Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая трансформация эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая трансформация эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов"

На правах рукописи

ТУЛИКОВА Анастасия Олеговна

ИО4607344

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК КУР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ

03.02.07-Генетика

03.03.01 -Физиология - 2 СЕ И 2010

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2010

004607844

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна;

доктор биологических наук Волкова Наталья Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Маленко Галина Петровна;

доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится « июля 2010 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ.

Автореферат разослан » июня 2010 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03

И.В. Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание генетически модифицированной птицы рассматривается в качестве одной из перспективных технологий синтеза рекомбинатных белков [Mizuarai S. et al., 2001; Harvey A. et al., 2002; Mozdziak P.E. et al., 2003; Kamihira M. et al., 2005; Kawabe Y. et al., 2006; Сураева H.M., 2008]. К важным преимуществам данной технологии производства рекомбинатных протеинов по сравнению с созданием животных-биореакторов следует отнести короткий генерационный интервал сельскохозяйственной птицы, позволяющий получать стадо продуцентов уже через полгода после получения родоначальников (для сравнения, получение стада продуцентов крупных сельскохозяйственных животных - коров, коз, свиней - требует до 3-5 лет), высокую белоксинтезирующую способность птицы, а также отсутствие патогенной микрофлоры в белке яйца. Вышеназванные преимущества обуславливают относительно невысокую стоимость получаемых рекомбинантных протеинов: затраты на производство 1 грамма рекомбинантного белка составляют около 10-25 центов, в то время как при использовании для этих целей молочной железы трансгенных животных стоимость возрастает до 100 долларов [Das R. С., 2001].

Традиционный метод получения трансгенных животных -микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы - является малоэффективным для получения трансгенной птицы. Это связано, прежде всего, с особенностями ее воспроизводства и развития, а именно с трудностями точного определения времени овуляции, большим количеством желтка в яйцеклетке, сильным уплотнением цитоплазмы в районе пронуклеусов. Все это требует поиска и разработки альтернативных методов переноса ДНК, одним из которых является использование векторов на основе рекомбинантных ретровирусов.

Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение факторов, влияющих на результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить компетентность эмбриональных клеток кур к рекомбинантным ретровирусным векторам in vitro.

2. Определить факторы, влияющие на результативность введения рекомбинантных ретровирусов в эмбриональные клетки кур (способ и период введения, концентрация и тип используемого препарата).

3. Изучить результативность генетической трансформации модифицированными ретровирусами эмбрионов кур in vivo.

4. Оценить влияние генно-инженерных манипуляций на развитие эмбрионов кур.

5. Провести анализ интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур.

Научная новизна. Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в эмбриональные клетки кур посредством использования ретровирусных векторов, изучено влияние проводимых генно-инженерных манипуляций на эмбриогенез кур. Выявлены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации эмбрионов кур in vivo. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов (lacZ, инсулин и гормон роста) в различных органах и тканях полученной трансгенной птицы.

Практическая значимость. Усовершенствован метод получения трансгенных кур, основанный на использовании ретровирусных векторов. Предложен усовершенствованный способ введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки создания трансгенной птицы, позволяющей получать трансгенных кур с интеграцией и экспрессией генов инсулина и гормона роста в ряде внутренних органов: печени, кишечнике, яйцеводе и репродуктивных органах, а также в мышечной ткани.

Основные положения, выносимые на защиту

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как результативный способ генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и in vivo.

• Способ подготовки, состав инъекционного препарата, стадии введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo как факторы, влияющие на результативность получения трансгенной птицы.

• Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, 2008гг.; «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006 г.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 1.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 109 страницах, содержит 9 таблиц, 24 рисунка, 9 графиков, 1 схему. Библиографический список содержит 110 источников, в том числе 90 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в период с 2005 по 2009 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии и физиологическом дворе ГНУ ВИЖ согласно схеме, представленной на рисунке 1.

Рис. 1. Схема исследований

Объектом исследований служили эмбрионы и куры кросса «Птичное». Для трансформации клеток-мишеней использовали ретровирусный вектор pBMN, содержащий репортерный ген lacZ (генная конструкция pBMN-lacZ) и вектор рХ, содержащий кДНК инсулина (генная конструкции pX-ins) и гормона роста человека (генная конструкция pX-RSVhgh). В первых двух конструкциях последовательности структурных генов были поставлены под контроль промотора цитомегаловируса человека (CMV), в третьей конструкции - под контроль промотора вируса саркомы Рауса (RSV). Для упаковки рекомбинантных ретровирусов были использованы две линии клеток-упаковщицpgl3 (векторpBMN) и GP+envAml2 (векторрХ).

Трансформацию эмбриональных клеток кур in vitro осуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и добавления вирусного препарата, представляющего собой среду культивирования клеток-упаковщиц и содержащего рекомбинантный ретровирус [Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу клеток.

Введение генных конструкций в эмбрионы кур in vivo осуществляли на разных стадиях развития эмбриона: до начала инкубации в область зародышевого диска, на первый день инкубации непосредственно в эмбрион, на третий день - в дорсальную аорту. Для инъекций использовали суспензию клеток-упаковщиц и вирусный препарат. Для получения инъекционного раствора клеток-упаковщиц, последние ресуспензировали в среде DMEM, содержащей полибрен (8мкг/мл). Вирусный препарат также вводили с добавлением полибрена (8 мкг/мл), причем наряду с неконцентрированным вирусным препаратом использовали и концентрированный.

Выделение ДНК из крови, ткани и эмбрионов цыплят осуществляли с использованием солевого и перхлоратного методов [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Экспрессию рекомбинантных белков в органах и тканях опытных кур изучали методами гистохимии (р-галактозидаза) и иммуногистохимии (инсулин и гормон роста человека). Гистологические препараты готовили по общепринятой методике [Ромейс Б., 1953]. Микроскопирование гистопрепаратов осуществляли с использованием компьютерной программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур ретровирусными векторами в культуре in vitro

С целью оценки компетентности эмбриональных клеток кур к используемым рекомбинантным ретровирусам был проведен ряд экспериментов по переносу экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур в культуре in vitro. Анализ результатов показал высокую результативность переноса рекомбинантной ДНК с использованием всех изучаемых генных конструкций (табл. 1).

Таблица 1.

Результаты генетической трансформации эмбриональных клеток кур in _vitro рекомбинантными ретровирусами_

Конструкция Совместное культивирование

клетки-упаковщицы вирусный препарат

105 КОЕ/мл 106 КОЕ/мл

частота П частота П частота П

генетич. ц генетич. Ц генетич. Ц

трансформ. р трансформ. Р трансформ. Р

pBMN-lacZ 2,9* 10"3 + 8,6*10"4 + 1,1*10"3 +

pX-ins 5,2* 10"3 + 9,4*10"4 + 1,4*10"3 +

pX-RSVhgh 5,9* 10"3 + 1,5*10"3 + 0,9* 10"3 +

Примечание: частота генетической трансформации - отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу инфицированных клеток.

Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала в зависимости от метода трансфекции. Наибольшее число генетически трансформированных клонов было получено при совместном культивировании клеток-мишеней с клетками-упаковщицами. Так, при культивировании эмбриональных клеток кур с клетками-упаковщицами линии pglS, упаковывающей рекомбинантный ретровирус рВМЫ-1ас1, экспрессия Р-галактозидазы была выявлена в 2,9* 1СГ3 случаев (рас. 2). При инфицировании эмбриональных клеток кур вирусным препаратом, представляющим собой среду культивирования клеток-упаковщиц, результативность трансформации была в 3,4 раза ниже и составила 8,6*10"4

Рис. 2. Гистохимическое окрашивание на р-галактозидазу первичной культуры клеток эмбриона курицы.

Примечание: 1 - опыт (трансформированная культура), 2 - контроль (нетрансформированная культура). Экспрессия р-галактозидазы, окрашенная в синий цвет, показана стрелками. Ув. х200.

Результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур с использованием генных конструкций pX-ins и pX-RSVhgh, упакованных в вирусные частицы пакующей линией GP+envAml2, была несколько выше по сравнению с использованием генной конструкции pBMN-lacZ и варьировала в зависимости от используемой генной конструкции при совместном культивировании с клетками-упаковщицами от 5,2*10"3 до 5,9*10~3, при инфицировании вирусным препаратом - от 9,4*10"4 до 1,5*10"3.

3.2. Изучение факторов, влияющих на результативность получения трансгенных кур С целью усовершенствования технологии трансгенеза органов и тканей кур нами выполнено исследование факторов, влияющих на эффективность переноса рекомбинантной ДНК в клетки-мишени in vivo с использованием в качестве модели генной конструкции pBMN-lacZ. Были изучены следующие факторы: способ и стадии введения генных конструкций, способ подготовки генных конструкций для инъекции и их концентрация. В контрольной группе введение генных конструкций в эмбрионы кур не осуществляли, однако проводили все манипуляции аналогично опытным группам (нарушение целостности скорлупы путем вырезания и последующего заклеивания окна в тупом конце яйца).

3.2.1. Способ и стадии введения генных конструкций в эмбрионы кур В качестве источника генных конструкций использовали вирусный препарат, который вводили на разных стадиях развития эмбрионов: (1) до инкубации яиц в область зародышевого диска, (2) на первый день инкубации непосредственно в эмбрион, (3) в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов.

Как показано в таблице 2, минимальный процент остановившихся в развитии эмбрионов отмечался при проведении генноинженерных манипуляций на стадии зародышевого диска: развитие было установлено у 78,8% эмбрионов. При манипуляциях на более поздних стадиях эмбриональная смертность была на 6,3-16,3% выше.

Детальный анализ показал, что наибольший процент остановившихся в развитии эмбрионов наблюдался в начале и конце инкубации, причем различия по данному показателю между опытными и контрольной группами были максимальными в начале инкубации-до 18,3% (рис. 3). Максимальное значение показателя эмбриональной смертности (процент неразвившихся и остановившихся в развитии эмбрионов от общего числа проинъецированных и заложенных на инкубацию эмбрионов) в опытных группах наблюдалось при введении вирусного препарата на первый день инкубации (20,0%), минимальное - при инъекции генных конструкций в область зародышевого диска и в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов (10,0%). В контрольной группе процент остановившихся в развитии эмбрионов не превышал 1,3%. В конце инкубации эмбриональная смертность в опытных группах варьировала незначительно от 7,5 до 12,5%. В контрольной группе данный показатель был на 2,5-7,5% ниже и составил 5%.

Таблш(а 2.

Эффективность генетической трансформации эмбрионов кур в

зависимости от стадии введения генных конструкций_

Показатель Стадии введения вирусного препарата

До инкубации на 1-й день инкубации на 3-й день инкубации

Объем вирусного препарата, мкл/эмбрион 100 1-2 1-2

Метод введения в область зародышевого диска в эмбрион в дорсальную аорту

Проколото эмбрионов 80 80 80

Развилось эмбрионов, п (%) в т.ч. трансгенных, п 63 (78,8) 18 50 (62,5) 20 58 (72,5) 28

Вылупилось цыплят, п (%) в т.ч. трансгенных, п 26 (32,5) 3 9(11,3) 4 12 (15,0) 5

Частота интеграции*, % 28,6 40,0 48,3

Эффективность трансгенеза *,% 22,5 25,0 35,0

Эффективность получения трансгенных кур , % 3,8 5,0 6,3

Примечание: * отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в %; **отношгние числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов, к числу инъецированных яиц, выраженное в %; ***отношение числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу инъецированных яиц, __выраженное в %._

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%

Введение ВП в область зародышевого

диска

Введение ВП в 1-суточный эмбрион

Введение ВП в дорсальную аорту 2,5-дн.

эмбрионов

контроль

в вторая неделя инкубации ®Ряд4

ш третья неделя инкубации

Рис. 3. Распределение остановившихся в развитии эмбрионов по периодам инкубации при использовании различных способов и стадий

введения генных конструкций. Примечание: ВП - вирусный препарат.

Несмотря на минимальный процент остановившихся в развитии эмбрионов при введении генных конструкций на стадии зародышевого диска, наибольшая частота интеграции генной конструкции (процент трансгенных эмбрионов от общего числа развившихся эмбрионов) наблюдалась при проведении генноинженерных манипуляций с эмбрионами на более поздних стадиях развития. При введении вирусного препарата в эмбрионы на первый и третий дни инкубации частота интеграции достигала 40,0-48,3%, что было на 11,4-19,7% выше по сравнению с аналогичным показателем, установленным при введении генных конструкций в эмбрионы кур на стадии зародышевого диска. Общая эффективность получения трансгенных кур (процент полученных трансгенных кур от общего числа проинъецированных эмбрионов) также была выше при введении генных конструкций на более поздних стадиях и составила 5,0-6,3% при проведении манипуляций на первый и третий дни инкубации эмбрионов и 3,8% - при введении генных конструкций в зародышевый диск неинкубированных яиц (табл. 2).

Так как генноинженерные манипуляции осуществляли с многоклеточными эмбрионами, трансформация эмбрионов кур носила мозаичный характер. Доля трансформированных органов и тканей была максимальной при введении генных конструкций в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов и достигала в среднем по группе 25,0±6,1% против 16,7±3,3и 20,0±4,1% при проведении манипуляций на стадии зародышевого диска и на первый день инкубации, соответственно.

Оценивая эффективность трансформации отдельных органов внутри каждой группы, следует отметить, что экспрессия репортерного белка была выявлена, преимущественно, в клетках печени, сердца, кишечника и мышечной ткани (рис. 4). Трансформация репродуктивных органов была установлена только при введении генных конструкций в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов. Исходя из этого, а так же учитывая более высокую результативность генетической трансформации клеток-мишеней при проведении манипуляций с 2,5-дневными эмбрионами, дальнейшие исследования проводились нами на данной стадии развития эмбрионов.

3.2.2. Способ подготовки генных конструкций для инъекции и их концентрация

Анализ двух различных способов подготовки генных конструкций (концентрированный вирусный препарат и клетки-упаковщицы) и различных концентраций вирусного препарата (20 и 100-кратный) и клеток-упаковщиц (500, 1000 и 2000 клеток/эмбрион) показал, что минимальное влияние на эмбриогенез кур было установлено при использовании в качестве источника генных конструкций суспензии клеток-упаковщиц в количестве 500-1000 клеток/эмбрион: развитие эмбрионов наблюдалось в 67-70% случаев. При введении в эмбрионы кур концентрированного вирусного препарата (хЮО) и клеток-упаковщиц в концентрации 2000 клеток/эмбрион эмбриональная смертность была на 26-32% выше (табл. 3).

Рис. 4. Гистохимическое окрашивание на (3-галактозидазу органов и тканей кур.

Примечание: 1 - печень, 2 - кишечник; а - опыт, б - контроль. Экспрессия ¡}-галактозидазы, окрашенная ДАБ окрашена в коричневый цвет, показана стрелками. Ув. Х400.

Таблица 3.

Эффективность генетической трансформации эмбрионов кур в

Показатель Вирусный препарат Клетки-упаковщицы

20х ЮОх 500 1000 2000

Метод введения в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов

Проколото яиц, шт 80 80 80 80 80

Развилось эмбрионов, п (%) в т.ч. трансгенных, п 49 (61) 24 33 (41) 17 56 (70) 30 54 (67) 36 30 (38) 19

Вылупилось цыплят, п (%) в т.ч. трансгенных, п 11 (14) 4 8(10) 3 18(23) 6 17(21) 7 7(9) 3

Частота интеграции*, % 49,0 51,5 53,5 66,7 63,3

Эффективность трансгенеза**,% 30,0 21,3 37,5 45,0 23,8

Общая эффективность ***, % 5,0 3,8 7,5 8,8 3,8

Примечание: * отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в %; **отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов, к числу инъецированных яиц, выраженное в %;

*** отношение числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу инъецированных яиц, выраженное в %.

Как показано на рисунке 5, наибольший процент остановившихся в развитии эмбрионов, как и в предыдущем опыте, наблюдался на первой и третьей неделях инкубации: различия между опытными и контрольной группами составляли в начале инкубации 48,7%, в конце инкубации - 8,8%. Максимальный процент остановившихся в развитии эмбрионов в первую неделю инкубации наблюдался при введении клеток-упаковщиц в концентрации 2000 клеток/эмбрион (50,0%), минимальный - 500-1000 клеток/эмбрион (15,0-17,5%). В контрольной группе данный показатель не превышал 1,3%. В конце инкубации эмбриональная смертность в опытных группах составила 8,9-13,8% при 5,0% в контрольной группе.

-5% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% 50% 55% 60% 65%

Контроль

первая неделя инкубации ш третья неделя инкубации

ш вторая неделя инкубации

Рис. 5. Распределение остановившихся в развитии эмбрионов по периодам инкубации в зависимости от способа подготовки и концентрации генных конструкций

Примечание: ВП - вирусный препарат, КК - клетки-упаковщицы. Метод введения - в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов

Максимальная эффективность трансгенеза была выявлена при введении в дорсальную аорту эмбрионов клеток-упаковщиц в концентрации 1000 клеток/эмбрион: интеграция репортерного гена \г.с,Ъ была доказана у 66,7% развившихся эмбрионов при общей эффективности получения трансгенных кур 8,8%. При использовании в качестве источника генных конструкций вирусного препарата, концентрированного в 20 и 100 раз, и клеток-упаковщиц в концентрации 500 и 2000 клеток/эмбрион данный показатель составил, соответственно, 5,0, 3,8,7,5 и 3,8%.

Топографический анализ паттернов интеграции показал, что наибольший процент трансформированных органов и тканей наблюдался при введении в эмбрионы кур клеток-упаковщиц в концентрации 500-1000 клеток/эмбрион - до 40,0±4,7%. Экспрессия репортерного белка, как и в

предыдущем опыте, была выявлена, преимущественно, в клетках печени, сердца, кишечника, мышечной ткани и репродуктивных органах. Максимальный процент трансформации репродуктивных органов наблюдался при использовании в качестве источника генных конструкций клеток-упаковщиц в концентрации 1000 клеток/эмбрион - 42,9%. При введении концентрированного вирусного препарата и клеток-упаковщиц в концентрации 2000 клеток/эмбрион данный показатель был на 9,6-17,9% ниже и варьировал от 25,0 до 33,3%.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить оптимальные условия для результативного переноса рекомбинантной ДНК в эмбрионы кур: максимальная эффективность трансгенеза была установлена при введении ретровирусных векторов в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов в виде суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 500-1000 клеток/эмбрион.

3.3. Эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих целевые гены человека, для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo С целью апробации усовершенствованного метода создания трансгенной птицы посредством использования ретровирусных векторов была проведена трансформация эмбрионов кур генными конструкциями pX-RSVhGh (п=100) и pX-Ins (п=100). Исходя из выявленных ранее закономерностей, в качестве источника генных конструкций использовали суспензию клеток-упаковщиц, которую вводили непосредственно в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов в концентрации 1000 клеток/эмбрион.

Введение генной конструкции pX-RSVhgh. Из 100 эмбрионов, проинъецированных генной конструкцией pX-RSVhgh, было получено 17 цыплят, что составило 22,7% от вывода молодняка в контрольной группе (табл. 4). В опытной группе отмечалась более высокая эмбриональная смертность (91,0%) по сравнению с контрольной группой (68,0%). При этом наибольший процент остановившихся в развитии эмбрионов был установлен в начале инкубации - 16,2% от общего числа проинъецированных эмбрионов. Анализ на трансгенность неразвившихся в процессе инкубации эмбрионов и вылупившихся цыплят показал наличие рекомбинантной ДНК в 42 из 68 случаев, в том числе у 8 из 17 вылупившихся цыплят. Частота интеграции генной конструкции составила 61,8% при эффективности получения трансгенных кур 8,0%.

Введение генной конструкции pX-Ins. Из 100 эмбрионов, проинъецированных генной конструкцией pX-Ins, было получено 16 цыплят, что было на 60,0% ниже по сравнению с выводом молодняка в контрольной группе (табл. 4).

Введение ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo

Показатель Опыт№1 Опыт №2

Группа опыт контроль опыт контроль

Генная конструкция pX-RSVhgh - pX-Ins -

Проинъецировано и/или заложено на инкубацию эмбрионов, шт 100 40 100 50

Введено клеток-упаковщиц, клеток/мкл 1000) 1000

Развилось эмбрионов, п(%) в т.ч. трансгенных, п 68 (68,0) 42 36 (91,0) 71 (71,0) 38 45 (90,0)

Вылупилось цыплят, п(%) в т.ч. трансгенных, п 17 (17,0) 8 30 (75,0) 16 (16,0) 7 38 (76,0)

Частота интеграции, % 61,8 - 53,5 -

Общая эффективность трансгенеза , % 42,0 - 38,0 -

Эффективность получения трансгенных кур , % 8,0 - 7,0

Примечание: *отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в %; **отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов, к числу инъецированных яиц, выраженное в %; ***отношение числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу инъецированных яиц, выраженное в %.

Следует отметить, что при использовании генной конструкции рХ-1т процент вылупления был несколько ниже по сравнению с генной конструкцией pX-RSVhgh. После проведения генноинженерных манипуляций развитие эмбрионов наблюдалось в 71% случаев. Максимальный пик эмбриональной смертности был установлен в первую неделю инкубации -14,3%. Наличие рекомбинантной ДНК было выявлено у 53,5% развившихся после генноинженерных манипуляций эмбрионов, в том числе у 7 (из 16) вылупившихся цыплят.

Анализ интеграции и экспрессии генных конструкций. ПЦР-анализ органов и тканей полученной трансгенной птицы выявил мозаичность интеграции генных конструкций. Наличие рекомбинантной ДНК было установлено, преимущественно, в клетках печени, кишечника, яйцевода, репродуктивных органах, а также мышцах (рис. б).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Дорожки: 1,2 - кишечник, 3,4 -

мышцы, 5,6 -яйцевод, 7,8 — сердце, 9,10 - почки, 11,12 -яичник, 13,14 - отрицательный контроль (ДНК интактной курицы), 15 - положительный контроль (ДНК генной конструкции).

Рис. 6. ПЦР органов и тканей курицы №2596 на наличие гена инсулина человека

Процент трансформированных органов у полученной после генноинженерных манипуляций птицы варьировал от 40,0±6,7 до 41,3±4,8 % в зависимости от генной конструкции. При этом эффективность трансформации репродуктивных органов достигала 50%, яйцевода - 57%

(рис. 7).

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

%

■В

а

!печень

ш кишечник

□ яйцевод

□ мышечная ткань

■ репродуктивные органы

Введение генной конструкции Введение генной конструкции рХ-тэ рХ^БУИдЬ

Рис. 7. Эффективность трансформации органов и тканей трансгенных кур при введении различных генных конструкций в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов

Данные ПЦР были подтверждены иммуногистохимическими исследованиями. Наиболее сильная экспрессия рекомбинантных белков, в частности, гормона роста и инсулина человека, была установлена в клетках яйцевода и мышечной ткани. Трансформированные клетки кишечника, печени и репродуктивных органов имели менее интенсивную окраску (рис. 8).

Рис. 8. Иммуногистохимическое окрашивание органов и тканей кур на

гормон роста человека Примечание: 1 - яйцевод, 2 - мышечная ткань; а ~ опыт, б - контроль.

Экспрессия гормона роста окрашена ДАБ в коричневый цвет, показана стрелками. Ye. х400.

Сопоставляя полученные результаты по генетической трансформации эмбрионов кур in vivo с использованием двух различных генных конструкций pX-ins и pX-RSVhgh, следует отметить, что эффективность переноса экзогенной ДНК в клетки-мишени была практически одинаковой. Процент полученной трансгенной птицы от общего числа проинъецированных эмбрионов варьировал от 7,0 до 8,0%, При этом интеграция ДНК генной конструкции при использовании разных векторов была установлена в одних и тех же органах, а характер экспрессии рекомбинантных белков в данных органах был практически идентичным, что свидетельствует о результативности использования усовершенствованного нами метода переноса экзогенной ДНК в эмбрионы кур in vivo посредством использования модифицированных ретровирусов для получения трансгенной птицы.

4. ВЫВОДЫ

1. Установлена компетентность эмбриональных клеток кур in vitro к рекомбинантным ретровирусам, полученным на основе векторов pBMN и рХ. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала от 8,6* 10"4 до 5,9* 10"3 в зависимости генной конструкции и метода трансфекции.

2. Выявлены факторы, влияющие на результативность генетической модификации эмбрионов кур in vivo рекомбинантными ретровирусами. С использованием генной конструкции pBMN-lacZ получены трансгенные цыплята с частотой интеграции экзогеннойй ДНК от 28,6 до 66,7% в зависимости от метода и стадии генно-инженерных манипуляций, а так же способа подготовки и концентрации генных конструкций.

3. Установлена высокая по сравнению с контролем эмбриональная смертность в опытных группах кур после проведения генно-инженерных манипуляций с эмбрионами. Максимальный процент гибели эмбрионов выявлен в первую неделю инкубации - от 10,0 до 50,0% при аналогичном показателе в контрольной группе 1,3%.

4. Усовершенствован метод введения ретровирусных генных конструкций в эмбриональные клетки кур, позволяющий получать трансгенную птицу с эффективностью до 8,8%. Максимальная результативность трансгенеза выявлена при введении клеток-упаковщиц в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов кур в концентрации 1000 клеток/эмбрион.

5. Установлен мозаичный характер интеграции и экспрессии генных конструкций в органах и тканях трансгенных цыплят. Наличие и экспрессия ДНК генных конструкций выявлены, преимущественно, в клетках сердца, печени, кишечника, репродуктивных органов, а также мышечной ткани. При введении генных конструкций в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов установлена трансформация репродуктивных органов у 25,0-42,9% полученных трансгенных цыплят в зависимости от концентрации вводимых генных конструкций.

6. Показана эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены инсулина и гормона роста человека, для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo. Интеграция генных конструкций выявлена у 53,5-61,8% развившихся эмбрионов при общей эффективности получения трансгенных цыплят 7,0-8,0%. Экспрессия рекомбинантных белков установлена, преимущественно, в клетках кишечника, печени, яйцевода, репродуктивных органов, а так же мышечной ткани.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся генной и клеточной инженерией животных, рекомендуем для эффективной трансформации органов и тканей

кур in vitro и in vivo использовать генные конструкции на основе рекомбинантных ретровирусов.

Для получения трансгенных цыплят с эффективностью 7,0-8,0% рекомендуем осуществлять введение генных конструкций на основе рекомбинантных ретровирусов в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов в виде суспензии клеток-упаковщиц.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волкова, H.A. Эффективность переноса экзогенной ДНК в клетки эмбрионов кур in vitro и in vivo с использованием ретровирусных векторов / H.A. Волкова, А.О. Туликова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, JI.K. Эрнст, Е.К. Томгорова, Н.С. Лоцманова II Доклады РАСХН.- 2007.- № 3 - С.37-39.

2. Волкова, Л.А. Оптимизация отдельных элементов технологии создания трансгенной птицы / Л.А. Волкова, А.О. Туликова, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы IV международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве».-Боровск,- 2006.-С.229-230.

3. Волкова, H.A. Эффективность использования ретровирусных векторов для трансформации эмбриональных клеток кур in vivo / H.A. Волкова, Л.А. Волкова, А.О. Туликова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы VI международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных».-Дубровицы.-2006.-С.52-53.

4. Томгорова Е.К. Эффективность использования ретровирусных векторов для получения трансгенных кур / Е.К. Томгорова, Д.В. Белоглазов, А.О. Туликова, H.A. Волкова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы 7-ой международной научной конференции-школы «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии»,- Дубровицы.-2008.-С.224-227.

Издательство ВНИИ животноводства 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8-4967)65-15-97

Сдано в набор 08.06.2010. Подписано в печать 09.06.2010 _Заказ № 12. Псч. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ВНИИ животноводства

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тулякова, Анастасия Олеговна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Особенности эмбрионального развития кур.

1.2. Методы трансгенеза в птицеводстве.

1.2.1. Микроинъекция ДНК в цитоплазму зиготы.

1.2.2. Использование вирусных векторов для переноса экзогенной ДНК в эмбриональные клетки и органы птицы.

1.2.3. Использование эмбриональных стволовых клеток.

1.2.4. Использование примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) для получения трансгенной птицы.

1.2.5. Осеменение самок трансформированными спермиями.

1.3. Ретровирусные векторы как эффективная система переноса чужеродных генов в клетки эукариот.

1.3.1 Биологические особенности ретровирусов.

1.3.2 Создание ретровирусных векторов.

1.3.3 Пакующие линии клеток.

1.3.4 Свойства ретровирусных векторных систем и их использование для генетической модификации сельскохозяйственной птицы.

1.4 Применение трансгенных кур.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Реактивы и оборудование.

2.2. Генные конструкции.

2.3 Работа с культурой клеток.

2.3.1 Культивирование клеток.

2.3.2 Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы.

2.3.3 Трансформация эмбриональных клеток кур in vitro ретровирусными векторами.

2.3.4 Введение ретровирусных векторов в в эмбрионы кур in vivo.

2.4. Анализ на наличие генной конструкции.

2.5 Анализ экспрессии рекомбинантных белков.

2.5.1 Имму ногистохимия.

2.5.2 Оценка экспрессии экзогенной [3-галактозидазы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур ретровирусными векторами в культуре in vitro.

3.2. Изучение факторов, влияющих на результативность получения трансгенных кур.

3.2.1. Способ и стадия введения генных конструкций в эмбрионы

3.2.2. Способ подготовки генных конструкций для инъекции и их концентрация.

3.3. Эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих целевые гены человека, для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo.

3.3.1. Введение в эмбрионы кур генной конструкции рХ-RSVhgh.

3.3.2. Введение в эмбрионы кур генной конструкцииpX-ins.

3.3.3. Анализ эффективности интеграции генных конструкций в органах и тканях опытных кур.

3.3.4. Анализ экспрессии рекомбинантных белков в органах и тканях опытных кур.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая трансформация эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов"

Создание генетически модифицированной птицы рассматривается в последние годы в качестве альтернативной технологии получения рекомбинатных белков человека, характеризующейся по сравнению с другими методами синтеза рекомбинатных белков (прокариотические и эукариотические клеточные системы, трансгенные животные биореакторы) относительно низкими материальными и временными затратами [Mizuarai S. et al., 2001; Harvey A. et ah, 2002; Mozdziak P. et ah, 2003; Kamihira M et a]., 2005; Kawabe Y. et al., 2006, Сураева H.M., 2008]. К важным преимуществам данной технологии производства рекомбинатных протеинов по сравнению с созданием животных-биореакторов следует отнести короткий генерационный интервал сельскохозяйственной птицы, позволяющий получать стадо продуцентов уже через полгода после получения родоначальников (для сравнения, получение стада продуцентов крупных сельскохозяйственных животных — коров, коз, свиней - требует до 3-5 лет), высокую белоксинтезирующую способность птицы, а также отсутствие патогенной микрофлоры в белке яйца. Вышеназванные преимущества обуславливают относительно невысокую стоимость получаемых рекомбинантных протеинов: затраты на производство 1 грамма рекомбинантного белка составляют около 10-25 центов, в то время как при использовании для этих целей молочной железы трансгенных животных стоимость возрастает до 100 долларов [Das R.C., 2001].

Однако традиционный метод получения трансгенных животных — микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы - является малоэффективным для получения трансгенной птицы, что связано, прежде всего, с особенностями ее воспроизводства и развития, а именно с трудностью в точности определения овуляции, большим количеством желтка в яйцеклетке, сильным уплотнением цитоплазмы около пронуклеусов. Все это требует поиска и разработки альтернативных методов переноса экзогенной ДНК, одним из которых является использование векторных систем на основе ретровирусов.

Цель и задачи исследований

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение факторов, влияющих на результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить компетентность эмбриональных клеток кур к рекомбинантным ретровирусным векторам in vitro.

2. Определить факторы, влияющие на результативность введения рекомбинантных ретровирусов в эмбриональные клетки кур (способ и период введения, концентрация и тип используемого препарата).

3. Изучить результативность генетической трансформации модифицированными ретровирусами эмбрионов кур in vivo.

4. Оценить влияние генно-инженерных манипуляций на развитие эмбрионов кур.

5. Провести анализ интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур.

Научная новизна

Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в эмбриональные клетки кур посредством использования ретровирусных векторов, изучено влияние проводимых генно-инженерных манипуляций на эмбриогенез кур. Выявлены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации эмбрионов кур in vivo. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов (lacZ, инсулин и гормон роста) в различных органах и тканях полученной трансгенной птицы.

Практическая значимость

Усовершенствован метод получения трансгенных кур, основанный на использовании ретровирусных векторов. Предложен усовершенствованный способ введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки создания трансгенной птицы, позволяющей получать трансгенных кур с интеграцией и экспрессией генов инсулина и гормона роста в ряде внутренних органов: сердце, печени, кишечнике, желудке, яйцеводе и репродуктивных органах, а также в мышечной ткани.

Основные положения, выносимые на защиту

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как результативный способ генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и in vivo.

• Способ подготовки, состав инъекционного препарата, стадия введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo как факторы, влияющие на результативность получения трансгенной птицы.

• Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, 2008гг.; «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006 г.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 109 страницах, содержит 9 таблиц, 24 рисунка, 9 графиков, 1 схему. Библиографический список содержит 110 источников, в том числе 90 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Тулякова, Анастасия Олеговна

5. ВЫВОДЫ

1. Установлена компетентность эмбриональных клеток кур in vitro к рекомбинантным ретровирусам, полученным на основе векторов pBMN и рХ. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала от 8,6*10"4 до 5,9*10"3 в зависимости генной конструкции и метода трансфекции.

2. Выявлены факторы, влияющие на результативность генетической модификации эмбрионов кур in vivo рекомбинантными ретровирусами. С использованием генной конструкции pBMN-lacZ получены трансгенные цыплята с частотой интеграции экзогеннойй ДНК от 28,6 до 66,7% в зависимости от метода и стадии генно-инженерных манипуляций, а так же способа подготовки и концентрации генных конструкций.

3. Установлена высокая по сравнению с контролем эмбриональная смертность в опытных группах кур после проведения генно-инженерных манипуляций с эмбрионами. Максимальный процент гибели эмбрионов выявлен в первую неделю инкубации - от 10,0 до 50,0% при аналогичном показателе в контрольной группе 1,3%.

4. Усовершенствован метод введения ретровирусных генных конструкций в эмбриональные клетки кур, позволяющий получать трансгенную птицу с эффективностью до 8,8%. Максимальная результативность трансгенеза выявлена при введении клеток-упаковщиц в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов кур в концентрации 1000 клеток/эмбрион.

ДНК генных конструкций выявлены, преимущественно, в клетках сердца, печени, желудка, кишечника, репродуктивных органов, а также мышечной ткани. При введении генных конструкций в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов установлена трансформация репродуктивных органов у 25,042,9% полученных трансгенных цыплят в зависимости от концентрации вводимых генных конструкций.

6. Показана эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены инсулина и гормона роста человека, для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo. Интеграция генных конструкций выявлена у 53,5-61,8%) развившихся эмбрионов при общей эффективности получения трансгенных цыплят 7,0-8,0%). Экспрессия рекомбинантных белков установлена, преимущественно, в клетках кишечника, печени, яйцевода, репродуктивных органов, а так же мышечной ткани.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся генной и клеточной инженерией животных, рекомендуем для эффективной трансформации органов и тканей кур in vitro и in vivo использовать генные конструкции на основе рекомбинантных ретровирусов.

Для получения трансгенных цыплят с эффективностью 7,0-8,0% рекомендуем осуществлять введение генных конструкций на основе рекомбинантных ретровирусов в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов в виде суспензии клеток-упаковщиц.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тулякова, Анастасия Олеговна, п. Дубровицы

1. Абдрахманов И. К. Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих: автореф. диссер. канд. биол. наук.- Дубровицы. 2001. С. 22.

2. Бессарабов Б. Ф. Инкубация яиц с основами эмбриологии сельскохозяйственной птицы / М.:КолосС. 2006. С.248.

3. Брем Г., Зиновьева Н.А., Эрнст JI.K. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // Сельскохозяйственная биология. 1993. №6. С.3-27.

4. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве /М.-РАСХН. 1995. С.326.

5. Волкова JI.A. Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток «упаковщиц»: автореф. дисс. канд. биол. наук.-Дубровицы. 2005. С. 25.

6. Вракин В. Ф., Сидорова М. В., Панов В. П. Морфология сельскохозяйственных животных. Анатомия и гистология с основами цитологии и эмбриологии / М.:Гринлайт. 2008. С. 510-516.

7. Гистология / Под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юрина М.: Медицина, 2002. - 695с.

8. Зиновьева Н. А., Эрнст JI. К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве // Дубровицы: ВИЖ. 2001.С. 128.

9. Зиновьева Н. А., Эрнст JI.K. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных // Дубровицы: ВИЖ. 2004. С. 316.

10. Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С. Саркизова, Ю.П. Перова. М.: Медицина, 1996. - 544 с.

11. Новое в клонировании ДНК. Методы. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1989. -368с.

12. Ромейс, Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. Пер. с нем. В .Я. Александрова, З.И. Кроковой М.: Изд.-во иностр. лит.-ры, 1953. - 718с.

13. Сураева Н. М., Самойлов А. В. Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы// Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 2009. Т. 20, №4. С. 19-23.

14. Сюрин В. Н. Вирусные болезни животных./ М.: ВНИТИБП, 1998. 363-460 с.

15. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих// Молекулярная биология. 1989. Т. 23, вып. 2. С. 8-12.

16. Титова В. А., Зиновьева Н. А., Волкова Н. А. Использование ретровирусных векторов для переноса генов в органы-мишени у сельскохозяйственных животных// Международная конференция. 2001. С. 90.

17. Эрнст JT. К., Зиновьева Н. А., Брем Г. Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве. М.: РАСХН, 2002. 341с.

18. Эрнст JI. К., Прокофьев М. И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1995. 192с.

19. Chapman, Hu W., Ivarie R. Rapid and improved method for windowing eggs accessing the stage x chicken embryo// Mol. Reprod. 2005. Dev. 69:31-34.

20. Barnard R., Elleder D., Young J. Avian sarcoma and leukosis virusvreceptor interactions: from classical genetics to novel insights into virus-cell membrane fusion// Virology. 2004. P. 25-29.

21. Reconstitution of a chicken breed by inter se mating of germline chimeric birds/ M. Bednarczyk et al. Poult. Sci, 2002. 81, 1347-1353.

22. Bednarczyk M., Lakota P., Siwek M. Improvement of hotchability of chicken eggs injected by biastodermal cells// Poult Sci. 2000. 79, 1823-1828.

23. Borwornpinyo S., Brake J., Mozdziak P., Petitte J. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells// Poult. Sci. 2005. 84, 1477-1482.

24. Bosselman R., Hsu R., Boggs T, Hu S. Germline transmission of exogenous genes in the chicken // Science. 1989. 243, 533-535.

25. Brinster R., Avarbock M. Germ line transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation// PNAS. 1994. 91, 11303-11307.

26. Brasolot C., Chen H., Trumbauer M., Senear A., Warren R., Palmiter R. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs// Cell. 1991. 27, 223-231.

27. Carsience R., Clark M., Verrinder Gibbins A., Etches R. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos // Development. 1993. 117, 669-675.

28. Chang I., Jeong D., Hong Y., Park T. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells// Cell Biol. Int. 1997. 21, 495-499.

29. Clark A. J. Pharmaceuticals from transgenic livestock// Trends Biotechnol. 1997. 5, 20-24.

30. Coffin J. Structure and classification of retroviruses// Plenum Press, NY. 1992. P. 19-49.

31. DCosta S., Pardue S., Petitte J. Comparative development of avian primordial germ cells and production of germ line chimeras// Avian Poult Biol Rev. 2001. 12, 151-168.

32. Das R. Production of therapeutic proteins from transgenic animals// Bio Business. 2001. P. 60-62.

33. Ebara F., Fujihara N. Reproductive characteristics of transgenic (TG) chickens carrying an exogenous gene // Asian J Androl. 1999. Vol. 1. P. 139-144

34. The receptor for the subgroup С avian sarcoma and leukosis viruses, Tvc, is related to mammalian butyrophilins, members of the immunoglobulin superfamily/ Elleder D. et al. Journal of Virology, 2005. 79, 10408-10419.

35. Emery D, Friedemann Т., Yee J. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus// Journal of Virology. 1998. 65, 1202-1207.

36. Fulton J., Delany M. Genetics. Poultry genetiresources—Operation rescue needed// Science. 2003. 300, 1667-1668.

37. Gordon J., Scongos G., Plotkin D., Sorbose J. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. 77, 7380-7384.

38. Harvey A., Ivarie R. Validating the hen as a bioreactor for the production of exogenous proteins in egg white// Poult Sci. 2003. 82, 927-930.

39. Harvey A., Speksnijder G., Bough L., Morris J. Consistent production of transgenic chickens using replication-deficient retroviral vectors and high throughput screening procedures // Poult Sci. 2002a. 81, 202-212.

40. Harvey A., Speksnijder G., Bough L., Morris J. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens// Nat Biotechnol. 2002b. 20, 396-399.

41. Hajkova P., El-Maarri O., Engemann S., Oswald J. DNA-methylation analysis by the bisulfite-assisted genomic sequencing method // Methods in Molecular Biology. 2002. 200, 143-154.

42. Han J., Park Т., Hong Y., Jeong D. Production of germline chimeras by transfer of chicken gonadal primordial germ cells maintained in vitro for an extended period//Theriogenology. 2002. 58, 1531-1539.

43. Hejnar J., Ha'jkova P., Plachy J., Elleder D. CpG island protects Rous sarcoma virus-derived vectors integrated into nonpermissive cells from DNA methylation and transcriptional suppression // PNAS. 2001. 98, 565-569.

44. Ivarie R. Avian transgenesis: progress towards the promise // Trends Biotechnol. 2003. 21, 14-19.

45. The developmental origin of primordial germ cells and the transmission of the donor-derived gametes in mixed-sex germline chimeras to the offspring in the chicken / Kagami H. et al. Mol. Reprod. Dev, 1997. 48, 501510.

46. Kanatsu-Shinohara M., Ogonuki N., Inoue K., Miki H. Long-term proliferation in culture and germ line transmission of mouse male germline stem cells // Biology of Reproduction. 2003. 69, 612-616.

47. Kanatsu-Shinohara M., Toyokuni S., Shinohara T. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ line stem cells in vivo // Biology of Reproduction. 2004. 71, 1202-1207.

48. Karagenc L. Origin of primordial germ cells in the prestreak chick embryo//Dev. Genet. 1996. 19, 290-301.

49. Kawabe Y. Production of scFv-Fc Fusion Protein Using Genetically manipulated Quails //Biosciens and Bioengineering. 2006. Vol. 102. P. 297-303.

50. Kalina J., S~enigl F., MicVkova' A., Mucksova' J., Blaz'kova'J., Yan H., Popls^tein M., Hejnar J., Trefil P. Retrovirus-mediated in vitro gene transfer into chicken male germ line cells // Reproduction. 2007. Vol. 134. P. 445453.

51. Kamihira, Pain S., Leibo M., Cochran M. Production of chicken chimeras from injection of frozen-thawed blastodermal cells // Poult. Sci. 2005. 76, 753-760.

52. Kawabe, Coltey M., Le Douarin N. Postnatal development of a demyelinating disease in avian spinal cord chimeras // Cell. 2006. 45, 307-314.

53. Retrovirus-mediated gene transfer and expression of EGFP in chicken/ B. Koo et al. Molecular Reproduction and Development, 2004. 68, 429-434.

54. Kubota H., Avarbock M., Brinster R. Growth factors essential for selfrenewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells // PNAS. 2004. 101, 16489-16494.

55. Koo В., Koo В., Choi В., Lee H. Development of transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein// Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. 320, 442-448.

56. Efficient production by sperm-mediated gene transfer of human decay accelerating factor (hDAF) transgenic pigs for xenotransplantation // M. Lavitrano et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99, 14230-14235.

57. Lavitrano M., Forni M., Bacci M., Di Stefano C. Sperm mediated gene transfer in pig: selection of donor boars and optimiza tion of DNA uptake // Mol Reprod Dev. 2003. 64, 284-291.

58. Van de Lavoir M., Diamond J., Leighton P., Mather-Love C. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells // Nature 2006. Vol. 44. P. 766-769.

59. Li С., Song Y„ Sha J., Wang N. Production of duck-chicken chimeras by transferring early biastodermal cells // Poult Sci. 1995. 81, 1360-1364.

60. Lois C., Hong E., Pease S., Brown E. Germline transmission and tissue-specific expression of trans-genes delivered by lentiviral vectors // Science. 2002. 295, 868-895.

61. Love J., Gribbin C., Mather C., Sang H. Transgenic birds by DNA microinjection//Biotechnology. 1994. 12, 60-63.

62. McGrew M., Sherman A., Ellard F., Lillico S. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors // EMBO Reports. 2004. 5, 728-733.

63. McGrew M., Sherman A., Ellard F., Lillico S. Efficient production of transgenic chickens using lentiviral vectors // Transgenic Animal Research Conference IV. University of California-Davis. 2003. P. 10-14.

64. Meloun M., Militky J., Forina M. Retrovirusmediated gene delivery into male germ line stem cells // FEBS Letters. 2000. P. 7-10.

65. Mikawa Т., Fischman D., Dougherty J., Brown A. In vivo analysis of a new lacZ retrovirus vector suitable for cell lineage marking in avian and other species/ / Exp Cell Res. 1991. 195, 516-523.

66. Mizuarai S., Ono K., Yamaguchi K., Nishijima M. Production of transgenic quails with high frequency of germ-line transmission using VSV-G pseudotyped retroviral vector // Biochem Biophys Res Commun. 2001. 286, 456463.

67. Mozdziak P., Borwornpinyo S., McCoy DW., Petitte J. Development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase // Dev Dyn. 2003. 226, 439-445.

68. Mozdziak P., Angerman-Stewart J., Rushton В., Pardue S. Isolation of chicken primordial germ cells using fluorescence-activated cell sorting // Poult. Sci. 2005. 84, 594-600.

69. Nagano M., Brinster C., Orwig K., Ryu B. Transgenic mouse produced by retroviral transduction of malegermline stem cells // PNAS. 2001. Vol. 99. P. 131-135.

70. Nagano M., Ryu В., Brinster C., Avarbock M. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro // Biology of Reproduction. 2003. 68, 22072214.

71. Naito M., Nirasawa K., Oishi T. Development in culture of the chick embryo from fertilized ovum to hatching // J. Exp. Zool.1994. 254,322-326.

72. Naldini, Perry M. Development in culture of the chick embryo from cleavage to hatch // Br. Poult. Sci. 1996. 30, 251-256.

73. Naito M., Tajima A., Tagami Т., Yasuda Y. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring// J. Reprod. Fertil. 1994a. 102, 321-325.

74. Naito M., Tajima A., Tagami Т., Yasuda Y. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells // Mol. Reprod. Dev. 1994b. 39, 153-161.

75. Опо Т., Machida Y. Immunomagnetic purification of viable primordial germ cells of japanese quail (Coturnix japonica) Сотр. Biochem. Physiol. Part A Mol. // Integr. Physiol. 1999. 122, 255-259.

76. Опо Т., Wakasugi N. Mineral content of quail embryos cultured in mineral-rich and mineral-free conditions // Poult. Sci. 1994. 63,159-166.

77. Pain В., Clark M., Shen M., Nakazawa H. Long-term in vitro culture and characterization of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities//Development. 1996. 122, 2339-2348.

78. Park Т., Jeong D., Kim J., Song G. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos // Biol. Reprod. 2003. 68, 1657-1662.

79. Pittoggi C., Beraldi R., complete culture system for the chick embryo //Nature. 2006. Vol. 331. P. 70-72.

80. Petitte J., Liu G., Yang Z. Avian pluripotent stem cells // Mechanisms of Development. 2004. 121, 1159-1168.

81. Petitte J., Clark M., Liu G., Etches R. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells // Development. 1990. Vol. 108. P. 185-189.

82. Petitte J., Mozdziak P. Production of transgenic poultry. In: Pinkert С A. editor. Transgenic technology: a laboratory handbook second edition // New York: Elsevier Science. 2002. P. 279-306.

83. Reynaud G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection // J. Embryol. Exp. Morphol. 1989. Vol. 21. P. 485-507.

84. Sang H. Prospects for transgenesis in the chick // Mechanisms of Development. 2004. 121, 1179-1186.

85. Salter, Carsience R., Etches R., Verrinder Gibbins A. The fate of female donor blastodennal cells in male chimeric chickens // Biochem. Cell. Biol. 1992. Vol. 70. P. 121-122.

86. Simkiss K., Rowlett K., Bumstead N., Freeman B. Transfer of primordial germ cell DNA between embryos // Protoplasma. 1999. 151,164-166.

87. Song Y., D'Costa S., Pardue S., Petitte J. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion // Mol. Reprod. Dev. 2005. Vol. 70. P. 438-444.

88. Speksnijder G., Ivarie R. A modified method of shell windowing for producing somatic or germline chimeras in fertilized chicken eggs // Poult. Sci. 2000. 79, 1430-1433.

89. Swift C. Origin and early history of primordial germ cells in the chick//Am. J. Physiol. 1994. Vol. 15. P.483-516.

90. Thoraval P., Lasserre F., Coudert F., Dam brine G.Somatic and germline chicken chimeras obtained from brown and white leghorns by transfer of early blastodermal cells //Poult. Sci. 1995. Vol. 73. P. 189-191.

91. Thurston R., Korn N. Spermiogenesis in comercial poultry species: anatomy and control // Poultry Science. 2000. 79, 1650-1668.

92. Trefil P., Polak J., Poplstein M., Mikus M. Preparation of fowl tetstes as recipient organs to germ-line chimeras by means of g-radiation // British Poultry Science. 2003. Vol. 44. P. 643-650.

93. Vick L., Luke G., Simkiss K. 1993. Germ-line chimaeras can produce both strains of fowl with high efficiency after partial sterilization // J. Reprod. Fertil. 1993. Vol. 98. P. 637-641.

94. Wei Q., Croy В., Etches R. Selection of genetically modified chicken blastodermal cells by magnetic-activated cell sorting // Poult. Sci. 2001. Vol. 80. P.161-168.

95. Wentworth A., Tsai H., Hallett J., Gonzales D. Manipulation of avian primordial germ cells and gonadal differentiation // Poult. Sci. 1989. Vol. 68. P. 999-1010.

96. Wentworth A., Wentworth B. The avian primordial germ cell.An enigma of germline evolution, development and immortality // Avian Poult. Biol. Rev. 2000. Vol. 11. P. 173-282.

97. Yasuda Y., Tajima A., Fujimoto Т., Kuwana T. A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells // J. Reprod. Fertil. 2001. Vol. 96. P. 521-528.

98. Zhao D., Kuwana T. Purification of avian circulating primordial germ cells by nycodenz density gradient centrifugation // Br. Poult. Sci. 2003. Vol. 44. P. 30-35.

99. Zhu L., van de Lavoir M., Albanese J., Beenhouwer P. 2005. Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens // Nat. Biotechnol. 2005. Vol. 23. P. 115-119.