Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гликопротеин муцинового типа (муцин-D) в клетках DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гликопротеин муцинового типа (муцин-D) в клетках DROSOPHILA MELANOGASTER"

/ч

- Со

На правах рукописи

ПОМЕЧУ ЕВ А Татьяна Валентиновна

ГЛИКОПРОТЕИН МУЦИНОВОГО ТИПА (МУЦГШ-1)) В 1СЛКТКАХ ГЖОХОРШМ МЕЫтаЛЯТЕИ

03 00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

В.А. Гвоздев

кандидат биологических наук А.А.Крамеров

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, профессор

И.С.Кулаев

кандидат биологических наук И.А.Гривенников

Ведущая организация: Институт биоорганической химии РАН

Защита состоится "_^ОлМ^^А-' 1997г . в

на заседании Диссертационного совета Д 051.05.32 при Московской Государственном Университете им.М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан _

Ученый секретарь Совета кандидат биологических наук / ^^ / М.В.Иваног

, С

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность гены. Гликопротеины участвуют в обеспечении жизненно важных функций клеток. Показана, в основной на позвоночных, их значительная роль в процессах межклеточного узнавания, цитодифференцировки и морфогенеза. Гликопротеинами являются биологически активные макромолекулы - гормоны, ферменты, иммуноглобулины, групповые вещества крови, транспортные белки, интерферон и др. В последнее время уделяется пристальное внимание изучению гликопротеинов муцинового типа позвоночных, которые, наряду с протеогликанами, являются важным компонентом внеклеточного мат-рикса. Муцины секретируются эпителиями пищеварительного, дыхательного тракта, слюнных желез, почек, половой системы и т.д. Активно исследуется структура, биосинтез и возможные функции муцинов как защитного барьера между клеткой и внешним окружением, и как компонента внеклеточного матрикса, определяющего способность клетки к дифференцировке или пролиферации. Муцины выступают и как маркеры раковых клеток, поскольку структура и свойства муцинов меняются при опухолевом перерождении. Общими биохимическими характеристиками муцинов являются: высокое содержание О-связанного через N-ацетилгалактозамин с серином или треонином углеводного компонента, а также его микрогетерогенность; аминокислотные повторы, включающие сайты о-гликоэилирования и обогащенные серином и треонином; преобладание 5-ти аминокислот (ала-нина, глицина, пролина, треонина, серина); наличие домена, богатого цистеином (Verma & Davidson,1994).

В отличие гликопротеинов позвоночных, гликопротеины насекомых остаются еще мало изученными, а исследования гликопротеинов класса муцинов практически не начаты. В связи с этим представляет интерес исследование структуры и свойств гликопротеина, составляющего главную фракцию новообразованных гликопротеинов, синтезирующихся в культуре клеток Drosophila meianogaster. В результате настоящей работы он был охарактеризован как гликопроте-ин муцинового типа (муцин-D). Таким образом, муциновый гликопро-теин был впервые обнаружен у насекомых. Иммуногистохимические исследования показали широкое распространение муцина-D в различных типах клеток и тканей дрозофилы, что может указывать на его мультифункциональную роль у насекомых.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в биохимической характеристике гликопротеина Drosophila. melanogas-

ter, его белкового и углеводного компонентов. В работе также исследовали секрецию и тканевую локализацию муцина-D.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые у насекомых был охарактеризован гликопрогеин класса муцинов (му-цин-D). Разработана методика его выделения из культуры клеток дрозофилы, проведено ферментативное дегликозилирование гликопро-теина, проанализированы его белковый и углеводный компоненты, состав и строение которых позволяют отнести исследуемый гликоп-ротеин к классу муциновых гликопрогеинов, ранее не описанных у насекомых. Исследована секреция муцина-D в линиях пересеваемых клеток дрозофилы, регулируемая гормоном линьки насекомых - эк-дистероном. Данные иммуногистохимичсской локализации муцина-D в тканях разного происхождения указывают на его возможную полифункциональную роль у насекомых. Исследование муцина-D позволит расширить представления о структуре и биологической роли этого класса соединений у животных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на ежегодных научных конференциях ИМГ РАН (Москва, 1992, 1993, 1994), 14й конференции FECTS (Лион, Франция, 1994).

Объем диссертации■ Материал диссертации изложен на 138 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 5 таблиц. Список цитированной литературы состоит из 201 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использовали две пересеваемые культуры клеток Dr.melanogaster (67j25D (Dm) и Schneider-2 (S~2)),a также пересеваемые культуры клеток Dr.virilis, Dr.hydei, клеточная линия тутового шелкопряда В.mori и эмбриональная клеточная линия комара A.aegypti.

Экдистерон (20-гидроксиэкдизон, "Serva", ФРГ) - 1 мкМ, монен-зин -10 мкг/мл) и брефельдин A ("Sigma", США)-10 мкг/мл добавляли к суспензии клеток (1 млн клеток в мл) при пересеве. Радиоактивный предшественник ([3H]-GlcNac, . 20-30 мкКи/мл;"Изотоп", Санкт-Петербург) добавляли к суспензии клеток при рассеве.

Для получения лизата клетки отмывали от среды в солевом растворе С-15 (Gvozdev et al., 1980), лизировали в 0,5X тритоне Х100 в С-15 и осаждали ядра центрифугированием при 800g 10 мин

при 4°С. Очистку гликопротеина из лиэата куль туры клеток Dm проводили с использованием ограниченного протеолиза (проназа Е, 20 мкг/мл, 2 часа при 37°С), преципитации термолабильных белков, препаративного электрофореза по Лэимли с последующей экстракцией из геля (подробнее ом . "Результаты").

Моноклональные антитела против очищенного гликопротеина были получены клонированием положительных клонов методом конечных разведений по стандартный методикам (Браун, Линг, 1991). Для скрининга клонов использовался метод дот- и блот-анализа.

Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях проводили по Laemmli (1970) в 0,035 М трис-глициновом буфере, 0.1 % SDS, pH 8,9 и на иинигелях ("PhastSystem", Pharmacia).

Электроблоттинг проводили в 20 мМ Na-боратном буфере, pH 9,2 на нитроцеллюлозную мембрану ВА-85 ("Shleicher &

Shuell",ФРГ).Блоты окрашивали иммунохимически после инкубации фильтров с моно(1:1000) или лоликлональными антителами (1:100), выявляемыми соответствующими вторичными антителами, конъюгиро-ванными с щелочной фосфатазой (1:1000).

Белок определяли микрометодом Брэдфорда (Bradford, 1986).

Радиоактивность фракций после электрофореза выявляли флуоро-ографией гелей, пропитанных 2М салицилатом натрия и высушенных под вакуумом.

В работе был использован полученный А.Краиеровым меченный [1Z5I] препарат гликопротеина.

Очищенный препарат гликопротеина обрабатывали о-гликаназой (эндо-й-Ы-ацетилгалактозаминидазой, К.Ф.3.2.1.97, "Boehringer -Mannheim", Австрия) соотношении 1:100 (в/в) в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7.0) при 37°С , а также трипсином или проте-азой V8 ("Sigma", США) в молярном соотношении 1:100 при 37°С. Продукты расщепления гликопротеина разделяли гель-хроматографией на сефадексе G-50 в 0,1 М NH4COOH буфере. Элюируемую белковую часть гликопротеина лиофильно высушивали и после кислотного гидролиза в смеси 1:2 трихлоруксусной и соляной кислот при 140°С в течение 1ч использовали для определения аминокислотного состава на аминокислотном анализаторе 835 Hitachi.

Фракции олигосахаридов, полученных как обработкой 0-гликана-зой, так и щелочным элиминированием (с использованием щелочного NaBH4 по Карлсону (Carlsson,1968)) хроматографировали на колонке

TSK-HW-40 (гель-фильтрация), а затем - методом ВЭЖХ - на колонке Ultrasphere С-18 ("Altex", США). Количественный анализ углеводов и аминокислот проводили с использованием анализатора Biotronik LC-200 (ФРГ) после кислотного гидролиза. Данные углеводного и аминокислотного анализа гликопротеина получены в сотрудничестве с Н.П.Арбатским (Институт органической химии РАН) и Л.А.Барато-вой (Молекулярный корпус МГУ).

Личинки 3-его возраста, куколки и имаго D.melanogaster фиксировали в жидкости Буэна и заключали в гистопласт (' Serva", ФРГ). Депарафинированные срезы отмывали в PBS и инкубировали с иммунной сывороткой. В качестве вторичных антител использовали ан-ти-кроличьи IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена ("Sigma", США). Аналогичные эксперименты осуществляли с использованием мо-ноклональных антител к гликопротеину дрозофилы. Активность пе-роксидазы выявляли с помощью 2 мИ диамииобензидина ("Sigma", США) в присутствии О.01% Н202. Отмытые срезы обрабатывали 0.1% раствором 0s04 и после обезвоживания заключали в канадский бальзам.

Собранные образцы тканей личинок и имаго дрозофилы гомогенизировали стеклянным гомогенизатором и супернатант после центрифугирования (800д 10 мин при 4°С) смешивали с буфером образца для электрофореза (Laemmli, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Г.' Очистка гликопротеина и получение его дегликозилирован-ной формы.

Для выделения муцина-D из культуры клеток 67j25D (Dm) был разработан метод, основанный на устойчивости муцииа-D к обработке проназой, его термостабильности, а также низкой эффективности его перекоса из полиакриламидного геля на фильтр. Содержание гликопротеина составляет 50 мкг на 1 млрд клеток линии Dm. Обработка проназой Е (20 мкг/мл, 2 часа при 37°С) цитозольного экстракта клеток, меченных [3H]GlcNAc, и последующий прогрев (5 мин, 95°С) позволяли осадить большую часть посторонних клеточных белков. На этом этапе ("надосадок") достигалась 100-кратная степень очистки гликопротеина с выходом около 70%. Дальнейшую

очистку осажденного из супернатанта ацетоном гликопротеина проводили методой электрофореза по Лэммли в 10% полиакриламидном геле с SDS. Чтобы избавиться от белковых примесей, препаративный гель после электрофореза подвергали электроблоттингу (Зч, 100 V, 400 mА). Использование этой стадии связано с низкой, по сравнению с другими белками, эффективностью переноса муцина-D (менее 5%) из геля на фильтр. После блоттинга окраской Кумасси в геле выявлялся практически один муцин-D. Дальнейшая экстракция из геля (0,05 М фосфат натрия, рН 7,5; 0,15% SDS), диализ и упаривание в вакууме позволяли получать очищенные в 1000 раз препараты муцина-D с выходом 10 - 15%. Видимая мол.масса изолированного гликопротеина по данным электрофореза составляла около 90 кДа.

Ферментом, способным отщеплять меченные [3H]-GlcNac углеводные цепи, оказалась О-гликанаэа (эндо-СС-М-ацетил-О-галактозами-нидаза, К.Ф.3.2.1.97) из Diplocoacus pneumonia, специфичная в отношении дисахарида Galp(1-3)GalNac, связанного 0-гликозидной связью с серином или треонином.В ходе инкубации гликопротеина с ферментом наблюдалось постепенное снижение количества радиоактивности, включившейся в состав углеводного компонента гликопротеина, что сопровождалось падением его видимой молекулярной массы до 70 кДа (рис.1,а). При ферментативном дегликозилировании иодированного по остаткам тирозина препарата гликопротеина авто-радиографически также выявляется фракция с мол.массой 70 кДа. (рис.1,в).

Узнавание дегликозилированной формы гликопротеина полученными нами моноклональными антителами против очищенного гликопротеина снижено на порядок, что указывает на углеводную природу выявляемого ими эпитопа (рис.1,6). Напротив, использованные в работе поликлональные антитела сохраняли способность выявлять фракцию 70 кДа (рис.1,г) .

При расщеплении дегликозилированной формы гликопротеина про-теазами - V8 и трипсином образовывался продукт с мол.массой около 50 кДа (рис.2). Обработка исходного очищенного муцина-D данными протеазами не приводила к его расщеплению. Можно предполагать, что после удаления большей части углеводного компонента, экранирующего белковую часть ГП, она становится доступной для атаки прогеаз. Продукт действия протеаз с мол.массой около 50 кДа устойчив к дальнейшему расщеплению трипсином и V8, что пред-

нкАТ пкАТ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

m .92 л .92 •**". jPH' _ .92

V й . W

• •. V.

,«е .66

. бе

Рис.1. Обработка меченного [3H]GlcNAc (а,б) и [125Х] (в,г) гликопротеина О-гликаназой (10ми/мл) при 37°С: (а,в) - флуорогра-фия; (б,г) - иммуноблоттинг с использованием моно- (мкАТ) и по-ликлональных (пкАТ) антител, соответственно; 1,5,9,11 - инкубация 16 ч без фермента; 2,6-2 часа инкубации с ферментом; 3,7 -4 часа инкубации с ферментом; 4,8,10,12 - 16 часов инкубации с ферментом. Отмечено положение полос калибровочных белков, фосфо-рилазы В (92 кДа) и бычьего сывороточного альбумина (66 кДа).

.92

V . .66

#

45

'I j а б в г

Рис.2. Обработка меченного [1251] гликопротеина ферментами, флу-орография: а) без обработки; б) инкубация с О-гликаназой; обработка дегликозилированного гликопротеина трипсином (в) и прогеа-зой МВ (г). Отмечено положение полос калибровочных белков (в кДа) .

- ? -

полагает наличие в гликопротеине фрагмента, вторичная или третичная структура которого затрудняет доступ протеаз к сайтам расщепления.

2. Аминокислотный состав гликопротеина.

Аминокислотный и углеводный состав муцина-D с кажущейся молекулярной массой около 90 кДа приведен в табл.1 (данные были получены в сотрудничестве с Л.А.Баратовой и Н.П.Арбатским) . Полипептид обогащен остатками глицина, треонина и серина. Последние формируют узел связи 0 - гликозидного типа с олигосахаридными цепями у муцинов. Белковый компонент содержит достаточное количество остатков пролина (7,3%), участвующих в формировании сайта 0-гликозилирования при биосинтезе муцинов. Расчеты показывают, что в молекуле имеется 8 остатков цистеина, ответственных за образование S-S связанных димеров исследуемого гликопротеина, описанных ранее (Kranerov et al.,1990).

3. Характеристика углеводного компонента гликопротеина.

Углеводы составляют по весу _40% от общей массы муцина-D, а молекулярная масса его полипептидной части составляет примерно 55 кДа. Преобладающими сахарами являются GalNac и Gal (табл.1), на долю которых приходится более 80% всех Сахаров. Значительно меньше обнаружено GlcNac и Man, присутствие которых свойственно для Ы-гликанов и может отражать наличие в молекуле муцина-D одной или двух N-связанных углеводных цепей. В следовых количествах обнаруживаются фукоза и рамноза.

4.Анализ олигосахаридных фракций, отщепляемых О-гликаназой или в результате щелочного элиминирования

Фракцию олигосахаридов,меченных [3Н]С1сНАс и отщепляемых О-гликаназой (75% исходной радиоактивной метки), выделяли

Таблица 1

Аминокислотный и углеводный состав гликопротеина

(число остатков на 100 аминокислотных остатков) АМИНОКИСЛОТЫ УГЛЕВОДЫ*

Asp+Asn 7 . .5 Met 1. 1 GlcNAc 1.45

Thr 11 , ,5 He 2. .2 GalNAc 12.25

Ser 10. . 8 Leu 5 . .5 Gal 9.55

Glu+Gln 10. . 5 Tyr 1 . .4 Man 2.0

Pro 7 , . 3 Phe 3 . , 5 Fue 0.58

Gly 15 .0 Lys 4. . 6 Xyl 1.02

Ala 8 .4 His 0. . 9 Glc 2.22

Cys 1 . 5 Arg 3 . .3 Rha следы

Val 4 . 0 Rib следы

* после кислотного гидролиза GalNAc и GlcNAc определяются в деацетилированной форме.

гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50. Gal и GalNAc присутствуют в этой фракции примерно в том же соотношении, что и в исходном гликопротеине (табл.2). После восстановления NaBH4, де-ионизации на катионите и хроматографии на колонке с TSK HW-40 (гель-фильтрация) (рис.За) основной углеводный материал был обнаружен во фракции А, которая по профилю элюции совпадает со стандартным дисахаридом 2 (Gal-GalNAc-ol).

Обращенно-фазовая хроматография на колонке Ultrasphere С-18 (рис.Зб) показала, что практически вся радиоактивность содержится в олигосахариде (фракция Б), совпадающим по профилю элюции со стандартным дисахаридом 2. Олигосахарид содержал практически эк-вимолярное количество Gal и GalNac-ol (табл.2). Полное восстановление GalNAc указывает на то, что этот моносахарид присутствует в гликопротеине только в узле 0-гликозидной связи с гид-роксиаминокислотами. Фракция А содержала также заметное количество GlcNAc (табл.2), однако обнаружить какой-либо GlcNAc-co-держаций компонент не удалось. Таким образом, практически единственным олигосахаридным фрагментом, отщепляемым в результате действия 0-гликаназы, является дисахарид Gal{5(1-3)GalNac - наи-

Таблица 2

Относительное содержание углеводов (в нмолях) в исходном гликопротеине и олигосахаридных фракциях, полученных обработкой 0-гликаназой

Ф P А К Ц И Я

олигосахаридная восстановленный олигосахарид

Сахар исходный ГП фракция фракция А фракция Б

GlcN 18 24 21 следы

GlcN-ol 0 0 5 следы

GalN 170 108 следы 0

GalH-ol 0 0 45 15

Gal 130 82 53 14

Man 30 8 3 следы

Xyl 14 5 следы следы

Fue 8 4 0 0

более распространенный вариант дисахарида, присоединенного к белковой части гликопротеинов муцинового типа у позвоночных.

Отщепление О-связанных углеводных цепей муцина-D провели также методом щелочного элиминирования в присутствии NaBH4 по Карлсону (Carlsson, 1968). Основной пик радиоактивности (рис.Зв) обнаруживается во фракции, соответствующей дисахариду 2, небольшое ее количество - в зоне выхода моносахаридов (GalNAc-ol) и, еще меньше - в зоне элюции трисахарида. При хроматографии фракций, соответствующих moho-, ди- и трисахаридам (рис.Зв,фракция В) на колонке Ultrasphere С-18 (рис.Зг) практически вся метка сосредоточена в пике, идентичном по времени элюции дисахариду 2, хотя небольшое ее количество содержится и в плече, совпадающем по времени элюции с GalNAc-ol и трисахаридом 3 (GlcNAc-Gal-GalNAc).

200 0.4

0.2-

0.8-

0.4-

4 3 2 1

1 1 и

4 ' \ V У V

200

0.04-

0.02-

А

I-1

т!

0.1-

5 0.05-

I1

■Л

Г1

' .л 1 I I »

! \ 1 ^

в —

срт-10" 9

15 20 25 т!

20

—| !-г

30 40га1П

Рис.3. Фракционирование олигосахаридов, полученных обработкой гликопротеина О-гликаназой (а,б) и щелочным раствором ИаВН4 (в,г), гель-фильтрацией на колонке с ТБК Ш-40 (а,в) и ВЭЖХ на колонке и1^гаэрЬеге-С18 (б,г). Детекция по УФ-поглощению (- - -}

и [3Н]метке (-). Для калибровки колонки использовали Са1-

НАс-о1 (1) и следующие олигосахариды:

Са1(Р1-3)Са1ИАс-о1 (2), С1сЫАс«Х1-4)Са1<р1-3)Са1ЫАс-о1 (3), Кис(0С1-2)Са1{(51-3) [01сЫАс(СС1-4 )Са1 (Р1-4)С1сЫАс(Р1-б) ]Са1ИАс-о1 (4

Таким образом, и при химическом отщеплении 0-связанных цепей в качестве главного углеводного компонента муцина-D также обнаруживали дисахарид Gal(5l-3GalNAc, представляющий собой "коровый" фрагмент 1-ого типа, широко распространенный среди О-гликанов позвоночных.

Учитывая, что кажущаяся молекулярная масса муцина-D составляет 90 кДа, мы провели формальные расчеты на основании данных, приведенных в табл.1 и 2, которые позволяют предположить, что молекула муцина-D содержит около 50 цепей О-гликанов типа Gal [5(1-3)GalNac, присоединенных к остаткам серина или треонина, число которых составляет около 100. Таким образом, приблизительно половина всех возможных сайтов 0-гликозилирования несет дисахарид муцинового типа.

5. Накопление и секреция муцина-D в культуре клеток.

Ранее было показано, что в культуре клеток Dm меченый гли-копротеин накапливается в основном в составе цитоплазматических структур, напоминающих секреторные пузырьки (Kramerov et al., 1986). Однако в культуральной среде не удавалось детектировать меченные [3H]-GlcNac молекулы новосинтезированного гликопротеи-на, что могло быть связано с низким уровнем его секреции или с продолжительным лаг-периодом, который предшествует появлению меченного муцина-D в среде.

Для изучения секреции муцина-D в культуре клеток были использованы полученные моноклональные антитела, узнающие его углеводный эпитоп.

Методом иммуцоблоттинга было показано, что количество муци-на-D, в период с 1-го по 7-ой день культивирования клеток линии Dm, возрастало в расчете на клетку в 4-5 раз (рис.4а), тогда как количество общего белка в расчете на клетку с возрастом культуры практически не менялось. В клетках линии Dm, обработанных гормоном линьки насекомых экдистероном, специфически подавляющим клеточную пролиферацию (Метаковский и др.,1975), заметного накопления муцина-D, выявляемого моноклональными антителами, не происходит (Рис.46).

Количество муцина-D в среде, выявляемое уже через 1 день после

пересева клеток линии Dm , увеличивалось к 7-му дню примерно в 3-4 раза, достигая около 10% его общего количества в клетке (Рис.4в). В присутствии экдисгерона содержание муцина-D в куль-туральной среде не увеличивалось (Рис.4г).

В клетках другой линии, Schneider-2 (S-2), выявляется гликоп-ротеин с меньшей видимой молекулярной массой (80 кДа), чем в линии Dm, что, по-видимому, связано с меньшей степенью гликозили-рования муцина-D в клетках S-2. Накопление гликопротеина в клетках этой культуры происходит в меньшей степени, чем в клетках Dm (Рис.4д). При культивировании клеток линии S-2 в присутствии эк-дистерона, который ингибировал деления клеток в той же степени, что и в линии Dm, по сравнению с контролем наблюдалось значительное (примерно 3-кратное) увеличение содержания гликопротеина в клетках (рис.4е). Таким образом, экдистерон по-разному влиял на накопление гликопротеина в клетках двух различных линий, усиливая его в клетках линии S-2 и подавляя - в линии Dm. В кульгу-ральной среде линии S-2 нам не удалось обнаружить гликопротеин как при культивировании контрольных, так и обработанных гормоном клеток.

Ингибитор секреции, брефельдин А (BFA) избирательно нарушает процессы, происходящие в дисгальных отделах аппарата Гольджи и связанные с внутриклеточной сортировкой и секрецией макромолекул (Klausner et al., 1992; Rothman, 1994). Мы исследовали влияние BFA на биосинтез меченого 3H-GlcNAc муцина-D в клетках линии Dm. В присутствии BFA включение 3H-GlcNAc снижено в 10 раз и обнаруживается лишь в составе фракций с меньшей молекулярной массой (70-80 кДа), соответствующих, по-видимому, не полностью гликози-лированной форме муцина-D (рис.4ж).

6.Накопление и секреция муцина в культурах клеток разных насекомых

С помощью иммуноблоттинга и моноклональных антител мы обнаружили муциновые гликопротеины с кажущейся молекулярной массой 80 кДа, как и в линии клеток S-2, в культурах клеток других видов насекомых (комара - A.aegypti, других видов дрозофилы - D.hydei, D.uirilis). Лишь в клетках B.mori (тутовый шелкопряд) обнаружи-

к л е т к и ш контр оль гормон

дни культивирования:

13 5 7

13 5 7

культуральная среда контр оль гормон

дни культивирования:

1 3 5 7 1

92

Рис.4. Муцин-О, выявляемый иммуноблоттингом в клетках линии От (а,б) и в-2 (д,е), а также в культуральной среде линии От (в,г), без гормона - а,в,д; с гормоном - б,г,в; ж - меченый 3Н-С1сНас гликопротеин из контрольных клеток (1) и обработанных брефельдином А (0,01 мг/мл) (2)

Отмечено положение полос калибровочных белков (в кДа). Нагрузки на дорожку соответствуют: 50 ООО клеток (а,б,д,е,ж); зоо ооо клеток (в,г)

вается гликопротеин с такой же молекулярной массой (90 кДа), как в линии От С.шeIanogгaster. Муциновые гликопротеины со сходными молекулярными массами выявлялись и в культуральных средах большинства исследованных культур клеток разных видов насекомых, что указывает на их способность секретировать муцины. Описанные гликопротеины составляют семейство секретируемых муциновых гликоп-ротеинов, характеризующихся наличием общего эпитопа углеводной природы, который удалялся после обработки О-гликанаэой.

7. Тканевая локализация муцина-Р.

При иммуногистохимическом исследовании срезов личинок,куколок и имаго Л.meJanograster муцин удается выявить в ряде тканей различного происхождения, обладающих способностью к секреции.Так, он был обнаружен в имагинальных дисках, принимающих участие в образовании имагинальной кутикулы и в эпидермальных клетках молодых мух, формирующих эндокутикулу брюшка (рис.5а). Муцин также выявляется в гемоцитах и эноцитах личинки - клетках, способных к активной секреции. На протяжении всего постэмбрионального развития прослеживается его присутствие в цитоплазме жирового тела, которое представляет собой ткань, продуцирующую многие белки секреторной природы. Наиболее интересным является обнаружение муцина-0 в яичниках дрозофилы, в фолликулярных клетках которых он выявляется уже на самых ранних стадиях развития яйцевых камер. По мере развития яйцевых камер муцин-О накапливается в апикальной части фолликулярных клеток,а позднее экзоцитозом попадает в питающие клетки и в яйцеклетку (рис.56).

С помощью моноклональных антител муцин выявлялся в большинстве исследованных типов тканей. Наиболее значительно содержание му-цина-0 (в расчете на мг белка) - в эмбрионах, яичниках, имагинальных дисках и ганглиях личинок (рис.6). Существенно меньшее количество муцина-Б выявляется в жировом теле и семенниках личинки. В большинстве тканей видимая молекулярная масса гликопро-теина составляет около 80 кДа, тогда как в яичниках выявляется дополнительная фракция с молекулярной массой около 65 кДа(рис.б).

Рис.5. Тканевая локализация муцина-О, выявляемая иммуноперокси-дазным окрашиванием тонких срезов с помощью моноклональных антител: а) эпидермальные клетки молодых мух; б)яйцевые камеры, стадия развития яйца 8-10 (1-ооцит,2-фолликулярные клетки, 3-питаю-щие клетки)

Рис.б. Иммуноблот-анализ с помощью моноклональных антител тканевых экстрактов Б. иelanogaster•. 1- яичники взрослых мух, 2- эмбрионы, 3- семенники личинок, 4 - имагинальные диски, 5- жировое тело, 6 - лизат клеток линии Б-2, 7- лизат клеток линии От. Количество белка на дорожку: 1,2 - 0,2 мг; 3-5 - 0,5 мг; 6,7 -0.02 мг клеточных белков

ОБСУЖДЕНИЕ.

Результаты исследования гликопротеина дрозофилы указывают на его сходство с гликопротеинами муцинового типа позвоночных -объектом широкого научного интереса последних лет. Сходство с муцинами прослеживается при анализе аминокислотного состава исследуемого гликопротеина. Согласно расчетам, полипептидная цепь муцина-D состоит из „500 аминокислотных остатков и обогащена, как и у муцинов, треонином и серином (в сумме составляющих 22%) , а также содержит существенное количество остатков пролина (7%) ■ Примерно каждый пятый аминокислотный остаток представлен треонином или серином. Расчеты показывают, что более половины из них несут 0-связанную дисахаридную цепь. в среднем одна углеводная цепь приходится на 8-10 аминокислот.

Углеводный компонент гликопротеина составляет около 40% (у муциновых гликопротеинов позвоночных 40 - 80%) мол.массы. Углеводы могут экранировать значительную часть поверхности белка, что объясняет его относительную устойчивость к действию протеаз. Основной частью углеводного компонента муцина-D являются О-свя-заиные цепи, отщепляемые О-гликаназой. Эти цепи представляют собой дисахарид GalfJ (1-3)GalNac, типичный для муцинов и классифицируемый как " коровый олигосахарид первого типа ". В отличие от гликопротеина дрозофилы, в муцинах млекопитающих дисахарид Gal|3 {1- 3) GalNac обычно включен в состав более сложных и гетерогенных структур - от трисахаридов до 15 - 20 членных разветвленных цепей. Исследуемый нами гликопротеин, вероятно, имеет очень короткие и однородные по размеру дисахаридные цепи, напоминая в этом отношении "антифризный" гликопротеин антарктических рыб, углеводный компонент которого целиком представлен дисахаридом Gal(J(1-3)GalNAc (Osuga & Feeney, 1978).По данным щелочного гидролиза в составе муцина-D обнаружено также небольшое количество 0-связанных монои трисахаридов.

Структура О-гликанов насекомых в настоящее время практически не исследована. Среди единичных работ, касающихся этого вопроса - исследование углеводного компонента рецептора вителлогенина из

клеток яичника саранчи (Hafer & Ferenz, 1991). На основании связывания этого гликопротеина с лектинами был сделан вывод о наличии в его О-гликанах дисахарида Gal-GalNAc. В главном мембранном гликопротеине из культуры клеток комара наряду с N-связанными олигосахаридами были найдены единичные 0-связанные остатки Gal-NAc (Butters it Hudhes, 1981). Эти и другие имеющиеся в настоящее время данные показывают, что изученные О-гликаны насекомых имеют относительно простую структуру и состоят из 1-3 моносахаридных остатков, включая, возможно, остатки сиаловой кислоты (Hafer & Ferenz, 1991) .

По результатам нашего исследования in vitro муцин-D является секретируемым. Использование в данной работе высокочувствительных моноклональных антител против углеводного эпитопа муцина-D позволило показать накопление муцина не только в клетках, но и в культуральной среде линий дрозофилы и других насекомых. Секреторная природа гликопротеина дрозофилы - черта, сближающая его с муцинами и отличающая от муциноподобных мембранно-связанных гли-копротеинов (таких, как гликофорин эритроцитов, лейкосиалин лейкоцитов и др.). Уровень секреции гликопротеина клетками in vitro невысок (около 10 % от его общего количества), что может быть следствием нарушений механизмов секреции при длительном культивировании клеток .

В присутствии ингибитора секреторного пути - брефельдина А, специфически подавляющего процессы посггрансляционной модификации гликопротеинов в дистальной части аппарата Гольджи, углеводный компонент муцина-D, по-видимому, в основном представлен моносахаридом, а не дисахаридом. Это позволяет предположить, что большая часть реакций элонгации гликоэилирования муцина-D протекает в транс-сети аппарата Гольджи, последнем компартменте секреторного пути.

Накопление муцина-D в культуре клеток регулируется гормоном линьки и окукливания насекомых - экдистероном. Экдистерон по разному влияет на накопление гликопротеина в двух клеточных линиях дрозофилы, усиливая его в линиии Schneider-2 и подавляя - в линии Dm. Можно предполагать,что эти клеточные культуры являются производными различных субпопуляций эмбриональных клеток, отличающихся по характеру физиологического ответа на гормональный стимул.

Результаты иммуногисгохимического исследования локализации муцина-D in vivo демонстрируют его "вездесущность" в тканях дрозофилы. Наиболее интересным и неожиданным было обнаружение исследуемого гликопротеина в фолликулярных клетках яичников и его секреция фолликулярными клетками в растущий ооцит в процессе его созревания. Сходный характер локализации родственного гликопротеина в фолликулярных клетках яичников из куколок В.mori (неопубликованные данные Н.Байковой) может указывать на определенную роль этих соединений в оогенезе насекомых.

Исследование тканевой локализации муцина-D, показавшее его присутствие в разных типах клеток дрозофилы, указывает на его возможную полифункциональную роль у насекомых (построение кутикулы, формирование внеклеточного матрикса гемоцитами, оогенеэ). Дальнейшее изучение муцина-D, связанное с попытками клонирования гена белковой части гликопротеина, позволит подойти к изучению генной регуляции его тканевой экспрессии.

ВЫВОДЫ.

1. Из культуры клеток Drosophila melanogaster очищен гликоп-ротеин, устойчивый к протеазам, с видимой молекулярной массой около 90 кДа. Дегликозилирование гликопротеина с помощью 0-гли-каназы снижает его видимую молекулярную массу до 70 кДа, после чего белковый компонент становится чувствительным к протеазам.

2. Основной компонент олигосахаридов гликопротеина идентифицирован как дисахарид Gal(Sl-3GalNAc, типичный для 0-гликанов му-цинового типа позвоночных, в то время как белковый компонент обогащен серином, треонином и пролином. Это позволяет рассматривать исследуемый гликопротеин D.melanogaster как впервые описанный у насекомых гликопротеин муцинового типа (муцин-D).

3. С помощью моноклональных антител показана секреция муци-на-D в культуре клеток дрозофилы, регулируемая гормоном насекомых - экдистероном. Брефельдин А, специфически подавляющий гли-козилирование секретируемых гликопротеинов в дистальной части аппарата Гольджи, блокирует образование зрелой гликозилированной формы муцина-D.

4. С помощью моно- и поликлональных антител показано широкое распространение муцина-D в различных типах клеток и тканей дрозофилы, что может указывать на его мультифункциональную роль у насекомых.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Kramerov A., Mikhaleva Е. Rozovsky Y., Pochehueva Т., Arbats-ky N., Baikova N., Gvozdev V.Insect mucin: biochemical characterization, secretion in cultured cells and tissue localization during Drosophila development. // Abstracts Book XIV FECTS Program Meeting, Lyon, France. 1994 - L12.

2. Крамеров A.A., Арбатский II.П., Розовский Я.М., Почечуева Т.В.., Михалева Е.А., Дружинина Т.Н., Гвоздев В.А, Шибаев В.Н. Гликопротеин из культуры клеток Drosophila melanogaster содержит 0-связанные углеводные цепи типа Gal(f$l-3)GalNAc. // Биохимия. - 1995. - Т. 60, К 5 - С. 805 - 812.

3. Крамеров А.А., Михалева Е.А., Розовский Я.М., Почечуева Т.В., Байкова Н.А., Гвоздев В.А. Тканевая локализация и секреция муцина-D Drosophila melanogaster, регулируемая гормоном линьки и метаморфоза 20-гидроксиэкдизоном. // Онтогенез. - 1997. - Т.28, N 4, С. 279 - 287.

4. Kramerov A.A., MikhaLeva Е.А., Rozovsky Ya.M., Pochehueva T.V.,Baikova N.A., Arsenjeva E.L., Gvozdev V.A. Insect mu-cin-type glycoprotein: immunodetection of the O-glycosylated epitope in Drosophila melanogaster cells and tissues. // Insect Biochemistry & Mol.Biol., - 1997 - Vol.27, N 6, P. 513 -522 .