Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая модификация дистрофин-дефицитной мышечной ткани в клеточной терапии наследственных миодистрофий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Кузнецов, Александр Борисович

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера -клиническая характеристика и биологические модели.

1.1.1. Клинико-генетическая характеристика прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна / Беккера

1.1.2. Этиология и патогенез заболевания

1.1.3. Биологические модели миодистрофии Дюшенна/Беккера.

1.2. Клеточная терапия прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера

1.2.1. Стволовые и прогениторные клетки

1.2.2. Применение стволовых клеток в лечении прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Характеристика экспериментальных животных

2.2. Идентификация мутации в гене дистрофина у мышей шёх

2.3. Характеристика ранних предшественников миогенеза

2.4. Методика трансплантации человеческих клеток мышам шёх

2.5. Иммуногистохимическое выявление человеческих ядер и дистрофина в мышечной ткани мышей-реципиентов

2.7. Исследование активности маркерных ферментов мышечного поражения в плазме крови мышей шёх.

2.8. Определение количества СБ25+ лимфоцитов и моноцитов в крови мышей шёх до- и после трансплантации

2.9. Исследование реакции сердечно-сосудистой системы на трансплантацию человеческих клеток

2.10. Плавательный тест

2.11. Статистическая обработка результатов исследования

Глава 3. Морфо-гистохимический исследование мышечной ткани мышей т(1х после трансплантации РПМ человека.

3.1. Исследование миграции и распределения человеческих клеток в мышечной ткани мышей тс1х после трансплантации ранних предшественников миогенеза человека.

3.2. Исследование синтеза дистрофина после трансплантации ранних предшественников миогенеза человека мышам тс1х.

Глава 4. Изучение активности биохимических маркеров миодистрофического поражения, показателей иммунного статуса и системного действия клеток человека на различные ткани и органы мышей тс1х.

4.1. Изменение активности- маркерных ферментов мышечного поражения (креатинкиназы и лактатдегидрогеназы) у мышей тс!х после трансплантации РПМ человека.

4.2. Влияние трансплантации РПМ человека на иммунную, кроветворную и другие системы организма.

Глава 5. Изменение функционального состояния скелетных мышц и сердечно-сосудистой системы до- и после трансплантации РПМ человека.

5.1. Изменение двигательной активности мышей тс1х после трансплантации РПМ человека.

5.2. Изменение основных сердечных показателей у мышей mdx после трансплантации человеческих клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая модификация дистрофин-дефицитной мышечной ткани в клеточной терапии наследственных миодистрофий"

Актуальность проблемы

К настоящему времени согласно данным МЗ РФ в России зарегистрировано около 2,5 млн. людей, страдающих двигательными нарушениями различного генеза. Медико-социальная реабилитация таких больных резко ограничена наличием органических дефектов мышечной ткани, а также центрального и периферического нейронов. Среди этих заболеваний особое место занимает прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна / Беккера (МДД/Б), которая является одним из наиболее тяжелых наследственных болезней человека. Заболевание начинается в раннем возрасте, быстро прогрессирует, приводя к обездвиживанию к концу первого десятилетия жизни и смерти при явлениях сердечной и дыхательной недостаточности к концу второго десятилетия.

В последние годы достигнут большой прогресс в изучении природы данного заболевания, идентифицирован ген и белок, ответственные за развитие миодистрофии, налажена система ДНК-диагностики. Однако терапия болезни по-прежнему остается безуспешной. Большие надежды на успех в лечении этого заболевания были связаны с генотерапией. Действительно, первые работы по трансгенозу минигена дистрофина мышам шёх, были обнадеживающими. Однако, как стало ясно из последующих исследований, эффект от трансгеноза оказался непродолжительным. Возникли проблемы с доставкой генетических конструкций в ткань, а также выраженный иммунный ответ на повторное введение минигена в составе вирусных носителей (1).

Новым направлением в лечении МДД/Б могла бы стать клеточная терапия. В основополагающем исследовании А.Н. Студицкого (1977) и его сотрудников (Булякова и соавт, 1995) было показана высокая способность стимуляции репарации поврежденной мышечной ткани суспензией измельченных мышц. В работах П.Лоу (114) показана эффективность терапии МДД/Б размноженными в культуре миобластами, которыми обкалывались мышцы больных. Однако, как оказалось в последующем, клиническое действие таких процедур было незначительным, а стоимость крайне высокой. Кроме того, такие трансплантации требовали интенсивной терапии иммуносупресснтами с развитием характерных осложнений от их применении. Новые надежды на эффективную терапию МДД/Б появись после установления высокой пролиферативной активности и пластичности эмбриональных предшественников миогенеза, а также их способность восстанавливать поврежденные ткани (Г.Т. Сухих, B.C. Репин, 1998). Показаны большие терапевтические возможности лечения заболеваний нервной системы трансплантацией эмбриональных клеток ( A.C. Брюховецкий, 2003; М.А. Александрова, А,В, Ревищин, Л.И. Корочкин, 2000).

Новый импульс к применению цитотерапии МДД/Б был получен после открытия стволовых клеток независимо друг от друга научными исследованиями Джона Герхарда и Джеймса Томсона в 1998 году. Оказалось, что стволовые клетки обладают выраженным дифференцировочным потенциалом и способностью компенсировать самые различные тканевые дефекты. Это определило начало нового поиска терапии МДД с помощью стволовых и прогениторных клеток. Соответственно, задачей дальнейшего развития этого направления исследований остается всестороннее изучение возможных механизмов влияния на дистрофин-дефицитные мышцы различных типов клеток предшественников миогенеза, в том числе эмбриональных миобластов и мезенхимальных клеток, а так же комплексный подход к диагностике пред- и посттрансплантационного состояния.

Новым практически не исследованным путем клеточной терапии не только МДД/Б, но и других патологических процессов, является изучение эффекта действия стволовых клеток при межвидовых трансплантациях.

Начатые в 1912 году работы С.С. Воронова (прообраз литературного персонажа М. Булгакова профессора Преображенского) по пересадке клеток щитовидной железы шимпанзе в щитовидную железу ребенка, больного врожденным гипотиреозом развития не получили. Это было обусловлено кратковременностью положительного действия пересадки вследствие развивающейся иммунологической несовместимости тканей донора и реципиента, механизмы которой тогда были неизвестны. Понятно, что наличие дешевого источника клеток в ксеногенных трансплантатах, в случае их успешности, решает множество проблем, в том числе и этических. Трансплантации стволовых клеток животных человеку теоретически вполне возможно, учитывая мощный стимулирующий бласттрансформационный потенциал чужеродных клеток и относительно низкую иммуногенность стволовых клеток. Эта магистральная идея и легла в основу настоящего исследования, являющегося первой попыткой изучения терапевтического влияния ксеногенных (человек - мышь) трансплантаций на примере одного из самых тяжелых и распространенных заболеваний, каким является МДД/Б.

Таким образом,

Целью настоящего исследования явилось определение возможности генетической модификации дистрофин-дефицитной мышечной ткани мышей с наследственной миодистрофией при воздействии на нее ранними предшественниками миогенеза человека.

В работе поставлены следующие конкретные Задачи:

1. Определение выраженности и длительности эффекта индукции синтеза дистрофина у экспериментальных дистрофин-дефицитных мышей шёх с помощью ранних предшественников миогенеза человека.

2. Мониторинг биохимических и иммунологических показателей активности дистрофического процесса до- и после трансплантации.

3. Комплексная оценка функционального состояния различных систем организма экспериментальных животных в ответ на ксеногенные клеточные воздействия.

Научная новизна

Впервые сделана успешная попытка генетической модификации дистрофин-дефицитной мышечной ткани мышей с наследственной мышечной дистрофией (линия тс!х) путем ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток миогенного ряда человека.

Впервые получены данные о высокой пластичности трансплантированных ксеногенных клеток, их способности ассоциироваться с мышечными волокнами реципиента и компенсировать генетический дефект.

Так же впервые показаны низкая иммуногенность трансплантированных ксеногенных клеток, которые в течение длительного времени функционировали в мышечной ткани мышей-реципиентов без какой-либо иммуносупрессии. В то же время, пересадка миобластов, полученных из мышечной ткани генетически близких (отеческих) биопсий, как следует из работ ряда авторов, оказалась менее успешной из-за быстрого развития отторжения пересаженных клеток. Даже при условии интенсивной иммуносупрессии циклоспорином время переживания и функционирования пересаженных клеток было меньшим, чем в наших экспериментах. Это указывает на возможность большего эффекта при использовании ксеногенных клеток, при этом очевидно, что фактором успеха при трансплантации является не столько генетическое родство трансплантированных клеток и тканей реципиента, сколько онтогенетический статус этих клеток. Не исключено, что ксенотрансплантация является дополнительным фактором усиления репаративных процессов в тканях хозяина за счет бласттрансформации клеток реципиента.

Впервые проведено комплексное исследование различных эффектов трансплантации: оценка состояния и возможностей двигательного аппарата, определение активности биохимических маркеров миодистрофического поражения (креатинкиназа, лактатдегидрогеназа), показателей иммунного статуса.

Впервые дана оценка состояния различных тканей и внутренних органов экспериментальных животных при локальных введениях эмбриональных клеток. Показана положительная реакция таких трансплантаций на сердечную мышцу, что делает перспективным клеточную терапию миокардиодистрофий и кардиомиопатий.

Научно-практическая значимость

Получены данные о возможной компенсации генетического дефекта с помощью клеточной терапии такого тяжелого наследственного заболевания как миодистрофия Дюшенна, что определяет новый этап в разработке этиологической и патогенетической терапии наследственных миодистрофий. Показано, что для проведения такой терапии не обязательно использовать генетически родственный клеточный донорский материал. По нашим данным лучший терапевтический эффект возникает при ксеногенных трансплантациях. Это исключительно важно для поиска дешевого клеточного материала, получаемого от животных, филогенетически близких по иммунологическим маркерам. Учитывая неспецифический характер действия трансплантированных клеток и их способность генетически модифицировать и корректировать различные дефекты, лечение пересадками ранних предшественников миогенеза можно использовать при большом количестве различных мышечных патологий как наследственной, так и экзогенной природы. Можно также предположить, что настоящее исследование станет новым стимулом к поиску эффективной клеточной терапии болезней человека.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кузнецов, Александр Борисович

выводы

1. Ксенотрансплантация ранних предшественников миогенеза человека мышам тс1х с наследственной миодистрофией (аналог мышечной дистрофии Дюшенна у людей) приводит к генетической модификации скелетной мускулатуры с восстановлением синтеза дистрофина, утерянного мышцами в результате генетического дефекта.

2. Трансплантированные клетки сохраняют свою жизнеспособность в течение длительного срока (не менее 5 месяцев) и функционально активны. Они мигрируют вдоль поврежденных волокон, вступают во взаимодействие как между собой с образованием миотубулярных структур, так и с мышечными волокнами мышей-реципиентов.

3. После трансплантации активируется ген дистрофина донорских клеток. В результате в мышечных волокнах мышей-реципиентов синтезируется полноразмерный человеческий дистрофии. Синтез сохраняется в течение длительного срока, не менее 5 месяцев.

4. Динамическое изучение маркеров дистрофического процесса до- и после трансплантации выявило наличие фенотипически значимого улучшения состояния животных с генетически модифицированными мышечными волокнами. Это проявлялось снижением показателей активностей креатинфосфокиназы и лактатдегидрогеназы.

5. Специфической особенность ксенотрансплантации ранних предшественников миогенеза является отсутствие выраженных явлений отторжения, что проявляется длительным периодом сохранения функциональных свойств трансплантата в условиях отсутствия какой-либо иммуносупрессии. Однако отмечается увеличение числа активированных (СБ25+) лимфоцитов и моноцитов на 4 сутки после трансплантации, что может указывать на активацию иммунной системы и на усиление репаративных процессов.

6. Ксеногенная трансплантация улучшает функциональное состояние опорно-двигательного аппарата у мышей с наследственной миодистрофией, что особенно наглядно проявляется при проведении плавательного теста. Даже спустя 30 дней после трансплантации продолжительность плавания у мышей тс1х была достоверно выше, чем до введения РПМ.

7. Отмечено положительное влияние пересадки эмбриональных клеток на состояние сердечно-сосудистой системы: восстановление нормального пульса, улучшение кровоснабжение миокарда и нормализация процессов его реполяризации.

8. Отдаленная межвидовая трансплантация эмбриональных предшественников миогенеза в системе «человек-мышь» не только возможна, но и способна вызвать не только заместительный эффект в случае генетической аномалии, но и оказать общестимулирующее влияние на весь организм реципиента. Это открывает новые перспективы в развитии трансплантологии, клеточной терапии и, в частности, в лечении прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Спектр рассмотренных в настоящей диссертации проблем имеет отношение к одной из наиболее актуальных и перспективных проблем современной медицинской генетики - возможности направленной генетической модификации тканевых образований с наследственно-детерминированной-патологией.

До недавнего времени наиболее эффективным путем решения такой задачи считался перенос здорового гена в ткани мишени в составе генноинженерных конструкций. Однако, как стало очевидно, позднее генотерапия наследственных заболеваний пока оказалась мало продуктивной. Это обусловлено сложностями доставки генных конструкций в ткань, кратковременностью их действия, наличия иммунного ответа на введения (1). Кроме того, даже в случае удачной интеграции нужного гена, в геном пораженных соматических клеток, полного восстановления их функции, очевидно, достичь крайне сложно.

Это обусловлено тем, что возникшие в организме к этому времени многочисленные патологические процессы, запущенные первичным действием мутантного гена, введением «здорового» гена едва ли можно устранить. Хорошим примером данного положения является безуспешная попытка генотерапевтического воздействия на мышечную ткань при

МДД/Б трансгенозом минигена дистрофина в составе аденовирусного или других носителей. Даже априори трудно себе представить возможность терапевтического воздействия на дистрофическую мышечную ткань транспортированного минигена, так как к моменту его введения мышечные волокна будут морфологически грубо изменены: потеря ими полигональной структуры, централизация саркоплазматических ядер, наличие фокальных некрозов, а в отдельных фрагментах потеря мышечными волокнами анатомической целостности.

Несформированность дистрофин-ассоциированного комплекса приводит к нарушению межтканевых взаимодействий (16, 19)- между всеми элементами двигательной единицы: мышечными волокнами,

-118соединительной тканью, сосудами и нервными окончаниями, каждый их которых претерпел к этому моменту сложные морфологические изменения. В этих условиях восстановление биосинтеза дистрофина введением минигена будет носить лишь фрагментарный характер и не исправит всего комплекса сложных морфо-функциональных расстройств в дистрофической мышечной ткани. Генотерапия зиготы, несущей мутантный ген, остается единственным возможным путем генно-инженерного решения проблемы, однако этот путь едва ли получит развитие из-за его сложности и недостаточной гарантированности успеха. Значительно рациональнее тестировать зиготы женщин носительниц гена МДД на наличие мутантного гена. Отбирая, таким образом, здоровые зиготы, или, по крайней мере, зиготы, детерминированные к развитию ребенка женского пола.

Совершенно иные перспективы открывает применение для терапии МДД стволовых клеток не миогенного происхождения или еще предпочтительнее ранних предшественников миогенеза (мезенхимальных стволовых клеток, сателлитных клеток, эмбриональных миобластов), которые можно получить из эмбриональной мышечной ткани после ее размельчения, активации в культуре с дифференцировкой на прогениторные элементы скелетных мышц. Введение таких клеток в пораженную мышечную ткань теоретически способно оказать влияние на все элементы двигательной единицы: мышечные волокна с восстановлением синтеза дистрофина за счет избирательной экспрессии гена этого белка миобластами; заполнение брешей в зонах фрагментации мышечных волокон, новообразование новых волокон (действие сателлитных клеток и эмбриональных миобластов), а также благоприятное воздействие на провизорные структуры за счет мезенхимальных клеток (соединительная ткань, сосуды).

Проведенное нами исследование эффектов трансплантации РПМ человека в дистрофированную мышцу мышей тс!х продемонстрировало правомочность теоретических допущений- о возможности эффективного терапевтического воздействия на пораженную мышечную ткань.

Прежде всего, важнейшим итогом проведенной работы является установление факта длительного сохранения жизнеспособности пересаженных клеток в ткани хозяина. При этом оказалось, что характерные для аутогенных трансплантаций эффекты быстрого развития процессов отторжения вследствие иммунологической несовместимости, не подавляемой мощной иммунносупрессией, при трансплантации ксеногенного материала были выражены значительно менее. При морфологическом исследовании не выявлялись характерные для процессов отторжения клеточные реакции с образованием воспалительных инфильтратов, макрофагальных скоплений лишь только на третьем - пятом месяцах после трансплантации признаки отторжения начинали проявляться, что очевидно приводило к неуклонному снижению числа дистрофин-положительных волокон. Параллельно с клеточной реакцией отторжения появлялись и иммунологические признаки развития этих процессов - увеличение количества С025+лимфоцитов и С025+моноцитов. Как нами уже подчеркивалось в обзоре литературы, реакция отторжения при аутогенной пересадке мышечных клеток или миобластов, полученных из зрелой мышечной ткани, выявлялись в ближайшие после трансплантации времени. Причина столь низкого иммунного ответа при ксеногенной трансплантации остается до конца не ясной.

Стоит отметить, что на ранних сроках после трансплантации (до 14 суток) большая часть клеток мигрирует от зоны введения вдоль мышечных волокон. Введенные РПМ вступают с ними во взаимодействие, создают подобие муфт вокруг мышечных волокон и скапливаются в местах их анатомических повреждений, «блокируя» бреши в участках разрывов. Трансплантированные клетки сливаются с хозяйскими с хозяйскими мышечными волокнами с формированием химерных структур, доставляя внутрь свои ядра, сохраняя свою видовую

-120специфичность, а следовательно и способность экспрессировать гены человека. Как было показано в другом исследовании (55), именно на этих ранних сроках (до 10 суток) после трансплантации развертывается основная картина компенсаторного миогенеза: синтез миогенных факторов (МуоЭ, Му55, миогенин), слияние клеток с мышечными волокнами, начало с синтеза дистрофина.

Нами было установлено, что трансплантация ксеногенных РПМ определяет более отчетливый и длительный синтез дистрофина человека в волокнах мышей-реципиентов спустя 1 месяц после трансплантации. Этот синтез наблюдался и на поздних стадиях исследования до 5 месяцев. При этом те волокна, в которых появился дистрофин человека, изменили свою морфологию - они приобрели полигональную форму, а их собственные ядра заняли характерное для здоровых мышц субсарколемальное положение. Однако, со временем отмечается снижение количества волокон, в которых синтезируется дистрофин человека, со временем после трансплантации. Такое медленное нарастание дегенеративных изменений в мышечной ткани мышей-реципиентов, по-видимому, можно связать с несколькими факторами.

Во-первых, это результат нерезко выраженной иммунной агрессии, которая возможна в случае возникшей барьерной толерантности вследствие образования химерных мышечных волокон или же низкой иммуногенности трансплантированных клеток. Ядро клетки человека, оказавшись в составе мышечного волокна мыши, начинает продуцировать собственные белки, при этом возможно только те, которые необходимы для нормального функционирования данного волокна, исключая антигены гистосовместимости. Тем самым волокна, появившиеся в результате слияния донорских клеток с поврежденными участками хозяйских мышечных волокон или же с активированными сателлитными клетками мышей-реципиентов, в меньшей степени подвергаются иммунной агрессии, чем новые волокна, целиком построенные из донорских РПМ.

Во-вторых, как установлено, дистрофин человека является мощным антигеном для иммунной системы мышей тёх. Генетически модифицированные мышечные волокна мышей-реципиентов постепенно вновь подвергаются дистрофическим изменениям вследствие механических воздействий при мышечных сокращениях и от других факторов. При этом происходит снятие барьерной толерантности для дистрофина человека вследствие разрушения сарколеммы мышечных волокон и окружающей их базальной мембраны. Возникает иммунная реакция на дистрофин человека, и эти уже частично разрушенные мышечные волокна подвергаются иммунной агрессии.

Как было сказано ранее, дистрофин стабилизирует сарколемму мышечного волокна от повреждений при механической нагрузке. В случае дефекта его синтеза происходит разрушение сарколеммы волокна и проникновение в кровь биологически активных веществ, ионов, а также маркерных ферментов: креатинфосфокиназы (КФК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Как мы установили, спустя месяц после трансплантации РПМ активность КФК у мышей-реципиентов резко упала до уровня, близкого к нормальным значениям, что в свою очередь свидетельствует в пользу возникшей стабилизации сарколеммы мышечных волокон за счет репаративной пластики «проколов» в сарколемме волокон синтезированным дистрофином человека. Спустя 2 месяца после трансплантации активность КФК вновь снизилась, но менее значительно, оставаясь при этом на нормальных значениях. Однако уже на сроке 4 месяца после трансплантации активность КФК вновь вернулась к первоначальному высокому значению, что свидетельствует в пользу нарастающих дегенеративных изменениях в мышечной ткани мышей-реципиентов - падением синтеза дистрофина на этом сроке и возвращением к исходному состоянию мышечной ткани. Аналогично изменялась активность ЛДГ. Что характерно, ксеногенный дистрофин почти также стабилизирует сарколемму мышечного волокна, как и собственный дистрофин мыши, что свидетельствует, очевидно, об

- 122универсальности молекулярных взаимодействий и механизмов в мышечной ткани.

Как мы установили в нашей работе, функциональные изменения скелетной мускулатуры мышей тёх, оцененной нами по показателям плавательного теста, имели четкую зависимость от морфологических и биохимических показателей . эффекта трансплантации. Как подчеркивалось ранее, мыши тс!х характеризуются сниженной двигательной активностью вследствие патологических изменений в скелетной мускулатуре, сердечной мышце и дыхательной системе. Однако, спустя 1 месяц после трансплантации обнаружилось возрастание двигательной активности мышей-реципиентов в виде увеличения времени их плавания. Эта тенденция сохранялась на сроке до 4 месяцев и более. Стоит отметить, что увеличение двигательной активности мышей-реципиентов сохраняется также на фоне повышения активности КФК. Как нам представляется, это связано с дополнительными компенсаторными механизмами, в частности, с положительными изменениями со стороны сердечно-сосудистой системы.

Среди показателей улучшения состояния сердечно-сосудистой системы мы отметили увеличение частоты сердечных сокращений (ЧСС) с низких патологических значений (300-400 уд/мин) до нормальных значений (600-700 уд/мин) у ряда мышей с брадикардией и признаками сердечной недостаточности. Также мы зафиксировали у части мышей улучшение кровоснабжения миокарда в виде исчезновения ЭКГ признаков ишемии.

Это позволяет считать, что введенные клетки действуют не только местно в мышце, подвергшейся трансплантации, но и системно, оказывая влияние на многие ткани, в частности на эндокринную, нервную, сердечно-сосудистую, иммунную, кроветворную системы и др. (рисунок 41). На нем мы представили схему возможного системного воздействия РПМ человека на ткани и органы мышей шёх.

Внутримышечное введение человеческих ранних миогенных предшественников (РМП) (750 тыс, клеток на мышь)

Рисунок 41. Системное действие трансплантированных РПМ человека на организм мыши-реципиента.

Это системное воздействие может быть опосредовано как через действие цитокинов и медиаторов, выделяемых самими клетками, так и благодаря прямой эмиграции РПМ из поперечно-полосатых мышц в кровоток, а затем и в органы мишени. Нами также не исключается возможность активации за счет эмбриональных медиаторов, выделяемых РПМ, внутренних компенсаторных механизмов и, как следствие, выбросу в кровоток собственных стволовых клеток их костного мозга и других донорных органов и миграции их в органы мишени. Так известно, что после трансплантации мезенхимальных стволовых клеток человека mdx мышам произошло увеличение экспрессии'мышиных транскрипционных миогенных факторов в 6 раз интенсивнее, по-сравнению с эффектом от введения плазмиды, содержащей ген дистрофина человека,(55).

Из ряда литературных источников известно, что некоторый процент внутримышечно трансплантированных миогенных стволовых клеток (Sca-1+- CD34" - L-selectin+ ) обнаруживается в костном мозге (0,1- 0,5% клеток), печени (около 2%), диафрагме (около 33%) и периферической крови (менее 1%) спустя 1 неделю, а в случае внутривенной трансплантации уже через 2 часа после введения. У летально облученных mdx мышей процент чужеродных клеток в периферической крови возрастает со временем после трансплантации ксеногенных миогенных клеток вместе с собственными гемопоэтическими стволовыми клетками, что свидетельствует о возможности гемопоэтической дифференцировки ряда миогенных клеток после их эмиграции в костный мозг мышей-реципиентов (184).

Проведенное нами исследование на выявление в периферической крови мышей-реципиентов клеток с ядрами, положительно окрашенными на человеческий ядерный антиген (human nucleus), не дало достоверный результат, вероятнее вследствие незначительного процента ксеногенных клеток в крови у мышей-реципиентов. Однако, по нашим данным спустя 14 суток после внутривенной трансплантации клетки человека были обнаружены в печени и селезенке мышей-реципиентов.

-125

На системный характер действия трансплантированных РПМ указывает обнаруженные нами у части животных увеличение продолжительности жизни, а также положительная динамика некоторых признаков старения животных в виде восстановления шерстяного покрова на местах возрастной алопеции.

Таким образом, на основании вышеизложенного мы установили некоторые общие закономерности регенераторных механизмов в дистрофичных мышцах при ксенотрансплантации эмбриональных РПМ человека. На начальных этапах посттрансплантационного периода происходит значительное нарастание компенсаторных регенеративных изменений, важнейшим проявлением которого является генетическая модификация мышечных волокон хозяина путем активации гена дистрофина трансплантированных РПМ человека. Этот дистрофии является функционально активным, что приводит к стабилизации сарколеммы мышечных волокон мышей миопатов и как следствие уменьшению активности сывороточной креатинфосфокиназы и лактатдегидрогеназы в плазме крови. Признаки превалирования процессов регенерации над процессами дегенерации наблюдается на сроках до 2-3 месяцев после трансплантации, затем наступает некоторая стабилизация и равновесие этих двух тенденций, а через 4-5 месяцев после трансплантации - превалирование дегенеративных изменений. Это фактически выражается в увеличении активности сывороточной КФК и ЛДГ и значительному снижению количества дистрофин-позитивных волокон к 4-5 месяцам после трансплантации. При этом стоит отметить, что скорость дегенеративных изменений на всем протяжении эксперимента остается относительно постоянной.

Целесообразно еще раз подчеркнуть значение того факта, что в нашем исследовании была продемонстрирована эффективность межвидовой трансплантации, которая, по крайней мере, не уступает таковой при трансплантации гомологичных РПМ. Само по себе это исключительно важно не только с теоретической, но и с практической

-126точки зрения. Понятно, что подбор наиболее полно отвечающих задачам в восстановлении функций патологически измененных мышц клеток позволяет использовать РПМ животных в качестве источника эмбриональных тканей. При этом решаются многие этические проблемы.

Возможно, наиболее удивительным итогом нашего исследования явилось обнаружение того факта, что ксеногенные клетки ранних стадий эмбрионального развития (стволовые и прогениторные клетки) миогенного ряда способны взаимодействовать со зрелыми патологически измененными мышечными волокнами без какой-либо иммуносупрессии. Это является еще одним подтверждением низкой иммуногенности стволовых и прогениторных клеток.

По-видимому, использование РПМ для лечения МДД/Б и других миопатий гораздо эффективнее, чем генно-инженерная терапия. Например, введение минигена дистрофина даже в условиях идеально проведенного трансгеноза в мышечные волокна приведет к генетической модификации волокна и синтезу дистрофина, однако, появление этого синтеза не устранит уже возникший на эмбриональной и ранней постнатальной фазе развития комплекс структурных нарушений в двигательной единице мышц - соединительной ткани, нервных окончаниях, сосудах. В то же время, введенные в суспензии стволовые и прогениторные клетки плода благодаря их полипотентности могут привести к восстановлению межтканевых взаимодействий в мышечной ткани.

В настоящее время терапия стволовыми и прогениторными клетками получает все большее развитие и постепенно внедряется в практику лечения многих тяжелых заболеваний. Главным препятствием на пути к еще более широкому ее применению стоит такая важная проблема как иммунологическая несовместимость трансплантат и тканей хозяина, требующая активной иммунносупрессирующей терапии. Другим грозным осложнением такой терапии является возможность превращения стволовых клеток в опухолевые. Имеются также и другие важные

- 127проблемы, в частности пока еще необъясненный интенсивный апоптоз клеток трансплантата, сложность и дороговизна получения и культивирования клеток, этические проблемы т.п. Нам представляется, что в данной работе удалось получить некоторые ответы на поставленные вопросы.

Как оказалось, ксенотрансплантация, по крайней мере, на первых этапах посттрансплантационного периода не требует иммуносупрессии. Вполне вероятно, что подключение иммуносупрессантов с этапа (конец 2-ого месяца) нарастания высокого уровня иммунокомпетентных клеток, ответственных за отторжение трансплантата, позволит еще более пролонгировать морфологическую целостность и функциональную активность мышечной единицы.

Наше исследование также предположить о возможности резкого снижения риска опухолевой трансформации трансплантата. Известно, что такой трансформации могут подвергаться, прежде всего, стволовые клетки. В тоже время, когда стволовые клетки начинают дифференцироваться в клетки-предшественники специализированной ткани (прогениторные клетки), они теряют способность к опухолевой трансформации. В этом смысле использование эмбриональной ткани первых недель гестации (8-10 недели) для заместительной терапии является более предпочтительным, так как она содержит преимущественно именно прогениторные элементы.

И, наконец, еще одним существенным обобщением, вытекающем из настоящего исследования, является констатация чрезвычайно высокой пластичности трансплантированных клеток к замещению специфического генетического дефекта. Так в наших наблюдениях экспрессия гена дистрофина начиналась в эмбриональных клетках под действием микроокружения мышечной ткани донора. Как мы уже подчеркивали, у человека экспрессия гена дистрофина начинается к 26 неделе гестации (51). Такой исключительно тонких характер взаимодействия индукторов генной экспрессии с геномом трансплантата с селективным включением

- 128активности одного из множества генов позволяет заключить, что подобный механизм компенсаторных взаимодействий возможен и при других генетических аномалиях. Это определяет перспективу дальнейшего изучения возможностей генетической модификации тканей с различным типом мутации, по крайней мере, в рамках генетической миологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Кузнецов, Александр Борисович,

1. Баранов B.C., Баранов А.Н., Зеленин A.B. Современное состояние и перспективы генной терапии миодистрофии Дюшенна в мире и России. // Генетика. Т.37. №8. стр. 1046-1053.

2. Бландова 3.JT., Душкин В.П., Малашенко A.M., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. // Наука. 1983. стр. 100-116.

3. Бочков Н.П. Клиническая генетика. // Медицина. 1997.

4. Гринио Л.П., Агафонов Б.В., Миопатии. // М. Медицина 1997

5. Комарова Н.В., Чухрова А.Л., Дадали Е.Л., Ситников В.Ф.,Евграфов О.В. ДНК-диагностика миодистрофии Дюшенна. // Первый (третий) российский съезд медицинских генетиков. М., 1994, 31.

6. Кошин В.В. — «Продукция супероксидного радикала и ПОЛ в скелетных мышцах», Сборник материалов 5 всесоюзной конференции по биохимии мышц.

7. Лакин Ф.Г. Биометрия. // М., Высшая школа.-1990.

8. Лескова H.H., Смирнов В.Ф., Ситников В.Ф., Сычев В.К. Изучение133.\тмышечного кровотока с Хе при прогрессирующей мышечной дистрофии. // Медицинская радиология. №4, 1977, Медицина. 34-37.

9. Лобзин B.C., Сайкова Л.А. "Нервно-мышечные болезни",— \\ 1998 г. Изд-во "Гиппократ", Санкт-Петербург стр. 75+8 1; 159-208.

10. Мусина P.A., Егоров Е.Е., Белявский A.B. Стволовые клетки: свойства и перспективы использования в медицине. \\ Мол. Биология. 2004. Т.38. №4. стр. 1-15.

11. Петренко А.Ю., Грищенко В.И. Трансплантация стволовых клеток -терапия 21 века. Характеристика и свойства стволовых клеток. \\ Проблемы микробиологии. 2001. №2. стр.3-12.

12. Прино Л:П. "Дюшенновская миодистрофия"—\\ 1998 г. Нижн. Новгород стр 7-29; 52-87; 131-134; 151-173.

13. Ситников В.Ф. Диссертация. «Изменение стромальной соединительной ткани скелетных мышц и костной системы при прогрессирующих мышечных дистрофиях». Москва, 1973.

14. Ситников В.Ф., Бадалян Л.О., Дунаевская Г. Н. "Лечение больных ПМД." \\ "Журнал неврологии и психиатрии им С.С. Корсакова" 1975 г. 75, 9 стр. 1317-1323.

15. Ситников В.Ф., Лескова H.H., Поташникова Н.П. "Обмен калия при ПМД."\\ "Журнал неврологии и психиатрии им С.С. Корсакова" 1980 г. №5 стр.1617-1619

16. Ситников В.Ф."Педиатрия" 1975 г. 1412 стр. 41-45. "Изменение костной системы и мышц у детей при нервно-мышечных заболеваниях."

17. Сухих Г.Т., Малайцев И.И., Багданова И.М., Дубровина И.В., Ситников В.Ф. Новый подход к лечению мышечной дистрофии Дюшенна с использованием ранних предшественников миогенеза. \\ БИБМ, 2001,Т132, №12, 604-612.-133

18. Alison M. R., Poulsom R, Jefery R. et al. Hepatocyte from non-hepatic adult stem cells // Nature.- 2000.- 406, № 2.-P. 257.

19. Alvarez-Dolado M. Pardal R. et al. 2003. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocetes. // Nature. 425. 96S-973.

20. Arnold, Winter R. //Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. Vol. 8. P. 539-544.

21. Baklcer, E.; Van Broeckhoven, C.; Bonten, E. J.; van de Vooren, M. J.; Veenema, H.; Van Hul, W.; Van Ommen, G. J. B.; Vandenberghe, A.; Pearson, P. L. Germline mosaicism and Duchenne muscular dystrophy mutations. //Nature 329: 554-556, 1987.

22. BallasC.B. Gerson S.L. et al. 2002. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: implications for greater use. // Cell Biochiem. 38. 20-28.

23. Barton-Davis, E. R.; Cordier, L.; Shoturma, D. I.; Leland, S. E.; Sweeney, H. L.Aminoglycoside antibiotics restore dystrophin function to skeletal muscles of mdx mice. // J. Clin. Invest. 104: 375-381, 1999.

24. Barton-Davis, E. R.; Cordier, L.; Shoturma, D. I.; Leland, S. E.; Sweeney, H. L. Aminoglycoside antibiotics restore dystrophin function to skeletal muscles of mdx mice. J. Clin. Invest. 104: 375-381, 1999.

25. Becker, P. E. Neue Ergebnisse der Genetik der Muskeldystrophien. ¡/Acta Genet. Statist. Med. 7: 303-310, 1957.

26. Becker, P. E. Eine neue X-chromosomale Muskeldystrophie. //Acta Psychiat. Neurol. Scand. 193: 427, 1955.

27. Becker, P. E. Two new families of benign sex-linked recessive muscular dystrophy. //Rev. Canad. Biol. 21: 551-566, 1962.

28. Birchmeier C., Gherardi E. // Trends Cell Biol. 1998. Vol. 8. P. 404-410.

29. Bischoff, R. 1994. The satellite cell and muscle regeneration. // Myogenesis. A.G. Engel and C. Franszini-Armstrong, editors. McGraw-Hill, New York. 97-118.

30. Bjomson C. R. Rietze R. L. Reynolds B. A. et al. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. // Science.- 1999.- 283.- P. 534-537.

31. Blottner D, Luck G Nitric oxide synthase (NOS) in mouse skeletal muscle development and differentiated myoblasts. // Cell Tissue Res 1998 May;292(2):293-302

32. Brazeau GA, Mathew M, Entrikin RK. Serum and organ indices of the mdx dystrophic mouse. // Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 1992 Aug;77(2): 179-89.

33. Bulfield G., SHEer W. G., Wight P. A. L., Moore K. G. X chromosome linked muscular dystrophy (mdx) in the mousell Proc. NatE. Acad. Sd. 1984. Vol.81. P. 1189—1192.

34. Camirand G, Caron NJ, Turgeon NA, Rossini AA, Tremblay JP. Treatment with anti-CD 154 antibody and donor-specific transfusion prevents acute rejection of myoblast transplantation. // Transplantation 2002 Feb 15;73(3):453-61

35. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells and gene therapy // Clin. Orthop.-2000:- 379.- P.67-70.

36. Caron NJ, Asselin I, Morel G, Tremblay JP. Increased myogenic potential and fusion of matrilysin-expressing myoblasts transplanted in mice. // Cell Transplant 1999 Sep-Oct;8(5):465-76

37. Charlton CA, Mohler WA, Blau- HM. Neural cell adhesion molecule (NCAM) and myoblast fusion. // Dev Biol 2000 May 1;221(1):112-9

38. Chelly, J.; Kaplan, J.-C.; Maire, P.; Gautron, S.; Kahn, A. Transcription of the dystrophin gene in human muscle and non-muscle tissues. // Nature 333: 858-860, 1988.

39. Chiu C.P. Dragowska W., Kim N.W. et al. 1996. Deferential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone marrow. // Stem Cells. 14. 239-248.

40. Clarke D. Frisen .J. 2001. Differentiation potential of adult stem cells. // Curr. Opin. Genet. Develop. 11. 575 -580.

41. Clarke D.L., Johansson C.B. et al. 2000. Generalized potential of adult neural stem cells. // Science. 288. 1660-1663.

42. Clerk A., Morris GE, Dubowitz V, Davies KE, Sewry CA. Dystrophin-related protein, utrophin, in normal and dystrophic humanfetal skeletal muscle. // Histochem J. 1993 Aug;25(8):554-61.-136

43. Colter D.C., Class R, DiGirolamo C.M., Prockop D.J. 2000. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. // Proc. Natl. Acad. Sci. 97. 3213-3218.

44. Cooper R. N., Tajbakhsh S., Mouly V., Cossu G., Buckingham M .and Butler-Browne G. S. In vivo satellite cell activation via Myf5 and MyoD in regenerating mouse skeletal muscle. // Journal of Cell Science 112, 28952901 (1999).

45. Cornelison, D.D., and B.J. Wold. 1997. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells.//Dev. Biol. 191:270-283.

46. Cosimo De Bari, Francesco Dell'Actio, Frank Vandenabeele, Joris R. Vermeesch, Jean-Marc Raymackers. Skeletal muscle repair by adult human mesenchymal stem cells from synovial membrane. // The Journal of Cell Biology, Volume 160, Number 6, 909-918

47. Cossu G., and F. Mavilio. 2000. Myogenic stem cells for the therapy of primary myopathies: wishful thinking or therapeutic perspective? // J. Clin. Invest. 105:1669-1674.

48. Cox G. A., Phelps S. F., Chapman V. M., Chamberlain-J. S. New mdx mutation disrupts expression of muscule and rionmuscule isoforms of dystrophin/I Nature Genet. I 993b. Vol. 4. R 87—93.

49. Darr K.C., Schultz E.//J. Appl. Phisiol. 1987. Vol. 63. 3. 1816-1821.

50. Deconinck A. E., Rafael J. A., Skinner J. A. et al. Utrophin-dystrophin deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy// Cell. 1997a. Vol. 90. P. 717—727.

51. Deconinclc A. E., Potter A. C., Tinsley J. M. et at. Postsynaptic abnormalities at the neuromuscular junctions of utrophin-deficient mice//J. Cell. Biol. 1997b. Vol. 136. R 883—894.

52. Deconinck N., Tinsley J., De Backer F. et at. Expression of truncated utrophin leads to major functional improvements in dystrophindeficient muscles of micell Nature Med. 1997c. Vol. 3. P. 1216— 1221.- 137

53. Delfini M, Hirsinger E, Pourquie O, Duprez D. Delta 1-activated notch inhibits muscle differentiation without affecting Myf5 and Pax3 expression in chick limb myogenesis. // Development 2000 Dec;127(23):5213-24

54. DeRosimo JF, Washabaugh CH, Ontell MP, Daood MJ, Watchko JF, Watkins SC, Ameredes BT, Ontell M. Enhancement of adult muscle regeneration by primary myoblast transplantation. // Cell Transplant 2000 May-Jun;9(3):369-77

55. Dickson, G.; Pizzey, J. A.; Elsom, V. E.; Love, D.; Davies, K. E.; Walsh, F. S. Distinct dystrophin mRNA species are expressed in embryonic and adult mouse skeletal muscle. // FEBS Lett. 242: 47-52, 1988.

56. Dietz, H.C., Valle, D., Francomano, C.A., Kendzior, R.J., Jr., Pyeritz, R.E., Cutting, G.R. 1993. The skipping of constitutive exons in vivo induced by nonsense mutations. // Science. 259:680-683.

57. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. Ultrastructural changes in muscular tissues of dystrophin/utrophin double-knockout mice after bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation. // 2004 May;24(5):501-4.

58. Domen J. Weissman l.L. 1999. Self-renewal, differentiation or death: regulation and manipulation of hematopoietic stem cell rate. // Mol. Med. Today 5. 20I-20S.

59. Emery, A. E. H. Duchenne Muscular Dystrophy. Oxford, UK: Oxford University Press (pub.) (2nd ed.) 1993.

60. El Fahime E, Torrente Y, Caron NJ, Bresolin MD, Tremblay JP. In vivo migration of transplanted myoblasts requires matrix metalloproteinase activity. // Exp Cell Res 2000 Aug l;258(2):279-87

61. Eriksson P. S. et al. Neuro-genesis in the adult human hippocampus // Nature Medicine.- 1988.-4. №11.-p. 1313-1317.

62. Ervasti, J.M., and K.P. Campbell. 1991. Membrane organization of the dystrophin-glycoprotein complex. // Cell. 66:1121-1131

63. Fiona M. Watt I., Brigid L M. Hogan. Out of Eden: Stem Cells and Their Niches // Science.- 2000.- 287, № 5457.-P. 1427-1430.

64. Friedenstein A.J. Piatetzky-Shapiro I.I et al. 1966. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J. Embryol. // Exp. Morphol. 16. 381390.

65. Friedenstein A.J. Gorskaja U. Kulagina N.N. 1976. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. // Exp. Hematol. 4. 267-274.

66. Gage F. H. Mammalian neural stem cells. // Science.-2000.- 287. № 5457.-P. 1433-1438.

67. Genetika 2001 Aug;37(8):l 104-11 Research Center for Medical Genetics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia.

68. Gibson AJ, Karasinski J, Relvas J, Moss J, Sherratt TG, Strong PN, Watt DJ. Dermal fibroblasts convert to a myogenic lineage in mdx mouse muscle. // J Cell Sci 1995 Jan;108 (Pt 1):207-14

69. Gibson, M. C., and Schultz, E. (1983). Age-related differences in absolute numbers of skeletal muscle satellite cells. // Muscle Nerve 6, 574-80.

70. Glesby MJ, Rosenmann E, Nylen EG, Wrogemann K. Muscle Nerve. Serum CK, calcium, magnesium, and oxidative phosphorylation in mdx mouse muscular dystrophy. // 1988. Aug;l l(8):852-6.

71. Gospe, S. M., Jr.; Lazaro, R. P.; Lava, N. S.; Grootscholten, P. M.; Scott, M. O.; Fischbeck, K. H. Familial X-linked myalgia and cramps: a nonprogressive myopathy associated with a deletion in the dystrophin gene.//Neurology 39: 1277-1280, 1989.

72. Grady R. M:, Teng H., Nichol M. C. et al. Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophyll Cell. 1 997a. Vol. 90. R 729—738.

73. Grady R. M., Merlie J. R, Sanes J. R. Subtle neuromuscular defects in utrophin-deficient mice. // J. Cell Biol. 1 997b. Vol. 136. P. 871—882.-139

74. Groh M.E., Maitra B., Szekely E. Human mesenchymal stem cells require monocyte-mediated activation to suppress alloreactive T cells. // Exp Hematol. 2005 Aug;33(8):928-34.

75. Guerette B, Skuk D, Celestin F, Huard C, Tardif F, Asselin I, Roy B, Goulet M, Roy R, Entman M, Tremblay JP. Prevention by anti-LFA-1 of acute myoblast death following transplantation. // J Immunol 1997 Sep 1;159(5):2522-31

76. Gussoni E. Soneka Y. et al. 1999. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. // Nature. 401. 390-394.

77. Hart, K. A.; Hodgson, S.; Walker, A.; Cole, C. G.; Johnson, L.; Dubowitz, V.; Bobrow, M. DNA deletions in mild and severe Becker muscular dystrophy. // Hum. Genet. 75: 281-285, 1987.

78. Hasty, P., A. Bradley, J.H. Morris, D.G. Edmondson, J.M. Venuti, E.N. Olson, and W.H. Klein. 1993. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. // Nature. 364:501506.

79. Heslop L, Beauchamp JR, Tajbakhsh S, Buckingham ME, Partridge TA, Zammit PS. Transplanted primary neonatal myoblasts can give rise to functional satellite cells as identified using the Myf5nlacZl+ mouse. // Gene Ther 2001 May;8(10):778-83

80. Hodgetts SI, Grounds MD. Complement and myoblast transfer therapy: donor myoblast survival is enhanced following depletion of host complement C3 using cobra venom factor, but not in the absence of C5. // Immunol Cell Biol 2001 Jun;79(3):231-9

81. Hoffman, E.P., R.H. Brown, Jr., and L.M. Kunkel. 1987. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. // Cell. 51:919-928.

82. Hu, X.; Burghes, A. H. M.; Ray, P. N.; Thompson, M. W.; Murphy, E. G.; Worton, R. G. Partial gene- duplication in Duchenne and Becker muscular dystrophies. // J. Med. Genet. 25: 369-376, 1988.

83. Hu, X.; Ray, P. N.; Murphy, E. G.; Thompson, M. W.; Worton, R. G. Duplicational mutation at the Duchenne muscular dystrophy locus: its frequency, distribution, origin, and phenotype-genotype correlation. // Am. J. Hum. Genet. 46: 682-695, 1990.

84. Hu, X.; Ray, P. N.; Worton, R. G. Mechanisms of tandem duplication in the Duchenne muscular dystrophy gene include both homologous and nonhomologous intrachromosomal recombination. // EMBO J. 10: 24712477, 1991.

85. Hu, X.; Worton, R. G. Partial gene duplication as a cause of human disease. //Hum. Mutat. 1: 3-12, 1992.

86. Jesse T.L., LaChance R., Jademarco M.F. el al. // J. Cell Biol. 1998. Vol: 140. P. 1265-1276.

87. Jiang Y., Jahagirdar B.N. Reinhardt R.L., et al. 2002. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. // Nature. 418. 41-49.

88. Im W. B., Phelps S. F., Copen E. H. et al. Differential expression of dystrophin isoforms in strains of mdx mice with different mutations/I Hum. Mol. Genet. 1996. Vol 5. R 1149—1153.

89. Ito H, Vilquin JT, Skuk D, Roy B, Goulet M, Lille S, Dugre FJ, Asselin I, Roy R, Fardeau M, Tremblay JP. Myoblast transplantation- in non-dystrophic dog. // Neuromuscul Disord 1998 Apr;8(2):95-110

90. Ito H, Hallauer PL, Hastings KE, Tremblay JP. Prior culture withconcanavalin A increases intramuscular migration of transplantedmyoblast. // Muscle Nerve 1998 Mar;21(3):291-7-141

91. Kato K, Okumura K, Yagita H. Immunoregulation by B7 and IL-12 gene transfer. // Leukemia 1997 Apr;l 1 Suppl 3:572-6

92. Kim D.H., Je C.M. et al. 2003. Effect of partial hepatectomy on in vivo engraftment after intravenous administration of human adipose tissue stromal cells in mouse. // Microsurgery. 23. 424- 431.

93. Kinoshita I, Vilquin JT, Guerette B, Asselin I, Roy R, Tremblay JP. Very efficient myoblast allotransplantation in mice under FK506 immunosuppression.// Muscle Nerve 1994 Dec;17(12):1407-15.

94. Koenig M., Hoffman E. R, Bertolstn C. J. et at. Complete cloninig of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DND gene in normal and affected individuals/I Cell. 1987. Vol.50. P. 509—517.

95. Koenig M., Monaco T., Kunkel L.M. The complete sequence of dystropin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein/I Cell. 1988. Vol. 53. R 219—228.

96. Kopen G.C. Prockop D.J. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. // 1999.Proc. Natl. Acad. Sei. 96,10711-10716.

97. Lequerica JL, Mirabet V, Montero JA, Hurtado C, Piquer S, Carbonell F.Ann In vitro proliferation, differentiation and immuno-magnetic bead purification of human myoblasts. // Transplant 1999;4(3-4): 103-8

98. Law PK, Goodwin TG, Fang Q, Deering MB, Duggirala V, Larkin C, Florendo JA, Kirby DS, Li HJ, Chen M, et al. Cell transplantation as an experimental treatment for Duchenne muscular dystrophy. // Cell Transplant 1993 Nov-Dec;2(6):485-505

99. LaBarge, M.A., and H.M. Blau. 2002. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. // Cell. 111:589-601.

100. Lawlor MA, Rotwein P. Insulin-like growth factor-mediated muscle cell survival: central roles for Akt and cyclin-dependent kinase inhibitor p21. // Mol Cell Biol 2000 Dec;20(23):8983-95

101. Lawlor MA, Feng X, Everding DR, Sieger K, Stewart CE, Rotwein P. Dual control of muscle cell survival by distinct growth factor-regulated signaling pathways. // Mol Cell Biol 2000 May;20(9):3256-65

102. Law P. K., Tena G. Feasibility, safety, and efficacy of myoblast transfer therapy on Duchenne muscular dystrophy boys. // Cell Transplantation. 1992. Vol.1 P. 235-244.

103. Lazarus H.M. Haynesworth S.E et all997. Human bone marrow-derived mesenchymal (stromal) progenitor cells (MCPCs) cannot be recovered from peripheral blood progenitor cell collections. // J. Hematother. 6 147—455.

104. Li Y, Jiang B, Ensign WY, Vogt PK, Han J. Myogenic differentiation requires signalling through both phosphatidylinositol 3-kinase and p38 MAP kinase. // Cell Signal 2000 Dec; 12(11-12):751-7

105. Leshem Y, Spicer DB, Gal-Levi R, Halevy O. Hepatocyte growth factor (HGF) inhibits skeletal muscle cell differentiation: a role for the bHLH protein twist and the cdk inhibitor p27. // J Cell Physiol 2000 Jul; 184( 1): 101 -9

106. Liu Cj, Wang H, Zhao Z, Yu S, Lu YB, Meyer J, Chatterjee G, Deschamps S, Roe BA, Lengyel P. MyoD-dependent induction during myoblast differentiation of p204, a protein also inducible by interferon. // Mol Cell Biol 2000 Sep;20(18):7024-36

107. Liu IM, Huang LW, Cheng JT. Gene expression of alpha(lA)-adrenoceptor but not alpha(lB)-adrenoceptor in cultured myoblast C(2)C(12) cells of mice. // Neurosci Lett 2000 Nov 17;294(2):93-6

108. Malcino S., Fukuda K., 1999. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. // J.Clin.Invest. 103. 697-705.

109. Mark A. Suckkow., Danneman P. The laboratory mouse. // 2001. P. 1012.

110. Martin G.R. 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by leratocarcinorna stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 7634-7638.

111. Matsui Y., Toksoz D., Nishikawa S., Williams D., Zsebo K., Hogan B.L. 1991 Effect of Steel factor and leukaemia inhibitory factor of murine primordial germ cells in culture.//Nature.353. 750-752.

112. Menasche P, Hagege AA, Scorsin M, Pouzet B, Desnos M, Duboc D, Schwartz K, Vilquin JT, Marolleau JP. Myoblast transplantation for heart failure. // Lancet 2001 Jan 7;357(9252):279-80

113. Megel R. M., Goudoul D., Diaz C., Nicolet M., Garcia L., Geraud G. N-cadherin and N-CAM in myoblast fusion: compared localisation and effect of blockade by peptides and ntibodies.// Journal of Cell Science 103, 897-906(1992)

114. Mendell JR, Kissel JT, Amato AA, King W, Signore L, Prior TW, Sahenk Z, Benson S, McAndrew PE, Rice R, et al. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. // N Engl J Med 1995 Sep 28;333(13):832-8

115. Michalak M., Fu S. V., Mimer R.E. et al. Phosphorylation of the carboxylterminal region of dystrophin// Biochem. Cell Biol. 1996. Vol. 74(4). P. 431-437.

116. Mikhailov VM, Zhestianikov VD, Savel'eva GE. Myocardium of mdx mice contains factor(s) that damage DNA structure and retard DNA- 144reparation after gamma-irradiation (experiences in modeling system). // Tsitologiia. 2003;45(4):418-21.

117. Mikhailov VM, Komarov SA, Nilova VK, Shtein GI, Baranov VS. Ultrastructural and morphometrical analysis of apoptosis stages in cardiomyocytes of MDX mice. // Tsitologiia. 2001;43(8):729-37.

118. Miller RG, Sharma KR, Pavlath GK, Gussoni E, Mynhier M, Lanctot AM, Greco CM, Steinman L, Blau HM. Myoblast implantation in Duchenne muscular dystrophy: the San Francisco study. // Muscle Nerve 1997 Apr;20(4):469-78

119. Moisset PA, Gagnon Y, Karpati G, Tremblay JP. Expression of human dystrophin following the transplantation of genetically modified mdx myoblasts. // Gene Ther 1998 0ct;5(10): 1340-6

120. Moisset PA, Skuk D, Asselin I, Goulet M, Roy B, Karpati G, Tremblay JP. Successful transplantation of genetically corrected DMD myoblasts following ex vivo transduction with the dystrophin minigene. // Biochem Biophys Res Commun 1998 Jun 9;247(l):94-9

121. Morandi L, Bernasconi P, Gebbia M, Mora M, Crosti F, Mantegazza R, Cornelio F. Lack of mRNA and dystrophin expression in DMD patients three months after myoblast transfer. // Neuromuscul Disord 1995 Jul;5(4):291-5

122. Naylor, J.A., Green, P.M., Rizza, C.R., Giannelli, F. 1993. Analysis of factor VIII mRNA defects in everyone of 28 haemophilia A patients. // Hum. Mol. Genet. 2:11-17

123. Newsome P.N. Johannessen I. et al. 2003. Human cord blood-derived cells can differentiate into hepatocytes in the mouse liver with no evidence of cellular fusion. // Gastroenterology. 124, 1891-1900.

124. Orlie D. Kajstura J. et al. 2001. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium. //Nature. 410. 701-705.

125. Ortiz I.A. Gambelli F. et al. 2003. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. // Proc. Ntil. Acad. Sei. 100. 8407-8411.

126. Pagel CN, Morgan JE, Gross JG, Partridge TA. Thymic myoid cells as a source of cells for myoblast transfer. // Cell Transplant 2000 Jul-Aug;9(4):531-8

127. Petersen ZQ, Huard J. The influence of muscle fiber type in myoblast-mediated gene transfer to skeletal muscles. // Cell Transplant 2000 Jul-Aug;9(4):503-17

128. Pittenger M.F. Maekay A.M. et al. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science 284. 143-147.

129. Pittenger M.F. Marshak D.R. 2001. Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow. // Stem Cell Biology. 349-374.

130. Pouzet B, Vilquin JT, Hagege AA, Scorsin M, Messas E, Fiszman M, Schwartz K, Menasche P. Factors affecting functional outcome after autologous skeletal myoblast transplantation. // Ann Thorac Surg 2001 Mar;71(3):844-50.

131. Pouzet B, Vilquin JT, Hagege AA, Scorsin M, Messas E, Fiszman M, Schwartz K, Menasche P Intramyocardial transplantation of autologous myoblasts: can tissue processing be optimized? // Circulation 2000 Nov 7;102(19 Suppl 3):III210-5

132. Prattis SM, Horton SB, van Camp SD, Kornegay JN. Immunohistochemical detection of neural cell adhesion molecule andlaminin in X-linked dystrophic dogs and mdx mice. 11 J Comp Pathol 1994 Apr;110(3):253-66

133. Qu Z, Huard J. Matching host muscle and donor myoblasts for myosin heavy chain improves myoblast transfer therapy. // Gene Ther 2000 Mar;7(5):428-37

134. Ratajezak M.Z. Kucia Met al. 2004. Stem cell plasticity revisited: CXCR4-positive cells expressing mRNA for early muscle, liver and neural cells 'hide out' in the bone marrow. // Leukemia. 18. 29-40.

135. Resnick.l.L.BixlerL.S. Cheng L. Donovan P.I. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. // Nature. 1992.359. 550-551.

136. Reubinoff B.K. Pera M.F. Fong C.Y et al. 2000. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.// Nature Biotech. 4. 399-104.

137. Reyes M., Lund T. et al. 2001. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. //Blood. 98. 2615-2625.

138. Rios R, Carneiro I, Arce VM, Devesa J. Myostatin regulates cell survival during C2C12 myogenesis. // Biochem Biophys Res Commun 2001 Jan 19;280(2):561-6

139. Sabourin, L.A., and M.A. Rudnicki. 2000. The molecular regulation of myogenesis. //Clin. Genet. 57:16-25.

140. Schneider BL, Peduto G, Aebischer P. A self-immunomodulating myoblast cell line for erythropoietin delivery. // Gene Ther 2001 Jan;8(l):58-66

141. Seale, P., and M.A. Rudnicki. 2000. A new look at the origin, function, and "stem-cell" status of muscle satellite cells. // Dev. Biol. 218:115-124.-147

142. Sealock R., Froehner S. C. Dystrophin-associated proteins and synapse formation: is a-dystroglycan the agrin receptor? // Cell. 1994. Vol.77.P. 617—619.

143. Seshi B. Kumar S. et al. 2003. Multilineage gene expression in human bone marrow stromal cells as evidenced by single cell microarray analysis. // Blood Cells Mol. Dis. 31. 268-285.

144. Seigneurin-Venin S, Bernard V, Moisset PA, Ouellette MM, Mouly V, Di Donna S, Wright WE, Tremblay JP. Transplantation of normal and DMD myoblasts expressing the telomerase gene in SCID mice. // Biochem Biophys Res Commun 2000 Jun 7;272(2):362-9

145. Shamhlott M.J. Axelman J. et al. 2001. Human embryonic germ cell derivates express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 98. 113-118.

146. Sheehan SM, Tatsumi R, Temm-Grove CJ, Allen RE. HGF is an autocrine growth factor for skeletal muscle satellite cells in vitro. // Muscle Nerve 2000 Feb;23(2):239-45

147. Sheng XG, Feng JZ, Wu S, Jin LJ, Yu XY, Zhang B. Differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into myogenic cells in vitro and expression of vascular endothelial growth factor gene after transfection. // 2004 Mar;24(3):290-4

148. Shi D, Reinecke H, Murry CE, Torok-Storb B. Myogenic fusion of human bone marrow stromal cells, but not hematopoietic cells. // Blood. 2004.

149. Slack J. M. W. Stem cells in epithelial tissues. // Science.-2000.- 287, № 5457.- P. 1431-1433.

150. Smith, C.K., M.J. Janney, and R.E. Allen. 1994. Temporal expression of myogenic regulatory genes during activation, proliferation, and differentiation of rat skeletal muscle satellite cells. // J. Cell. Physiol. 159:379-385.

151. Smythe GM, Fan Y, Grounds MD. Enhanced migration and fusion of donor myoblasts in dystrophic and normal host muscle. // Muscle Nerve2000 Apr;23(4):560-74

152. Smythe GM, Hodgetts SI, Grounds MD. Immunobiology and the future of myoblast transfer therapy. // Mol Ther 2000 Apr; 1(4):304-13

153. Suzuki K, Brand NJ, Allen S, Khan MA, Farrell AO, Murtuza B, Oakley RE, Yacoub MH. Overexpression of connexin 43 in skeletal myoblasts: Relevance to cell transplantation to the heart. // J Thorac Cardiovasc Surg2001 Oct;122(4):759-66

154. Suzuki K, Murtuza B, Suzuki N, Smolenski RT, Yacoub MH. Intracoronary infusion of skeletal myoblasts improves cardiac function in-149doxorubicin-induced heart failure. // Circulation 2001 Sep 18;104(12 Suppl l):I213-7

155. Suzuki K, Smolenski RT, Jayakumar J, Murtuza B, Brand NJ, Yacoub MH. Heat shock treatment enhances graft cell survival in skeletal myoblast transplantation to the heart. // Circulation 2000 Nov 7; 102(19 Suppl 3):III216-21

156. Thomas M, Langley B, Berry C, Sharma M, Kirk S, Bass J, Kambadur R. Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. // J Biol Chem 2000 Dec 22;275(51):40235-43

157. Thomson .J.A. Shapiro S.S. Embryonic stein cell lines derived from human blastocyst. // Science. 282. 1145-1147.

158. Tohill M, Mantovani C, Wiberg M, Terenghi G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. //Neurosci Lett. 2004 May 27;362(3):200-3

159. Torrente Y, El Fahime E, Caron NJ, Bresolin N, Tremblay JP. Intramuscular migration of myoblasts transplanted after muscle pretreatment with metalloproteinases. // Cell Transplant 2000 Jul-Aug;9(4):539-49

160. Torrente Y., Geoffrey Camirand, Federica Pisati. Identification of a putative pathway for the muscle homing of stem cells in a muscular dystrophy model.// JCB. V. 162, N3. P. 511-520.

161. Tremain N., Korkko. J. et al. 2001. MicroSAGe analysis of 2353 expressed genes in a single cell-derived colony of undifferentiated- 150human mesenchymal stem cells reveals mRNAs of multiple cell lineages. //Stem Cells. 19.408-418.

162. Turvey SE, Gonzalez-Nicolini V, Kingsley CI, Larregina AT, Morris PJ, Castro MG, Lowenstein PR, Wood KJ. Fas ligand-transfected myoblasts and islet cell transplantation. // Transplantation 2000 May 15;69(9): 1972-6

163. Vilquin JT, Kinoshita I, Roy R, Tremblay JP. Cyclophosphamide immunosuppression does not permit successful myoblast allotransplantation in mouse. // Neuromuscul Disord 1995 Nov;5(6):511-7

164. Bing Wang, Juan Li, and Xiao Xiao. Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97, Issue 25, 13714-13719, December 5, 2000.

165. Warrens AN. Studies on the interaction of T-cells with major histocompatibility complex class II antigens. // Clin Sci (Colch) 1997 Jan;92(l):25-36

166. Wei Q, Paterson BM. Regulation of MyoD function in the dividing myoblast. // FEBS Lett 2001 Feb 16;490(3): 171-8

167. Weimann J.M. Johansson C.B. et al. 2003. Stable reprogrammed beterokaryons from spontaneously in Purkinje neurons after bone marrow transplants. // Nature Cell Biol. 5. 959-966.

168. Wiendl H, Behrens L, Maier S, Johnson MA, Weiss EH, Hohlfeld R. Muscle fibers in inflammatory myopathies and cultured myoblasts express the nonclassical major histocompatibility antigen HLA-G. // Ann Neurol 2000 Oct;48(4):679-84

169. Woodbury D. et al. 2000. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. // J. Neurosci. Res. 61, 364-370.

170. Yuasa K. Effective restoration of dystrophin-associated proteins in vivo by adenovirus-mediated transfer of truncated dystrophin cDNAs. // FEBS Letters 425 (1998) P. 329-336.

171. Zhonghua Nei Ke Za Zhi. Transplantation of exogenous mesenchymal stem cells for treatment of myocardial infarction in rat. // 2004 Mar;43(3): 186-90.

172. Zege R.M., Goudou D. N-cadherin and N-CAM in myoblast fusion: compared localization and effect of blockade by peptide and antibodies. // J. Cell Science, 103, 897-906.