Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гипотензивное и кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа как физиологических доноров оксида азота

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Гипотензивное и кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа как физиологических доноров оксида азота"

Дроботова Диана Юрьевна

Гипотензивное и кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа как физиологических доноров оксида азота

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 20 И г

2 6 МАЙ 2011

4847806

Работа выполнена в НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ "Российски кардиологический научно-производственный комплекс" Министерств здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

Рууге Энно Куставич

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Тимошин Александр Анатольевич

доктор биологических наук, профессор Азизова Офелия Ахатовна ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России

доктор биологических наук Реутов Валентин Палладиевнч

Учреждение Российской Академии Наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики имени Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится « 2011 г. в

Ю-

час. на заседани

диссертационного совета Д 208.057.01 при Федеральном государственно учреждении «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины) Федерального медико-биологического агентства по адресу: 119435, г. Москва, ул. Малая Пироговская, 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБ России. . ^ 0 Автореферат разослан « / » <Л1-<Я ->\__2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Мурина М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Известно, что такое низкомолекулярное нестабильное соединение, как оксид азота (N0) выполняет роль важного регулятора многих метаболических и физиологических процессов в организме животных и человека. В сердечнососудистой системе N0 является фактором регуляции тонуса сосудов, а также оказывает антиоксидантное действие путём перехвата короткоживущих кислородных радикалов, образующихся во время реперфузии после продолжительного нарушения кровоснабжения, нейтрализации их токсичных вторичных продуктов. Исследование биофизических и биохимических аспектов действия этого соединения является до сих пор актуальной и недостаточно исследованной проблемой.

В клинической практике в качестве лекарственных средств, оказывающих гипотензивное действие, часто используют препараты-доноры N0 на основе органических нитратов (нитроглицерин и его аналоги), которые быстро метаболизируются в организме с выделением N0. Однако, при длительном использовании их развивается привыкание и, как следствие, толерантность к определенной дозе, а вынужденное повышение дозы вводимого препарата может вызывать гиперпродуцирование N0 и приводить к неблагоприятным последствиям. В связи с этим, в настоящее время активно изучаются свойства и возможности применения в клинической практике также других препаратов - доноров N0. К таким препаратам можно отнести динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с различными тиол-содержащими лигандами (цистеин, глутатион, тиосульфат). Такие соединения являются природными соединениями, они формируютсяся в организме эндогенно и способны осуществлять депонирование, внутри- и межклеточный транспорт N0, подавление тромбообразования, эффективное антиоксидантное действие.

Однако остается неясной реакция организма на экзогенное введение ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами (цистеин, глутатион, тиосульфат) при нормальном кровоснабжении и его региональных нарушениях. Комплексное исследование действия таких препаратов в условиях целого организма, в том числе изучение механизмов транспорта, депонирования и распределения комплексов, а также их распада проводятся в данной диссертационной работе.

Целью исследования явилось выяснение механизмов вазодилататорного и антиоксидантного эффектов разных форм ДНКЖ в организме млекопитающих в условиях естественного кровоснабжения, а также при региональной ишемии и репефузии миокарда.

Задачи исследования

1. Изучение содержания N0 в ткани органов (сердце, лёгкое, печень, почка) крыс в условиях естественного кровоснабжения и его изменения в результате введения ДНКЖ и других доноров N0. Оценка интегрального гипотензивного эффекта ДНКЖ и его сравнение с действием других доноров N0.

2. Исследование фармакокинетики ДНКЖ в кровотоке крыс в условиях естественного кровоснабжения, перехода этих комплексов с низко- на высокомолекулярные лиганды (альбумин, гемоглобин), а также процессов их спонтанного или индуцированного распада.

3. Изучение антиоксидантного и кардиопротекторного действия ДНКЖ на модели региональной ишемии миокарда крысы в условиях т ¡¡ш. Исследование влияния этих комплексов на уровни N0 и активных форм кислорода (АФК) в разных зонах миокарда в условиях окислительного стресса. Оценка накопления связанных с белками ДНКЖ в интакгаой и ишемизированной зонах миокарда.

Научная новнзна исследования

1. В диссертационной работе впервые проведено комплексное исследование уровня N0 в интерстиции ткани органов (сердце, печень, почка) с помощью метода микродиализа, а также в лёгких крыс в условиях т яИи.

2. Установлено, что базальные уровни свободного N0 в интерстиции ткани сердца, печени и почки между собой достоверно не различаются. Впервые показано, что введение ДНКЖ вызывает длительное увеличение уровня N0 в ткани органов (сердце, легкое, печень и почка), при этом специфичность действия этого препарата, как донора N0, на эти органы не обнаружена. Похожий эффект увеличения содержания N0 в интерстиции ткани органов был показан также в результате инфузии препарата Изокет (Изосорбитдинитрат), но наиболее заметный рост был установлен для сердца животного.

3. На модели региональной ишемии миокарда впервые показано, что ДНКЖ эффективно накапливаются в зоне риска ткани миокарда, что, вероятнее всего, отражает дополнительное образование этих комплексов в зоне окклюзии. Установлено, что в условиях постишемической реперфузии происходит существенное увеличение скорости распада связанных с белками ДНКЖ в миокарде в результате эффективного перехвата этими комплексами короткоживущих кислородных радикалов.

4. Впервые показано, что введение ДНКЖ в условиях региональной ишемии и реперфузии миокарда оказывает кардиопротекторное действие, подавляя гиперпродуцирование N0 и высокотоксичных кислородных радикалов в окклюдируемой зоне.

Научно-практическая значимость работы

1. В диссертационной работе получены новые данные о влиянии ДНКЖ на уровни N0 в ткани миокарда в условиях нормального кровоснабжения и при его нарушениях, что может быть использовано при создании на основе этого

соединения лекарственных препаратов, обладающих гипотензивным и кардиопротекторным действием. 2. Проведено сравнительное исследование влияния ДНКЖ на уровни N0 в различных органах животного, что позволяет делать оценки влияния этого комплекса на содержание N0 в интерстиции сердца, печени и почки на основании неинвазивной регистрации N0 в выдыхаемом воздухе. Апробация работы.

Основные результаты диссертации доложены на следующих российских и международных научных конференциях: VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006 г); XV Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", (Ялта-Гурзуф, 2007 г); 5-ой Национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека", (Смоленск, 2007 г); VHth International Workshop on EPR (ESR) in biology and Medicine, (Krakow, 2007); XVI Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", (Ялта-Гурзуф, 2008 г); 4-й Крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии", (Судак, 2008 г); Международной научной конференции и восьмого съезда белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, 2008 г); 19th European Meeting on Hypertension (Milan, 2009); 6th National Scientific Practical Conference with International Participation "Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants and human health" (Smolensk, 2009); 5-ой Международной крымской конференции "Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии" (Судак, 2009 г.); 20th European Meeting on Hypertension (Oslo, 2010); III Евразийском Конгрессе по Медицинской Физике и Инженерии "Медицинская физика-2010" (Москва, 2010 г.); 2nd International Conference RAHMS "Recent advances in health and medical sciences" (Paphos, 2010).

Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кадиологии ФГУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здоравоохранения и социального развития Российской Федерации от 16 сентября 2010 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 20 работ. Из них - 5 статей (в том числе 4 - в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК России) и 15 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 25 рисунками. Библиография включает 95 источников, из которых - 20 отечественных и 75 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Во введении рассмотрены актуальность темы диссертационной работы, обоснованы и сформулированы цель и основные задачи исследования.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данной главе кратко описаны физико-химические свойства оксида азота и его метаболическая активность в модельных системах, а также в организме. Его свойства определяются во многом уникальной способностью атомов азота окисляться или восстанавливаться в составе различных соединений. Наличие неспаренного электрона существенно повышает реакционноспособность N0 по отношению к другим радикалам; при этом среднее время жизни N0 в различных

биологических системах составляет от 0,1 с до нескольких суток. Молекулы N0 продуцируются эндогенно ферментативным путем из L-аргинина NO-синтазами (NOS) в присутствии кислорода. Известны 3 изоформы: нейрональная, индуцибельная и эндотелиальная, различающиеся по месту экспрессии и роли в биологических системах организма. В условиях ишемии при дефиците кислорода и развитии ацидоза ткани в продукцию N0 включаются также нитритредуктазные системы, причём восстановление эндогенного нитрита до N0 может быть как ферментативным, так и неферментативным. Ферментативное восстановление нитрита происходит с участием гемоглобина, миоглобина, а также ксантиноксидазы, цитохромоксидазы с и цитохрома Р450.

В организме молекулы N0 выполняют широкий спектр функций: эти молекулы являются эндогенным фактором релаксации гладких мышц; проявляют нейромедиаторную активность, участвуя в межклеточной сигнализации центральной и периферической нервной системы; являются фактором регуляции окислительного фосфоршшрования и образования АФК в митохондриях; регулирует внутриклеточную концентрацию ионов Са+2 и активность ряда ферментов, а также потребление и транспорт кислорода в тканях. Кроме того, они проявляют антиоксидантную активность в условиях окислительного стресса посредством перехвата АФК и их вторичных продуктов в клетках и тканях. В основе механизма гипотензивного действия N0 лежит активация гуанилатциклазы путём изменения конформации ее гемового центра при связывании с N0, что далее и обеспечивает вазодилататорный эффект.

Необходимо отметить, что NO оказывает дихотомическое действие в сердечно-сосудистой системе. Так, при низких концентрациях N0 проявляет цитостатическую активность, а при высоких - способствует необратимому повреждению кардиомиоцитов, что является следствием образования избытка пероксинитрита, способного привести к генерации высокотоксичных гидроксильных радикалов, вызывающих необратимые повреждения ткани органов. Поэтому к наиболее перспективным и безопасным препаратам-донорам N0

необходимо отнести естественные депонированные формы N0, введение которых в организм не приводит к быстрому высвобождению большого количества свободного N0, способного привести к неблагоприятным воздействиям.

Для защиты ткани от повреждений в условиях временного нарушения и восстановления кровоснабжения также широко применяются препараты-доноры N0, способные оказывать вазодилататорное и антиоксидантное действия. Однако, к настоящему времени известны также данные о том, что эффективное защитное действие оказывают ингибиторы N0 синтаз, в результате чего достигается подавление гиперпродуцирования N0 в условиях ишемии и постишемической реперфузии. Поэтому в качестве перспективного защитного средства в условиях нарушения и восстановления кровоснабжения представляется целесообразным применение природных депонированных форм N0, в результате чего будут достигаться вазодилататорный и антиоксидантный эффекты, но при этом не будет происходить образования избытка свободного N0.

Для этого в настоящее время активно изучаются динитрозильные комплексы железа (ДНЮК) с тиол-содержащими лигандами (Уашп, 2009). Известно, что такие комплексы оказывают длительный гипотензивный эффект (Ьакоткт е1 а1. 2007), они способны подавлять накопление высоких концентраций пероксинитрита (Лобышева и др., 1999), а также перехватывать супероксидные радикалы (51шшасу е1 а1., 2008). Изучению действия ДНЮК на модели целого организма в условиях естественного кровоснабжения и при его нарушениях посвящена данная диссертационная работа.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные. Работа проводилась на нормотензивных крысах линии Wistar (самцы массой 350-400 г).

Реагенты. Для регистрации N0 в качестве спиновой ловушки применялись комплексы Ре3+-(МГД)г, а для оценки уровня кислородных радикалов — спиновая ловушка 5,5-диметил-1-пирролин-Ы-оксид (ОМРО). Комплексы ДНЮК с

тиосульфатом были синтезированы в Институте проблем химической физики РАН (г. Черноголовка). ДНКЖ с лигандом глутатионом синтезированы на экспериментальном производстве медико-биологических препаратов ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития РФ по методике, разработанной проф. А.Ф.Ваниным. Другие реагенты были получены от фирм Sigma и АИпсЬ (США). Исследование действия ДНКЖ в условиях естественного кровообращения. В первой части работы работы проводилось комплексное исследование действия ДНКЖ с тиосульфатом, вводимого внутривенно при нормальном кровоснабжении организма. В ходе работы изучались уровни N0 в интерстиции ткани сердца, печени, почки в условиях т причём как в интактных условиях, так и после инъекции исследуемого препарата (концентрация 2,5 мМ, доза введения в физиологическом растворе — 1,0 мл). Изменение уровня N0 в ткани органов оценивали с использованием метода микродиализа (рис. 1). Для этого в исследуемые органы имплантировали диализные волокна (активная длина 6-11 мм, внешний диаметр 0,25 мм, проницаемость пор - до 5 кДа). Через волокна пропускали раствор спиновой ловушки Ре3+-(МГД)2, в результате взаимодействия которой с N0 происходило образование спиновых аддуктов МО-Ре-(МГД)2, регистрируемых методом ЭПР. Уровень N0 в ткани исследуемых органов оценивали исходя из амплитуды сигналов аддуктов N0 в диализате. Для оценки уровня N0 в ткани лёгких в ходе всех опытов с помощью спиновой ловушки Ре3+-(МГД)2 проводилась его регистрация в выдыхаемом воздухе с использованием проточной кюветы, причём как до, так и после введения препарата ДНКЖ. Кроме регистрации уровня N0, в ходе работы для регистрации гипотензивного эффекта ДНКЖ проводился также мониторинг артериального давления (АД), а также определялось содержание ДНКЖ в цельной крови после его введения. В других экспериментах изучалось действие стандартного препарата Изокет (Изосорбитдинитрат, водорастворимый аналог нитроглицерина) на уровни N0 в ткани органов. Данный препарат (0,1% раствор) также вводился внутривенно со скоростью 15 мкл/мин, начало его введения осуществлялось через 40 мин после

начала эксперимента и продолжалось далее в течение 100 мин, т.е. до конца эксперимента. Оценка уровня N0 в органах и мониторинг АД в этих экспериментах проводились по стандартной методике.

Исследование защитного действия ДНКЖ в условиях нарушения кровоснабжения миокарда. В другой части работы действие ДНКЖ исследовалось на модели региональной ишемии миокарда, создаваемой путём 40-минутной окклюзии коронарной артерии, и постишемической реперфузии ишемизированной зоны сердечной мышцы. Для оценки уровня N0 и короткоживущих кислородных радикалов, как в интактной, так и в ишемизируемой зонах миокарда, применялся метод микродиализа (рис. 1) и использовались спиновые ловушки. Для регистрации N0, как и в первой части работы, в качестве ловушки применялись комплексы ионов железа и МГД (Ре3+-(МГД)г), а для регистрации уровня кислородных радикалов применялась спиновая ловушка БМРО. Парамагнитные спиновые ад дукты в образцах диализата во всех случаях регистрировались методом ЭПР.

В данной части работы всех животных произвольным образом делили на две экспериментальные группы - контрольных и получающих ДНКЖ. Введение ДНКЖ с лигандом глутатионом (3,1 мкмоль/кг массы тела в 1,0 мл физиологического раствора) проводилось внутривенно одновременно с началом 40-минутной окклюзии. Контрольным крысам в этот период вводилось эквивалентное количество физиологического раствора. Внутри каждой экспериментальной группы часть опытов проводилась с использованием ловушки Ре3+-(МГД)2, а другая часть -с применением БМРО. В ходе всех опытов проводились также мониторинг АД и оценка размеров инфарктной зоны. Кроме того, в части экспериментов с применением ДНКЖ диализ не проводился, но после введения стандартной дозы препарата и начала окклюзии в разных опытах на 2-й и 40-й минутах ишемии, а также 60-й минуте реперфузии вырезались и замораживались образцы ткани зоны риска и интактной зоны миокарда, а также печени и цельной крови животного.

Далее полученные образцы исследовались методом ЭПР.

Рис. 1. Общая схема микродиализа сердца:

1 - катетер для регистрации АД; 2,3 -шприцы с раствором спиновой ловушки, проходящим через интактную и ишемизированную области сердца, соответственно; 4,5 - сбор диализата, содержащего спиновые аддукты; 6 - окклюдер на передней нисходящей коронарной артерии для создания региональной ишемии.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие ДНКЖ с тиосульфатом в условиях естественного кровоснабжения.

В первой части диссертационной работы исследовались вазодилататорный эффект внутривенного введения ДНКЖ, а также его влияние на уровни свободного N0 в ткани органов в условиях нативного кровоснабжения.

Мониторинг содержания ДНКЖ в цельной крови животных проводился методом ЭПР в течение всех опытов. Характерные спектры этих парамагнитных комплексов и кинетика их содержания представлены на рис. 2 (А, Б). Исходя из формы спектров ДНКЖ (рис. 2А) видно, что сразу после введения в кровоток происходит их перенос на белковые тиол-содержащие лиганды (альбумин,

гемоглобин). На рис. 2Б представлена кинетика содержания данных комплексов в крови. Из рисунка видно, что после введения препарата амплитуда сразу же достигает своего максимального значения, после чего монотонно убывает в течение всего опыта, что является следствием разложения ДНКЖ с высвобождением N0, а также их выхода из кровотока в ткань органов.

Для оценки гипотензивного действия ДНКЖ в ходе опытов проводился мониторинг АД. На рис. 3 представлена кинетика изменений среднего АД в результате введения ДНКЖ с тиосульфатом. Видно, что в этом случае регистрировался существенный (35-40 % снижение АД с последующим частичным восстановлением) и пролонгированный гипотензивный эффект, что свидетельствует об эффективном действии ДНКЖ, как вазодилататора. На том же рисунке представлены аналогичные данные о действии на АД стандартного препарата Изокет, который вводился непрерывно начиная с 40-й минуты и до конца опыта. Из рисунка видно, что непрерывная инфузия Изокета приводила к аналогичному вазодилататорному эффекту.

В другой части работы изучалось влияние инъекции ДНКЖ, а также инфузии препарата Изокет на уровень свободного N0 в ткани органов. С этой целью применялся метод микродиализа, который позволял наименее травматично оценивать уровень свободного N0 в интерстиции ткани исследуемых органов. Для регистрации N0 в диализате применялась спиновая ловушка Ре3+-(МГД)2. Контрольные эксперименты показали, что образование спиновых аддуктов МО-Ре-(МГД)2 в диализных волокнах происходит вследствие взаимодействия свободного N0 со спиновой ловушкой Ре3+-(МГД)2.

На рис. 4 и 5 показаны кинетики содержания спиновых аддуктов N0 в образцах диализата, соответствующих всем исследуемым органам. Из рисунков видно, что в отсутствии экзогенных доноров базальный уровень N0 в сердце, печени и почке не различался в пределах стандартной ошибки. Как следует из рис. 4, уровень N0 увеличивался и выходил на плато в ткани всех этих органов уже через 20 мин после введения ДНКЖ.

310 315 320 325 330 Магнитное поле, мТл

40 60 80 100 120 140 Время, мин

Рис. 2. Сигналы ЭПР ДНКЖ с высокомолекулярными лигандами через 4 и 100 мин после инъекции препарата (А) и кинетика содержания ДНКЖ в цельной крови (Б). /40 мин - инъекция ДНКЖ с тиосульфатом/

100 80

г? 60

о.

и

5 40 20 0

Инъекция ДНКЖ или начало инфузии ИЗОКЕТ

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Время, мин

Рис.3. Падение и дальнейшее восстановление среднего значения АД в результате введения Изокета и ДНКЖ с тиосульфатом.

0,5-

0,0-

-■-СЕРДЦЕ -•-ПЕЧЕНЬ -А- ПОЧКА

20 40

60 80 100 Время, мин

120 140

Рис. 4. Кинетики концентрации ЫО-Ре-МГД2 в образцах диализата, соответствующих сердцу, печени и почке крысы. Введение препарата ДНКЖ с тиосульфатом - 40 мин после начала сбора образцов диализата.

г 2

2,52,01,5-

1.0-

§ 0,5-

0,0-

-■- СЕРДЦЕ -•- ПЕЧЕНЬ -А-ПОЧКА

20 40 60 80 100 120 140 ВРЕМЯ,мин

Рис. 5. Кинетики концентрации МО-Ре-МГД2 в образцах диализата, соответствующих сердцу, печени и почке крысы. Начало введения препарата Изокет - 40 мин после начала сбора образцов диализата.

Аналогичная кинетика содержания аддуктов N0 в диализате была получена также для препарата Изокет (рис. 5). Для оценки уровня N0 в ткани лёгких в ходе экспериментов проводилась регистрация оксида азота в выдыхаемом воздухе. Для этого использовали проточную кювету с растовором спиновой ловушки, через который пропускали выдыхаемый воздух, после чего методом ЭПР регистрировали образование спиновых аддуктов N0 в этом растворе. Установлено, что введение как ДНКЖ, так и Изокета приводило к повышению уровня N0 в выдыхаемом воздухе, причем степень увеличения близка к значениям, полученным при анализе трех органов (рис. 4 и 5). В результате введения ДНКЖ и Изокета уровень N0 в выдыхаемом воздухе через час достигал плато и в последующие 40 мин достоверно не изменялся.

На рис. 6 представлены значения степени увеличения содержания аддукта N0 в диализате и растворе, через который проходил выдыхаемый воздух, вызванного введением ДНКЖ (левая сторона) и Изокета (правая сторона).

Рис. 6. Увеличение концентрации в образцах диализата,

соответствующих сердцу, печени и почке крысы, а также в растворе Ре2+- МГДг после пропускания через него выдыхаемого из лёгких воздуха в результате введения в организм ДНКЖ с тиосульфатом или Изокета. [КО-Ре2+МГД2]исх. -усреднённые значения содержания аддукта N0 за период 0-40 мин (т.е. до введения донора N0); [ЫО-Ре2+МГД2]К0„ - усреднённые значения содержания аддукта N0 за период 100-140 мин. 1-сердце, 2 - печень, 3 - почка, 4 - лёгкое.

Из рис. 6 видно, что в результате введения ДНКЖ в интерстиции ткани всех исследуемых органов наблюдался рост уровня N0, причём данный эффект был приблизительно одинаков для всех органов. Следовательно, введение препарата ДНКЖ приводило к росту уровня свободного N0 в интерстиции ткани органов, причём его действие для разных органов было неизбирательным. В результате инфузии Изокета наиболее значительное по сравнению с базальным увеличение уровня N0 наблюдалось для сердца. Возможно, что этот факт - результат более избирательного действия Изокета на сердечную мышцу. Необходимо отметить, что полученная степень увеличения уровня N0 отражает рост свободного N0, тогда как значительная часть пула ДНКЖ сохраняет в себе N0 в депонированной форме в течение длительного времени.

Защитное действие ДНКЖ в условиях региональной ишемии миокарда

Во второй части работы изучалось кардиопротекторное действие ДНКЖ с глутатионом (ДНКЖ-Глт), вводимого внутривенно одновременно с началом 40-минутной региональной ишемии миокарда. Выбор в качестве лиганда глутатиона был сделан в связи с тем, что сам глутатион способен оказывать антиоксидантное и кардиопротекторное действие.

В ходе экспериментов проводили мониторинг среднего АД. В контрольной группе (введение физиологического раствора без ДНКЖ) региональная ишемия и последующая реперфузия в левом желудочке не приводили к достоверным изменениям АД и ЧСС, что свидетельствовало о том, что ишемия носила локальный характер и не оказывала заметное влияние на показатели общей гемодинамики организма. В экспериментальной группе (введение ДНКЖ-Глт одновременно с началом ишемии) АД снижалось до уровня 51±7 % от исходного на 2-ой минуте окклюзии коронарной артерии. Далее, к концу ишемии АД восстанавливалось до уровня 58±5 %, а в конце реперфузии - уже до значений 73±5 % от исходного уровня. Такой ход кинетики АД отражал существенный и длительный гипотензивный эффект данного препарата. Кроме того, было

установлено, что введение ДНКЖ-Глт способно органичивать размер инфарктной зоны на левом желудочке миокарда, а также подавлять нарушения ритма сердца, что свидетельствует о том, что в данных экспериментальных условиях ДНКЖ способны оказывать эффективное гипотензивное и кардиопротекторное действие.

При исследовании действия ДНКЖ-Глт, как депонированной формы N0 и антиоксиданта, проводилось комплексное избирательное исследование уровней N0 и АФК в миокарде в условиях региональной ишемии и реперфузии. На рис. 7 представлены кинетики содержания спинового аддукта БМРО-ОН в ишемизируемой и интактной зонах миокарда крыс из контрольной группы, что отражает уровень кислородных радикалов в исследуемых областях. Из рис. 7 видно, что в начале постишемической реперфузии существенно возрастало содержание БМРО-ОН в диализате (в 1,3 раза), что означало соответствующее увеличение уровня АФК в интерстиции ишемизируемой зоны миокарда, который далее оставался повышенным до конца эксперимента. На рис. 8 представлены кинетики содержания спинового аддукта ЫО-Ре-МГД2, соответствующие ишемизируемой и интактной зонам миокарда для контрольной группы животных, что отражает уровень N0 в исследуемых областях.

0,40

Е 0,35 2 £

9 о,зо о о. Е

а 0,25 0,20

Рис. 7. Кинетики содержания аддукта БМРО-ОН в образцах диализата, соответствующих ишемизируемой и интактной областям миокарда в контроле.

Время, мин

Время, мин

Рис. 8. Кинетики содержания аддукта в образцах диализата в

ишемизируемой и интактной областях миокарда в контроле.

Из этого рисунка видно, что уровень N0 в ишемизируемой области возрастал в 1,7 раз с началом ишемии, затем снижался к началу реперфузии, но оставался повышенным до конца эксперимента. Из рис. 7 и 8 также видно, что в интактной зоне никаких изменений в уровнях АФК и N0 в течение всего опыта обнаружено не было. Следовательно, в результате окклюзии коронарной артерии в участке миокарда развивалась ишемия, о чём свидетельствовало резкое повышение уровня N0, АФК и нарушение ритма сердца. В то же время, эти шпемические нарушения носили лишь локальный характер и никак не влияли на соседние области миокарда, о чём свидетельствовал постоянный уровень N0 в течение всего эксперимента.

В другой экспериментальной группе после внутривенного введения ДНКЖ-Глт одновременно с началом ишемии уровень АФК в начале реперфузии повышался примерно в 1,13 раз, а затем постепенно снижался к концу эксперимента (рис. 9), что означало, что генерация АФК в этом случае была существенно слабее, чем в контрольной группе (рис. 7). Следовательно, в результате введения ДНКЖ-Глт инициировалось существенное подавление роста уровня АФК во время постишемической реперфузии. Вероятно, что такой эффект

был обусловлен эффективным перехватом супероксидных радикалов молекулами ДНКЖ с образованием нетоксичных вторичных продуктов.

Из рис. 10 видно, что после внутривенного введения ДНЮК-Глт одновременно с началом ишемии в диализате из ишемизируемой области миокарда регистрировалось некоторое увеличение содержания адцукта N0, но существенно более слабое, по сравнению с животными из контрольной группы (рис. 8). Полученные данные могли свидетельствовать о том, что введение этого комплекса способно оказывать защитное действие, предохраняя ткань от избытка N0 и его токсичных метаболитов, образующихся в результате региональной ишемии. В интактной области также наблюдалось увеличение уровня N0, что было связано с распадом ДНКЖ и высвобождением N0 в ткань миокарда. Таким образом, ДНКЖ, вводимый внутривенно перед началом региональной ишемии, способен оказывать протектирующее действие, вследствие чего подавляется вызванное ишемией гиперпродуцирование короткоживущих кислородных радикалов и N0 в ткани миокарда.

0,40

Е 0,35

§0,30

о

си

о 0,25 0,20

Рис. 9. Кинетики содержания аддукта ОМРО-ОН в областях диализате в ишемизируемой и интактной областях миокарда в группе животных, получавших ДНКЖ-Глт.

—▼—интактная зона —•—ишемизир. зона

+ ДНКЖ-Глт окклюзия |

20 40 60 80 100 120 140 Время, мин

■—а. с[

1,6, 1,51,41,31,2 1,11,00,90,80,70,60,5-

—Т— интактная зона —ишемизир. зона

I

?

| + ДНКЖ-Глт | окклюзия

20

40

60

80 100 120 140

Время, мин

Рис. 10. Кинетики содержания аддукта N0 -Ре2+-МГД2 в образцах диализата, соответствующих ишемизируемой и интактной областям миокарда в группе животных, получавших ДНКЖ-Глт.

Однако, на основании полученных данных не представляется возможным объяснения эффекта ДНКЖ на уровень N0 во время ишемии. Поэтому в данной работе проводились также специальные серии экспериментов, в которых изучалось содержание связанных с белками ДНКЖ в различных областях сердечной мышцы (ишемизируемой и интактной) после внутривенного введения ДНКЖ-Глт во время региональной ишемии и реперфузии.

На рис. 11 показано содержание ДНКЖ в ткани сердца и печени на 2-ой, 40-ой минутах ишемии, а также на 60-ой минуте реперфузии. Из этого рисунка видно, что в результате инъекции ДНКЖ его содержание в исследуемых органах сразу же достигало своих максимальных значений и далее постепенно снижалось. При этом его содержание в миокарде было выше, чем в печени, что отражало более эффективное накопление этих комплексов в ткани сердечной мышцы после введения препарата.

Рис. 11. Содержание ДНКЖ в миокарде крысы (ЗР - зона риска, ИЗ - интактная зона) и печени в ходе региональной ишемии и реперфузии.

Из рис. 11 также видно, что как в начале, так и в конце ишемии средние значения содержания ДНКЖ, соответствующие зоне риска, были несколько выше по сравнению с интактной зоной миокарда. Такой эффект мог быть связан с тем, что в ишемизируемой зоне в условиях гипоксии распад введённого ДНКЖ происходит медленнее, чем в интактной области. При этом также был возможен и дополнительный синтез ДНКЖ в области окклюзии. Нами также было показано, что в ходе реперфузии скорость уменьшения содержания ДНКЖ в ишемизированной и интактной зонах заметно усиливалась, причём более существенный эффект наблюдается для зоны риска. Такие изменения легко объяснить, учитывая, что ДНКЖ способны эффективно разлагаться в результате взаимодействия с короткоживущими супероксидными радикалами, генерация которых усиливается во время реперфузии. Из рис. 11 также видно, что в ткани печени после введения ДНКЖ содержание этих комплексов также сразу достигало

своего максимального значения и далее постепенно уменьшалось. Следовательно, полученные нами данные указывают на то, что после внутривенного введения препарата ДНКЖ происходило его депонирование в ткани сердца и печени, причём в зоне острого нарушения кровоснабжения миокарда этот эффект был несколько более выражен. В условиях окислительного стресса эти комплексы, по-видимому, оказывали антиоксидантное действие, перехватывая короткоживущие АФК, в результате чего происходил их сравнительно быстрый распад в условиях реперфузии. В ткани печени наблюдалось депонирование меньшего количества ДНКЖ и существенно более медленное уменьшение их содержания с выделением N0. Можно предположить, что антиоксидантные свойства ДНКЖ с глутатионом во многом обуславливает его кардиопротекторное действие. При этом регистрируемое в данных экспериментальных условиях ускорение распада этого комплекса во время реперфузии может рассматриваться как следствие увеличения уровня кислородных радикалов в данной области организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении подведены итоги работы, сделан вывод о том, что ДНКЖ, как природная форма депонирования N0, обладает эффективным и безопасным действием, как донор N0 и кардиопротектор.

ВЫВОДЫ

1. После внутривенного введения динитрозильных комплексов железа с низкомолекулярными лигандами происходит быстрый перенос Рс(ЫО)2 групп на белковые лиганды в крови и ткани органов. Последующий медленный распад этих комплексов происходит с выделением оксида азота, приводящего к появлению длительного гипотензивного эффекта.

2. Установлено, что базальные уровни свободного оксида азота в интерстиции ткани сердца, печени и почек между собой не различаются.

3. Введение динитрозильных комплексов железа вызывает длительное увеличение уровня N0 в ткани органов (сердца, легких, печени и почек). При этом специфичность действия препарата, как донора N0, на эти органы не проявляется.

4. На модели региональной ишемии миокарда показано, что ДНКЖ эффективно накапливаются в зоне риска. Это, вероятнее всего, отражает дополнительное образование этих комплексов в зоне окклюзии.

5. При реперфузии зоны окклюзии происходит существенное увеличение скорости распада динитрозильных комплексов железа в миокарде. Это может свидетельствовать об эффективном перехвате данными комплексами активных форм кислорода.

6. Установлено, что в результате введения динитрозильных комплексов железа происходит подавление вызванных ишемией гиперпродукции оксида азота и активных форм кислорода в окклюдируемой зоне.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ Статьи

1. Тимошин А.А., Цкитишвили О.В., Дроботова Д.Ю., Студнева И.М., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К., Писаренко О.И. Взаимосвязь образования оксида азота с повреждениями кардиомиоцитов при региональной ишемии и реперфузии сердца крысы. // Биофизика. 2008. - Т.53, № 4. - С. 679-683.

2. Timoshin А.А., Drobotova D.Yu., Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Vanin A.F. Estimation of nitric oxide level in vivo by microdialysis with water-soluble iron-N-methyl-D-dithiocarbamate complexes as NO traps: A novel approach to nitric oxide spin trapping in animal tissues. // Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2008. - V.19, № 4. - P. 338-344.

3. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Цкитишвили O.B., Серебрякова Л.И., Писаренко О.И., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Защитное действие динитрозильных комплексов железа с глутатионом в условиях региональной ишемии миокарда крыс: исследование методом микродиализа. // Доклады Академии Наук (Раздел "Биофизика"). 2010. - Т.432, № 3. - С. 416 - 419.

4.А.А.Тимошин, О.И.Писаренко, О.В.Цкитишвили, Л.И.Серебрякова, И.М.Студнева, Д.Ю.Дроботова, Э.К.Рууге, А.Ф.Ванин. Динитрозильные комплексы железа с глутатионом в ткани миокарда крысы в условиях регионального

нарушения и восстановления кровоснабжения сердечной мышцы. // Биофизика. 2010 - Т.55, № 6. - С. 1099-1107.

5. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Лакомкин B.JI., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Влияние экзогенных доноров на уровень оксида азота в органах животных in vivo: исследование методом микродиализа с использованием спиновых ловушек. // Сборник статей "Проблемы биологической физики" (Под ред. В.А.Твердислова). Издательство "УРСС", Москва. 2010. - С. 107-124.

Тезисы докладов

1. Тимошин A.A., Орлова Ц.Р., Дроботова Д.Ю., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Изучение динитрозильных комплексов железа в организме млекопитающих методом ЭПР. // Тезисы докладов VII Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 25-26 октября 2006 г). С. 257-259.

2. Тимошин A.A., Орлова Ц.Р., Дроботова Д.Ю., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Содержание оксида азота в нормальных условиях и при региональной ишемии миокарда. // Материалы XV Международной конференции и дискуссионного научногоклуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2007 г). С. 401-403.

3. Тимошин A.A., Цкитишвили О.В., Дроботова Д.Ю., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Исследование содержания оксида азота в ткани миокарда крысы в условиях региональной ишемии. // Сборник трудов 5-й национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (г. Смоленск, 18-22 сентября 2007 г.). С. 189-191.

4. Timoshin A.A., Drobotova D.Yu., Gubkina S.A., Vanin A.F., Ruuge E.K. Effect of NO donors and acute regional cardiac ischemia on NO level in rat organs: an EPR study. // Abstracts of Vllth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (October 3-6,2007, Krakow, Poland). P. 76.

5. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Губкина C.A., Цкитишвили О.В., Серебрякова О.В., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Исследование динитрозильных комплексов железа в организме млекопитающих методом ЭПР. // Труды XVI Международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая - 9 июня 2008 г). С. 384-386.

6. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Губкина С.А., Орлова Ц.Р., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа — доноры NO и антиоксиданты в организме млекопитающих. // Тезисы докладов 4-й Крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии", (Украина, Крым, Судак, 31 мая-9 июня 2008 г). С. 50.

7. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Губкина С.А., Орлова Ц.Р., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Парамагнитные динитрозильные

комплексы железа в организме млекопитающих. // Сборник статей Международной научной конференции и восьмого съезда белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25-27 июня 2008 г). Ч. 2. С. 143-145.

8. A.A.Timoshin, V.L.Lakomkin, O.V.Tskitishvili, L.I.Serebryakova, D.Yu.Drobotova, A.F.Vanin Hypotensive and cardioprotective actions of Dinitrosyl-Iron Complexes with thiol-containing ligands. // Abstracts of the 19th European Meeting on Hypertension (Milan, Italy, June 12-16,2009). 2009. P. S295-S296.

9. Timoshin A.A., Drobotova D.Yu., Tskitishvili O.V., Serebryakova L.I., Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Vanin A.F. Hypotensive and cardioprotective action of Dinitrosyl-Iron Complexes with thiol-containing ligands in animal organism. // Abstracts of the 6th National Scientific Practical Conference with International Participation "Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants and human health" (Smolensk, September 14-18,2009). 2009. P. 73-74.

10. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Цкитишвили O.B., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа в условиях региональной ишемии миокарда. // Тезисы докладов 5-й Международной крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Судак, Крым, Украина, 21-30 сентября 2009 г.). 2009. С. 62.

11. Timoshin А.А., Drobotova D.Yu., Lakomkin V.L., Tskitishvili O.V., Serebryakova L.I., Vanin A.F. Dinitrosyl-Iron Complexes as hypotensive and cardioprotective substances in mammalian organism. // Abstracts of the 20th European Meeting on Hypertension (Oslo, Norway, June 18-21, 2010) //Journal of Hypertension. 2010 June. V. 28 e-Supplement A. P. el96.

12. A.A. Тимошин, Д.Ю. Дроботова, O.B. Цкитишвили, Л.И. Серебрякова, Э.К. Рууге, А.Ф.Ванин Защитное действие динитрозильных комплексов железа в условиях региональной ишемии и реперфузии миокарда крыс. Исследование методом ЭПР. // Материалы III Евразийского Конгресса по Медицинской Физике и Инженерии "Медицинская физика-2010" (Москва, 21-26 июня 2010 г.). С. 365-367.

13. Д.Ю. Дроботова, А.А. Тимошин, В.Л. Лакомкин, Э.К. Рууге, А.Ф. Ванин Динитрозильные комплексы железа, как природные физиологические формы оксида азота. Исследование методом ЭПР. // Материалы III Евразийского Конгресса по Медицинской Физике и Инженерии "Медицинская физика-2010" (Москва, 21-26 июня 2010 г.). С. 229-230.

14. Timoshin А.А., Drobotova D.Yu., Tskitishvili O.V., Serebryakova L.I., Ruuge E.K., Vanin A.F. Cardioprotective action of Dinitrosyl-Iron Complexes with glutathione in mammalian organism. // Abstracts of 2nd International Conference RAHMS "Recent advances in health and medical sciences" (Paphos, Cyprus, 8-12 July, 2010). 2010. P. 52.

15. Drobotova D.Yu., Timoshin A.A., Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Vanin A.F. Effect of DNIC injection on NO level in rat organs during native blood circulation. // Abstracts of 2nd International Conference RAHMS "Recent advances in health and medical sciences" (Paphos, Cyprus, 8-12 July, 2010). 2010. P. 66.

Подписано в печать: 07.05.11 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 769735 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дроботова, Диана Юрьевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Оксид азота и его роль в организме.

1.2. Оксид азота в сердечно-сосудистой системе.

1.3.ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами, как физиологические доноры N0.

1.4. Вазодилататорное и кардиопротекторное действия ДНКЖ.

1.5.Перспективы применения ДНКЖ в терапевтической практике.

Постановка задачи.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Приборы и оборудование.

2.3. Статистический анализ.

2.4. Методы исследования.

2.4.1. Исследование действия ДНКЖ в условиях естественного кровообращения

2.4.2. Исследование защитного действия ДНКЖ в условиях нарушения кровоснабжения миокарда.

2.4.3. Спектроскопия ЭПР.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Действие ДНКЖ с тиосульфатом в условиях естественного кровоснабжения.

3.1.1. Регистрация N0 в интерстиции ткани органов методом микродиализа.

3.1.2. Кинетика содержания ДНКЖ в крови после внутривенного введения.

3.1.3- Определение базалъного уровня N0 в ткани органов.

3.1.4. Влияние экзогенных доноров N0 на его содержание в интерстиции ткани органов.

3.2. Защитное действие ДНКЖ в условиях региональной ишемии миокарда.

3.2.1. Регистрация ишемических повреждений в зоне окклюзии и защитного действия ДНКЖ с глутатионом.

3.2.2. Исследование антиоксидантного эффекта ДНКЖ с глутатионом в условиях региональной ишемии миокарда.

3.3. Исследование содержания ДНКЖ в крови и ткани органов.

3.3.1. Сигналы ДНКЖ в крови и ткани органов в интактных условиях.

3.3.2. Содержание ДНКЖ в крови и ткани органов в условиях окислительного стресса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гипотензивное и кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа как физиологических доноров оксида азота"

На протяжении десятилетий исследования свойств оксида азота (N0) показано, что это низкомолекулярное нестабильное соединение играет роль важного регулятора многих метаболических и физиологических процессов в организме. Выяснение биофизических и биохимических аспектов действия этого соединения является до сих пор актуальной и недостаточно исследованной проблемой.

Одним из важнейших вопросов остается роль N0 в работе и регуляции сердечно-сосудистой системы. Имеются многочисленные данные о проявлении вазодилататорной активности путем регуляции тонуса сосудов, а также уменьшения последствий ишемии органов и тканей, перехвата супероксидных радикалов, появляющихся во время реперфузии при насыщении ткани миокарда кислородом после продолжительного нарушения кровоснабжения.

Механизмы образования N0 (как ферментативные, так и неферментативные) в условиях нарушения и восстановления кровоснабжения органов активно исследуются в настоящее время. Кроме того, хорошо известно действие N0 на митохондриальную дыхательную цепь и на стенки сосудов. Имеются многочисленные доказательства дихотомического действия N0 при его различном содержании в ткани. В последнее время считается, что такие факторы, как продолжительность действия гипоксии, определяют — снижаются ли последствия ишемии после восстановления кровотока или произойдет стимуляция окислительного стресса.

В клинической практике дня лечения различных патологий сердечко-сосудистой системы используют препараты на основе доноров N0, которые быстро разлагаются в организме с выделением N0. В частности, к таким препаратам относятся широко известные лекарственные средства на основе органических нитратов, например, нитроглицерин и его аналоги. Однако в большинстве случаев при длительном использовании развивается привыкание и, как следствие, толерантность к определенной дозе, а вынужденное повышение дозы вводимого препарата может приводить к неблагоприятным последствиям.

Одновременно с тпироким использованием нитроглицерина в настоящее время изучаются свойства и возможности применения в клинической практике также других препаратов — доноров N0. К таким соединениям относятся динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с различными лигандами (цистеин, глутатион, тиосульфат). Эти соединения с тиол-содержащими лигандами, характеризующиеся в растворе ионнои формой {(К^РелЫО'Ы , могут формироваться в организме по Ь-аргинин-зависимому пути и накапливаться в клетках. Наряду с другой формой эндогенных соединений N0 - Б-нитрозотиолами - ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами обеспечивают защиту N0 в организме животных и человека от деструктивного действия на них анионов супероксида. Эта защита обеспечивает депонирование N0, а также его внутри- и межклеточный транспорт в организме. Вместе с тем, ДНКЖ как доноры N0 способны воздействовать на разнообразные физиологические процессы, вызывая гипотензию, расслабление кровеносных сосудов, подавление тромбообразования и т.д. Кроме того, эти комплексы способны сказывать антиоксидантное действие, нейтрализуя токсичные вторичные продукты перекисного окисления липидов. В результате спонтанного или индуцированного распада ДНКЖ в организме происходит высвобождение N0, ионов двухвалентного железа и 8-нитрозотиолов. Однако остается неясной реакция организма на экзогенное введение ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами при нормальном кровоснабжении и его региональных нарушениях.

Эффективное терапевтическое действие таких соединений связано с их вызодилататорным и антиоксидантным эффектами, а также со способностью являться пролонгированным источником ионов железа. Комплексное исследование действия таких препаратов как в модельных системах, так и в организме, а также изучение механизмов транспорта, депонирования и распределения комплексов в ткани органов проводятся в данной диссертационной работе.

Цель исследования

Выяснение механизмов вазодилататорного и антиоксидантного эффектов разных форм ДНКЖ в организме млекопитающих в условиях естественного кровоснабжения, а также при региональной ишемии миокарда.

Задачи исследования

1. Изучение содержания N0 в ткани органов (сердце, лёгкое, печень, почка) крыс в условиях естественного кровоснабжения и его изменения в результате введения ДНКЖ и других доноров N0. Оценка интегрального гипотензивного эффекта ДНКЖ и его сравнение с действием других доноров N0.

2. Исследование фармакокинетики ДНКЖ в кровотоке крыс в условиях естественного кровоснабжения, перехода этих комплексов с низко- на высокомолекулярные лиганды (альбумин, гемоглобин), а также процессов их спонтанного или индуцированного распада

3. Изучение антиоксидантного и кардиопротекторного действия ДНКЖ на модели региональной ишемии миокарда крысы в условиях да л7/г/. Исследование влияния этих комплексов на уровни N0 и АФК в разных зонах миокарда в условиях окислительного стресса. Оценка накопления связанных с белками ДНКЖ в интактной и ишемизированной зонах миокарда.

Научно-практическая значимость работы

1» В диссертационной работе получены новые данные о влиянии ДНКЖ на уровни N0 в ткани миокарда в условиях нормального кровоснабжения и при его нарушениях, что может быть использовано при создании на основе этого вещества лекарственных препаратов, обладающих гипотензивным и кардиопротекторным действием.

2. Проведено сравнительное исследование влияния ДНКЖ на уровни N0 в различных органах животного, что позволяет делать оценки влияния этого комплекса на содержание N0 в интерстиции сердца, печени и почки на основании неинвазивной регистрации N0 в выдыхаемом воздухе.

Научная новизна диссертации

Е диссертационной работе впервые проведено комплексное исследование уровня N0 в интерстиции ткани органов (сердце, печень, почка) с помощью метода микродиализа, а также в лёгких крыс в условиях т

2. Установлено, что базальные уровни свободного N0 в интерстиции ткани сердца, печени и почки между собой достоверно не различаются. Впервые показано, что введение ДНКЖ вызывает длительное увеличение уровня N0 в ткани органов (сердце, легкое, печень и почка), при этом, специфичность действия этого препарата, как донора N0, на эти органы не обнаружена. Похожий эффект увеличения содержания N0 в интерстиции ткани органов был показан также в результате инфузии препарата Изокет (Изосорбитдинитрат), но наиболее заметный рост был установлен для сердца животного.

3. На модели региональной ишемии миокарда впервые показано, что ДНКЖ эффективно накапливаются в зоне риска ткани миокарда, что, вероятнее всего, отражает дополнительное образование этих комплексов в зоне окклюзии. Установлено, что в условиях постишемической реперфузии происходит существенное увеличение скорости распада связанных с белками ДНКЖ в миокарде в результате эффективного перехвата этими комплексами короткоживущих кислородных радикалов.

4. Впервые показано, что введение ДНКЖ в условиях региональной ишемии н реперфузии миокарда оказывает кардиопротекторное действие, подавляя гиперпродуцирование NO и высокотоксичных кислородных радикалов в окклюдируемой зоне.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на следующих конференциях: VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 25-26 октября 2006 г); XV Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине., биологии, фармакологии и экологии", (Украина, Крым, Лгга-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2007 г); 5-ой Национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека", (Смоленск, 18-22 сентября 2007 г); Vffih International Workshop on EPR (ESR) in biology and Medicine, (October 3-6, 2007, Krakow, Poland); XVI Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая — 9 июня 2008 г); 4-й Крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии", (Украина, Крым, Судак, 31 мая - 9 июня 2008 г); Международной научной конференции и восьмом съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25-27 июня 2008 г); 19th European Meeting on Hypertension (Milan, Italy, June 12-16,2009); 6th National Scientific Practical Conference with International Participation "Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants and human health" (Smolensk, September 14-18, 2009); 5-ой Международной крымской конференции "Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии" (Судак, Крым, Украина, 21-30 сентября 2009 г.); 20th European Meeting on Hypertension (Oslo, Norway, June 18-21, 2010); in Евразийское Конгрессе по Медицинской Физике и Инженерии "Медицинская физика-2010" (Москва, 21-26 июня 2010 г.); 2nd International Conference RAHMS "Recent advances in health and medical sciences" (Paphos, Cyprus, 8-12 July, 2010).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дроботова, Диана Юрьевна

выводы

1. После внутривенного введения динитрозильных комплексов железа с низкомолекулярными лигандами происходит быстрый перенос Ре(Ж))г групп на белковые лиганды в крови и ткани органов. Последующий медленный распад этих комплексов происходит с выделением оксида азота, приводящего к появлению длительного гипотензивного эффекта.

2. Установлено, что базальные уровни свободного оксида азота в интерстиции ткани сердца, печени и почек между собой не различаются.

3. Введение динитрозильных комплексов железа вызывает длительное увеличение уровня N0 в ткани органов (сердца, легких, печени и почек). При этом специфичность действия препарата, как донора N0, на эти органы не проявляется.

4. На модели региональной ишемии миокарда показано, что ДНКЖ эффективно накапливаются в зоне риска. Это, вероятнее всего, отражает дополнительное образование этих комплексов в зоне окклюзии.

5. При реперфузии зоны окклюзии происходит существенное увеличение скорости распада динитрозильных комплексов железа в миокарде. Это может свидетельствовать об эффективном перехвате данными комплексами активных форм кислорода.

6. Установлено, что в результате введения динитрозильных комплексов железа происходит подавление вызванных ишемией гиперпродукции оксида азота и активных форм кислорода в окклюдируемой зоне.

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА

Статьи

1. Тимошин А.А., Цкитишвили О.В., Дроботова Д.Ю., Студнева И.М., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К., Писаренко О.И. Взаимосвязь образования оксида азота с повреждениями кардиомиоцитов при региональной ишемии и репер фузии сердца крысы. // Биофизика. 2008. - Т.53, № 4. - С. 679-683.

2. Timoshin А.А., Drobotova D.Yu., Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Yanin A.F. Estimation of nitric oxide level in vivo by microdialysis with water-soluble iron-N-methyl-D-dithiocarbamate complexes as NO traps: A novel approach to nitric oxide spin trapping in animal tissues. //Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2008. - V. 19, No 4. - P. 338-344.

3. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Цкитишвили O.B., Серебрякова JI.EL, Писаренко О.И., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Защитное действие динитрозильных комплексов железа с глутатионом в условиях региональной ишемии миокарда крыс: исследование методом микродиализа. // Доклады Академии Наук (Раздел "Биофизика"). 2010. -Т.432,№3.-С. 416-419.

4. АА.Тимопшн, О.И.Писаренко, О.В .Цкитишвили, Л.И.Серебрякова, И.М.Студнева, Д.Ю.Дроботова, Э.К.Рууге, А.Ф.Ванин Динитрозильные комплексы железа с глутатионом в ткани миокарда крысы в условиях регионального нарушения и восстановления кровоснабжения сердечной мышцы. // Биофизика. 2010 - Т.55, № 6. -С. 1099-1107.

5. Тимошин А.А., Дроботова Д.Ю., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин АФ. Влияние экзогенных доноров на уровень оксида азота в органах животных in vivo: исследование методом микродиализа с использованием спиновых ловушек. // Сборник статей "Проблемы биологической физики" (Под ред. В.А.Твердислова). Издательство "УРСС", Москва. 2010. - С. 107 -124.

Тезисы докладов

1. Тимошин A.A., Орлова Ц.Р., Дроботова Д.Ю., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Изучение динитрозильных комплексов железа в организме млекопитающих методом ЭПР. // Тезисы докладов VII Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2526 октября 2006 г). - С. 257 - 259.

2. Тимошин А А, Орлова Ц.Р., Дроботова Д.Ю., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Содержание оксида азота в нормальных условиях и при региональной ишемии миокарда. // Материалы XV Международной конференции и дискуссионного научногоклуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая - 9 июня 2007 г). - С.401 - 403.

3. Тимошин A.A., Цкитишвили О.В., Дроботова ДЮ., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Исследование содержания оксида азота в ткани миокарда крысы в условиях региональной ишемии. // Сборник трудов 5-й национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (г. Смоленск, 18-22 сентября 2007 г.). - С. 189 -191.

4. Timoshin A.A., Drobotova D.Yu., Gubkina S.A., Vanin AF., Ruuge EJL Effect of NO donors and acute regional cardiac ischemia on NO level in rat organs: an EPR study. // Abstracts of Vllth International Workshop on EPR(ESR) in Biology and Medicine (October 3-6,2007, Krakow, Poland). - P.76.

5. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Губкина CA., Цкитишвили O.B., Серебрякова О.В., Лакомкин B.JL, Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Исследование динитрозильных комплексов железа в организме млекопитающих методом ЭПР. // Труды XVI Международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая — 9 июня 2008 г). — С.384 - 386.

6. Тимошин А.А., Дроботова Д.Ю., Губкина С.А., Орлова ДР., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Лакомкин В.Л., Рууте Э.К., Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа - доноры NO и антиоксидангы в организме млекопитающих. // Тезисы докладов 4-й Крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии", (Украина, Крым, Судак, 31 мая — 9 июня 2008 г). С.50.

7. Тимошин А.А., Дроботова Д.Ю., Губкина С.А., Орлова Ц.Р., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Парамагнитные динитрозильные комплексы железа в организме млекопитающих. // Сборник статей Международной научной конференции и восьмого съезда белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25 - 27 июня 2008 г). - 4.2. — С. 143 — 145.

8. Timoshin А.А., Lakomkin V.L., Tskitishvili О.V., Serebiyakova L.I., Drobotova D.Yu., Vanin A.F. Hypotensive and cardioprotective actions of Dinitrosyl-Iron Complexes with thiol-containing ligands. // Abstracts of the 19th European Meeting on Hypertension (Milan, Italy, June 12-16,2009). - P.S295 - S296.

9. Timoshin A.A., Drobotova D.Yu., Tskitishvili O.V., Serebryakova L.L, Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Vanin A.F. Hypotensive and cardioprotective action of Dinitrosyl-Iron Complexes with thiol-containing ligands in animal organism. // Abstracts of the 6th National Scientific Practical Conference with International Participation "Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants and human health" (Smolensk, September 14 - 18, 2009). -P.73 - 74.

10. Тимошин А. А., Дроботова Д.Ю., Цкитшпвили О .В., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа в условиях региональной ишемии миокарда. // Тезисы докладов 5-й Международной крымской конференции "Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии" (Судак, Крым, Украина, 21 - 30 сентября 2009 г.). - С.62.

11. Timoshin A.A., Drobotova D.Yii., Lakomkin V.L., Tskitishvili O.V., Serebryakova L.L, Vanin A.F. Dinitrosyl-Iron Complexes as hypotensive and cardioprotective substances in mammalian organism. // Abstracts of the 20th European Meeting on Hypertension (Oslo, Norway, June 18-21, 2010). / Journal of Hypertension. 2010 June. V.28 e-Supplement A. P.el96.

12. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Цкитшпвили О .В., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К, Ванин А.Ф. Защитное действие динитрозильных комплексов железа в условиях региональной ишемии и реперфузии миокарда крыс. Исследование методом ЭПР. // Материалы Ш Евразийского Конгресса по Медицинской Физике и Инженерии "Медицинская физика-2010" (Москва, 21 - 26 июня 2010 г.). - С. 365 - 367.

13. Дроботова Д.Ю., Тимошин А.А., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа, как природные физиологические формы оксида азота. Исследование методом ЭПР. // Материалы Ш Евразийского Конгресса по Медицинской Физике и Инженерии "Медицинская физика-2010" (Москва, 21—26 июня 2010 г.). - С. 229-230.

14. Timoshin А.А,, Drobotova D.Yu., Tskitishvili O.V., Serebryakova L.L, Ruuge E.K., Vanin A.F. Cardioprotective action of Dinitrosyl-Iron Complexes with glutathione in mammalian organism. // Abstracts of 2nd International Conference RAHMS "Recent advances in health and medical sciences" (Paphos, Cyprus, 8-12 July, 2010). - P. 52.

15. Drobotova D.Yu , Timoshin A.A., Lakomkin V.L , Ruuge E.K-, Vanin A.F. Effect of DN1C injection on NO level in rat organs during native blood circulation. // Abstracts of 2nd International Conference RAH MS "Recent advances in health and medical sciences" (Paphos, Cyprus, 8-12 July, 2010). - P. 66.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании полученных результатов представляется целесообразным оценить роль ДНКЖ, как природных форм депонирования N0 при различных физиологических состояниях организма.

Так, в условиях естественного кровоснабжения введение ДНКЖ приводит к увеличению уровня N0 в интерстиции ткани органов. Необходимо отметить, что степень увеличения уровня N0 в результате введения ДНКЖ была практически одинаковой для всех исследованных органов (сердце, лёгкое, печень, почка), что говорило в пользу того, что этот препарат, как донор N0, оказывает приблизительно одинаковое действие на эти органы. Величина эффекта увеличения содержания N0 в этих органах достаточно хорошо соответствовала данным, полученным ранее авторами работы (БегегЬепкоу е! а1., 2008) на основании анализа аддуктов N0 в моче животного с использованием спиновой ловушки Ре^-МГДг, не проникающей через клеточную мембрану. В то же время, при регистрации аналогичного эффекта ДНКЖ с помощью липофильной спиновой ловушки Ре2+-ОЕТС2 был получен существенно больший эффект увеличения содержания аддукта в результате введения ДНКЖ (Лакомкин и др., 2009), что, вероятнее всего, говорит о том, что липофильная ловушка могла взаимодействовать в клетке не только с N0, но также с ДНКЖ. Таким образом, исходя из результатов оценки уровня N0 с помощью спиновых ловушек с применением трёх различных методик регистрации аддуктов, следует, что впервые использованная в диссертационной работе система регистрации N0 с помощью метода микродиализа - наиболее адекватная, позволяющая регистрировать именно уровень низкомолекулярного N0 в течении длительного времени при минимальном воздействии на организм. Кроме того, полученные в работе данные могут свидетельствовать о том, что в результате введения ДНКЖ эффект увеличения депонированных форм N0 существенно больше, чем рост свободного N0. Это означает, что после инъекции этого донора N0 происходит главным образом депонирование N0 в физиологических формах, позволяя избежать при этом токсичного действия на организм, вызванного гиперпродукцией свободного N0.

В другой части работы в результате исследования действия ДНКЖ в условиях регионального нарушения и восстановления кровоснабжения сердечной мышцы, установлено, что ДНКЖ является уникальным природным соединением, способным оказывать защитное действие в условиях окислительного стресса, предохраняя ткань от избытка кислородных радикалов и N0. Кроме того, в условиях ишемии происходит эффективное накопление и/или образование новых ДНКЖ. Поэтому в результате таких процессов происходит увеличение содержания этих комплексов в зоне с нарушенным кровоснабжением, где они оказывают вазодилататорное и антиоксидантное действия, предохраняя ткань от повреждений, вызванных окислительным стрессом. Необходимо также отметить, что увеличение скорости распада этих комплексов во время реперфузии может являться маркёром генерации избытка активных форм кислорода и их перехватом молекулами ДНКЖ в данной области организм

Полученные в работе данные позволяют рассматривать ДНКЖ, обладающие вазодилататорными и антиоксидантными свойствами, как эффективное средство для профилактики и лечения патологий, связанных с ишемическими нарушениями в организме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дроботова, Диана Юрьевна, Москва

1. Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований // Биохимия. 1998. — Т. 63. С. 867 - 869.

2. Ванин А. Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы — две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах // Биохимия. 1998. Т. 63, № 7. - С. 924 - 938.

3. Зотова И.В., Затейщиков Д.А., Сидоренко Б.А. Синтез оксида азота и развитие атеросклероза//Кардиология. 2002. -№ 4. С. 58 - 67.

4. Лакомкин В.Л., Тимошин A.A., Ванин А.Ф., Капелько В.И., Чазов Е.И. Длительный гипотензивный эффект стабильных динитрозильных комплексов железа у бодрствующих нормогензивных и гипертензивных крыс // Кардиологический вестник. 2006. Т. 1, №1. — С. 42 - 47.

5. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорздикальные процессы в норме и при патологических состояниях // Пособие для врачей. 2001. Р. 78.

6. Лобышева И.И., Сереженков В.А., Ванин А.Ф. Взаимодействие динитрозильных тиолсодержащих комплексов железа с пероксинигритом и перекисью водорода. //Биохимия. 1999. Т.64, № 2. - С. 194 - 200.

7. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты // М.: Слово. 2006.-556 с.

8. Метелица В.И. Справочник по клинической фармакологии сердечнососудистых лекарственных средств // М.: Бином. 2002. 926 с.

9. Осипов А.Н., Борисенко Г.Г., Владимиров Ю.В. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов. //Успехи биологической химии. 2007. Т.47. - С.259 - 292.

10. Писаренко О.И., Серебрякова Л.И., Цкитишвили О .В., Студнева И.М., Ванин А.Ф. Ремоделирование инфаркта миокарда у крыс динитрозильным комплексом железа с глутатионом // Российский физиологический журнал им. Сеченова. 2009. Т. 95, №5. - С.465 - 475.

11. Писаренко О.И., Студнева И.М., Серебрякова Л.И., Цкитишвили О.В., Тимошин A.A. Защита миокарда крыс селективным ингибитором Na+/H+ -обмена и шпемическим прекондиционированием // Кардиология. 2005. Т.45, №2. -С.37 - 44.

12. Писаренко О.И., Серебрякова Л И., Цкитишвили О.В., Студнева И.М., Ванин А.Ф., Чазов Е.И. Кардиопротекторная активность динитрозильного комплексажелеза с цистеином у крыс in vivo. // Известия Академии Наук. Сер. Биолог. 2008.-№ 1. — С.110 — 114.

13. Ремизова М.И., Кочетыгов Н.И., Гербут К.А., Ванин А.Ф. Влияние динитрозильного комплекса железа с глутатионом как донора оксида азота на кровообращение у здоровых животных /7 Биофизика. — 2008. — Т. 53, №5. — С. 867 873.

14. Реутов B.IL Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности. // Биохимия. 2002. Т.67, №3. — С.353-376.

15. Тимошин A.A., Орлова Ц.Р., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Регистрация уровня радикала оксида азота в организме млекопитающих с использованием водорастворимых комплексов трехвалентного железа с дигиокарбаматом // Биофизика. 2005. Т.50, №3. - С.537 - 543.

16. Тимошин А.А, Цкитишвили O B., Серебрякова Л.И., Кузьмин А.И., Медведев О.С., Рууге Э.К. Образование гидроксильных радикалов при локальной ишемии сердца собаки // Биофизика. 1994. Т39, № 3. — С.502 — 506.

17. Шумаев КБ., Губкин A.A., Губкина С.А., Гудков Л.Л., Свиряева И.В., Тимошин A.A., Топунов А.Ф., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Взаимодействие динитрозилыых комплексов железа с интермедиатами окислительного стресса. // Биофизика. 2006. Т.51, № 3. - С.472 - 477,

18. Bates Т.Е., Loesch A., Bumstock G., Clark J.B. Mitochondrial nitric oxide synthase: a ubiquitous regulator of oxidative phosphorylation? // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V.218.-P.40 - 44.

19. Bian K., Ke Y., Kamisaki Y. Murad F. Proteomic modification by Nitric Oxide // J. Pharmacol. Sei. 2006. V. 101, № 4. - P.271-279.

20. Bolli R. Cardioprotective function of inducible nitric oxide synthase and role of nitric oxide in myocardial ischemia and preconditioning // J.Mol.Cell.Cardiol. 2001. — V. 33.-P.1897— 1918.

21. Bosworth C.A., Toledo J.C., Zmijewski J. W., Li Q., Lancaster J.R. Dinitrosyliron complexes and the mechanism(s) of cellular protein nitrosothiol formation from nitric oxide //Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 2009. V.106, №12. -P.4671-4676.

22. Bryan N.S. Nitrite in nitric oxide biology: Cause or consequence? A systems-based review // Free Radic. Biol. Med. 2006. V.41, № 5. - P.691- 701.

23. Butler A.R., Megson I.L. Non-heme iron nitrosyls in biology // Chem.Rev. 2002. -V.102, №4. P.l 155 - 1166.

24. Cooper C. E. Nitric oxide and iron proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1999. — V. 1411. — P.290 309.

25. Davidson S.M., Duchen M.R. Effects of NO on mitochondrial function in cardiomyocytes: Pathophysiological relevance. // Cardiovascular Reseach. 2006. — V.71,№1.-P.1G

26. Dawson V.L., Dawson T.M., BarUey D.A., Uhl G.R., Snyder S.H. Mechanisms of nitric oxide-mediated neurotoxicity in primary brain cultures // J. Neurosci. 1993. — V.13. — P.2651 -2661.

27. Depre C., Fierain L., Hue L. Activation of nitric oxide sinthase by ischaemia in the perfused hearts 11 Cardiovasc.Res. 1997. Y.33. - P.82 - 87.

28. Ferdinandly P., Schulz R. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischemia-reperfiision injury and preconditioning // British Journal of Pharmacol. 2003. V. 138, №4. - P.532 - 543.

29. Franchi A.M., Chaud M., Rettori V., Suburo A., McCann S.M., Gimeno M. Role of nitric oxide in eicosanoid synthesis and uterine motility in estrogen-treated rat uteri. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. -V.18, №91(2). -P.539 543.

30. Gross G.J., Fryer RJM Mitochondrial KATP channels. Triggers of distal effectors of ischemic or pharmacological preconditioning // Circ.Res. 2000. V.87. P.431 - 433.

31. Han X., Shimoni Y., Giles W.R. An obligatory role for nitric oxide in autonomic control of mammalian heart rate //J. Physiol. (London). 1994. V.476. -P.309-314.

32. Hayward C.S., Macdonald P.S., Keogh A.M. Inhaled nitric oxide in cardiology // Expert Opin. Investing Drugs. 2001. V.10, №11,- P.1947 - 1956,

33. Jones S.P., Bolli R. The ubiquitous role of nitric oxide in cardioprotection I I J.Mol.Cell.Cardiol. 2006. V.40. - P. 16 - 23.

34. Joshi M.S., Ponthier J.L., Lancaster J.R. Cellular antioxidant and pro-oxidant actions of nitric oxide //Free Radic.Biol.Med. 1999. V.27. - P.1357 - 1366.

35. Kanner J., Harel S., Granit R. Betalains — a new class of dietary cationized antioxidants //Arch.Biochem.Biophys. 1991. V.289. - P. 130 -136.

36. Krumenacker J.S., Murad F. NO cGMP signaling in development and stem sells Ji Mol. Genet. Metab. 2006. V.87, №4. - P.311- 314.

37. Kudei R.K., Depre C. NO with no NOS in ischemic heart // Cardiovascular Research. 2007. V.74, №1. - P.l - 3.

38. Lalu M.M., Wang W., Schulz R. Peroxynitrite in myocardial ischemia-reperfusioii injury // Heart Fail Review. 2002. V.7, №4 - P.359 - 369.

39. Mailman D., Guntuku S., Bhuiyan M.B.A, Murad F. Organ sites of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in the anesthetized rat // Nitric Oxide: BioL Chem. 2001. V.5. - P.243 -251.

40. Mahler A.R., Milsom A.B., Gunaruwan P., Abozguia K., Ahmed I., Weayer R.A., Thomas P., Ashrafian H., Born G., James P., Frenneaux M. Hypoxic modulation ofexogenous nitrite-induced vasodilation in humans // Circulation. 2008. — V.117. — P.670 677.

41. Megson LL., Miller M.R. NO and sGC-stimulating NO donors, in cGMP, Generators, Effectors and Therapeutic Implications, H.H.H. Schmidt (ed.) // Handbook of Experimental Pharmacology, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg. 2009. -V.247-P.248-280.

42. Muller B., Kleschyov A.L., Alencar J.L., Vanin A., Stoclet J.C. Nitric oxide transport and storage in 1he cardiovascular system // Ann. N.Y. Acad. Sei. 2002. -V.962. — P.131—139.

43. Nagano T., Yoshimura T. Bioimaging of nitric oxide // Chem. Rev. 2002. V. 102. -P. 1235- 1270.

44. Pain T., Yang X.-M., Critz S.D., Yue Y., Nakano A., Liu G.S., Heusch G„ Cohen M.V., Downey J.M Opening of mitochondrial KAtp channels triggers the preconditioned state by generating free radicals // Circ.Res. 2000. V. 87. - P.460 -466.

45. Rakhit R.D., Marber M.S. Nitric Oxide: an emerging role in cardioprotection // Heart. 2001. V.86. - P.368 -372.

46. Sasaki N., Sato T., Ohler A., O'Rourke B., Marban E. Activation of mitochondrial ATP-dependent potassium channels by nitric oxide // Circulation. 2000. V.101. -P.439 — 445.

47. Schechter AN., Gladwin M.T. Hemoglobin and the paracrine and endocrine functions of nitric oxide // New Eng. J. Med. 2003. V.348. - P. 1483 - 1485.

48. Schulz R., Kelm M., Heusch G. Nitric Oxide in myocardial ischemia/ reperfusion injury // Cardiovascular research. 2004. V.61. - P.402 - 413.

49. Shafer F.Q., Wang P.H., Kelley, Cueno K.L., Martin S.M., Buetter G.R. Comparing beta-carotine, vitamin E and nitric oxide as membrane antioxidants. //J. Biol. Chem. 2002. V.383. - P.671 - 681.

50. Shumaev K.B., Kosmachevskaya O.V., Timoshin A.A., Vanin A.F., Topunov A.F. Dinitrosyl iron complexes bound with haemoglobin as markers of oxidative stress // Methods in Enzymology. 2008. V.436, Part A. - P.445 - 461.

51. Stone J.R., Marietta M.A. The ferrous iron heme of soluble guanylate cyclase; formation of hexacoordinate complexes with carbon monoxide andnitrosomethane // Biochem. J. 1995. V.34, №5. -P.16397 -16403.

52. Thomas D.D., Liu X., Kantrow S.P., Lancaster J.R. The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and 02 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. - P. 355-360.

53. Timoshin A.A., Tskitishvili O.V., Serebryakova L.I., Kuzmin A.I., Medvedev O.S., Ruuge E.K. Microdialysis study of ischemia-induced hydroxyl radicals in tha canine heart // Experientia. 1994. V.50. - P.677 - 679.

54. Tiravanti E., Samouilov A., Zweier J.L. Nitrosyl-heme complexes are formed in the ischemic heart//J.Biol.Chem. 2004. V.279. -P.11065 - 11073.

55. Vanin A.F. Dinitrosyl-iron complexes with thiolate ligands: Physico-chemistry, biochemistry and physiology // Nitric Oxide: Biology and chemistry. 2009. V.21. -P.l-13.

56. Vanin A.F., Kleschyov A.L. EPR detection and biological implications of nitrosyl nonheme iron complexes. In: Nitric Oxide in transplant rejection and anti-tumor defens // Basel. Kluwer Academic Publishers. 1998. P.49 - 82.

57. Vanin A.F., Muller B., Alencar J.L., Lobysheva I.I., Nepveu F., Stoclet J-C, Evidence that intrinsic iron but not intrinsic copper determines S-nitrosocysteine decomposition in buffer solution // Nitric Oxide. 2002. V.7. - P. 194 - 209.

58. Vanin A.F., Poltorakov A.P., Mikoyan V.D., Kubrina LN., Burbaev D.S. Polynuclear ware-soluble dinitrosyl iron complexes with cystein or glutathione ligands: Electron paramagnethic resonance and otical studies //Nitric Oxide. 2010, -V.23. -P.136-149.

59. Vanin A.F., Serezhenkov V.A., Mikoyan V.D., Genkin M.V. The 2.03 signal as an indicator of dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands // Nitric Oxide. Biol. Chem. 1998. V.2. -P.224 -234

60. Vanin A.F., Varich V.Ja. Nitrosyl non-heme iron complexes in animal tissues // Studia biophysica. 1981. V.86.-P.175- 185.

61. Vegh A., Papp J.G., Szekeres L., Parratt J.R. Prevention by an inhibitor of the L-arginine-nitric oxide pathway of the antiarrhythmic effects of bradykinin in in anaesthetized dogs // Br.J.Pharmacol. 1993. V. 110. - P. 18 - 19.

62. Ueno T., Suzuki Y., Fujii S., Vanin A, Yoshimura S. In vivo distribution and behavior of paramagnetic dinitrosyl dithiolato iron complex in the abdomen of mouse // Free Rad. Res. 1999. V.3L - P.525 - 534.

63. Webb A, Bond R, McLean P., Uppal R, Benjamin N., Ahluwalia A Reduction of nitrite to nitric oxide during ischemia protects against myocardial ischemia-reperfusion damage // PNAS. 2004. -V. 14. P. 13683 - 13688.

64. Woolum J.C., Commoner B. Isolation and identification of a paramagnetic complex from livers of carcinogen-treated rats //Biochim. Biophys. Acta. 1970, -V.201.-P.131 140.

65. Zafiriou O.C., McFarland M Determination of trace levels of nitric oxide in aqueous solution // Anal. Chem. 1980. V. 52. - P. 1662 - 1667.

66. Zhang Z., Naughton. D.P., Blake DR., Benjamin N., Stevens CJL, Winyard P.G., Symons M.C., Harrison R Human xanthine oxidase converts nitrite ions into nitric oxide (NO) // Biochem. Soc.Trans. 1997. V.25. -P.524S.

67. Zveier J.L., Wang P., Kuppusamy P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy // J.Biol.Chem. 1995. -V.270. — P.304 — 307.

68. Zwejer J., Samouilov A, Kuppusamy P. Non-en2ymatic nitric oxide synthesis in biological systems//Biochim. etBiophys.Acta. 1999. -V.1411. -P.250-262.1. БЛАГОДАРНОСТИ

69. Отдельно хочу поблагодарить своего научного руководителя д.ф.-м.н. профессора Рууге Энно Куставича и научного консультанта к.ф.-м.н. с.н.с. Тимошина Александра Анатольевича за помощь в работе и ценные советы.