Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез и локализация алкогольоксидазы у метилотрофных дрожжей Pichia methanolica

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез и локализация алкогольоксидазы у метилотрофных дрожжей Pichia methanolica"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК - г МНСЩГУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

? 1 I»'-:; г-т и й-.к ¡-^--^

На правах рукописи УДК 577.152.1

ЛЕОНОВИЧ Оксана Александровна

БИОСИНТЕЗ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ У МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ РкМа теИшпоПса.

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научные руководители:

кандидат биологических наук Я.М. Рабинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Т.А. Белозерская доктор биологических наук А.Б. Циомепко

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт генетики и

заседании диссертационного совета (К.002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы (Москва, Ленинский пр., 33, корп. 1)

Автореферат разослан "-" мая 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится

Еон- 5И4ОЪ МЛ, О ,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов биогенеза и регуляции 'лкового состава пероксисом эукариотических клеток является одним из овивающихся аспектов биологии клетки. Дополнительный стимул к разработке iHHoro направления связан с обнаружением наследственных заболеваний ловека, связанных с дисфункцией пероксисом (ПС). Удобной моделью для ¡следования этих органелл являются дрожжи, среди которых особое место шнадлежит группе метилогрофных дрожжей.

За последние годы был получен ряд регуляторныхих мутантов с мененным спектром утилизируемых источников углерода [Сибирный A.A. и 1986; Sibirny, A.A., et al., 1987,], позволивших исследовать пути метаболизма ¡танола, этанола и глюкозы в дрожжевой клетке. Особое значение в последнее емя получили исследования, направленные на расшифровку механизмов анслокации и сборки белков в пероксисомах. Получен ряд мутантов по сборке биогенезу пероксисом, что позволило идентифицировать группу белков, аствующих в этом процессе.

Пути превращения метанола, этанола, глюкозы и их регуляция довольно эдны у всех видов метилотрофных дрожжей [Sahm, Н., 1977; Veenhuis, J.P., et 1983]. При этом утилизация метанола и этанола сопровождается цественным изменением белкового матрикса пероксисом. Транскрипция »уктурных генов, кодирующих алкогольоксидазу (ЕС 1.1.3.13) наиболее ражена в присутствии метанола [Eggeling, L., et al., 1980], а многоуглеродные ¡страты роста (этанол, глюкоза) репрессируют ее синтез [Eggeling, L., et al., 50; Сибирный A.A. и др., 1986]. Помимо катаболитной репрессии, ферменты юксисом, в том числе и алкогольоксидаза (АО), подвержены катаболитной (ктивации, которая наблюдается при переносе дрожжевых клеток, выросших метаноле, в среду с глюкозой или этанолом [Сибирный A.A. и др., 1986; Hill, ., et al., 1985; Tutlle, D.L., et al., 1995]. По исчерпание репрессора вновь

синтезируемые предшественники АО транслоцируются только в находящуюся j стадии роста ПС и не обнаруживаются в ПС, возникших при росте на этанол Все имеющееся данные о рефляции биосинтеза АО не дают однозначного отве на вопрос, является ли присутствие метанола решающим фактором д транскрипции генов АО и развитии ПС определенного белкового состава.

Агрегатное состояние АО, а также активность фермента, зависят соединений, которые взаимодействуют с SH-реагенгами [Bellion, Е., Goodira J.M., 1987]. Определение первичной структуры АО дрожжей P. methanoli показало, что АО относится к цистеин-богатым белкам [Raymond, С.К., et г 1998]. Несет ли это какую-нибудь функциональную нагрузку - неизвестно, можно предположить, что некоторые из цистеиновых остатков существенны восстановленном состоянии для правильной сборки активного фермента, поддержание восстановительных условий в матриксе пероксисом — важт функция глутатиона и глутатионредуктазы при росте клеток на метаноле.

Для большей части белков, локализованных в цитоплазме, отсутству условия для образования дисульфидных связей вследствие восстановленное среды [Freedman, R.B., 1989]. Необходимое для стабильности S-S свя: соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона обнаруже экспериментально лишь в эндоплазматическом ретикулюме у эукариотичесь клеток и в периплазме бактерий и дрожжей [Raina, S., Missiakas, D., 1997], настоящему времени нет надежной информации ни о степени восстановленно< матрикса пероксисом, ни о необходимости глутатиона для поддержа! структуры ферментов матрикса.

Основной целью данной работы стала идентификация регулятор! механизмов биосинтеза и транслокации АО в пероксисомы и исследования р< сульфгидрильных соединений в поддержание активной октамерной структ) фермента у метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. При э~ предусматривалось решение следующих задач:

- исследование мутанта с нарушенной эганольной репрессией ecrl и тределение в локализации алкогольоксидазы в клетках этого штамма методом ьмуноспецифнческой электронной микроскопии,

- характеристика пероксисом дрожжей дикого типа и мутанта ecrl с >чки зрения распределения в них ключевого фермента метаболизма метанола,

- исследование влияния (З-меркаптоэтанола на активность АО п рост еток дрожжей дикого типа и клеток мутантов, нерастущих на метаноле.

Научная новизна. Впервые показано, что метанол не является [дуктором синтеза алкогольоксидазы у метилотрофных дрожжей Р. zthanolica. Установлено, что у мутанта по катаболитной репрессии в шсутствии этанола алкогольоксидаза синтезируется и транспортируется в роксисомы, где и собирается в активный комплекс. Сульфгидрильные агенты необходимы для синтеза и проявления активности алкогольоксидазы у 'танта, не растущего на метаноле. Это указывает на важность тиолового зтуса клетки для сборки/функционирования алкогольоксидазы in vivo.

Практическая значимость работы. Полученные результаты по ученшо функционирования алкогольоксидазы у мутанта с нарушенной габолитной репрессией создают теоретическую основу для понимания огенеза пероксисом с целью выявления причин ряда заболеваний человека.

Данные по исследованию токсичности сульфгидрильных соединений гут быть использованы для создания штаммов дрожжей, устойчивых к эессивному воздействию SH-реагентов.

Публикации н апробация работы. По материалам диссертации убликовано и принято к публикации 5 печатных работ. Основные положения Зоты были представлены на школе-конференции «Горизонты физико-мической биологии» (Пущино, 2000).

Объем работы. Диссертация имеет стандартную структуру. Всего__

)., в том числе 2 таблицы, 18 рисунков и 121 ссылок цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследований использовали штаммы дрожже Pichia methanoîica дикого типа МН4-1032 [Толсторуков И.Й. и др., 1977] мутантов: МН4-717 (adel ecrl) [Сибиршлй A.A. и др., 19866] и Р6 (mihi [Мотрук О.М., 1989].

Клетки дрожжей выращивали в колбах, на качалке при 150 об/мин, 28° 100 мл жидкой среды следующего состава: 0,3% (NH4)2S04, 1,3% КН2Р04, 0,1° Na2HP04, 0,05% MgS04, 0,01% CaCL2, 0,1% дрожжевой экстракт, 0,3% маль экстракт [Толсторуков И.И., и др., 1977] и аденин в средах для ауксотрофов (4 мг/л). В качестве источника углерода применяли: 1% глюкозу, 1% метанол, 11 этанол, смесь 0,5% метанола и 0,5% этанола. На глюкозе выращиваю: проводили в течение 24 ч., на метаноле - 44 ч.

Для получения сферопластов клетки (10 г сырой массы) осаждал центрифугированием, промывали водой и 30 мин инкубировали при 25° в 50 м 10 мМ имидазол-НСЬбуфера pH 7,5, содержащего 10 мМ меркаптоэтано. Клетки собирали, суспендировали в 10 мл среды А (10 мМ имидазол-НС1, 0,5 1 маннит, 0,5 M сорбит, I мМ глутатион, pH 7,0) и оставляли на ночь при 0°. Дал( клетки промывали, ресуспендировали в среде А без глутатиона и добавляли 1С мг литиказы из желудочно-кишечного тракта виноградной улитк Ферментативную обработку продолжали 1-1,5 ч при 25° на водяной бан Полученные сферопласты осаждали 15 мин при 2 000 g, суспендировали в 10 N среды Б (10 мМ Mes, 0,5 M маннит, 0,5 M сорбит, 5 мМ EDTA, 0,5 мМ PMSF, р 5,8) и разрушали ультразвуком 10-15 с [Bezborodova O.A., et al., 1992 Неразрушенные клетки, клеточные стенки, ядра и частично митохондр! удалялись центрифугированием при 4 000 g в течение 20 мин. Суперната] центрифугировали 30 мин при 20 000 g. Осадок Р2о суспендировали в 0,2 л среды Б и анализировали далее.

Осадок Р2о центрифугировали в непрерывном градиенте сахарозы (30-)%) при 105 ООО g в течение 3 ч (ротор SW50, центрифуга L-65, «Beckman», SA). Собирали со дна с помощью перистальтического насоса 14-15 фракций и феделяли в них маркерные активности, белок и плотность сахарозы.

Эндогенное дыхание н активность алкогольоксидазы измеряли in vivo и vitro амперметрически на полярографе LP7 в ячейке с электродами, крытыми фторопластовой пленкой при 25°С [Шольц К.Ф., Островский Д-Н., »75]. Суспензию дрожжей, эквивалеппгую 2 ОП (при 600 нм) помещали в 1 мл ) мМ КН2Р04 буфера (рН=7) и измеряли скорость поглощения кислорода без бстрата (эндогенное дыхание) и после добавления в ячейку 10 мкл метанола, ктивность АО рассчитывали как разницу в скорости поглощения кислорода в шсутствии метанола и без субстрата и выражали в нагом02/мин на 1 единицу 1тичсской плотности при 600 нм.

Электрофорез проводили в 10% ПААГ в присутствии ДС-Li в буферной стеме Лэммли [Laemmly U.K., 1970] на вертикальных пластинах 18 х 13 х 0,04 [. После электрофореза гелевую пластину разрезали на две части. Одну ловину окрашивали с Coomassie R-250, а содерж!Мое другой полусухим оттингом переносили на нитроцеллюлозный фильтр [Kyhse-Andersen J., 1984]. юле обработки фильтра антителами против АО положение полосы субединиц ) ■ определяли после реакции с вторичными антикроличьими антителами, нъюгированиыми с пероксидазой.

Белок определяли по методу Брэдфорд [Bradford М.М., 1976].

Плотность сахарозы измеряли рефрактометрически.

Для выделения алкогольоксидазы клетки дрожжей P. methanolica дикого та выращивали 44 ч в жидкой среде с 1% метанолом. Клетки (7,5 г сырого :а) собирали центрифугированием, промывали дистилированной водой и эсосаждали. Затем суспендировали в 31,5 мл КФ-буфера (0,05 М [2P04/NaOH, рН =7,5) и разрушали ультразвуком 9 мин при 0°С.

Неразрушенные клетки и клеточные стенки осаждали центрифугированием п{ 4°С (4 ООО об/мин, 15 мин). К полученному бесклеточному экстракту (30 мл) nj перемешивании добавляли 21 мл насыщенного раствора (NH4)2S04 и 2 мл 0,05 КФ-буфера, рН доводили до 7,5. Перемешивали 2 ч при 4°С. Появивший осадок отделяли центрифугированием (55 ООО об/мин, 30 мин). Полученш супернатант наносили на колонку (объемом 40 мл) с октил-сефарозс уравновешенной 40% (NH4)2S04. Промывали трехкратным объемом 40 (NH4)2S04. Белок смывали (40%-0%) градиентом (NH4)2S04 (V=160 мл) скоростью 60 мл/ч. Собирали фракции по б мл. В каждой фракции измеряли С при 280 нм и определяли активность АО. Фракции с пиком активности АО (7 108 мл) объединяли. Полученный раствор белка (36 мл) разбавляли до 360 мл мМ КФ-буфером и наносили на ионообменную колонку (объемом 60 мл) DEAE-Toyopearl 650М. Белок агаоировали (0-0,5М) градиентом КС1 скоростью 20 мл/ч. Собирали фракции по 7 мл. Каждую фракцию тестировали наличие флавина (ОП при 445 нм) и активности АО. Фракции с пик активности и ОП (77-91 мл градиента) объединяли, добавляли 40 мл КФ-буфе] Полученный раствор белка концентрировали на колонке с DEAE-Toyopearl 65С (объемом 5 мл), уравновешенной 50 мМ КФ-буфером. Смывали 5 мл 0,4 М К со скоростью 0,5мл/мкн. Выход белка контролировали по характерной жёл оранжевой окраске раствора. Полученный концентрированный раствор АО мл) хранили в замороженном виде.

Антитела против алкогольоксидазы получали периодичен иммунизацией кроликов по схеме [Егоров А.М. и др., 1991]: первая инъекция мг антигена (АО) вводиться кролику внутривенно. Вторая инъекция (чере: недели) и третья инъекция (через 2 недели после второй) - 1 мг антигена в cmi с полным адъювантом Фрейнда в шесть точек на спине животного. Кр< отбирали из вены уха кролика в период между 2-й и 4-й неделями, считая последней инъекции в объеме 40 мл. Кровь оставляли на ночь при 4°С.

Зразовавшнйся сгусток фибрина удаляли центрифугированием при 1000-2000 i/мин в течение 15 мин. Полученную сыворотку хранили при -20°С, «дварительно разлив во флаконы по 1 мл.

И м м у но х и м нч с с к о е мечение ультратонких срезов клеток антителами отив алкогольоксидазы и конъюгированным с золотом белком А проводили по андартной методике [Slot J.W., Geuze H.J., 1984].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика пероксисом дрожжей P. methanolica. У ожжей дикого типа (WT) в зависимости от источника углерода может разовываться только один тип пероксисом (ПС). В норме этанол является прессором экспрессии ферментов метаболизма метанола, и при выращивании смеси метанола и этанола будут образовываться пероксисомы, которые эактерны для метаболизма этанола (т. е. они будут иметь в своем составе щитратлиазу, малатсинтазу и не иметь АО и диоксиацетонсинтазу). При ecrl тации снимается репрессия этанолом синтеза ферментов метаболизма ганола. В этом случае должны синтезироваться как ферменты метаболизма ганола, так и этанола при выращивании на смеси этих спиртов. Для »актеристики образующихся при этом пероксисом (с точки зрения ■пределен^ в них маркерных ферментов) и сопоставления их характеристик с дикого типа, клетки дрожжей P. methanolica WT, выращенные на 1% -аноле, и клетки ecrl мутанта, выращенные на смеси спиртов, разрушали тразвуком. Дифференциальным центрифугированием гомогенатов от 4 000 g 20 000 g получали осадок (Р20), содержащий грубую фракцию пероксисом, в ором после изопикничсского центрифугирования в градиентах сахарозы >еделяли плавучую плотность пероксисом по активности АО - основного 1мента пероксисом.

02468 10 1214 № фр акции

2-!

О 2 4 6 8 10 12 14 № ф р а к ц и и

[Белок], г/смЗ

Результаты, представленные на рисунк 1, показали гетерогенное распределени как ПС дрожжей \УТ, так и ПС мутантг В составе пероксисом клеток (рис 1а) и мутантных клеток (рис. 16 обнаруживается два пика А( активности. Основная масса активност АО (до 70% от наносимой на градиент обнаруживается в тяжелой зон

градиента (фракции 2-6), чт соответствует плавучей плотности 1,2^ 1,27 г/см3. Часть активности А< наблюдается в легкой зоне градиент (фракции 12-15) при плавучей плотност 1,165-1,175 г/см3. При этом удельш активность АО тяжелой зоны оказалас в 7-15 раз выше по сравнению с легко] Для других метилотрофных дрожже известно, что алкогольоксида: локализована именно в ПС. Не являют! исключением и исследуемые на?^ дрожжи Р. т&ИапоНса (рис. 3). Таким

Рис. 1. Активность АО (а, б), белок (в, 1 и 2) и плотность сахарозы (е, 3) в осадках Р20, выделенных из Р. те\капоЧса \УТ, выращенных на метаноле (а, г, 1) и мутанта есг!, выращенного на смеси этанола и метанола (б, в, 2). Содержание белка и активность АО выражена в % от общего количества, наносимого на градиент.

'бразом, нет сомнения в том что, как и у других видов метилотрофных дрожжей, iO дрожжей P. methanolica является меркерным ферментом перокнсом.

Очевидно, изопикническое центрифугирование позволяет очистить ероксисомы дрожжей P. methanolica, и их плавучая плотность соответствует еличипе р=1,25+0,02 г/см3. Определенная величина соответствует значениям, звестным для других метилотрофов, таких как Candida boidimi, Hansemda olymorpha (p=l,25 г/см3), Yarrowia lipolytica (p=l,25 г/см3), а также и для рожжей Saccharomyces cerevisiae (p=1.22 г/см3).

Пероксисомальная локализация алкогольоксндазы у мутанта ecrl. 1утация ecrl дрожжей P. methanolica, в отличие от штамма WT, приводит к нятию репрессии биосинтеза АО и образованию пероксисом на смеси спиртов метанола и этанола). Результаты предыдущей главы показывают, что физико-имические свойства AO-содержащих ПС у мутанта ecrl не меняются от свойств [С в диком типе дрожжей P. methanolica. ПС имеют сходную плавучую

В

О

АО

67kDa

67kDa

2;.

1С. 2. Анализ АО дрожжей Р. теЛапоНса АУТ (В2) и мутанта есг! (А1, А2; В1). Клетки лрашивали с 1% метанолом (А2), 1% этанолом (В1 и В2) или со смесью 0,5% этанола и 5% метанола (А1). На трек наносили по 5 мкг (А) или 10 мкг (В) белка. Слева -«П'ноблоты с антителами против АО, справа- ДС-Ы электрофорез.

плотность при изопикническом центрифугировании. Похожее распределен! активности АО во фракциях ПС дикого типа клеток и мутанта предпологает, чг АО может синтезироваться, транспортироваться в ПС и собираться в активны комплекс в клетках мутанта есг1, при выращивании на средах с этанолом. Д; подтверждения этих выводов были проведены иммунохимический цитоиммунохимический анализы распределения АО в клетках мутанта есг 'Иммунохимический анализ выявил присутствие субъединиц АО в клетке мутанта, выращенных на этаноле, метаноле и смеси спиртов (рис. 2А,В), и нет в клетках дикого типа, выращенных на этаноле (рис. 2В) и смеси. Дд определения локализации АО в клетках дрожжей был проведен

"гг

-• '«у/»?'. V

е"1'I г -

- - . ' <'

ь

! /

\

-•г I'

*ч *,

V

; 4 * V'-

Рис. 3. Цитоиммуно химическая демонст рация АО в клетка: дрожжей Р. теЛапоИсI дикого типа (а, Ь) ] мутанта есг1 (с, с1, е) пр] выращивании н

метаноле (а, с), на смеа этанола и метанола (Ь, <1) на этаноле (е) (Р пероксисома, М митохондрион).

а

ггоиммунохимический аналго с использованием антител к АО, меченных шюидным золотом. Как и можно было ожидать, АО-специфический сигнал шаруживался не только в ПС дикого типа и мутанта, выращенных на метаноле ис. За,с), но и в ПС мутантов, выращенных на смеси этанола и метанола (рис. i), а также и в ПС клеток мутанта, выращенных только на этаноле (рис. Зе), что :азалось весьма неожиданным. Контрольная процедура на специфичность ;чения АО показала отсутствие метки в клетках дрожжей WT, выращенных на lecu метанола и этанола (рис. ЗЬ). Необходимо отметить, что объем ПС и число ;ток в клетке заметно уменьшается в ряду: дикий тип на метаноле (рис. За), /тант на смеси (рис. 3d), мутант на этаноле (рис. Зе). Возможной причиной (лученных результатов может быть деградация ПС и пероксисомальных :рментов в клетках мутанта в присутствии этанола в следствие наличия таболитной инактивации в мутанте ecrl.

Итак, полученные результаты позволяют внести некоторую коррекцию глядов на регулятор пые механизмы биосинтеза АО у метилотрофных ожжей. По-видимому, присутствие метанола не является решающим фактором я развития ПС, синтеза АО и для транслокацни АО в ПС, так как фермент пешно синтезируется и транспортируется в пероксисомы мутанта ecrl, гтущего на средах со смесью метанола и этанола или только на этаноле. Эти воды находятся в соответствии с данными, полученными при исследовании танта по глюкозной репрессии gîr2-l H. polymorphe [Parpinello G., et al., 1998], горый имел как пероксисомы, так и ферменты метаболизма метанола при гте на 2%-ой глюкозе. При этом репрессивный характер действия этанола у танта glr2-l сохранялся, что еще раз подтверждает представления о различии гей, реализующих репрессию этанолом и глюкозой.

Восстановление активности АО ft-меркаптоэтанодом у мутанта mthl эжжей P. methanolica. Мутант mthl был получен по позитивной селекции ira ■ойчивость к аллиловому спирту [Мотрук О.М. и др., 1989]. Этот мутант не

имел заметной активности АО и, поэтому, не был способен к росту на метанол« В предварительных экспериментах было установлено, что выращиван клеток У/Т на средах с низким содержанием глюкозы (0,25%) не приводит репрессии АО. Это выражалось в возобновлении биосинтеза полипепти; выявляемого по наличию на электрофореграмме белковой полос положительно реагирующей на антитела к АО и имеющей подвижное характерную для субъединиц АО (рис. 4, трек 2), а также в появлен биологической активности фермента (таблица).

Проверка фенотипа муш

АО

1

1

67kDa

В

Рис. 4. Анализ АО дрожжей Р. теОтпоИса (/, 2) и мутанта пик! (3). Клетки выращивали с 1% метанолом (/) и с 0,25% глюкозой (2, 3). На трек наносили по 5 мкг белка. А -иммуноблоты с антиАО, В - ДС-Ы электрофорез,

mihi показала, что он дейевительно способен к росту на метаноле и им< редуцированную активность АО г росте в среде с низким со держали глюкозы. При этом, как и у WT, электрофореграмме клеточн

экстрактов этого мутанта выявляе-белковая полоса АО (рис. 4, трек рис. 6, трек 3). электрофореграммах присутствует j полипептидов меньшего разме также положительно реагирующих антитела к АО. Вероятно, что э меньшего молекулярного в полипептиды, которые не обнаруживаю в клетках WT, выращенных на мета»

(рис. 4, трек 1) и на 0,25% глюкозе (рис трек 2), могут быть продуктами деградации субъединиц АО в клетках мута гШк!.

[блица. Влияние ß-меркаптоэтанола на дыхание и активность АО в клетках ожжей Р. methanolica дикого типа (WT) и мутанта mihi.

Цтамм Концентрация Меркалто-этанола в среде роста, мМ Поглощение 02 в Присутствии метанола, натом/мин , при росте на Активность Алкогольоксидазы, натом/мин, при росте на

0.25% глюкоза 1% метанол 0,25% глюкоза 1% метанол

WT 0 41,2 (9,8)** 56.2 (22.6) 31,4 33,7

0 33,15 (23,9) н.о. 9,25 н.о.

mthl 1 72,30 (36,15) 160 (78) 36,15 82

2 58,65 (37) 99 (72) 21,65 27

5 и.о. 64,8 (54) н.о. 10.8

- Значения приведены на количество дрожжей, имеющих поглощение ОП (600) = 1.

- эндогенное дыхание клеток не определяли.

ОП, % 400

Рис. 5. Влияние (3-меркагттоэтанола на рост клеток Р. теЛапоИса \¥Т (1, 2, 3) и мутанта тЛ1 (4, 5). Клетки выращивали в присутствии р-меркаптоэтанола в течение 44 ч с 1% метанолом (/, .5), и в течение 24 ч с 1% глюкозой (4) и с 0,25% глюкозой (2, 3). За 100%

принимали

оптическую

плотность (ОП) биомассы в отсутствие р-меркаптоэтанола.

0 2 4 6 8 10 меркаптоэтанол.мМ

Установлено, что (3-меркаптоэтанол подавляет рост клеток дрожжей диког типа на разных источниках углерода (рис. 5). С увеличением концентраци меркаптоэтанола до 5 мМ наблюдается усиление его ингибирующего эффекта !-клетки (рис. 5, кривые 3-5). В отличие от штамма присутствг:

меркаптоэтанола в среде роста приводит к стимуляции роста клеток мутантног штамма т!И1(рис. 5, кривые 1, 2). При этом позитивный эффект меркаптоэтано; на клетки мутанта проявляется не только при росте на 0,25% глюкозе (кривая 2 но и на среде с метанолом (кривая I). Этот факт оказался особеш неожиданным, так как метанол не утилизируется клетками мутанта тМ отсутствие меркаптоэтанола.

Результаты иммунохимического анализа показали, что мутант тг/?/, 1 имеющий активности АО и не способный расти на метаноле, в услови; дерепрессии (росте на 0,25% глюкозе) обнаруживает белковую полосу подвижностью субъединицы АО и с положительной реакцией на антитела к А (рис. 6). Количество этого белка возрастает при добавлении в среду рос глутатиона (рис. 6, трек 2) и ещё более - меркаптоэтанола (рис. 6, трек 1).

ри этом, увеличение числа субъедишщ АО в дрожжах сопровождалось )явлением активности АО (таблица). Установлено, что появление максимума лтдаюсти АО наблюдается при концентрации в среде роста меркаптоэтанола 1 VI. Эта концентрация оказывала максимальный стимулирующий эффект на >ст клеток мутанта как на метаноле, так и на 0,25% глюкозе (рис. 5). При более iIcoichx ■ концентрациях наблюдалось подавление активности АО (таблица) и нпбирование роста клеток. Таким образом, представленные здесь результаты называют, что наличие в среде ß-меркаптоэтанола каким-то образом частотно 1мпенсирует мутантный фенотип штамма Р6 {mihi). Напомним, что имулирующим действием на биосинтез и активность АО обладал не только ¡ркаптоэтанол (рис. б, трек 1), но так же и глутагион (рис. 6, трек 2), т.е. можно »едположить, что присутствие SH-соединений в среде является необходимым ловием восстановления активности АО в клетках, в которых на обычных едах наблюдается лишь редуцированный биосинтез полипептида АО.

3 1

Рис. 6. Анализ АО мутанта mihi дрожжей Р. mcthanolica. Клетки

выращивали с 0,25% глюкозой в присутствии 1 мМ меркаптоэтанола (/), 0.5 мМ глутатиона (2) или без SH-соединений (5). На грек наносили по 10 ми-белка. А - иммуноблот с антиАО, В - ДС-Li электрофорез.

АО

f 67kDa

.'Л

3

Данный феномен описан впервые и может представлять интерес с то зрения выяснения механизмов сборки октамерного белка АО. Известно, чт дрожжей P. methanolica имеется два независимых и близких по структуре п кодирующих АО. Делеция одного из этих генов практически не влияет способность культуры к росту на метаноле, при делеции другого скорость рс заметно снижается; полный блок роста на метаноле (и, естественно, отсутст биосинтеза полипептидов АО) наблюдается у мутанта с делениями об' структурных генов АО [Raymond С.К., et al., ]. По данным электрофореза (рис 6), биосинтез полипептида АО не нарушен, исходя из чего представляе маловероятным, что ген МТН1 является одним из двух структурных генов АО каким-либо позитивным регулятором экспрессии этих генов. Неда установлено, что на среде с метанолом экспрессируются оба структурных гена [Nakagawa Т., et al., 1999]. При этом сборка активного фермента, состоящего i субъедннин, происходит путем случайного объединения двух полипептидо образованием 9 изоформ АО (2 из которых представляют собой гомооктамеры, - гетерооктамеры с различным содержанием каждого из двух полипептщ [Грузман М.Б. и др., 1996; Nakagawa Т., et al., 1999]. Появление активности А присутствии SH-соединений можно объяснить предположив, что продукт г МТН1 каким-то образом вовлечен в процесс сборки активного фермента . Другим возможным объяснением может быть участие его в защите полипепти АО или уже собранного фермента от деградации. В любом случае представляс вполне обоснованным предположение, что основным прямым дефектом в клет мутанта mthl являются нарушения обмена глутатиона, который как-то вовлечь сборку АО. Если это действительно так, то основной механизм стимулируюи действия меркаптоэтанола (и глутатиона) на клетки мутанта mthl на срел метанолом может заключаться в восстановлении тиолового статуса клеток и, следствие, в обеспечении нормальной сборки и функционирования октамера А( Ранее, методом тетрадного анализа и случайной выборки спор [Мотрук О.

др., 1989] было установлено, что фенотип Mth" определяется рецессивной тацией mthl одного ядерного гена. По-видимому, эта мутация mthlи привела к рушению в обмене глутатиона и связанному с ним дефекту в активности АО. вестно, что агрегатное состояние и активность АО зависят от соединений, пшодействующих с SH-реагентами, таких, как динитрофенол и м-эркарбонилцианидфенилгидразон. Образование октамера в их присутствии не 5людается как in vivo, так и in vitro, и может быть обращено дитиотрейтолом и татионом [Bellion Е., Goodman J.M., 1987]. Эффект не был связан с юбщаюшим действием динитрофенола и хлоркарбонилцианидфенилгидразона, возможно, связан с необходимостью в сульфгидрилышх группах для )ышения стабильности октамерной структуры АО.

Токсичность меркаптоэтанола. Эксперименты по выращиванию дрожжей л P. methanolica на средах с 1%, 0,25% глюкозой, 1% метанолом и с 0,5% 1жжевым экстрактом показали, что p-меркаптоэтанол подавляет рост клеток окжей (рис. 7). Видно, что характер зависимости роста мало зависит от очника углерода и 50%-ное подавление роста наблюдается при концентрации

меркаптоэтанола 2-3 мМ.

ОП, %

Иная картина наблюдается при усвоении тех же источников углерода у мутанта по катаболитной репрессии этанолом ферментов метаболизма метанола есг1 (рис. 8).

100

80

60

40-

20J

-Я Рис. 7. Влияние меркаптоэтанола на рост дрожжей Р. теОтпоИса \УТ при ^ выращивании на средах с 1% метанолом (/), 1% глюкозой (2) и с 0,5 % дрожжевым 20 экстрактом (3).

О

,----------т-------

0 5 10 15 20 меркаптоэтанол,мМ

Рис. 8. Влияние меркаптоэтанола I рост мутанта есг1 дрожжей теЛапоИса при выращивании на 1 метаноле (1), 1 % глюкозе (2), 0,5 дрожжевом экстракте (3).

В этом случае 50%-ное подавлен! роста наблюдается щ концентрации меркаптоэтанола О мМ в случае усвоения метанола, мМ - глюкозы, и 25 мМ - углеро, 0,5%-ного дрожжевого экстраю Возможной причине

определяющей столь различи) реакцию этой линии Р. теИмтоИса от дрожжей \УТ по отношению меркаптоэтанолу, может быть потеря чувствительности регуляторного белка и. продукта гена ЕСЯ1 к окислительно-восстановительному потенциалу среды следствии мутации есг1. Альтернативным объяснением, может быть изменен окислительно-восстановительного баланса клетки, спровоцированно появлением другого набора ферментов.

Ранее мы рассмотрели мутантный штамм пиН1 дрожжей Р. теМапоШ который обнаруживал зависимость роста на метаноле и 0,25 % глюкозе от меркаптоэтанола (см. результаты предыдущей главы). Анализ токсичное меркаптоэтанола для т(к1 показывал смену вектора зависимости роста клет при низких концентрациях реагента (рис. 5). Если рост дрожжей \УТ и мутаг есг! на глюкозе подавляется меркаптоэтанолом в концентрации 1-2 мМ (рис. 8), то рост мутанта стимулируется этими концентрациями меркаптоэтано. Дальнейшее повышение содержания меркаптоэтанола в среде приводит постепенному подавлению ростовых процессов. Таким образом, рост клеток

ОП, %

меркаптоэтанол, мМ

ожет подавляться, быть устойчивым или стимулироваться меркаптоэтанолом, го, на наш взгляд, является следствием разного внутриклеточного тиолового гатуса в рассмотренных штаммах дрожжей. Ранее установлено, что мутация т/?/, вероятно, связана с нарушениями в обмене глутатиона. По-видимому, еркаптоэтанол восстанавливает нарушенный тполовый статус мутантных четок, что и обеспечивает их нормальный рост на метаноле в присутствии еркаптоэтанола. Итак, изменение меркаптоэтанолом клеточного тиолового гатуса может либо приближать его значение к оптимальному (и в этом случае гимулировать ростовые процессы), либо превышать оптимальный уровень, эдавляя при этом рост клеток.

ВЫВОДЫ

Пероксисомы клеток метилотрофных дрожжей Р. methanolica дикого типа и клеток мутанта ecrl показали сходную плавучую плотность (1,24-1,27 г/см") в градиентах плотности сахарозы; как и в других видах метилотрофных дрожжей, алкогольоксидаза является маркерным ферментом перокисом. У мутанта дрожжей Р. methanolica с нарушенной катаболитной репрессией, ecrl, сохраняется способность к синтезу алкогольоксидазы и сборка пероксисом в присутствии этанола.

Присутствие метанола не является решающим фактором для развития пероксисом, биосинтеза алкогольоксидазы и транслокации алкогольоксидазы в пероксисомы у мутанта ecrl дрожжей Р. methanolica. Среди мутантов дрожжей Р. methanolica, неспособных расти на метаноле выявлен мутант mihi, способность к росту на метаноле которого зависит от сульфгидрильных соединений.

ß-Меркаптоэтанол восстанавает способность клеток mthl мутанта расти на метаноле и стимулирует их рост в условиях дерепрессии.

20 ---------6. Ростовой эффект ß-меркаптоэтанола при дерепрессии сопровождает увеличением количества белка алкогольоксидазы, выявляемо специфическими антителами и частичным восстановлением активное алкогольоксидазы.

7. ß-Меркаптоэтанол имеет широкий спектр воздействия на рост разш штаммов дрожжей P. methanolica: от стимуляции роста у мутанта mil относительной устойчивости у ecrl, до подавления ростовых процессов дикого типа.

8. Предполагается, что чувствительность к меркаптоэтанолу зависит тиолового статуса дрожжевой клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Леонович O.A., Серкова H.H., Рабинович Я.М. Биосинтез пероксисомальная локализация алкогольоксидазы в мутантах дрожжей methanolica с нарушенной катаболитной репрессией и неспособных к рос на метаноле. Материалы школы-конференции "Горизонты физш химической биологии". Пущино. 2000.

2. Leonovitch O.A., Tolstorukov I.I., Serkova N.N., Rabinovich Y.M. Biosynthe of alcohol oxidase in different mutants of Pichia methanolica yeast in ethan containing media. The 10th International Symposium on Yeasts. The Netherlan 2000 (in press).

3. Луста K.A., Леонович O.A., Толсторуков И.И., Рабинович Я. Конститутивный биосинтез и ^ пероксисомальная локшиши алкогольоксидазы в мутанте ест J дрожжей Pichia methanolica катаболитной репрессии, вызываемой этанолом. Биохимия. 2000. Т. 65. №

4. Леонович O.A., Погуце О.М., Серкова H.H., Дутова Т.А., Толсторукоп И.И., Рабинович Я.М. ß-Меркаптоэтанол восстанавливает активность алкотольоксидазы и стимулирует рост на метаноле мутанта дрожжей Pichia methanolica МН4 с дефектной алкогольоксидазой. Биотехнология. 2000. №3.

5. Леонович O.A., Серкова H.H., Рабинович Я.М. Токсичность меркаптоэтанола для различных линий дрожжей Pichia methanolica растущих на различных источниках углерода.Прикл. биохимия и микробиология (принято в печать).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Леонович, Оксана Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. РОЛЬ ПЕРОКСИСОМ В МЕТАБОЛИЗМЕ МЕТАНОЛА

1.1. Диссимиляция метанола

1.2. Ассимиляция метанола

2. МЕТАБОЛИЗМ ЭТАНОЛА В ДРОЖЖАХ 14 2.1. Другие варианты функций пероксисом

3. СТРУКТУРА И БИОГЕНЕЗ ПЕРОКСИСОМ

3.1. Регуляция синтеза пероксисомальных ферментов

3.2. Развитие пероксисом в процессе вегетативного роста

3.3. Деградация пероксисом

4. ТРАНСЛОКАЦИЯ И СБОРКА БЕЖОВ В ПЕРОКСИСОМАХ

4.1. Сигнальные последовательности белков

4.2. Рецепторы РТБ

4.3. Импорт олигомерных белков

4.4. Транслокация мембранных белков пероксисом

5. МЕТАБОЛИЗМ И ФУНКЦИЯ ГЛУТАТИОНА В МИКРООРГАНИЗМАХ 39 5.1. Роль глутатиона в поддержании тиолового статуса клетки

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика пероксисом дрожжей Р. те^апоИса

2. Пероксисомальная локализация алкогольоксидазы у мутанта есг

3. Восстановление активности алкогольоксидазы |3-меркаптоэтанолом у мутанта т(Ь1 дрожжей Р. те1капоИса

4. Токсичность Р-меркаптоэтанола

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез и локализация алкогольоксидазы у метилотрофных дрожжей Pichia methanolica"

Изучение механизмов биогенеза и регуляции белкового состава пероксисом эукариотических клеток является одним из развивающихся аспектов биологии клетки. Дополнительный стимул к разработке данного направления в последние годы связан с обнаружением наследственных заболеваний человека, связанных с дисфункцией пероксисом. Удобной моделью для исследования этих органелл являются дрожжи, среди которых особое место принадлежит группе метилотрофных дрожжей, у которых метаболизм различных углеродных субстратов связан с регуляцией белкового состава пероксисом.

За последние годы был получен ряд регуляторных и метаболических мутантов с измененным спектром утилизируемых источников углерода [Сибирный А.А. и др., 1986а; 19866; ЗШггпу А.А., е! а1., 1987], что позволило исследовать различные метаболистические процессы в клетке. Так, изучение генетических линий дрожжей Р. те(капоИса, дефектных в негативной субстратной регуляции алкогольоксидазы (АО), выявили не менее четырех регуляторных механизмов, индуцируемых глюкозой или этанолом, которые реализуются четырьмя независимыми путями передачи сигнала. Особое значение в последнее время получили исследования, направленные на расшифровку механизмов транслокации и сборки белков в пероксисомах. Получен ряд мутантов по сборке и биогенезу пероксисом, что позволило идентифицировать группу белков, участвующих в этом процессе.

Пути превращения метанола, этанола, глюкозы и их регуляция довольно сходны у всех видов метилотрофных дрожжей [Sahm Н., 1977; Veenhuis J.P., et al., 1983; Tolstorukov I.I., et al., 1989]. При этом утилизация метанола и этанола сопровождается существенным изменением белкового матрикса пероксисом. Регуляция ростовыми субстратами белкового состава матрикса пероксисом необычна для других органелл. Известно, что транскрипция структурных генов, кодирующих алкогольоксидазу (ЕС 1.1.3.13) наиболее выражена в присутствии метанола [Eggeling L., et al., 1980], в то время как многоуглеродные субстраты роста (этанол, глюкоза) репрессируют ее синтез [Eggeling L., et al., 1980; Сибирный А.А. и др., 1986а]. Помимо катаболитной репрессии, ферменты пероксисом, в том числе и алкогольоксидаза, подвержены катаболитной инактивации, которая наблюдается при переносе дрожжевых клеток, выросших на метаноле, в среду с глюкозой или этанолом [Сибирный А.А. и др., 19866; Hill D.J., et al., 1985; Tutlle D.L., et al., 1995]. По исчерпание репрессора (в условиях дерепрессии или индукции метанолом) вновь синтезируемые предшественники АО транслоцируются только в находящуюся на стадии роста ПС и не обнаруживаются в ПС, возникших при росте на этаноле. Однако, все имеющееся данные о регуляции биосинтеза АО не дают однозначного ответа на вопрос, является ли присутствие метанола решающим фактором для развития пероксисом, транскрипции генов АО и транслокации АО в пероксисомы. Возможно, исследование регуляторного мутанта с нарушенной катаболитной репрессией позволит нам прояснить механизмы регуляции биосинтеза АО в дрожжах.

Известно, что агрегатное состояние АО, а также активность фермента, зависят от соединений, которые взаимодействуют с SH-реагентами [Bellion Е., Goodman J.M., 1987]. Определение первичной структуры АО дрожжей Р. methanolica показало, что АО относится к цистеин-богатым белкам [Raymond

C.К., et al., 1998]. Несет ли это какую-нибудь функциональную нагрузку -неизвестно, но можно предположить, что некоторые из цистеиновых остатков существенны в восстановленном состоянии для правильной сборки активного фермента, а поддержание восстановительных условий в матриксе пероксисом -важная функция глутатиона и глутатионредуктазы при росте клеток на метаноле.

Известно, что для большей части белков, локализованных в цитоплазме, отсутствуют условия для образования дисульфидных связей вследствие восстановленности среды [Freedman R.B., 1989]. Необходимое для стабильности S-S связей соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона обнаружено экспериментально лишь в эндоплазматическом ретикулюме у эукариотических клеток и в периплазме бактерий и дрожжей [Raina S., Missiakas

D., 1997]. К настоящему времени нет надежной информации ни о степени восстановленности матрикса пероксисом, ни о необходимости глутатиона для поддержания структуры ферментов матрикса. Поэтому нам кажется важным исследование мутантов с нарушением первичного окисление метанола (лишенных активности АО) при росте на различных углеродных субстратах, которое, возможно, позволит изучить роль сульфгидрильных соединений в окислительном метаболизме клетки. 7

Для идентификации регуляторных механизмов биосинтеза, сборки и транслокации алкогольоксидазы в пероксисомы и исследования роли сульфгидрильных соединений в поддержание активной октамерной структуры фермента в качестве объекта исследований нами были выбраны метилотрофные дрожжи РгсЫа те1капоИса. Целью настоящей работы стало:

- исследование мутанта с нарушенной этанольной репрессии есг! и определение в нем локализации алкогольоксидазы методом иммуноспецифической электронной микроскопии,

- характеристика пероксисом дрожжей дикого типа и мутанта есг! с точки зрения распределения в них ключевых ферментов метаболизма метанола и этанола,

- исследование влияния (3-меркаптоэтанола на рост и активность АО клеток дрожжей дикого типа и клеток мутанта по АО.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

К настоящему времени имеются сведения о нескольких видах дрожжей и грибов, способных использовать метанол в качестве источника углерода и энергии для роста [Ogata К., et al., 1969; Lusta А.К., et al., 1991]. Использование ряда источников углерода и азота у дрожжей связано с развитием специальных внутриклеточных структур в клетке. Эти структуры окружены единственной мембраной и, в общем, названы микротельцами [Veenhuis М., et. al., 1979а]. Работы де Дюве и его коллег [De Duve С., 1969] дали первое описание функций и свойств микротелец. Установлено, что в этих органеллах каталаза разлагает вредный пероксид водорода, выделяющийся в предшествующих реакциях, и, поэтому для обозначения этих органелл был предложен термин «пероксисомы».

При изучении метаболизма одноуглеродных соединений в дрожжах исследователи столкнулись с удивительными примерами адаптации функций пероксисом к составу среды роста дрожжей [Veenhuis М., Harder W., 1987]. Так, при росте метилотрофных дрожжей на глюкозе, пероксисомы очень трудно обнаружить и, их физиологическая функция не определена [Veenhuis М., et al., 1979а; Avers C.J., 1971; van Dijken J.P., et al., 1975; Sahm H., 1977]. Однако, когда эти дрожжи растут в среде, содержащей метанол в качестве источника углерода, можно наблюдать ряд огромных пероксисом в клетках. Эти органеллы содержат в большом количестве каталазу и алкогольоксидазу, которые вовлечены в первоначальное окисление метанола [Sahm Н., 1977; Veenhuis М., et al., 1979b; Harder W., Veenhuis M., 1989]. Процесс роста и развития пероксисом легко 9 обратим при переносе клеток, выросших на метаноле, в среду, содержащую глюкозу или другие многоуглеродные соединения, включая этанол. При этом пероксисомы, присутствующие в клетке, быстро исчезают в результате активной деградации [Вогтапп С., БаЬт Н. 1978; УеепЬшв М., е1 а1., 1978]. Такая быстрая изменчивость числа и функций пероксисом в зависимости от условий роста привела к тому, что дрожжи стали предпочтительной моделью для изучения физиологических функций и биогенеза этих органелл.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Леонович, Оксана Александровна

ВЫВОДЫ

1. Пероксисомы клеток метилотрофных дрожжей Р. methanolica дикого типа и клеток мутанта ecrl показали сходную плавучую плотность (1,24-1,27 г/см3) в градиентах плотности сахарозы; как и в других видах метилотрофных дрожжей, алкогольоксидаза является маркерным ферментом перокисом.

2. У мутанта дрожжей Р. methanolica с нарушенной катаболитной репрессией, ecrl, сохраняется способность к синтезу алкогольоксидазы и сборка пероксисом в присутствии этанола.

3. Присутствие метанола не является решающим фактором для развития пероксисом, биосинтеза алкогольоксидазы и транслокации алкогольоксидазы в пероксисомы у мутанта ecrl дрожжей Р. methanolica.

4. Среди мутантов дрожжей Р. methanolica, неспособных расти на метаноле выявлен мутант mthl, у которого способность к росту на метаноле зависит от сульфгидрильных соединений.

5. ß-Меркаптоэтанол восстанавает способность клеток мутанта mthl расти на метаноле и стимулирует их рост в условиях дерепрессии.

6. Ростовой эффект ß-меркаптоэтанола при дерепрессии сопровождается увеличением количества белка алкогольоксидазы, выявляемого специфическими антителами и частичным восстановлением активности алкогольоксидазы.

77

7. Р-Меркаптоэтано л имеет широкий спектр воздействия на рост клеток разных штаммов дрожжей Р. те1капоИса: от стимуляции роста у мутанта тИп1, относительной устойчивости у ест7 при утилизации углерода дрожжевого экстракта, до подавления ростовых процессов у дикого типа.

8. Предполагается, что чувствительность к Р-меркаптоэтано лу зависит от тиолового статуса дрожжевой клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леонович, Оксана Александровна, Москва

1. Грузман М.Б., Титоренко В.И., Луста К.А., Троценко ЮА. (1996) Множественные молекулярные формы алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. Биохимия 61, 2131-2139

2. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа М.: Высш. шк, 1991. - 288с.

3. Мотрук О.М., Толсторуков И.И., Сибирный А.А. (1989) Селективное получение мутантов по алкогольоксидазе у метилотрофных дрожжей Pichia pinus. Биотехнология 56, 692-698

4. Сибирный А.А., Титоренко В.И., Беневоленский С.В., Толсторуков И.И. (1986а) О регуляции метаболизма метанола у мутанта дрожжей Pichia pinus с дефектной изоцитратлиазой. Биохимия, 51, с. 16

5. Сибирный А.А., Титоренко В.И., Беневоленский С.В., Толсторуков И.И. (19866) О различиях в механизмах этанольной и глюкозной катаболитной репрессии ферментов метаболизма метанола у дрожжей Pichia pinus. Генетика, 12, 584-592

6. Сибирный А.А., Титоренко В.И. (1988) Подавление метанолом индукции изоцитратлиазы и малатсинтазы у дрожжей Pichia pinus. Биотехнология, 4, 194-196

7. Толсторуков И.И., Дутова Т.А., Беневоленский С.В., Соом Я.О. (1977) Гибридизация и генетический анализ метанолокисляющих дрожжей Pichiapinus. Генетика 13, 322-326

8. Шольц К.Ф., Островский Д.Н. (1975) Методы современной биохимии. М.: Наука. 52-58

9. Avers, C.J. (1971) Peroxisomes of yeast and other fungi. Sub-Cell. Biochem. 1, 25-37

10. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., and Y. Ohsumi (1994) Ultrastructural analisis of the autophage process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. J. Cell. Biol. 124, 903-913

11. Bellion E., and J.M. Goodman (1987) Proton jonophores prevent assembly of peroxisomal protein. Cell 48, 165-173

12. Bezborodova, O.A., Rabinovich, Ya.M., and R.A. Zvjagilskaya (1992) A new procedure for preparetion of mitochondria from the yeast Endomyces magnusii complement at all translation stages. J. Microbiol. Meth. 16, 289-295

13. Bormann, C., and Sahm, H. (1978) Degradation of microbodies in relation to activities of alcohol oxidase and catalase in Candida boidinii. ArchMicrobiol. 117, p.67

14. Borst, P. (1986) How proteins get into microbodies (peroxisomes, glyoxysomes, glycosomes). Biochim. Biophys. Acta 866, 179-203

15. Borst, P. (1989) Peroxisome biogenesis revisited. Biochem. Biophys. Acta 110, 113

16. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

17. Breindenbach, B.W., and H. Beevers (1976) Association of the glyoxylate cycle enzymes in a novel subcellular particle from castor bean endosperm. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 462-469

18. Bjomstedt, M., Xue, J., Huang, W., Akesson, B., and A. Holmgren (1994) The thioredoxin and glutaredoxin systems are efficient electron donors to human plasma glutathione peroxidase. J. Biol. Chem. 269, 29382-29384

19. Carlberg, I., and B. Mannervik (1975) Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver. J. Biol. Chem. 250, 5475-5480

20. Chiang, H.L., Schekmen, R., and S. Hamamoto (1996) Selective uptafe of cytosolic, peroxisomal, and plasma membrane proteins into the yeast lysosome for degradation. J. Biol. Chem. 271, 9934-9941

21. Cimini, A. M., Singh, I., Farioli-Vecchioli, S., Cristiano, L., and M.P. Cera (1998) Presence of heterogeneous peroxisomal population in the rat nervous tissue. Bioch. Bioph. Acta 180, 13-26

22. De Duve,C. (1969) The peroxisome: anew cytoplasmic organelle. Proceedings of the Royal Society, London, Series B 173, 71

23. De Koning, W„ Gleeson, M.A.G., Harder, W., and C. Dijkhuiren (1987) Regulation of methanol methabolism in the yeast Hansenula polimorpha. Arch. Microbiol. 147, 375-382

24. Demple, B., and C.F. Amabile-Cuervas (1991) Redox redux: The control of oxidative stress responses. Cell 67, 837-839

25. Distel, B., S. J. Gould, T. Voorn-Brouwer, M. Van der Berg, H. F. Tabak, and S. Subramani (1992) The carboxyl tripeptide serine-lysine-leucine of firefly luciferase is necessary but not sufficient for peroxisomal import in yeast. New Biol. 4, 157-165

26. Dunn, W.A., Jr. (1994) Autophagy and related mechanisms of lysosome-mediated protein degradation. Trends Cell Biol. 4, 936-943

27. Eggeling, L., and H. Sahm (1980) Regulation of alcohol oxidase synthesis in Hansenula polymorpha: oversynthesis during growth on mixed substrates and induction by methanol. Arch. Microbiol. 127, 119-124

28. Egli, T., van Dijken, J.P., Veenhuis, M., Harder, W., and A. Fietcher (1980) Methanol metabolism in yeasts: regulation of the synthesis of catabolic enzymes. Arch. Microbiol. 124, 115-121

29. Egli, T., Lindley, N.D., and J.R. Quayle (1983) Regulation of enzyme synthesis and variation of residual methanol concentration during carbon-limited growth of Klorckera sp. 2201 on mixtures of methanol and glucose. J. Gen. Micribiol. 129, p. 1269

30. Eitzen, G.A., Szilard, R.K., and R.A. Rachubincki (1997) Enlarged peroxisomes are present in oleic acid-grown Yarrowia lipolytica overxpressing the REX 16 gene encoding an intraperoxisomal peripheral membrane peroxin. J. Cell Biol. 6, 12651278.

31. Fukui, S., Tanaka, A., Kawamoto, S., Yasuhara, S., Teranishi, Y., and M. Osumi (1975) Ultrastracture of methanol-utilizing yeast cells: appearance of microbodies in relation to high catalase activity. J. Bact. 123, 317-328

32. Girzalsky, W., Rehling, P., Stein, K., Kipper, Blank, L., Kunau, W.-H., and R. Edmann (1999) Involvement of Rex 13p in Pexl4p localization and peroxisomaltargeting signal 2 dependent protein import into peroxisome. J. Cell Biol. 6, 1151-1162

33. Glover, J., Andrews, D. and R. Rachubinski (1994) Saccharomyces cerevisiae peroxisomal thiolase is imported as a dimer. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 1054110545

34. Goodman, J.M., Scott, C.W., Donahue, P.H. and J.P. Atherton (1984) Alcohol oxidase assembles post-translationally into peroxisome of Candida boidinii. J. Biol. Chem. 159, 8485-8493

35. Gould, S.J., G.-A. Keller, N. Hosken, J. Wilkinson, and S. Subramani (1989) A conserved sorts proteins to peroxisomes. J. Cell Biol. 108, 1657-1664

36. Gould, S.J., D. McCollum, A.P. Spong, J.A. Heyman, and S. Subramani (1992) Development of the yeast Pichia pastoris as a model organism for genetic and molecular analisis of peroxisome assembly. Yeast 8, 613-628

37. Grant, C.M., Collinson, L.P., Roe, J.H., and I.W. Dawes (1996) Yeast glutathione reductase is required for protection against oxidative stress and is a target for yAP-1 transcriptional regulation. Mol. Microbiol. 21, 171-179

38. Harder, W., and M. Veenhuis (1989) Metabolism of one-carbon compounds, p. 289-316. In A.H. Rose and J.S. Harrison (eds), The Yeasts, volume 3 (2nd edition). Academic Press, London

39. Hill D.J., Hann, A.C., and D.D. Lloid (1985) Degradative inactivation of peroxisomal enzyme, alcohol oxidase, during adaptation of methanol grown Candida boidinii to ethanol. Biochem. J. 232, 743-750

40. Holmgren, A. (1985) Thioredoxin. Arum. Rev. Biochem. 54, 237-271

41. Holmgren, A. (1989) Thioredoxin and glutaredoxin systems. J. Biol. Chem. 264, 13963-13966

42. Huhse, B., Rehling, P., Albertini, M., Blank, L., Mellerand, K., and W.-H. Kunau. (1998) Pexl7p of Saccharomyces cerevisiae is novel peroxin and component of peroxisomal protein translocation machinary. J. Cell Biol. 140, 49-60

43. Hwang, C., Sinskey, A.J., and H.F. Lodish (1992) Oxidized Redox State of glutathione in the endoplasmic reticulum. Science 257, 1496-1502

44. Jaspers, C., and M.J. Penninckx (1985) Molecular and kinetic propeties of purified y-glutamyltranspeptidase from yeast Saccharomyces cerevisiae. Phytochemistry 24, 1913-1918

45. Kato, N., Sakawa, C., Nishizawa, T, Tani, Y., and H. Yamada (1980) Purification and characterization of S-formylglutatione hydrolase from a methanol-utilizing yeast, Kloeckera sp. 2201. BBA 611, 323-332

46. Kosower, N.S., and E.M. Kosower (1978) The glutathione status of cells. Int. Rev. Cytol. 54, 109-160

47. Kragler, F., A. Langeder, J. Raupachova, M. Binder, and A. Hartig (1993) Two independent peroxisomal targeting signals in catalase A of Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 120, 665-673

48. Kulachkovsky, A.R., Moroz, O.M., and A.A. Sibirny (1997) Impairment of peroxisomes degradation in Pichia methanolica mutants defective in acety-CoA synthetase or isocitrate lyase. Yeast, 13, 1043-1052

49. Kyhse-Andersen, J. (1984) Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffertank for transfer of proteins from polyacrylamide to notrocellulose. J. Biochem. Biophys. Meth. 10, 203-209

50. Laemmly, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature 227, 680-685

51. Large, P.J. (1981) In Proceeding of third simposium on microbial growth on Cr compounds (H. Dalton, ed.), p.55. Meyden and Son Ltd. London

52. Lazarow, P.B. and C. de Duve (1973) The synthesis and turnover of rat liver peroxisomes. J. Cell Biol. 59, 507-524

53. Lazarow, P., and C. de Duve (1976) A fatty acyl-CoA oxidizing system in rat liver peroxisomes; enhancement by clofibrate, a hypolipidemic drug. Proc. Natl. Acad. Set USA 73, 2043-2046

54. Lazarow, P.B., and Y. Fujiki (1985) Biogenesis of peroxisomes. Annu. Rev. Cell Biol. 1, 489-530

55. Lee, J., Dawes, I.W., and J.-H. Roe (1997) Isolation, expression, and regulation of the pgrl+ gene encoding glutatione reductase absolutly required for the grown of Schizosaccharomycespombe. J. Biol. Chem. 272, 23042-23049

56. Liu, H., Tan, X., Russell, K.A., Veenhuis, M., and J.M. Cregg (1995) PER3, a gene required for peroxisome biogenesis in Pichia pastoris, encodes a peroxisomal membrane protein involved in protein import. J. Cell Biol. 270, 10940-10951

57. Lusta, A.K., Oleg, V.S., and A.A Sharyshev (1991) Cytobiochemical characterization of Aspergellus terreus 17p utilizing various carbon substrates. J. Basic Microbiol. 4, 265-277

58. Marzioch, M., Erdmann, R., Veenhuis, M., and W-H. Kunau (1994) PAS7 encoded a novel yeast memner of the WD-40 protein family essential for import of 3-oxoacyl-CoA thiolase, a PTS2-containing protein, into peroxosomes. EMBO J. 13, 4908-4918

59. McNew, J. A., and J. M. Goodman (1994) An oligometric protein is imported into peroxisomes in vivo. J. Cell Biol. 127, 1245-1257;

60. McCammon, M.T., McNew, J.I., Willy, P.J., and J.M. Goodman (1994) An internal region of the peroxisomal membrane protein PMP47 is essential for sorting to peroxisomes. J. Cell Biol. 124, 915-925

61. Meister, A., and M.Z. Anderson (1983) Glutathione. In Ann. Rev. Biochem. 52, 711-760

62. Middelkoop, E., Wiemer, E.A., Schoenmaker, D.E., Strijland A, and J.M. Tager (1993) Topology of catalase assembly in human skin fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1220(1), 15-20.

63. Nakagawa, T., Mukaiyama, H., Yurimoto, H., Sakai, Y., and N. Kato (1999) Alcohol oxidase hybrid oligomers formed in vivo and in vitro. Yeast 15(12), 12231230

64. Neben, I., Sahm, H., and M.R. Kula (1980) Studies on an enzyme, S-formilglutatione hydrolase, of the dissimilatory pathway of methanol in Candida boidinii. BBA 614, 81-91

65. Ogata, K., Nishikawa, H., and M. Ohsuji (1969) A yeast capable of utilizing methanol. Agricul And Biol. Chem. 33, 1519

66. Parpinello, G., Berardi, E., and Strabbioli, R. (1998) A regulatory mutant of Hansenula polimorpha exhibiting methanol utilization metabolism and peroxisome proliferation in glucose. J. Bacteriol. 180, 2958-2967.

67. Penninckx, M. J., Jaspers, C., and J.M. Wiame (1980) Glutathione metabolism in relation to amino-acid permeation systems in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 104, 119-123

68. Rachubinski, R.A., and S. Subramani (1995) How proteins penetrate peroxisomes. Cell 83, 525-528,

69. Raymond C., Bukowski, T., Holderman, S.D., Ching, A.F.T., Nanaja, E., and Stamm M.R. (1998) Development of methilotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65 kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase. Yeast 14, 11-23

70. Roggenkamp, R., Janowicz, Z., Stanikowski, B., and Hollenberg, C.P. (1984) Biosinthesis and regulation of the peroxisomal methanol oxidase from the methylotrophic yeast Hansenula polimorpha. Mol. Gen. Genet. 194, p. 489

71. Sacksteder, K.A., Jonesa, J.M., South S.T., Li, X., Liu, Y., and S.J. Gould (2000) PEX19 binds multiple peroxisomal membrane proteins, is predominantly cytoplasmic, and is required for peroxisome membrane synthesis. J. Cell Biol. 148, 931-944.

72. Sahm, H., and F. Warner (1973) Microbial assimilation of methanol. The ethanol and methanol enzymes of yeast Candida boidinii. Eur. J. Biochem. 36, 250-256

73. Sahm, H., Roggenkamp, R., Wragner, F., and W. Hinkelmann (1975) Microbodies in methanol-grown Candida boidinii. J. Gen. Microbiol. 88, 218-222

74. Sahm, H. (1977) Metabolism of methanol by yeast. Adv. Biochem. Eng., 6, p. 77

75. Sibirny, A.A., Titorenko, V.I., Efremov, B.D., and I.I. Tolstorukov (1987) Multiplicity of mechanisms of carbon catabolite repression. Yeast 3, 233-241.

76. Slot, J.W., and H.J.Geuze (1984) Immunolabelling for Electron Microscopy (Polak, J.M., and Varndell, J.M., ed.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 129-149.

77. Spong, A.P., and S. Subramani (1993) Cloning and characterization of PASS: a gene required for peroxisome biogenesis in the methilotrophic yeast Pichia pastoris.J. Cell Biol. 123,535-548

78. Subramani, S. (1993) Protein import into peroxisomes and biogenesis of the organelle. Annu. REV. Cell Biol. 9, 445-478

79. Subramani, S. (1998) Components involved in peroxisome import, biogenesis, proliferation, turnover, and movement. Physiol. Rev. 78, 1-18

80. Suiter, G.J., Looyenga, L., Veenhuis, M., and W. Harder (1990b) Occurrence of peroxisomal membrane proteins in methilotrophic yeast grown under different conditions. Yeast 6, 35-43

81. Suiter G.J., van der Klei I.J., Schanstra J.P., Harder W., and M. Veenhuis (1991) Ethanol methabolism in peroxisomes-deficient mutant of Hansenula polymorpha. FEMSMicrobiol. Lett. 82, 297-302

82. Suiter, G., W. Harder, and M. Veenhuis (1993) Structural and functional aspects of peroxisomal membranes in yeast. FSMSMicrobiol. Rev. 11, 285-296

83. Swinkels, B.W., S.J. Gould, A.G. Bodnar, RA.Rachubinski, and S. Subramani. (1991) A novel, cleavable peroxisomal targeting signal at the amino-terminus of the rat 3-ketoacyl-CoA thiolase. EMBO J. 10, 3255-3262

84. Swinkels, B. W., Gould, S. J. and S. Subramani (1992) Targeting efficiencies of various permutations of the consensus C-terminal tripeptide peroxisomal targeting signal. FEBSLett. 305, 133-136

85. Terlecky, S.R., Nuttley, W.M., McCollum, D„ Sock, E., and S. Subramani (1995) The Pichia pastoris peroxisomal protein PAS8p is the receptor for the C-terminal tripeptide peroxisomal targeting signal. EMBO J. 14, 3627-3634

86. Titorenko, V.I., Snith, J.J., Szilard, R.K., and R.A. Rachubincki (1998) Pex20p of yeast Yarrowia lipolytica is required for the oligimerisation of thiolase in the cytosol and its targeting to the peroxisome. J. Cell Biol. 142, 403-420

87. Titorenco, V.I., Chatia, H., and R.A. Rachubinski (2000) Fusion of small peroxisomal vesicles in vitro reconstrucrs an early step in the in vitro multistep peroxisome assembly pathway of Yarrowia lipolytica. J. Cell Biol. 148, 29-44

88. Todd, M.M., and E.L.Vigil (1972) Cytochemical localization of peroxidase activity in Saccharomyces cerevisiae. J. Histochem. Cytochem. 20, 344-349

89. Tolbert, N.E. (1981) Methabolic pathways in peroxisomes and glyoxysomes. Annu. Rev. Biochem. 50, 133-157

90. Tolstorukov, I.I., Efremov, B.D., Benevolensky, S.V., Titorenko, V.I., and A.A. Sibirny (1989) Mitants of the methilotrophic yeast Pichia pinus defective in C2 methabolism. Yeast 5, 179-186.

91. Tompson, S.L., Burrows, R., Laub, R.J., and S.K. Krisans (1987) Cholesterol synthesis in rat liver peroxisomes. J. Biol. Chem. 262, 17420-17425

92. Tuttle, D.L., Lewin., A.S., and W.A. Dunn, Jr. (1993) Selective autography of peroxisomes in methilotrophic yeasts. Eur. J. Cell Biol. 60, 283-290;

93. Tuttle, D.L., and W.A. Dunn, Jr. (1995) Divergent models of autophagy in the methilotrophic yeast Pichiapastoris. J. Cell Sci. 108, 25-35

94. Veenhuis, M., van Dijken, J.P., Pilon, S.A.F., and W. Harder (1978) Development of crystalline peroxisomes in methanol-grown cells of yeast Hansenula polimorpha and its relation to enviromental conditions. Arch. Microbiol. 117, 153-163

95. Veenhms, M., Keizer, I., and W. Harder (1979a) Characterization of peroxisomes in glucose-grown Hansenula polimorpha and their development after the transfer of cells into methanol-containing media. Arch. Microbiol. 120, 167175.

96. Veenhuis, M., Kierer, J., Harder, W., and van Dijken, J.P. (1979b) Characterization of peroxisomes in glucose-grown Hansenula polimorpha and their development after transfer into methanol containing media. Arch. Micribiol. 120, 167-175

97. Veenhuis, M., Harder, W., van Dijken, J.P., and F. Mayer (1981) Substructure of crystalline peroxisomes in methanol-grown Hansenula polimorpha: evidence for an in vivo crystal of alcohol oxidase. Mol. Cell Biol. 1, 193-203

98. Veenhuis, M., van Dijken, J.P., and W. Harder (1983) The significance of peroxisomes in the methabolism of one carbon compounds in yeast. Adv. Microbiol. Physiol. 24, 1-82.

99. Veenhuis, M., and W. Harder (1987) Metabolic significance and biogenesis of microbodies in yeast, p. 436-458. In H.D. Famini and H.Sies (eds.), Peroxisomes in Biology and Medicine. Springer Verlag Berlin-Heidelberg.

100. Veenhuis, M., M. Mateblowski, W.H. Kunau, and W. Harder (1987) Proliferation of microbodies in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 3, 77-84

101. Veenhuis, M., and W. Harder (1991) Microbodies, p.601-653. In A.H.Rose and J.S.Harrison(ed.), The Yeasts, 2nd ed., vol. 4. Acedemic Press, London, Englend

102. Walton, P.A., Hill, P.E. and S. Subramani (1995) Import of stable folded proteins into peroxisomes. Mol. Biol. Cell 120, 675-683

103. Wanders, R.J.A., Heymans, H.S.A., Schutgens, R.B.H., Barth, P., van den Bosch, H., and J.M. Targer (1988) Peroxisomal disorders in neurology. J. Neuirol. Sci. 88, 1-39

104. Waterham, H.R., Russel, K.A., de Vries, Y., and J.M. Cregg (1997) Peroxisomal targeting, import, and assembly of alcohol oxidase in Pichia pastoris. J. Cell Biol. 139, 1419-1431.

105. Wu., A.-L., and W.S. Moye-Rowly (1994) GSH1, which encodes gamma-glutamylcysteine syntetase, is a target gene for yAP-1 trancriptional regulation. Mol. Cell. Biol. 14, 5832-5839

106. Yasuyoshi, S., Koller, A., Rangell, L.K., Keller, G.A., and S. Subramani (1998) Peroxisome degradation by microautography in Pichia pastoris: identification of specific steps and morphological intermediates. J. Cell Biol. 141, 625-636

107. Yawetz A. and Agosin M. (1981) Purification of glutathione S-transferase of Trypanosoma cruzi. Comp. Biochem. Physiol. 68/2B:273-243

108. Yuan, W., Tuttle, D.L., Shi, Y.J., Ralph, G.S., and W.A. Dunn, Jr.(1997) Glucose-induced microautophagy in Pichia pastoris requires the alpha-subunit of phosphofructokinase. J. Cell Sci. 110, 1935-1945

109. Yurimoto, S.Y., Matsuo, H., and N. Kato (1998) Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methilotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast 14(13), 1175-1187

110. Zhang, J.W. and Lasarow, P.B. (1995) PEB1(PAS7) in Saccharomyces cerevisiae encoded a hydrophilic, intra-peroxisomal protein that is a member of the WD repeat family and essential for the import of thiolase into peroxisomes. J. Cell Biol. 129, 65-80