Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ген ADE1 метилотрофных дрожжей Pichia methanolica: клонирование, анализ структуры и использование для трансформации

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Ген ADE1 метилотрофных дрожжей Pichia methanolica: клонирование, анализ структуры и использование для трансформации"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ЧАН ТУАН ЛШ1 . ГЕН аое1 МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ р1сн1а метнаью1лса< КЛОНИРОВАНИЕ. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ

специальность 03. 00. 15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1992

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета, Санкт-Петербург, Россия.

Научный руководитель: - кандидат биологических наук

ПАВЛОВ Ю,И.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук

ТОЛСТОРУКОВ и.и.

- кандидат биологических наук САСНАУСКАС К.В.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский

институт ядерной физики РАН.

Залита состоится " 1ч?п&0>1$ 1992 г. в -// час. на заседании специализированного Совета Д 063.57.21 то защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности "Генетика'* при Санкт-Петербургском государственном университете (Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. Н •/ ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

•Автореферат разослан "З.А* 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Долгое время генетика дрожжей была построена на основе данных, полученных у s. cerevisiae. Изучение каждого нового вида дрожжей позволяет расширить генетическую картину эукариоти-ческих микроорганизмов, сделать ее более полноценной. С другой стороны, нетрадиционные дрожжи усваивают "нетрадиционные источники" углерода, такие как парафины и метанол. В настоящее время метило-трофные дрожжи H. polymorphe И P. pastoris ИНТ6НСИВНО ИСПОЛЬЗУЮТ КЭК Обье'КТ ДЛЯ экспрессии гетерологичных генов Oarrawicz et al-, .1988;

Agaphonov et al., 19dl; Cregg et al. , 1997;. Sreekrishna et al.,

1988, 16905.,Продуктивность экспрессии генов в этих дрожжах гораздо больше, чем В аналопгчных. конструкциях у S.cerevisiae.

Pichia methanolica CP.plnus MH4, Tolstorukuv, Burkett, 19915

один из видов метилотрофных дрожжей. В генетическом аспекте этот вид хорошо изучен (см.Толсторуков, 1988), но в молекулярно-генети-ческом,аспекте эти дрожжи изучены еще недостаточно, p. methanolica трансформируют с применением гетерологичных генов ade2 и leue s. се-

revlsiae СНеЙСТЭТ И Др., 1987; тагutIna, Tolstorukov, 1091 ). ОДНЭКО

до последнего времени не было системы трансформации p.methanoiica собственными генами. Разработка такой системы трансформации может стать основой для генно-инженерного исследования этого обьекта.

С этой целью мч выбряли ген adei , мутации в котором приводят к накоплению красного пигмента, что облегчает отбор мутантов и позволяет следить за судьбой ' трансформирующих векторов (silver,

Eaton,. 1969; ТОЛСТОРУКОВ и Др., 1987; СМ. Stolz, Linder, 1690).

При выполнении данной работы нами поставлены и выполнены следующие задачи»

I) Клонирование гена ADEI P. methanol ica 2 ) Секвенироваже клонированного гена

3) Анализ полученной нуклеотидной последовательности и сравнение кодируемой ей АИР-карбоксилазы с гомологичными белками других организмов.

4) Трансформация P.methanoiica С ИСПОЛЬЗОВЭНИвМ ГвНЭ ADE1 .

5) Применение приемов трансформации пихии геном adei для генно-инженерного исследования P. methanollea.

Научная новизна полученных результатов. В нашей работе впервые был клонирован И секвенирован ген ADEI P. methanol lea. Мы предложили

новый метод получения упорядоченных делений для секвенирования. Аминокислотная последовательность, кодируемая геном adei p.methanolica сравнена с гомологичными протеинами разных организмов. Мы выявили сильную гомологию между дрожжевыми АИР-карбоксилазами. Гомология с аналогичным! ферментами высших эукариот и e.coU была менее значительной. Ген adei был использован как генетический маркер для трансформации пихт*. Отработаны условия высокоэффективной трансформации пихии собственным геном adei, а также гетерологичными генами

ADE2 и leu2 S. cerevisiae. ТраНСфОрМЭЦИЯ ИНТЭКТНЫМИ ПЛЭЗМИДаМИ С

геном adei мало эффективна. Линеаризация плазмид в единственном сайте внутри гена adei повысила эффективность трансформации. Трансформация линейными фрагментами ДНК, содержащими вышеуказанные гены, очень высокоэфективна. Вводимое фрагменты ДНК либо замыкаются в кольцо яа счет неспецифического лигирования, давая нестабильных трансфэрмонтов, либо интегрируют в разные места генома. Мы обнаружили такке высокую Эффективность котрансформации у р. methanolica.

Мы получили дизрупцию гена adei на хромосоме и использовали эту дизрупцию для исследования внутригенной рекомбинации в диплоидных штаммах, которая происходит, в основном, через механизм конверсии. Наблюдается и внутригенная рекомбинация в гаплоидных штаммах Р. methanolica.

Практическая ценность работы. Клонированный и секвенированный ген adei пихии можно использовать как векторный маркер для трансформации дрожжей (p.Kj&thanoiica и s.ce.-evisiae). Высокоэффективная трансформация пихии гомологичным геном adei и гетерологичными генами

ADE2 и LEU2 S. cerevisaie МОЖеТ СЛУЖИТЬ ОСНОВОЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВаНИЯ

р. methanolica как обьекта экспрессии чужеродных генов. У пихии очень часто происходит негомологичная интеграция вводимой ДНК. Это может сделать р.methanolica моделью для изучения иегомологичной рекомбинации, часто наблюдаемой у млекопитающих (Roth, Wilson, iseso. Апробация работы. Результаты работы представлены на научных семинарах лаборатории физиологической генетики (БиНИИ, СПбГУ), кафедри гене гики Хошиминского университета (Вьетнама), xv-om международном симпозиуме по генетике дрожжей (Riga, lean, международной конференции по генетике и молекулярной биологии нетрадиционных дрожжей (Basel, 1У925.

Публикпции. По материалам работы опубликованы 3 тезисов дозсладов и 2 статьи в печати.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов (клонирования и секвенирования гена adei, трансформации им, использования гена adei для молекулярного исследования), обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 202 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 27 рисунков и 216 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В.работе использованы следующие штаммы дрожжей s.cerevisiae: ЗЗГ-

Д373' Са pheAJO ade2-l 44,717 his7-l Iys9-A21 ura3-52 leu2-3, 112 trpl-2893, 22-П3890 Ca ade2-919 Iys2-2S3, 6Б-Д354 ta ade2-del668 iysa-29 1вч2-з, на ui-a4> из коллеции нашей лаборатории; 1А-АЯ Са

ade2-del668 lys2-29 leu2-3,112 arg4} , ПрвДОСТаВЛвННЫЙ А.ЯНУШКОЙ

(НПО, "Ферментас" Литва) и следующие штаммы p. methanoiica: гзз7

Cleul his4>, 2997 С leul adel-20655, 2998 Cleul adel-2063), 2999 С leul adei-20655 3000 Cleul adei-20653, првДОСТаВЛвННЫв И.ТОСТОру-

вым (ВШИ генетика, Москва). Для молекулярной манипуляции плазмид-НОЙ ДНК использованы штаммы Escherichia coll НВЮ1, DHSa, JM103,

XL-Blue CSanibrook et al., 1989>.

Набор упорядоченных делеций был получен методом, предложенным нами. Он основан на использовании набора мелкошепящих эндонуклеаз рестрикции, таких как Aiui, заизл, Нра2 и Hinfi. Этот метод является модификацией методов разрезания SauSA С Lee, Lee, 1988) и ДНКазы I (Barnes, Be van, 19зз-> и включает этап обогащения необходимыми лелециями (Салганик, 1990). Сначала проводили частичное расщепление плазмиды, несущей вставку интересующего фрагмента ДНК в полилинкере, различными мелкощепящими эндонуклеазами в отдельных опытах. Пробы с максимальным содержанием полных линейных плазмид из разных экспериментов собирали вместе. Эту смесь подвергали полному гидролизу рестрикционной эндонуклеазой, имеющей в плазмкде единственный сайт расщепления между праймером для секвенирования и клонированным фрагментом ДНК. Линейные фрагменты ДНК после "затупления" концов лигировали в кольцо с помощью лигазы фага Т4 и трансформировали ими е.сои. Следующие этапы - обогащение необходимыми делениями и скрининг делеций проводили согласно (Салганик, 1990). Метод эффективен для плазмид типа рис или pBiuescript: до 50% проанализированных нами клонов несли делеции в интересующем фрагменте. Определение нуклеотидной последовательности проводили по методу

С Sanger et al., 1977), ХрОМОСОМНЫв ДНК ДфОЖКеЙ ВЫД9ЛЯЛИ М6Т0Д0М

со-уег еь а1., 19755. Методы молекулярного клонирования к анализа ДНК описаны В руководстве (БатЬгоок е1 а1., 19095. БОЛЬШИНСТВО генетических методов приведено в руководстве (Захаров и др., 1584). Трансформацию ПИХИИ проводили ПО методу си о еЬ а1., 19835 с модификацией СТагиПпа, ТоГяЬогикоу, 19915. АН8ЛИЗ НуКЛвОТИДНЫХ ПОСЛв-

довательностей проводили с помощью пакета "оыА-эим" (А.Миронов, ВНИК Генетика)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование гена аре! р.гопьапоЫса. Библиотекой генома пихии на плазмиде УЕРгз (см. КизЬп1гоу с». а1., 19905 мы трансформировали штамм 53Г-Д373 по компенсации мутации ас)е2. Получены II дае^еи'1' трансформантов, которые на неселективной среде теряли два признака вместе. Плазмидная ДНК двух из них была выделена и перенесена в е.сои. Плазмида из обоих ре трансформантов были идентичны и несли вставку длиной около 10,т.п.о. (рис.1). Плазмида названа ¥Ер13-аое1 . Рви-рестрикты этой плазмида был 1 перенесены на нитроцеллюло-еный фильтр по Саузерну и прогибридизированы с структурной частью гена аве2 сегеу1з!ае. Только Реи-фрагмент длиной 2.1 т.п.о. дал гибридизацию, р^ы-субфрагменты вставки переклонировали в плазмиду

рП.44 СВоппеаиа е1 а1., 19915 ПО РзИ СЭЙТУ ПОЛИЛЧНКвра И аНЭЛИЗИ-ровали ИХ способность компенсировать мутации аае2 Э. сегеуХэЛае. Результат теста показал, что ген аое1 р. »еъьапоиса, гомологичный сахарсмицетному гену аоеэ, локализуется в р®и-фрагменте размером 2.1 т.п.о. Плазмида рплд с этим фрагментом (рП-44лг) способна нормально трансформировать также штаммы ПА-АЯ и 6Б-Д354, имеющие полную делецию гена аое2. Эта способность сохраняется при инверсии

-фрагмента в плаямиДе рРЬ44лг. Нуклеотидная последовательность гена аре! р. теишпоиса. -фрагмент ДЛИНОЙ 2.1 '.-.П.О. Перенесен На фаГИ М13 тр18; тр19 <Ке*51пд е1 а1., 19855 и в ллазмиду риса для дальнейшего секвенирования. Основные клоны с делециями гена для определения нуклеотидаой последовательности были получены предложенным нами методом. Анализ нуклеоти-дной последовательности Р*и-фрагмента показал, что открытая рамка считывания начинается с 59-ого нуклеотида от левого Рем-конца. Это означает, что ген асе1 р.methanc.ii.ca, находясь на мультикопийной пласмиде рП-44А2, компенсирует мутации ас!е2 S.cerevisiae без большей части промотора. Подобное наблюдение сделано для гомологичного ему гена АПЕ2 б. сегоу! ь1ае С&?(М1аК.е гЬ а!.. 19915. Для СвКВвНИ-

роваяий промотора tena Abei мы переклонировали фрагмент p™s-psü <рис.I) в плазмидн рвиш-sct-ipt серии ks, sk по Psti-Smai сайтам и Получили набор делений в этих фрагментах, На рис. 2 представлена нуклеотидная последовательность фрагмета f-Me-Psti длиной 3077 п.о.

Рис. I. Вставка длиной около 10 т.и.о.,- клошгоочаняая в плазмиде yefiia и стратегия секвенирования гена a-dei .

t<**.- г.-ítb ~>t

pv* o. 9kb< р 0. & fí hfc S l.i p 2.6 r 4.0 p

s-': i -i -: =i ==t =: =t

Примечание: короткие стрелки - нуклеотидкые последовательности субфрагментов, которые собирались затем в единую последовательность (рис.2), пунктирная линия - открытая, рамка считывания гена adei.

pv CPvu2), P CPstl), H CHind3), Hp CHpal), SCSallJ, RCEcoRlJ.

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность гена adei p.methanoiica и кодируемая ею аминокислотная последовательность белка, обозначенная буквами нзд-нуклеотидной последовательностью.

Pvu2

cagctgctctgct.ccttgattcgtaattaatgttatccttttactttgaaotcttgtcgg 61 tccceaacagggat tccaateggt gctcagegggatttcccatgaggtttttgacaactt 21 tattgatgctgcaaaaactttttlagçcgggtttaagtaactgggcaatatttccaaagg 1Ô1 ctgtgggcgttccaoactccttgctt tt cataatctctgtgtattgttttattcgcattt 241 tg3ttctcttattaccagttatgtagaaagatcggcaaacaaaatatcaacttttatctt 301 gaacgctgacccacggtttcaaataactatcagaactctatagct ataggggaagtt tac 361 t gettgettaaagcggctaaaaagtgtttggcaaattaaaaaagctgtgacaagtaggaa 421 ctcctgtaaagggccgattcgact tcgaaagagcctaaaaacagtgactattggtgacgg 4Ô1 aaaattgctaaaggagtactagggctgtagtaataaataatggaacagtggtacaacaat 541 aaa^gaat gaegctgtatgtcgtaycctgcacgagtagctcagtggt agagcagcagatt 601 gcaaatetgttggtcaccggttcgatccggtctegggcttccttttttgctttttegata 661 tttgegggtaggaagcaaggtctagt tttcgtcgtttcggatggtttacgaaagtatcag 721 ccatgagtgtttccctctgyctacctaatatatttattgateggtetetcatgtgaatgt 7Ô1 t tctttccaagt tcggctttcagct.cgtaaatgtgcaagaaatatttgactccagcgacc 841 tttczgagtcaaattaattttcgctaacaatttgtgtttttctggagaaacctaaagatt Ô01

taactgataagtcgaatcaacatctttaaatcctttagttaagatctc?gcagcggccag 961

m d s o t 5

tatt aaccaatagcatattcacaggcatcacatcggaacattcagaatggactcgcaaac 1021

VGILGGGQLGRMIVEAAHRL 25

tgtegggattttaggtggtggccaacttggtcgtatgatcgttgaagctgcacacagatt 1081

NI KTVILENGDQAPAKQINA 45 gaatatcaaaactgtgattctcgaaaatggagaccaggctccagcaaagcaaatcaacgc 1141

lddhi dgsfndpkaiaelaa 65

ttt agatgaccatattgacggctcattcaatgatceaaaagcaattgccgaattggctgc 1201

JCCDVLTVEI EHVD TDALVEV 85 caagt gtgatgttttaaccytt gagattgaacatgttgacactçratgcgttggttgaagt 1¿61

qkatgikifpspetislikd 105

tcaaaa'ggcaaetgçjcatcaaaatct'tcccatcaccagaaact.at ttcattgatcaaaga 1321

К Y L Q К E H L I К N G I AVAESÇS 125 taaatacttgeaaaaaga?y catttgattaagaatgncattgctgttgccgaatcttgtag 1381

VESSAASLEEVGAKYGFPYM 145 tgttgaaagtagcgcagcatctttagaagaagttggtgccaaatacggct tcccatacat 1441

LKSRTMAYDGRGNFVVKDKS 165 gctaaaatctagaacaatgc/cctatgacggaagaggtaat tttgttgtcaaagacaacjtc 1501

Y I PEAL'KVLDDRPLYAEKWA 165 atatatacctgaagctttgaaagttttagatgacaggccgttatacgccgagaaatgggc S561

pfskelavmvvrsi dgqvys aos

tccatt-ttcaaaggagttagctg ttatgg t tg tgagatcaatcgatggccaagt ttattc 1621

YPTVETIHQNNICHTVFAPA 225 ctacccaactgt tgaaaccatccacc«aaacaacatctp tcacac Lgtctttgct ccagc 1681

rvndtvokkaûi ladnavks 245 tagagt+.aacgatac tgt ccaaaagaaggcccaaattt,tggctyacaacgc tgtcaaatc 1741

FPGAGI FGVEMFLLQNGDLL 265 tttcccaggtgctggtatctttggt gttgaaatgtttttatt-acaaaatggtgacttatt 1801

VNEI aprph NSGHYTI DACV 285 agtcaacgaaattgccccaagacctcacaattctggtcactataccat cgacgett-gt-gt 1861

TS O. FEA H VRAI TGLPMPKNF 30S cacctcgcaatttgaagctcatgt tagggccattactggtctacccatgccgaagaactt 1921

TCL.STPSTQAI MLNVLGGDE 325 cacttgt-ttgtcgac tccatctacccaagctat tatçj* lgaacgttttaggtggcgatga 1981 • QHGE FKMCKRAL ETPHASVY 345 gcaaaacggtgagttcaagatgtgtaaaagagcactaçjaaactcctcatgcttcl.gttta 2041 LYGKTTRPGRKMGHINI V S Q 365

cttatacggtaagactacaagaccaggcagaaaaatgggtcacattaatatagtttct-ca 2101

SMTD C 'E RRLHY I EGTTHSI P 385 atcaatçjactgactgtgagcgtagat cacattасаtagaaggtacgactaacagcatccc 2161

LEEQYTTDSI PGTSSKPLVG 405 tctcgaagaacagtacactacagattccattccgggcacttcaagcaagccattagtcgg 2221

VI MGSDSDLPVMSLGCNI LK 425 tgt,catcat.gggtt.ccgattcggacct.accagtcatgt,ct-cKaggtt-gtaat.3t.attgaa 2281

QFNVPFEVTI VSAHRTPQRM 445 gcaattt-aacgtlccatt^gaagtcactatcgtt-tccgctcatagaaccccacaaayaat 2341 AKYAI DAPKRGLKCI I AGAG 465

ggccaagtatgccatt,gatgctccaaagagagggttgaagtgcatcatt,gctggtc,ct-99 2401

GAAHLPGMVAAMTPLPVIGV 485 tggtgccgcicatttaccgggaatggtt gcggcgatgacgccgctgcctgttattggt gt 2461

PVKGSTLDGV'DSLHSI VQMP 505 ccctgttaaaggctctactttggatggtgttgattcactacactccatcgttcaaatgcc 2521

R G I P V A T V Л I HNATWAALLA 525 aagaggt-attcctgttgctactgtggctattaacaatgctactaacgctgccttgctage 2581

ITILGAGDPNTCLQWKFI& 544

tatcacaatcttaggtgccggcgatccaaatacttgtctgcaatggaagtttatatgaac 2641 aatatggaaaatgaagtt tti;ggcaaggctgaaaaat*,ggaaaatggtggatatgaagaa 2701 tacttgagtacatacaagaagtagaaccttttatattt-gatatagtacttactcaaagic 2761 ttaattgtict-aactgttaatttctgctttgc.atttclgaaaagt-ttaagacaagaaatc 2821 t tgaaatttctag--tgctcgtaagaggaaacttgcattcaaataacattaacaat aaatg 2881 acaataatatattatttcaacactgctatatggiagttttataggtttggttaggatttg 2941 agatattgctagcgct-tatcatiatccttaattgttcatcgacgcaaatcgacgcatt te 3001 cacaaaaat > ttcegaacctgttt ti cacttctccagatctt gg^ttagtat agcttttg 3061 acacctaatacctgcag 3077

ATst 1

Гомологичное сравнение■ Аминокислотная последовательность, кодируемая геном ADE1 p. metlianoiica бНЛЭ СраЕНеНЭ С ГОМОЛОГИЧНЫМИ ПрОТЭ-инаыи разного происхождения. дрожжевая АКР-карбоксилаза (АИРК) имеет две части - СОд-связавающая (м-часть, около 400 а.к) и каталитический центр (С-Часть, ОКОЛО 150 а.К) (tM.Stotz, Linder, 1990), которые гомологичны с ригк и р»ге протеинами e.coii, соответственно. Однако, только С-часть имеет гомологию о АИРК-частью мультифункцио-нальных белков высших еукариот, которая обладает одновременно и катамтической и СО^-связквающей активностями сем. eben et ai., lego). При этом гомология между СО-,-связыЕаю!дими частями АИРК (там, где эта часть сохранена) во'всех случаях значительно ниже, чем между каталитическими центрами АКР-карбоксилаз (табл.1). Степень гомологии между дрожжевыми АИРК спихни и сахаромицетов) 68% выше, чем ГОМОЛОГИЯ между ИХ SUP2 протеинами 60% CKushniror et al., 1S90). Последние имеют большую гомологию с гомологичным протеином gstti-hs

человека CSamsonova et al., 1991) 58%, В ТО ВрвМЯ K8K ГОМОЛОГИЯ

между дрожжевыми"и человеческим АИРК незначительна (24%-25%).

Табл.1. Степень гомологии между аминокислотными последовательностями АИР-карбоксилаз разных организмов (в процентах).

Е. с purE Е.С риг 1С S. с ADE2 S.p ADE6 P. m ADEl Н. s ADE2 G.g purEK

Е. cpui Е

Е. с pur К 15

S. с ADE2 40 25

S.pADEe 46 25 57 51 <34

P. inADEl 51 22 68 78 59=" ОЭ

Н. SADE2 21 13 24 27 25

G. gpurEK 23 14 24 27 25 87

E.cpurE, Е. cpurK - протеины purE, purK E.coii, ССЮТВЭТСТВеННО. S. CADE2, S. PADE6, И P.mADEl - АИР-КарбОКСИЛЭЗЫ S. cerevisiae, S. ponibe, и P. methanolica, СООТВвТСТВеННО. Н. SADE2, G. gpurEK -

АИРК-части САИКАРС-АКРК" протеинов челозека и курицы, соответственно. Гомологичный анализ дрожжеБых АИРК дается в трех параметрах: степень гомологии между всеми аминокислотными последовательностями АИРК (крупные цифры); между их я-частями (верхние цифры) и между их С-чаотями (нижние цифры).

КодоноЕое использование. Анализ состава использованных кодонов гена adei иши и сравнение его другими генами: swa s,cere-yisiae

CKushnirov et al., 19885, SUP2P Р. methanolica OCushniroy et al,, 19^05, ADES S.cerevisiae CStot;-, Linder, 19905, ADES S, panibe CSzankasi et al., 19S85 ПОКаЗЭЛ, ЧТО ГвН APE1 ПИХИИ, ПОДОбНО ЭТИМ

генам, приналекит к умеренноэкспрессируемым генам. Составы кодоно.в гена adei и гена supep пихии сходны; оба гена часто используют или вовсе не используют одни и те же триплеты,

Табл.2. Средняя частота трансформации штаммов пихии геном adö,

_____________ЩИ_______________________KOJ^SCT^Me^lMKr^^jK^^.

название_________2IE2K2YES____________£2абиль!яе_^^я_^нестабильнце_

Интактные плазмида

pUCÖAÄ р fj 1 »5 О

pfl44a2 р--5-ю о

pfl44a3 р ~::::::::ii-| s_io о

Yepl 3ade1 р l 1-S О

Линеаризованные в сайте HPai плазмида

рисала ргзс——15-го о

pfl44aa р^з 25-50 7-17

pfl44a3 р. ' 100-153 30-45 фрагменты ДНК, содержащие ген adei

Pstl C2.1kb5 I I 1.10г-2. 10г О

Bgia сг.овкю ■ | . l.io2- г.ю2 4.ю2

Pvu2-EcoR5 СЗ.ОкЬЗ I ГЗ 2.10й- 3.102 4.10Э-6.103

Pv<i2-Xhol С6.5кЬ5 ' . ¡r'.".'r;.....4.102-G. Ю2 lO4

фрагменты, содержащие ген ade2 s.cerevisia« Psti-xhoi с4.окь5 и mit ичпт е.ю2-юэ о

Pst 1 —EcoRlС 4. ОкЬ5 IШЧПШГШ 2.102- 4.102 5.102- 8.102

1-1 ген ADE1 Р. methanolica. щд ГвН L.EU2, ГеН URA3, ¡щ ГеН ADE2

— бактериальная часть плазмида, — ДКК от 2-шжронной плазмида

- Ii -

Трансформация p- methanoiica гомологичным геном adei и гетерологич-ныки генами ades и leus s. r.erevisiaa. Различными конструкциями с геном ADEi трансформировали adei штаммы штата. В табл.2 представлено среднее количество трансформантов для четырех штаммов: 2997, 2998, 2999 и 3000 (на 1мкг ЦНК). Были получены как белые, крупные так и мелкие, розовые (красные) трансформанты. Ка неселектиеной среде YEPD мелкие трансформанты после 24 часов роста дали не больше В% потомков Ade*, тогда как - белые трансформанты были стабильны: после 4 дней на такой среде Ade" колоний не наблюдалось.

Анализ с помощью гибридизации по Саузерну общей ДНК нестабильных ма* трансформантоа из разных вариантов (трансформация фрагментами ДНК Вд12-Вэ12, pvu2-ecorv) показал, что нестабильные трансформанты содержат экстрахромосомные элементы. В том случав, когда фрагменты содержали еще бактериальный ген Ampi из общей ДНК нестабильных трансформантов нам удалось получить бактериальных ретрансформантов (для фрагментов Hind3 CLEU2+Apr+adel) длиной около 8,0 т.п.o., Hind3-xhoi CLEU2+Apr) длиной около 6,0 т.п.о.). На основании этих данных и данных Тарутиной и Толсторукова cTarutina, . Tois-torukov, 1991) мы предположили, что нестабильные трансформанты фрагментами ДНК содержат автономно реплицирующиеся плазмиды в кольцевой форме - результат оамолигирования трансформирующих фрагментов ДНК. Наличие нестабильных трансформантов зарегистрировали для разных фрагментов ДНК с некомплементарными концами, так что по-видимому трансформирующие фрагменты in vivo замыкаются независимо от их концов за счет повышенной неспецифической лигазной активностью в пихни. Это предположение нашло некоторое подтверздение в опыте по котрансформации (см. ниже).

Рестрикциошый анализ плазмид, полученных из нестабильных трансформантов Н1паз-фрегмеитом (с помощью hípD3 и *w) показал, что из 7 случаев только две плазмиды теряли шпиз сайты при самозамыкании. Судя по размеру, эти две плазмиды не несут значительных изменений. Это явление наблюдается при фенотиггаческом анализе нестабильных Ade+ траясформантов фрагментом Pvu2-xhoi, содержащим гены adei и leua: все полученные нестабильные лне+ трансформанты имеют неслективный маркер Leu+. Этот результат соответствует данным Тарутиной и Толсторукова для нестабильных трансформантов Вз1г-фрагкен-том гена leu2 с Таги*, i па, Toistorukov, 1991). Однако при трансформации Bgi2-фрагментом гена adei с частично дел&тзфсванным промотором

(оставшаяся часть длиной 65 н.т.)- выявилось явление полимеризации вводного фрагмента: экстрахромосомные элементы нестабильных трансформантов имеют молекулярные весы гораздо больше, чем размер исходного трансформирующего фрагмента с а.лкю. возможно, что полимеризация фрагмента необходима для увеличения активности АИР-карбокси-лазы, которая занижена из-за делеции промотора (см. Gedviiaíi.e et,

al., 1991Э.

Вое проанализированные стабильные Ad*+ трансформанты пихии (более 1000) штаммов ad<*j ieui фрагментом pvu2-xhoi, содержащим ген

ADEl p. mwthar.olicsi И ГРН LEU2 S. cerevisJ а» бКЛИ Ade-+I.eu+, НВСМОТрЯ

ьа то, что отбор производился только по признаку Этим пихия

довольно резко отличается от сахаромицетов: при подобной трансформации s. cei-«vi siae не гомологичный "хвост" трансформирующего фрагмента всегда теряется за счет двойного кроссинговара. Данные у пихии можно объяснить лишь негомологичной интеграцией вводимого фрагмента ДНК. Это является и генетическим свидетельством того, что вводимые фрагменты у'пихии в основном не подвергаются серьезным перестройкам, что соотствует данным Тарутикой и Толсгорукова при физическом анализе трансформантов-иктегрантов (личное сообщение).

.Анализ хромосом стабильных м** трансформантов Psti-фрагментом гена adei с помощью гибридизации по Cayзерну показал, что этот фрагмент интегрируют в разные места хромосом несмотря на его полную

гомологию с геномом реципиента (см. рис. 3)

*

Рис. 3. Гибридизация по Саузерну.хромосомных ДНК траноформантов Ad«1" штамма 29?7, полученных при трансформации .линеаризованной Hpai плазмидои pfl44a3 и Pstt-фрагментом ген aüei , Дорожки I, 2, 3*- хромосомная ДНК трансформантов линеаризованной Hpai плазмидбй pFL44A3; дорожка 4 - штамма 2997 ; 5, 6, 7 - ттзансформантов Psti-фрагментом. I, 2', 3 - гидооллз sail ДяК; 4, 5, 6, 7 - гидролиз P*ti. В качестве зонда использовали Pst.ir фрагмент гена adei.

Как видно из рис. 3, три независимых трансформанта линеаризованной Hpai плазмидой PFL44A3 дали одинаковые картины - свидетельство того, что линеаризованные в середине гена adei ллазмицы инте-.грирук/т в определенный сайт. В тоже время фрагмэкт, содержащий ген adei интегрирует в разные места генома, несмотря на его полную го-

I 2 3.4

.6 -7

23.0-

Э-Ч— -0 6-

ЬЧ-

- гз.о 9А -Б.6 -¿..г,

>■?>■ i

мологию с геномом хозяина. Кегсмологичная интеграция вводимых ДНК наблюдается и у других метилотрофных дрожжей, таких как н. polymorph» CCM.Roggenk.imp et al., 19893, Р.. pastor is CCregg et al., 1937}.

Результат физического анализа стабильных трансформвнтов Psti-фрагментом гена adei позволяет 2 вывода: с одной стороны, это соответствует предположению о предпочтительной негомологичной интеграции у пихии, которое мы сделали, опираясь на генетические данные, с другой стороны, показано, что фрагмент Psti с частично делетирован-ным промотором (оставшаяся часть от промотора длиной 59 п.о.) способен компенсировать adei мутации,, находясь в единичной копии (дорожки 5, 6). Это соответствует тому, что наблюдается для гена апез

S. cerevisiae CGedvilaite et ai., 19913. Эти ЭВТОрЫ П0КЭ38ЛИ, 4^0 ГеН ADE2 S. cerevisiae КОМПвЕСИруеТ adeS МУТЭЦИИ ПрИ ДвЛвЦИЯХ ÍTpON.'.i-

тора, находясь на центромерной плззмиде.

Получение ДИЗРУПЦИИ хромосошой КОПИИ гена adei P. methanolica. Для этого мы трансформировали штамм 2337 (ms4 íeui) Psti-фрагментом гена adei, разорванным геном leus, к признаку leu*. Трансформантов отбирали на селективной среде с добавлением-, адетгаа. Среда 616 крупных Leu* (Н9 СЧИТЭЯ болев 6000 средних и мельких Leu+3 только 8% трансформантов было мутантами по гену adeiХромосомный анализ двух из таких трансформантов с помощью Слот-гибридизации по Саузерну показал, что оба трансформанта идентичны и содержат дазруптированкый ген adei геном leus (рис. 4). Эти штаммы мы назвали 231Д, а мутантше аллели - adei-n.

Рисунок 4. Физический анализ

ХРОМОСОМНЫХ ДНК РОЗОВЫХ Leu+Ade~

трансформантов, полученных при трансформации пихии разорванным геном adei. Дорожки I - контроль, хромосомная ДНК штамма 2337; 2,3 - хромосомная ДНК трансформанта номер 1'; 4,5 - хромосомная ДНК трансформанта номер 2; 1,2,4 - ДНК гидролизованы Psti; 3,5 - ДНК гидролизованн Psti и san совместно. Изучение внутрпгекной рекомбинации у p.methanol lea. с помощь» полученной дизрупцж; хромосошой копии гена adei мы имел!: возможность исследовать механизм внутригенной рекомбинации у p. methanolic.-i.

1 2 3 4 5

2.1

41W

Штамм 231Д (adei-D his4) скрещивали со штаммом 2997 (ad<-1-2065 ieui ). Полученные" гибриды при индукции ультрафиолетовым светом (5

СеК. - 25 Дж/lM1") ДЗВаЛЧ Ade+ рОКОМбИНаНТОВ ДВУХ ТИПОВ Ade\.eu+ и

л dt- Leu" в соотношении 63%:37£. Дальнейший анализ сегрегантов этих Atie+ рекомбинантов с по 50 клонов) показал, что ни один 'из них не содержит двойную мутацию adei-гог>5,d. Это означает, что появление Ade+ рекомбинантов происходит, в основном, не за счет митотического реципрокного кроссинговера, а за счет конверсии; неодинаковое количество рекомбинантов дзух классов является следствием неразномерного переноса информации при конверсии, что согласуется с данными по сахаромицетам при изучении рекомбинация между делецмонкыми к Т0ЧК0БЫМИ мутациями lys2 (Che.-nui f et al. , '.9843. Внутркгеннея рекомбинация в гаплоидных штаммах p.methanoiica. Мы расматривали Енутригенную рекомбинацию в гаплоидных штаммах : между исходной аллелью adei—2065 и новозводимой аллелью adel , которая находится либо на хромосоме з разных местах,, либо на автономной длззмиде. В обоих . случаях мы получили реверсии к Ade? что свидетельствует о наличии внутригенной рекомбинации. В первом случае было изучено два варианта (см, табл.3). Разные стабильные Leu+ транеформанти давали Ade+ рекомбинантов с разной частотой, по-видимому зависимо от расположения ноькх аллелей. В том случае, когда ген .LEua находился в середине гена adei среди ade+ рекомбинантов мы выяеили два класса: a.3e+leu+ к ли-леи-. Последний класс не выявляется, когда ген leu2^ находился на фланге фрагмента гена adei . Это говорило том, что потеря leu+ признака, 6 основном, является следствием репарации дизруптирсванной аллели на матрице . исходной аллели adei-гоез по механизму конверсии, а не рекомбинации между1прямыми повторами двух копий гена adei.

Нестабильные Ade'Leu'* клонн трансформант.ов штамма 2999 Ыпаз-фрагментом при поддерживании.на селективной среде очень часто . давали белке секторы с стабильным фенотипом Ade+Leu* что свидетельствует о наличии внутригенной рекомбинации между плазмидной и хромосомной аллелями adei у гашш. После, инкубации (24 часа) в кадкой, yepd с последующей селекцией ad*+ рекомбинантов.среди 452 ade"1, клонов 6 имеют Ade+Le«~ фенотип. Анализ по блот-гибридизации хромосомных ДНК этих Ade+Leu" клонов показал, что плазмида- не. интегрировала в. хромосомы. Так как мутация adei-aoes почти не ревертирурует, можно предположить, что хромосомная мутантная аллель была воотанозлена

на основа плазмидной матрицы без интеграции самой плазмиды.

Табл.3. Количество Ade* рекомбинантов, возникших в некоторых+ трэнсформантах штамма 2999 разными фрагментами (среднее число^е клонов_на_щтрга_трех_отпечатков_ти_|ш ___

фрагментом Hind3 фрагментом Pvua-stui

Amp__LEU?.__adei PvtjS AP 3. Sich E1 Stul

a. 3kb —атоЕБ----i. bkb k. ölcb ТЕШГ ТТгкЬ

номер тран-тов Ade* Ad©+Leu+ номер тран- •TOB Ade+ Ade^Lei

I 0 0 I I i

4 13 тз 6 28 24

7 I I 8 2 I

9 3 3 10 2 2

10 5 5 II 0 0

II 18 18 14 0 • 0

13 0 0 16 0 0

14 I I 17 8 5

18 23 23 ■ 18 8 3

22 15 15 20 I т

23 23 23 21 33 31

24 0 0 23 7 7

26 25 25 24 2 т

штамм 2999 С 0 штамм 2999 0 0

Репарация дизруптированного гена при трансформации. Мы изучали репарацию дизруптированной аллели ariei-D при трансфомации фрагментом или интактной плазмидой, содержащими ген adei. Интактной плазмидой рисвАй и Psti -фрагментом этой плазмиды (смесью фрагментов после Psti-рестрикции), трансформировали штамм 231Д. При трансформации Psti-фрагментом среди 217 Ade+ трансформантов было обнаружено II кленов Ade+Leu" (около Ь%) - результат репарации дизруптированной аллели Psti-фрагментом; при трансформации интактной плазмидой доля Ade"1, Leu" трансформантов среди лае* составляла 20%. Это означает, что при трансформации интактной плазмидой чаще происходит гомологичная рекомбинация, чем при трансформации фрагментом. Когрансформация фрагментов ДНК. Мы провели котрансформацию штамма 299Э (adei ieui) двумя фрагментами (см. табл.4). Анализ с помощь» гибридизации по Саузерну стабильных котрансформантов выявили ка-

личие коинтеграции двух трансформирующих фрагментов (5 из 7 проан-ализованных котрансформантов). Анализ ДНК нестабильных котрансфор-мантов фрагментами Saii^xhoi и Psii по блот-гибридизацим показал, что два этих фрагмента соединяются воедино. В случае, когда был использован Есои+вд1г-фрагмент ДНК, удалось получить бактериальных ре трансформантов штата е.сои hbioi амРг общей IHK, выделенной из отдельных нестабильных котрансформактов (всего было получено 12). Эти Арг трансформанты оказались Leu+. Рестрикционнкй анализ плазмид ВЫЯВИЛ, ЧТО два фрагмента Sall+Xhol СLEUS} И EcoRl+Bgla CADE1+Ampr) соединены в одну плазмиду. Судя по размеру полученных плазмид можно предполагать, что в процессе соединения могут участвовать и другие фрагменты ДНК, например остатки от-рестрикции исходных плазмид.

Табл. 4. Частота котрана$ормации у p. methanonca (на 1мкг ДНК).

селективные маркеры ! : Ade* . | 1 Ade* i i : Leu* j t

Фрагменты я гены на этих фрагментах Pstl | i (АСЕ1Э j EcoRl-Во12 CADE1 +Атр} t Xliol-Sall { СLE425 1

P-stl (ADE1Э стаб. Ade* ; j » 256_котр ! 8500 Leu * j l

EcoBl-Bgia С ADE1 +Ainp5 t CTa6»Ade+ - 2I2.KOTP i 9220 Leu * 1

Xliol-Sall С LElia > (28c+2I7H)Ade+ j (49'4+208)Ade* 90% нестаб.| 10% стаб.' 1

Примечание: котр - котраноформантн; с, н - стабильные и нестабильные' трансфсрмэнты, соответственно. Гены на фрагментах обозначаются в скобках.

ОСНОВНЫЕ вывода ДИССЕРТАЦИИ ■ i) Клонирован ген ах>е1 р. ^иапоиса, гомологичкнй гену лока э.сеге^вхэе, и определена его нуклеотидная последовательность в фрагменте ДНК длиной 3077 н.т. ' .

2) Аминокислотная последовательность АШР-карбоксилазы p.methanol tea была сравнена с АИР-карбоксилазами различного происхождения. Выявлена высокая степень . гомологии между дрожжевыми АИР-карбсксилазами, с одной стороны, и ограниченная степень гомологии между дрожжевыми АКР-карбоксилазами с аналогичными ферментами е.сои, курицы и человека.

3), Клонированный ген .adei p.methanoiica использован для трансформации пихни. Впервые была получена . высокоэффективная трансформация p.methanoiica собственным геном, adei, а также

ГОМОЛОГИЧНЫМ ГеНОМ ADE2 S.cerevisiae.

4). Трансформирующие фрагменты в P.methanoiica ЛИбо интегрирую? В разные места генома, либо замыкаются, давая нестабильные трансформанты.

5). У p.methanoiica была обнаружена высокая, способность . к котрансформации. Причиной этого явления повидимому является повышенная лигазная активность: введенные фрагменты часто соединялись вместе in vivo независимо от структур их концов.

6). Впервые была получена дизрупция гена у p.methanoiica. Дизруптированный ген adei был использован для изучения внутригенной рекомбинации в диплоидных штаммах. Была обнаружена ее конверсионная природа и полярность переноса информации при конверсии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Tran Ttian Hi ер, V. N. Kulikov, V. N. Noskov, and V. I.Pavlov. The structure of the ADEI gene from methylotrophic yeast Pichia pinusi comparison with the AlR-carboxylase genes from other species. /v Abstr. loth international specialized symposium on yeasts. -Riga С USSR), September' 30-0ctober 6, 1901, p. 53.

2. Tran Tuan Hi ep, Y.I. Pavlov. Cotransf orination and cointegratioi, in transformation of methylotrophic yeast Pichia methanolica. // Abstr. Internatinal workshop on genetics and molecular biology of non-conventional yeast. Basel С Switzerland), August 10-14, 1992.

3. Tran Tuan Hiep, V. N. Noskov and У. I.Pavlov. Transformation system in the methylotrophic yeast Pichia methanolica Abstr. Int.*rnatinal workshop on genetics and molecular biology of non-conventional yeast. Basel CSwitzerlard), August 10-14, 1992.

Подписано к печати 20.10.92 Заказ 303 Тираж 100 Объем I п.я. ПМЛ СПГУ ■ '

199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова.б.