy of enoxaparin (Aventis Pharma) with unfractionated heparin // Ann. Intern. Med. 2001. V. 134. P. 134-202.

187. Millet J., Jouault S.C., Mauray S., Thevenaux J., Sternberg C., Boisson V.C., Fischer A.M. Antithrombotic and anticoagulant activities of a low molecular weight fucoidan by the subcutaneous route // Thromb.Haemost. 1999. V.81, № 3. P. 391-395.

188. Monnet E., Fauvel-Lafeve F. A new platelet receptor specific to Type III collagen. Type III collagen-binding protein //J.Biol.Chem. 2000. V. 275. P. 10912-10917.

189. Morton L.F., Fitzsimmons C.M., Rauterberg J., Barnes M.J. Platelet reactive sites in collagen//Biochem. J. 1987. V. 248. P.483-487.

190. Mosesson M.W. Fibrinogen y chain functions // Thromb.Haemost. 2003. V. 1, №2. P. 231-238.

191. Mushunje A., Zhou A., Huntington A., Conrad J., Carrell R.W. Antithrombin "DREUX" (Lysl 14Glu): a variant with complete loss of heparin affinity // Thromb. Haemost. 2002. V. 88, №3. P. 436-443.

192. Narayani R., Rao K.R. Polymer-costed gelatin capsules as oral delivery devaces and their gastrointestinal tract behaviour in humans // J.Biomater.Sci.Polym. 1995. V. 7, № 1. P. 39-48.

193. Neises B., Broersma R.J., Tarnus C. Synthesis and comparison of tripeptidylfluoroalkane thrombin inhibitors // Bioorg.Med.Chem. 1995. V. 23. P. 1049-1061.

194. Noll T., Wozniak G., McCarson K., Hajimohammad A., Metzner H.J., Inserte J., Kummer W., Herlein W.F., Piper H.M. Effect of factor XIII on endothelial barrier function // J.Exp.Med. 1999. V.189,№9. P. 1373-1382.

195. Persson E., Kjalke M., Olsen O.H. Rational design of coagulation factor Vila variants with substantially increased intrinsic activity / Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2001. V. 98, №24. P. 13583-13588.

196. Petitou M., Herault J.P., Bernat A., Driguez P.A., Dushaussoy P., Lormeau J.C., Herbert J.M. Synthesis of thrombin-inhibiting heparin mimetics without side effects //Nature (London). 1999. V. 398. P. 417-422.

197. Pettila V., Leinonen P., Markkola A., Hiilesmaa V., Kaaja R. Postpartum bone mineral density in women treated for thromboprophylaxis with unfractionated heparin or LMW heparin // Thromb.Haemost. 2002. V. 87. P. 182-186.

198. Rainey J.K., Goh M.C. A statistically derived parametrization for the collagen triple-helix // Protein Science. 2002. № 11. P. 2748-2754.

199. Ralevic V., Burnstock G. Receptors for purines and pyrimidines // Pharmacol.Rev.1998. V. 50. P. 413-492.

200. Rolf M.G., Brearley C.A., Mahaut-Smith M. Platelet shape change evoked by selective activation of P2Xi purinoceptors with a, p methylene ATP // Thromb. Haemost. 2001. V. 85. P. 303-308.

201. Rosenberg R.D., Lam L. Correlation between structure and function of heparin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 1218-1222.

202. Rothman A.B., Mortensen H.D., Holmskov U., Hojrup P. Structural characterization of bovine collectin-43 // Eur. J. Biochem. 1997. V. 243, № 3. P. 630-635.

203. Ruggeri Z.M. Structure and function of von Willebrand factor // Thromb.Haemost.1999. V. 82, №2. P. 576-584.

204. Samonina G., Ashmarin I., Lyapina L. Glyproline peptide family: review on bioactivity and possible origins // Pathophysiology. 2002. № 8. P. 229-234.

205. Sanderink G.J., Liboux A.L., Jariwala N., Harding N., Ozoux M.-L., Shukla U., Montay G., Boutouyrie B., Miro A. Enoxaparin pharmacokinetics and pharmacodynamics in obese subjects // J.Am.Coll.Cardiol. 2001. V. 37, suppl. A. P.229A (#1076-172)

206. Schmaier A.H., Rojkjaer R.,Shariat-Madar Z. Activation of the plasma kallikrein/kinin system on cells: a revised hypothesis // Thromb.Haemost. 1999. V.82, № 2. P. 226-233.

207. Schulman S., Hellgren-Wangdahl M. Pregnancy, heparin and osteoporosis // Thromb.Haemost. 2002. V. 87. P. 180-181.

208. Shattil S.J. Signalling Through Platelet Integrin <xllb(33: Inside-out, Outside-in, and Sideways // Thromb.Haemost. 1999. V. 82, №2. P. 318-325.

209. Siljander P.-M., Munnix I., Smethurst P., Deckmun H., Lindhout T., Ouwehand W., Farndale R., Heemskerk J. Adhesion receptor interplay regulated human thrombus formation on collagen fibres in under blood flow // Blood.2004.V.103. P.1333-1341.

210. Sixma J.J., van Zanten G.H., Huizinga E.G., van der Plas R.M., Verkleij M., Wu Y.P., Gros P., de Groot P.G. Platelet adhesion to collagen: an update. Thromb.Haemost. 1997; 78: 434-8.

211. Sixma J.J., Wester J. The hemostatic plug // Semin. Hematol.1977. V.14. P.265-299.

212. Stevenson C., Pitter M.H., Ernst E. Garlic for treating hypercholesteromia: a metaanalysis of randomized clinical trials // Ann. Intern. Med. 2000. V.133. P. 420-429.

213. Tominaga R., Samejima M., Sakai F., Hayashi T. Occurence of cello-oligosaccharides in the apoplast of auxin-treated pea stems // Plant Physiol. 1999. V. 119, № l.P. 249-254.

214. Turpie A.G. Setting a standard for venous thromboembolism prophylaxis // Am.J.Health.Syst.Pharm. 2001. V.l (58), suppl. 2. P. S18-23.

215. Uspenskaya M.S., Pasorova V.E., Lyapin G.Y., Novikov V.S., Lyapina L.A. Antithrombotic agent of extracts from peony roots // J. of the Intern. Society on Thromb. and Haemost. 1995. V. 73, № 6. P. 1324.

216. Vaughan-Thomas A., Young R.D., Phillips A.C., Duance V.C. Characterization of type XI collagen-glycosaminoglycan interactions // J. Biol.Chem. 2001. V. 276, №7. P. 5303-5309.

217. Visentin G.P. Heparin-induced thrombocytopenia: pathogenesis // Thromb.Haemost. 1999. V. 82, № 2. P. 448-456.

218. Wang W.-J., Huang T.-F. Purification and characterization of a novel metalloproteinase, Acurhagin, from Agkistrodon acutus venom // Thromb. Haemost. 2002. V. 87, № 1. P. 641-650.

219. Warkentin T.E., Chong B.H., Greinacher A. Heparin-induced thrombocytopenia: towards consensus//Thromb.Haemost. 1998. V. 79. P. 1-7.

220. Watson S., Berlanga O., Best D., Frampton J. Update on collgen receptor interaction in platelets: is the two-state model still valid? // Platelets. 2000. V.l 1. P. 252-258.

221. Watson S.P. Collagen receptor signaling in platelets and megakaryocytes // Thromb.Haemost. 1999. V. 82, № 2. P. 365-376.

222. Wess T.J., Hammersley A.P., Wess L., Miller A. Molecular packing of type I collagen in tendon // J.Mol.Biol. 1998. V. 275. P. 255-267.

223. Wess T.J., Hammersley A.P., Wess L., Miller A. A consensus model for molecular packing of type I collagen //J.Struct.Biol. 1998. V.122,№l-2. P. 92-100.

224. Wessler S. Thrombosis in the presence of vascular stasis // Amer. J. Med. 1962. V. 33, № 5. P. 648-666.

225. Wilson D.L., Martin R., Hong S., Cronin-Golomb C., Mirkin C.A., Kaplan D.L. Surface organization and nanopattering of collagen by dip-pen nanolithografy // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2001. V. 98, № 24. P. 13660-13664.

226. Wilson S.J.A., Wilbur K., Burton E., Anderson D.R. Effect of patient weight on the anticoagulant response to adjusted therapeutic dosage of low-molecular-weight heparin for the treatment of venous thromboembolism // Haemostasis. 2001. V. 31. P. 42-48.

227. Wolberg A.S., Stafford D.W., Erie D.A. Human factor IX binds to specific sites on the collagenous domain of collagen IV // J.Biol.Chem. 1997. V. 272. P. 1671716720.

228. Wu J.J., Eyre D.R. Structural analysis of cross-linking domains in cartilage type XI collagen. Insights on polymeric assembly // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 1886518870.

229. Xia T., Akers K., Eisen A.Z., Seltzer J.L. Comparison of cleavage site specifity of gelatinases A and B using collagenous peptides // Biochim.Biophys.Acta. 1996. № 1293 (2). P. 259-266.

230. Xu Y., Gurusiddappa S., Rich R.L., Owens R.T., Keene D.R., Mayne R., Hook A., Hook M. Multiple binding sites in collagen type I for the integrins a 1(31 and a2(31 // J.Biol.Chem. 2000. V. 275. P. 38981-38989.

231. Yong E., Prins M., Levine M.N., Hirsh J. Heparin binding to plasma proteins, an important mechanism for heparin resistance // Thromb.Haemostas. 1992. V. 67, №6. P. 639-643.

232. Zacharski L.R., Rosenstein R. Failure of collagen to activate factor XII // Thromb. Res. 1975. V. 7. P. 929-933.

Информация о работе

Оберган, Тамара Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.13

Диссертация

Глипролины и их комплексные соединения с гепарином как физиологические модуляторы функции противосвертывающей системы организма - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Глипролины и их комплексные соединения с гепарином как физиологические модуляторы функции противосвертывающей системы организма - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы