Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональное состояние дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс при экспериментальном токсическом гепатите

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Функциональное состояние дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс при экспериментальном токсическом гепатите"

На правах рукописи

ШИРЯЕВА Анна Петровна

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ

специальность 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

003164195

Работа выполнена в Лаборатории клеточной патологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

кандидат биологических наук Сакута Галина Анатольевна доктор биологических наук Морозов Владимир Игоревич

доктор биологических наук Гамалей Ирина Акивовна доктор биологических наук, профессор Савина Маргарита Васильевна

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится 22 февраля 2008 года в 13 00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр , 4 E-mail cellpath@mail cytspb rssi ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН (194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр , 4) Автореферат разослан 22 января 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук /Г&рал*^ ^ В Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Заболевания печени занимают одно из ведущих мест по летальности среди населения (Рябинин, 2002) К наиболее тяже тым из них относятся гепатиты различной этиологии и алкогольное поражение печени, вследствие которых зачастую развивается цирроз Развитие токсического гепатита сопровождается активацией как дегенерации, так и регенерации печени и соотношение этих процессов оказывает решающее влияние на исход заболевания Успех регенерации зависит от того, насколько эффективен энергетический метаболизм гепатоцитов, который целиком определяется состоянием дыхательной цепи митохондрий

Дыхательная цепь представляет собой сложную мультикомпонентную структуру, состоящую из пяти комплексов, локализованных во внутренней мембране митохондрий НАДН-СоР-оксидорсдуктаза (комплекс I), сукцинат-CoQ-оксидоредуктаза (комплекс II), CoQ-цитохромС-оксидоредуктаза (комплекс III), цитохром с оксидаза (комплекс IV) и АТФ-синтаза Непосредственный синтез АТФ осуществляет АТФ-синтаза, локализованная во внутренней мембране митохондрий в непосредственной близости к электрон-транспортной цепи (Nicholls, Ferguson, 2002, Rubinstein et al, 2003)

Сведения о состоянии дыхательной цепи при токсическом гепатите весьма противоречивы и недостаточны Так, некоторые авторы утверждают, что компоненты дыхательной цепи при патологии печени серьезно повреждаются, следствием чего является снижение синтеза АТФ (Krahenbuhl et al, 1989, Nozu et al, 1992, Hwang, Ismail-Beigi, 2003) Однако детальные исследования механизмов этих нарушений не проведены Другие авторы считают, что компоненты дыхательной цепи не повреждаются, но могут изменять свою функциональную активность (Cederbaum et al, 1974, Bottenus et al, 1982, Yang et al, 2004) Важно подчеркнуть также, что обычно состояние дыхательной цепи митохондрий изучают в рамках уже сложившейся патологии печени, используя модели, предполагающие применение длительных сроков (боле е двух месяцев) отравления животных, когда компенсаторные механизмы

3

в клетке практически истощены и преобладают процессы деградации Вместе с тем важно изучить состояние дыхательной цепи митохондрий в ранний период развития патологии, когда компенсаторные механизмы клетки активированы в ответ на повреждающее воздействие токсических веществ Такие данные могут помочь в разработке адекватной тактики лечения токсического гепатита

Патологические процессы, развивающиеся в печени при токсическом гепатите, как вследствие непосредственного воздействия токсинов, так и в результате нарушения механизма их детоксикации, приводят к окислительному стрессу (Noyan et al, 2006, Esrefoglu et al, 2007, Raja et al, 2007) Окислительный стресс вызывает повышение внутриклеточной генерации активных форм кислорода (АФК) и окислительное повреждение молекулярных структур клетки (Андреев и др , 2005, Avasarala et al, 2006, Wang, Cederbaum, 2006)

Митохондрии концентрируют в себе большую часть окислительных метаболических путей и содержат многочисленные редокс-переносчики и сайты, потенциально способные к одноэлектронному восстановлению кислорода до супероксидного аниона (02' ) - предшественника других АФК (Андреев и др, 2005, Cadenas et al, 1977, Lenaz, 2001) В дыхательной цепи митохондрий в норме роль основных генераторов 02 отводят комплексам I (Cadenas et al, 1977, Lenaz, 2001) и III (Bovens, Chance, 1973, Turrens, Bovens, 1980) В гепатоцитах нормальной печени интенсивность продукции СЬ° очень мала Так, митохондрии в состоянии 4 (V4) по Чансу продуцируют 0 6-1 нмоль Нг02 за 1 мин на 1 мг белка, что составляет примерно 2 % от всего потребляемого ими кислорода (Liu, 1997) Вырабатываемый при этом 02* может быть вовлечен в регуляцию клеточного метаболизма или элиминирован митохондриальной супероксиддисмутазой (Mn-СОД) (Liu, 1997, Turrens, 1997) При патологиях печени уровень продукции АФК в митохондриях гепатоцитов значительно возрастает (Андреев и др, 2005, Yang et al, 2004), однако механизм усиления продукции Ог" в дыхательной цепи митохондрий практически не изучен

Исходя из вышесказанного, цель настоящей работы состояла в исследовании состояния дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс с экспериментальным токсическим гепатитом, вызванным комбинированным воздействием этанола и ССЦ В рамках цели исследования были сформулированы следующие задачи:

1) получить гистологическую и биохимическую характеристики печени крыс, подвгргавшихся комбинированному воздействию этанола и ССЦ в течение 1 мес,

2) провести ингибиторный анализ скорости дыхания изолированных гспа! оцитов и митохондрий крыс с токсическим гепатитом,

3) исследовать продукцию (V различными комплексами дыхательной цепи митохондрий крыс с токсическим гепатитом,

4) изучить состояние антиоксидантной системы митохондрий гепатоцитов крыс с токсическим гепатитом,

5) исследовать эиергообразующую функцию печени крыс с токсическим гепат итом

Научная новизна Ряд результатов, полученных нами при исследовании состояния дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс при патологии печени, носит приоритетный характер В частности, впервые в рамках одной экспериментальной модели проведены исследования состояния дыхательной цепи митохондрий на изолированных гепатоцитах, митохондриях и субмитохондриальных частицах При этом параметры, характеризующие функциональное состояние дыхательной цепи митохондрий, были измерены у каждого животного индивидуально Впервые установлено, что при токсическом гепатите повышенное потребление кислорода митохондриями и гепатоцитами связано с продукцией 02' дыхательной цепью митохондрий Основной вклад в продукцию 02* вносит комплекс I Кроме того, впервые проведено детальное исследование мест продукции 02' в дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс с токсическим гепатитом Полученные в работе данные позволяют рассматривать усиление продукции 02" не только в качестве

5

основной составляющей патологического процесса, но также как компенсаторный механизм, позволяющий поддерживать электрон-транспортную функцию дыхательной цепи митохондрий в условиях ее частичной блокады в комплексе I

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Скорости потребления кислорода как изолированными гепатоцитами, так и изолированными митохондриями повышены при токсическом гепатите

2 Повышенное потребление кислорода изолированными гепатоцитами и митохондриями крыс с токсическим гепатитом связано с усилением продукции 02' дыхательной цепью митохондрий

3 Усиление продукции 02"~ при токсическом гепатите определяется, главным образом, частичной блокадой переноса электронов в комплексе I дыхательной цепи митохондрий, хотя степень сопряжения окисления и фосфорилирования дыхательной цепи остается высокой

4 Повышенную продукцию 02* при токсическом гепатите можно рассматривать не только в качестве составляющей патологического процесса, но также как компенсаторный механизм, позволяющий поддерживать электрон-транспортную функцию дыхательной цепи митохондрий в условиях ее частичной блокады

5 Увеличение активности цитохром с оксидазы (комплекс IV) при токсическом гепатите также можно рассматривать как один из компонентов компенсаторного механизма, направленного на нейтрализацию повышенного количества 02"

6 Активности основных ферментов антиоксидантной защиты митохондрий Мп-СОД и глутатионпероксидазы при токсическом гепатите снижены, что способствует развитию окислительного стресса в гепатоцитах

7 Несмотря на то, что степень сопряжения окисления и фосфорилирования, а также скорость потребления кислорода высокие, содержание АТФ в печени падает

Теоретическая и практическая значимость. Работа имеет фундаментальную направленность, однако изучение функционирования дыхательной цепи митохондрий при токсическом гепатите на ранних стадиях развития патологии, когда в клетке активированы компенсаторные процессы в ответ на повреждение, поможет в разработке оптимальной тактики профилактики и лечения данной патологии

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 8-м Международном конгрессе по клеточной биологии (Ницца, Франция, 2004), Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), Международном симпозиуме «Биоэлектрохимия 2007» (Тулуза, Франция, 2007)

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Санкт-Петербурга в рамках персональных грантов (стипендий) 2006 года для студентов и аспирантов из вузов и академических институтов Санкт-Петербурга

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих глав Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список цитируемой литературы, включающий 197 источников Работа изложена па 112 страницах и содержит 32 рисунка и 5 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Исследования проведены на 50 крысах-самцах Вист ар, вес которых в начале опыта составил 180-200 г Животных содержали в стандартных условиях светового режима и на стандартном рационе Все животные были разделены на 2 группы 1-я группа служила контролем (интактные крысы), а у крыс 2-й группы вызывали экспериментальный токсический гепатит (БйнЬек е1 а1, 1978, Венгеровский и др , 2000), для чего

7

животным в течение месяца два раза в неделю интрагастрально вводили 50 %-ный раствор СС14 в вазелиновом масле в дозе 0 2 мл/кг При этом в качестве питья животные получали 5 %-ный этанол Через 1 нед после последнего введения ССЦ крыс умерщвляли, используя тиопенталовый наркоз

Приготовление препаратов. Гистологические срезы готовили по стандартной методике (Роскин, 1957) Срезы окрашивали гематоксилином-эозином или пикрофуксином по Ван Гизону (Пирс, 1962)

Получение изолированных гепатоцитов, изолированных митохондрий и субмитохондриальных частиц. Изолированные гепатоциты крыс получали по модифицированному методу Сеглена с использованием коллагеназы IV (Seglen, 1976) Жизнеспособность гепатоцитов оценивали по окраске трипановым синим, акридиновым оранжевым и бромистым этидием, а также с помощью МТТ-теста (Mossman, 1983) Количество изолированных гепатоцитов в суспензии определяли, подсчитывая клетки в камере Горяева Клетки культивировали в С02-инкубаторе при 37 °С Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования по методу Джонсона и Лэрди (Jonson, Lardy, 1969) Субмитохондриальные частицы получали из изолированных митохондрий печени крыс с помощью дифференциального центрифугирования (Herrero, Barja, 2000) Количество белка определяли по Бредфорд (Bradford, 1976)

Цитохимические методы. Для анализа морфологического состояния митохондрий гепатоциты окрашивали флуоресцентным красителем родамином 123 по методу Джонсона с соавторами (Johnson et al, 1980) Для сохранения жизнеспособности гепатоцитов во время микроскопирования покровные стекла с монослоем клеток помещали на предметное стекло с предварительно подготовленной герметичной камерой, заполненной подогретой культуральной средой Флуоресценцию окрашенных гепатоцитов возбуждали светом 480 нм и наблюдали с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа Leica (Германия)

Параметры оценки функционального состояния дыхательной цепи митохондрий. Измерение скорости потребления кислорода изолированными гепагоцитами и митохондриями проводили с помощью полярографического метода с использованием платинового электрода типа Кларка (Chance, Williams, 1956, Estabrook, 1967) Функциональное состояние НАДН-CoQ-оксидоредуктазы (комплекс I), сукцинат-СоО-оксидоредуктазы (комплекс II), CoQ-цитохром с-оксидоредуктазы (комплекс III) оценивали с помощью специфических субстратов и ингибиторов данных комплексов, используя при работе на изолированных митохондриях следующие параметры

■ V4 - скорость дыхания в состоянии 4 по Чансу (при высоком содержании в среде инкубации субстратов - 5 мМ глутамата и 5 мМ малата (субстраты комплекса I), либо 5 мМ сукцината (субстрат комплекса И) при отсутствии

АДФ),

■ V3 - скорость дыхания в состоянии 3 по Чансу (условия те же, что и при определении V4, но в присутствии 200 мкМ АДФ, при этом фактором, лимитирующим скорость реакции, является сама дыхательная цепь),

" VUIK — скорость разобщенного дыхания (условия те же, что и при определении Уд, но в присутствии 30 мкМ 2,4-динитрофенола - разобщителя окисления и фосфорилирования),

■ дыхательный контроль - отношение V4 к V3

При исследовании функционального состояния комплексов дыхательной цепи митохондрий на изолированных гепатоцитах использовали иные параметры

■ Vo — эндогенное дыхание (скорость потребления кислорода клетками на эндогенных субстратах),

■ дыхание на экзогенных субстратах (5 мМ глутамата и 5 мМ малата либо 5мМ сукцината),

■ дыхание при воздействии на клетки 1мкМ ротенона (ингибитора комплекса I) и ?0 мкМ 2,4-динитрофенола (разобщитель окисления и фосфорилирования)

Биохимические методы. Активность цитохром с оксидазы определяли полярографическим методом (Estabrook, 1967) с использованием аскорбиновой кислоты (донор электронов), дигитонина (перфоратор мембраны), цитохрома с для устранения ограничения скорости реакции, связанной с его недостатком, и тетраметилпарафенилендиамина (переносчик электронов с аскорбиновой кислоты на систему цитохромов)

Адениловые нуклеотиды в образцах измеряли методом ионообменной хроматографии с применением хроматографа марки Knauer (Германия) и колонок, заполненных сорбентом Separon SGX NH2 (150 ><33 Мм, 5 мкм) и Diasorb amine (120 х 1 мм, 5 мкм) при длине волны 260 нм В качестве элюента использовали 0 35 М KH2P04-Na2HP04 буфер, pH 6 8 Для разделения АТФ, АДФ и АМФ применяли линейную градиентную элюцию фосфатным буфером (0 - 0 35 М)

Скорость образования 02' субмитохондриальными частицами определяли по методу, основанному на окислении адреналина 02" (Misra, Fndovich, 1972) При расчете скорости продукции 02'~ для каждой пробы из скорости реакции без СОД вычитали скорость реакции с СОД, принимая во внимание то, что коэффициент молярной экстинции образующегося адренохрома составляет 4 0 103 (моль/л) см (Тагреу, 2001) Для локализации мест продукции 02'~ в дыхательной цепи митохондрий использовали субстраты и специфические ингибиторы цепи переноса электронов НАДН - 10 мМ, сукцинат - 5 мМ, ротенон - 5 мкМ, антимицин А - 10 мкМ, миксотиазол -10 мкМ

Интенсивность перекисного окисления липидов исследовали, измеряя в гомогенате печени концентрацию диеновых конъюгатов (Гаврилов, Мишкорудная, 1983) и Шиффовых оснований (Таранова, Нилова, 1986) Уровень триглицеридов в печени крыс измеряли с помощью колориметрического метода (Прохорова, 1992) Активность митохондриалыюй Мп-СОД определяли методом Флоха и Оттинга (Flohe, Otting, 1984) Активность митохондриальной глутатионпероксидазы определяли методом Флоха и Гунцлера (Flohe, Gunzler, 1984) Глутатион определяли по скорости

10

восстановления 5,5'-дитиобис-(2-бензойной кислоты), которая пропорциональна количеству присутствующего в пробе GSH или GSSG (Tietze, 1969, Hazelton, Lang, 1980)

Статистическая обработка полученных данных. Статистическую обработку данных проводили с помощью /-критерия Стьюдента, используя стандартные пакеты программ для персонального компьютера OnginPro 8 0 и SigmaPlot Различия считали достоверными при доверительной вероятности 0 95

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Гепатиты токсической природы получают все большее распространение в мире, что определяет большой интерес исследователей к данной проблеме (Рябинин, 2002) По общему мнению исследователей ключевым звеном патологического процесса является нарушение работы дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов, в основе которого лежит усиление продукции АФК - окислительный стресс (Avasarala et al, 2006, Wang, Cederbaum, 2006) Вместе с тем литературные данные, посвященные исследованию состояния дыхательной цепи митохондрий при токсическом гепатите, не полны и весьма противоречивы (Monmoto et al, 1988, Krahenbuhl et al, 1989, Harvey et al, 2000, Yang et al, 2004) Мы полагаем, что противоречивость данных может быть связана с использованием моделей, предполагающих применение различных сроков отравления такими токсическими агентами, как тиоацетамид, алкоголь и ССЦ Подавляющее большинство авторов используют длительное (более 2 мес) отравление животных (Jikko et al, 1984, Monmoto et al, 1988, Krahenbuhl et al, 1989, Harvey et al, 2000, Yang et al, 2004, Son et al, 2007) Вместе с тем важно подчеркнуть, что развитие хронического токсического гепатита представляет MHOiостадийный процесс На первой стадии происходит активация компенсаторных механизмов клетки в ответ на повреждающее воздействие токсических веществ В течение следующей стадии клетка активно сопротивляется воздействию, используя все свои компенсаторные механизмы, а

11

по их исчерпании наступает конечная стадия развития патологии, которая приводит к необратимым структурным и функциональным нарушениям клеточных компонентов Стадийный характер, по-видимому, носит и развитие нарушений в функционировании дыхательной цепи При этом и интенсивность электронного транспорта, и активность комплексов дыхательной цепи в отдельности, и синтез АТФ могут определяться стадией развития токсического гепатита Основываясь на данных разных авторов мы выявили зависимость функционального состояния дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов от продолжительности воздействия токсическими агентами (рис 1) На рисунке видно, что на длительных сроках отравления токсическими агентами интенсивность работы дыхательной цепи митохондрий значительно снижена Снижение интенсивности дыхания гепатоцитов указывает на уже сложившуюся патологию печени, когда компенсаторные механизмы в клетке практически истощены и преобладают процессы деградации гепатоцитов Вместе с тем для понимания сущности патологического механизма важно изучить состояние дыхательной цепи митохондрий на других этапах развития патологии, когда компенсаторные механизмы клетки активированы в ответ на повреждающее воздействие токсических веществ В соответствие с этим в нашей работе была использована модель индукции токсического гепатита, основанная на введении токсических веществ в течение 1 мес

Наряду с активно развивающимися патологическими процессами в печени при токсическом гепатите протекают регенераторные процессы От полноты и скорости регенерации зависит восстановление и поддержание функций пораженной печени Полноценность регенераторных процессов при токсическом гепатите в значительной мере определяется адекватностью энергетического метаболизма в печени, а именно состоянием дыхательной цепи митохондрий

0.5 1 2 4 6

Время, мес

Рис. 1 Зависимость скорости потребления кислорода митохондриями от продолжительности воздействия токсическими агентами. Кривая построена на основе данных литературы: Ширяева и др., 2007; Jikko el al., 1984; Morimoto et ai. 1988; Krahenbiihl et al., 1989; Harvey et al, 2000; Yang et al, 2004; Son et al, 2007.

Таблица 1

Скорость потребления кислорода гепатоцнтами при добавлении Manama и пирувата. __ротенона и 2,4-динитрофенола__

Скорость потребления кислорода, нмольОгмин '■ |(/'кл 1 Контроль Гепатит

Эндогенное дыхание Vo 14.0 ± 0.8 18.8± 1.7 *

Малат (1 мМ) + пируват (5мМ) 19.4 ±0.9 18.7± 1.5

2,4-Динитрофенол (5мкМ) 18.5 ±0.7 25.2 ±5.1

Т"отенон (5мкМ) 8.0 ±0.5 13.7± 1.1

Цианид 1.4 ±0.9 6.0 ± 1.0 *

Примечание: X±S.E., N- 1 5. * Р < 0.05 при сравнении с контролем.

Проведенное исследование показало, что скорости дыхания как изолированных гепатоцитов, так и изолированных митохондрий крыс с токсическим гепатитом достоверно выше, чем в контроле. Так, эндогенное дыхание гепатоцитов крыс с токсическим гепатитом было повышено на 34 % (табл. 1), а скорости дыхания митохондрий в состояниях 3 (У3) и 4 (У4) на субстратах комплекса I дыхательной цепи превышали контрольные значения па 77 и 56 % соответственно (рис. 2, 3). Скорость дыхания У3 митохондрий опытной группы на субстрате комплекса II была также выше по сравнению с контролем (рис. 4), однако скорость дыхания У4 не отличалась от контроля (рис. 5).

В экспериментах, проведенных на изолированных гепатоцитах, было показано, что степень ингибирования скорости дыхания ротеноном (ингибитор

13

комплекса I) в опытной группе существенно меньше (-27 %), чем в контроле (59 %) (табл. !). Отличия скоростей дыхания Уз и изолированных митохондрий опытпой группы от контроля на субстратах комплекса I были выше, чем на субстрате комплекса 11. Это указывает на то, что функционирование комплекса I дыхательной цепи митохондрий при токсическом гепатите существенно отличается от контроля.

Возникает вопрос: почему повышено поглощение кислорода митохондриями гепатоцитов крыс с токсическим гепатитом и с работой каких комплексов дыхательной цепи оно связано?

'^„ю о ■

1 80 ■

В 6.0

5

2.0 0.0

Контроль

Гепатит

Рис. 2. Скорости потребления кислорода в состоянии 4 (У^ митохондриями гепатоцитов (на I мг белка) контрольных крыс и крыс с токсическим гепатитом. Субстраты: глутамат и манат.

N=13,* Р < 0.05 при сравнении с контролем.

Контроль Гепатит

Рис. 3. Скорости потребления кислорода митохондриями (на 1 мг белка) в состоянии 3 (У3) (черные столбики) и в присутствии динитрофенола (У„т) (серые столбики) контрольных и опытных крыс. Субстраты: глутамат и малат. £>.I 5.* Р < 0.05 при

сравнении с контролем.

0 50.0

1

а 40 0 ж

30 0

з

Э 20 0

¡3

3 100

►Л

5 оо

2 Контроль Гепатит

о

Рис. 4. Скорости потребления кислорода митохондриями (на I мг белка) в состоянии 3 (Уз) (черные столбики) и в присутствии динитрофенола (У,тс) (серые столбики) контрольных и опытных крыс. Субстрат: сукцинат. А'±5". О., N-15.* Р < 0.05 при сравнении с контролем.

Можно предположить, что повышенное потребление кислорода митохондриями гепатоцитов при токсическом гепатите связано с усилением продукции АФК. Известно, что не весь кислород, потребляемый митохондриями, расходуется в процессе окислительного фосфорилирования при работе цитохром с оксидазы (Boveris, Chance, 1973; Liu, 1997). В норме 1 -2 % кислорода уходит на выработку дыхательной

s

S ¡80

0 160 (3 140

1 IZO S

10 0 S 80 в 6.0

й 40 Й 2.0

2 00

i, 70 0 п g 60 0

3 50 0 X

«г "«М 3

Я 300

К ошро.пъ

и 20 0

rî

2 10 0

Рис. 5. Скорости потреблении кислорода в состоянии 4 (У^) митохондриями гепатоцитов (на 1 мг белка) контрольных крыс и крыс с токсическим гепатитом. Х±Б. И., N=15. Субстрат: сукцинит.

Рис. 6. Изменение активности цитохром с оксидазы (в расчете на I мг МХ белка) в печени крыс с токсическим гепатитом.

О., N=1 5,* Р < 0.05 при сравнении с контролем.

Контроль

цепью 02" (Boveris, Chance, 1973, Turrens, 1997; Liu, 1997). В дыхательной цепи митохондрий выявлено несколько сайтов образования СЬ" (рис. 7). Предполагают, что два или более таких сайта находятся в комплексе 1 (Гривенникова, Виноградов, 2003; Fridovich, 1974; Kotlyar et al, 1990; Genova et al., 2001; Kushnareva et al., 2002; Turrens, 2003). При этом основные сайты выявлены на флавинмоиоиуклеотидном участке и участке передачи электронов между железо-серными кластерами и убихиноном (Cadenas et al., 1977, Turrens, Boveris, 1980).

межмеморанное пространство

Г

иг им' метрике

Рис. 7. Дыхательная цепь митохондрий с указанием предположительных мест продукции О/ и мест воздействия использованных в работе ингибиторов.

Контроль

Рис. 8. Сравнение показателей дыхательного контроля в присутствии (серые столбики) и в отсутствие динитрофенола (черные столбики) митохондрий контрольной и опытной групп. Субстрат: сукцинат. Х±5\£>., N=15,* Р < 0.05 при сравнении с контролем.

Контроль

Рис. 9. Сравнение показателей дыхательного контроля в присутствии (серые столбики) и в отсутствие динитрофенола (черные столбики) для митохондрий контрольной и опытной групп. Субстраты: глутамат и малат.

N=15.* Р < 0.05 при сравнении с контролем.

В комплексе III также происходит образование 02' при окислении и восстановлении убихинона (Turrens et al„ 1985; Nicholls, Budd, 2000; Grivennikova, Vinogradov, 2006). Комплекс I дыхательной цепи рассматривают как один из основных источников АФК в клетке при патологии (Barja, Herrero,

1998, Barja, 1999, Nicholls, 2002, Trojanovvski, 2003) Для того, чтобы оценить долю потребляемого кислорода, не связанного с работой цитохром с оксидазы, мы использовали ее специфический ингибитор - цианид В присутствии цианида дыхание гепатоцитов крыс с токсическим гепатитом снижалось на 70 %, тогда как в контроле степень этого ингибирования составила 93 % (табл 1) Данный факт свидетельствует о том, что часть потребляемого митохондриями кислорода при токсическом гепатите расходуется, не доходя до конечного звена дыхательной цепи - цитохром с оксидазы Скорость потребления кислорода митохондриями крыс с токсическим гепатитом в состоянии Уз на сукцинате и ротеноне была незначительно выше по сравнению с контролем Основываясь на этих данных, можно предположить, что комплексы II и III также могут участвовать в продукции 0{ , наряду с комплексом I Вместе с тем, основываясь на данных литературы о том, что комплекс II обладает наименьшей способностью к продукции Ог' по сравнению с остальными комплексами дыхательной цепи (McLennan, Esposti, 2000), можно полагать, что вклад комплекса II в продукцию О2' при токсическом гепатите незначителен В связи с тем, что доля избыточного дыхания митохондрий крыс опытной группы на субстратах малате и глутамате выше, чем на сукцинате и ротеноне, мы предполагаем, что вклад комплекса I в продукцию О2' значительно преобладает над вкладом комплекса III

Изменение работы комплекса I, связанное, по-видимому, с нарушением транспорта электронов (утечка электронов на кислород), как раз и может быть причиной повышенной продукции Ог' Избыточный Ог' может окисляться цитохромом с, который в свою очередь переносит электроны на цитохром с оксидазу (рис 7) (Kowaltowski, Vercesi, 1999) Этот механизм хорошо согласуется с обнаруженным нами повышением на 80 % активности цитохром с оксидазы митохондрий гепатоцитов крыс с токсическим гепатитом (рис 6)

Вместе с тем результаты исследования сопряжения процессов окисления и фосфорилирования на изолированных гепатоцитах и на изолированных митохондриях указывают на то, что разобщение этих процессов отсутствует как

17

на субстратах комплекса I, так и на субстратах комплекса II дыхательной цепи Различий между параметрами Уцпс и У3 на сукцинате с ротеноном и глутамате с малатом в опытной группе не обнаружено (рис 3, 4) Дыхательные контроли оказались не только не ниже соответствующих значений контрольной группы, но даже превысили их (рис 8, 9) Кажется парадоксальным, что митохондрии при патологии имеют высокий дыхательный контроль В ряде работ показано, что при токсическом гепатите дыхательный контроль, а также степень сопряжения окисления и фосфорилирования снижаются (Лкко с1 а1, 1984, КгаЬепЬиЫ е1 а1, 1992а) Однако наши данные указывают на высокую степень сопряжения окисления и фосфорилирования митохондрий гепатоцитов на ранней стадии развития токсического гепатита Высокий дыхательный контроль определяется, по-видимому, увеличением скорости дыхания в состоянии Уз, что свидетельствует о высокой электронной проводимости самой дыхательной цепи

Наиболее часто используемые длительные модели развития патологии печени вызывают истощение компенсаторных механизмов клетки, приводят к повреждению дыхательной цепи, снижению дыхательного контроля и степени сопряжения процессов окисления и фосфорилирования (Лкко ^ а1, 1984, КгаЬепЬиЫ е! а1, 1992а) В рамках нашей относительно непродолжительной модели (1 мес) общая активация компенсаторных механизмов гепатоцита включает и активацию митохондриальных резервов, направленную на обеспечение возросшей потребности клетки в энергии Увеличение скорости транспорта электронов по переносчикам дыхательной цепи митохондрий, а также высокий дыхательный контроль и степень сопряжения окисления и фосфорилирования при токсическом гепатите, выявленные нами, подтверждают предположение об активации митохондриальных резервов, обеспечивающих создание необходимого электрохимического потенциала Показано, что тесное сопряжение окисления и фосфорилирования в митохондриях является необходимым условием продукции АФК дыхательной цепью (Нтк1е с1 а1, 1967, Тиггепв, 2003)

18

Данные, полученные при исследовании параметров дыхания изолированных гепатоцитов и митохондрий крыс, позволяют сформулировать гипотезу о том, что при токсическом гепатите происходит нарушение работы комплекса I дыхательной цепи, связанное с утечкой электронов на кислород и образованием 02° Выявленные при этом изменения в активности цитохром с оксидазы, по-видимому, носят компенсаторный характер и направлены на сохранение энергообразующей функции митохондрий

Для проверки выдвинутой гипотезы мы исследовали продукцию 02'~ дыхательной цепью митохондрий Полученные в работе данные, характеризующие продукцию 02" субмитохондриальными частицами крыс с токсическим гепатитом, указывают на то, что в комплексе I существует некоторое препятствие, ограничивающее продвижение электронов Так, скорость продукции 02* в присутствии НАДН субмитохондриальными частицами крыс с токсическим гепатитом была в 2 5 раза выше, чем в контроле Добавление ротенона, который блокирует передачу электронов в комплексе I с железосерных кластеров на окисленный убихинон (Herrero, Barja, 2000, Андреев и др, 2005), к субмитохондриальным частицам опытной группы в присутствии НАДН не привело к изменению скорости продукции 02' Скорость продукции 02" в контрольной группе в присутствии НАДН с ротеноном соответствовала таковой 02' в опытной группе в присутствии одного НАДН (рис 10). Появление препятствия в транспорте электронов по переносчикам комплекса 1 может приводить к тому, что часть электронов пойдет на образование 02' (рис 7)

NADH Сукцикат Рот INADH Рот / Микс / АнтА / Мине АнтА

Сукцмнат NADH NADH I NADH

Рис. 10. Продукция Oj субмитохондриальными частицами гепатоцитов крыс в норме (белые столбики) и при токсическом гепатите (серые столбики). X±S.D., N=15. * Р < 0.05 при сравнении с контролем; "* Р < 0.05 относительно скорости продукции О/ СМЧ в контроле при добавлении НАДИ; '* Р < 0.05 то же, но в рамках опытной группы. Сокращения: Рот — ротенон; Микс - миксотиазол; Ант А - антимчцин А.

Для оценки вклада в продукцию 02" остальных комплексов дыхательной цепи мы провели измерение скорости продукции СЬ' в присутствии миксотиазола и антимицина А, имеющих отличные от ротенона сайты ингибирования электронного транспорта в дыхательной цепи. Миксотиазол имеет два сайта воздействия (рис. 7), блокируя окисление CoQ в центре Q,, комплекса III и частичное восстановление CoQ в комплексе I (Ortega-Saenz et al., 2003; Ward, 2003). Антимицин А подавляет передачу электронов с цитохрома Ь566 на окисленный убихинон в комплексе III, тем самым препятствуя восстановлению убихинона (Андреев и др., 2005; Grivennikova, Vinogradov, 2006). Миксотиазол в норме вызывает многократное увеличение продукции АФК комплексом I, а антимицин А - комплексом III. Совместное действие миксотиазола и антимицина А проявляется в небольшом снижении продукции Oj комплексом III (Андреев и др., 2005). Уровень продукции 02' субмитохондриальными частицами опытной группы в присутствии

миксотиазола и НАДН на 72 % выше, чем в контроле в тех же условиях (рис 7) Данный факт указывает на то, что интенсивность электронного транспорта по дыхательной цепи митохондрий опытных крыс намного выше, чем в контроле Напротив, в присутствии антимицина А продукция 02' субмитохондриальными частицами опытных крыс была ниже, чем в контроле, но не отличалась от скорости продукции 02' субмитохондриальными частицами опытных крыс в присутствии ротенона и НАДН Следовательно, либо продукция 02" комплексом III при гепатите очень низкая, либо весь образующийся в комплексе III 02" утилизируется в рамках компенсаторного механизма с участием цитохрома с и цитохром с оксидазы Цитохром с может окислять образовавшийся 02' и переносить его на цитохром с оксидазу, кот орая, в свою очередь, восстанавливает кислород до воды (Korshunov et al, 1999, Андреев и др, 2005) Выявленное нами ранее почти двукратное увеличение активности цитохром с оксидазы при токсическом гепатите подтверждает такую возможность (Ширяева и др, 2007) По-видимому, результат совместного действия миксотиазола и антимицина А в опытной группе, определяется действием одного миксотиазола в комплексе I Эти данные также подтверждают предположение о существовании в комплексе I дыхательной цепи митохондрий при токсическом гепатите препятствия в транспорте электронов

Данные по измерению скорости продукции 02" на субстрате комплекса II дыхательной цепи - сукцинате не выявили каких-либо отличий между крысами опытной и контрольной групп Следовательно, при токсическом гепатите комплекс II не участвует в выработке АФК

Митохондрии млекопитающих обладают эффективной системой защиты от АФК (Андреев и др , 2005, Li et al, 1995) Устранение первичных АФК (02* и Н >02) осуществляют Mn-содержащая СОД и глутатионпероксидаза Мп-СОД, расположенная в митохондриалыюм матриксе, ускоряет дисмутацию 02" в Н202, защищая от 02" железосерные кластеры, входящие в состав комплексов дыхательной цепи (Gardner et al, 1995) Глутатионпероксидаза утилизирует

21

Таблица 2

Аштюксидантный статус митохондрий гепатог/итов крыс в норме и при хроническом

токсическом гепатите

Показатели Контроль Опыт

Mn-СОД, ед/мг белка 5.8 ±0.4 3.8 ± 0.1 *

Глутатионпероксидаза, нмоль/мин/мг белка 466 ± 14 345 ± 32 *

Глутатион, нмоль/мг белка 2.6 ±0.3 2.1 ±0.1

Глутатион восст., нмоль/мг белка 2.0 ±0.3 1.6 ± 0.1

Глутатион окисл., нмоль/мг белка 0.60 ± 0.06 0.50 ±0.06

Примечание. Х±Б. Е., N=15, * Р < 0.01 при сравнении с контролем.

Рис. II. Содержание адениловых нуклеотчдов в печени контрольных крыс (белые столбики) и крыс с токсическим гепатитом (серые столбики), индуцированным применением СС14 и этанола. ^±5. Р., N=15, * Р < 0.01.

Н2О2 посредством окисления восстановленного глутатиона (Li et al., 1995). Активность систем удаления АФК в норме очень высока, однако при патологии скорость выработки АФК митохондриями может превышать скорость их утилизации системой аитиоксидантной защиты (Андреев и др., 2005). При исследовании основных ферментов ангиоксидантпой защиты митохондрий оказалось, что активности Mn-СОД и глутатионпероксидазы при токсическом гепатите снижены на 34 % и 26 % соответственно (табл. 2). Продукты окислительного стресса могут подавлять компоненты аитиоксидантной системы (Bota, Davies, 2002), что, возможно, и является причиной выявленного нами снижения аптиоксидаптных ферментов митохондрий при токсическом гепатите. Возможно также появление модифицированных окислением белков электрон-транспортной цепи, которые могут привести к нарушению работы дыхательной цепи, усилению окислительного стресса и снижению синтеза АТФ. Результаты наших исследований выявили снижение на 45 % содержания АТФ в печени животных с токсическим гепатитом (рис. 11). Снижение синтеза

АТФ и активности глутатионпероксидазы обнаружено также при хроническом

22

3 000 2.500 2 000 1 500 1 000 0 500 0.000

АМФ

АДФ

АТФ

алкогольном поражении печени (Bailey et al, 2006) и при циррозе печени (Balkan et al, 2001) Следовательно, при гепатите в условиях окислительного стресса антиоксидантная система не обеспечивает эффективную утилизацию АФК, образующихся в митохондриях, что в свою очередь может усугублять патологический процесс

Данные, полученные при изучении продукции 02"~ субмитохондриальными частицами позволяют заключить, что выработка 0{ дыкателыюй цепью митохондрий при токсическом гепатите значительно увеличена Основным местом выработки 02" является комплекс I, тогда как вклад комплекса III в продукцию 02'~ при токсическом гепатите незначителен Усиление продукции 02'~, вероятно, можно рассматривать не только как составляющую патологического процесса, но также и как компенсаторный ме>анизм, позволяющий митохондрии сохранить электрон-транспортную функцию дыхательной цепи в условиях частичной блокады комплекса I Однако действие такого компенсаторного механизма недостаточно, что выражается в значительном снижении уровня АТФ в печени при токсическом гепатите

ВЫВОДЫ

1. Скорость дыхания изолированных гепатоцитов и митохондрий при 1 оксическом гепатите повышена При этом степень сопряжения окисления и qt>ocфopилиpoвaния в дыхательной цепи митохондрий остается высокой

2. Продукция 02' дыхательной цепью митохондрий гепатоцитов при токсическом гепатите повышена, основной вклад в эту продукцию вносит комплекс I дыхательной цепи вследствие частичного блокирования переноса электронов в этом комплексе

3. Усиление продукции 02* можно рассматривать не только в качестве основной составляющей патологического процесса, но также как компенсаторный механизм, позволяющий поддерживать электрон-

транспортную функцию дыхательной цепи митохондрий в условиях ее частичной блокады в комплексе I

4. Активность антиоксидантной системы митохондрий гепатоцитов при токсическом гепатите снижена, что проявляется в уменьшении активностей Mn-СОД и глутатионпероксидазы

5. Содержание АТФ в печени при токсическом гепатите снижено, что указывает на ослабление энергообразующей функции митохондрий гепатоцитов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Оковитый С В , -Ярославцев М Ю , Сакута Г А , Литанюк (Ширяева) А.П , Шуленин С Н , Кудрявцев Б Н 2004 Особенности действия симвастатина при экспериментальной гепатопатии у крыс Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология Приложение гепатология, 5 4-7

2 Сакута Г А , Байдюк Е В , Литанюк (Ширяева) А.П., Морозов В И , Оксман А Я 2004 Исследование цитопротекторного действия глюкурала на изолированные гепатоциты крыс Тезисы Междунар Симпозиума «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» Цитология, 46(10) 938

3 Litanyuk (Shiryaeva) А , Baydiuk Е , Sakuta G , Okovityi S 2004 Oxygen consumption of rats hepatocytes in cirrhotic liver Abstracts of 8th International World Congress of Cell Biology Nice, France ELSO 2004 Proseedings

4 Сакута Г A , Байдюк E В , Литанюк (Ширяева) А.П , Морозов В И , Оксман А Я 2005 Глюкурал как цитопротектор Исследование на изолированных гепатоцитах крысы Инф Бюлл «Клеточные культуры» СПб, 20 58-63

5 Литанюк (Ширяева) А.П 2006 Активность дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс с экспериментальным стеатогепатитом Тезисы докладов 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» Пущино, стр 113

6 Ширяева А.П , Байдюк Е В , Аркадьева А В , Оковитый С В , Морозов В И , Сакута Г А 2007 Состояние дыхательной цепи митохондрий печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом Цитология, 47(2) 125-132 Англ пер Shiryaeva А.Р, Baidyuk Е V , Arkadieva А V , Okovityy S V , Morozov V I, Sakuta G A 2007 State of liver mitochondrial respiratory chain in rats with experimental toxic hepatitis Cell and Tissue Biology, 1(2) 169-177

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Avasarala it al 2006 Toxicology 228 310 - 322 Bailey ct al 2006 Am J Physiol Gastromtest Liver Physiol 291(5) 0857 -867 Balkan a al 2001, Hum Exp Toxicol 20 251 -254 Barja 1999 J Biocncrg Biomcmbr 31(4) 347 -366 Bola Davics 2002 Nal Cell Biol 4 674 -680 llottcnus cl al 1982 Biochcm Biophys Res Commun 105 1368 -1373 Bovcris Chance 1973 Biochcm J 134(3) 707-716 tadinjs ct al 1177 Arch Biochem Biophys 180 248-257 Ccdcrbaum ct al 1974 Arch Biochcm Biophys 165 560-569 Esrcfoglu ct al 2007 Exp Toxicol Pathol 58(5) 367 - 374 FudoMch 1974 Eur J Biochcm 180(1)173 - 80 Gardner ct al 1995 J Biol Chcm 270 13399 - 13405 (nno\a cl al 2001 FEBS Lett 505(3 ) 364 - 368 Grivinnikova Vinogradov 2006 Biochtm Biophys Acta 1757 553-561 Harvey clal 2000 J Pharmacol Exp Tllcrap 293 641 -645 Hcrriro Barja 2000 J Biocncrg Biomcmbr 32 609 - 615 Hmklc el al 1967 J Biol Chcm 242 5169 5173 Hwang Ismail Bclgl 2003 Am J Physiol 281 CI365 -C1372 JiUoelat 1984 J Surg Res 37 361 -368 Jonson Lardy 1969 Methods in Enzymology N V Acad Press 10 94 - 96 Korshunov el al 1999 FEBS Lcll 462 192 -198 Kotlvar ct al 1990 FEBS Lett 264(1) 17-20 Kowallowski Vcreesi 1999 Free Radic Biol Med 26 463 -71 KrJhcnbuhl ct al 1989 Biochcm Pharmacol 38 1583 -1588 kibtmire\a ct al 2002 BtiKhcm 1 368 545 -553 Lcnaz 2001 ШВМВ Life 52 159- 164 Liu 1997 Biosci Rep 17 259-272 McLennan Esposti 2000 J Biocncrg Biomcmbr 32 153 - 162 Morimoto cl al 1988 Clin Sci 74 485-489 Mossman 1983 J Immunol Methods 65 55 -63 Nicholls Ferguson 2002 Int J Biochcm Cell Biol 34(11) 1372 -1381 Noyan el al 2006 Cell Biol Toxicol 22(6) 381-391 Nozu ct al 1992 Hcpatology 15 1099- 1106 Ortega Saenz cl al 2003 J Physiol 548(Pt 3) 789-800 Raja et al 2007 J Ethnophamiacol 109(1) 41-47 Rubin leinetal 2003 EMBO J 22(23) 6182 - 6192 Tro| ino»sLt 2003 Exp Neural 179(1) 6-8 Turrens 2003 J Physiol 552 335 - 344 Turrcns Bovcns 1980 Biochcm J 191 421-427 Wang Cederbaum 2006 J Pharmacol Exp Thcr 317(1) 44-52 Yang et al 2004 Cell Mol LifcSti 61 220-229 Андреев и лр 2005 Биохимия 70 246 - 264 Iрнвенникова Винофадов 2003 Успехи биоло! и icckoii химии 43 19 -57 Рнбикнн 2002 Вестник транец ianm ioi ПИ п искусственных opi анов 1 42-49 Ширяева А П и лр 2007 I (п ю iot ия 47 125-132

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 21 01 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 2486Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел /факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ширяева, Анна Петровна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Общие принципы строения и функции печени

2.2 Морфо-функциональные изменения в печени при хронических гепатитах и циррозе различной этиологии

2.3 Гепатотоксическое действие четыреххлористого углерода

СС14) и этанола

2.4 Регенерация печени. Роль клеточного дыхания

2.5 Дыхательная цепь митохондрий. Структура и функция

2.6 Состояние дыхательной цени при патологии печени

2.7 Возможные места образования супероксидного аниона в дыхательной цепи митохондрий

2.8 Антиоксидантная система митохондрий гепатоцитов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Экспериментальные животные и моделирование токсического гепатита

3.2 Приготовление гистологических срезов печени

3.3 Получение изолированных гепатоцитов и их культивирование

3.4 Окраска изолированных гепатоцитов родамином

3.5 Выделение митохондрий из гепатоцитов

3.6 Выделение субмитохондриальных частиц из митохондрий

3.7 Оценка функционального состояния дыхательной цепи митохондрий

3.7.1 Применение полярографического метода измерения скорости потребления кислорода изолированными гепатоцитами и митохондриями

3.7.2 Параметры оценки функционального состояния дыхательной цепи митохондрий

3.7.3 Определение активности цитохром с оксидазы

3.7.4 Определение адениловых нуклеотидов

3.8 Измерение скорости продукции супероксидного аниона

3.9 Определение параметров перекисного окисления липидов в печени

3.9.1 Измерение диеновых конъюгатов

3.9.2 Измерение Шиффовых оснований

3.10 Определение уровня триглицеридов

3.11 Измерение сухой массы изолированных гепатоцитов

3.12 Оценка антиоксидантного статуса митохондрий

3.12.1 Определение активности митохондриальной супероксиддисмутазы

3.12.2 Определение активности митохондриальной глутатионпероксидазы

3.12.3 Определение окисленного и восстановленного митохондриального глутатиона

3.13 Статистическая обработка полученных данных 56 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Экспериментальный токсический гепатит

4.1.1 Гистологическая характеристика печени

4.1.2 Морфология изолированных гепатоцитов

4.1.3 Морфология митохондрий, окрашенных родамином

4.1.4 Уровень триглицеридов в печени

4.1.5 Сухая масса изолированных гепатоцитов

4.2 Активность процессов перекисного окисления липидов в печени крыс при экспериментальном токсическом гепатите

4.3 Отработка условий измерения скорости дыхания изолированных гепатоцитов с помощью полярографического метода

4.4 Оценка скорости дыхания изолированных гепатоцитов при 4 экспериментальном токсическом гепатите

4.5 Оценка скорости дыхания изолированных митохондрий при экспериментальном токсическом гепатите

4.6 Активность цитохром с оксидазы

4.7 Продукция супероксидного аниона субмитохондриальными частицами гепатоцитов при экспериментальном токсическом гепатите

4.8 Анализ антиоксидантной системы митохондрий при экспериментальном токсическом гепатите. Активности супероксиддисмутазы и глутатион-пероксидазы, концентрации окисленного и восстановленного глутатиона

4.9 Содержание адениловых нуклеотидов в печени (АМФ, АДФ, АТФ)

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональное состояние дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс при экспериментальном токсическом гепатите"

6

Заболевания печени занимают одно из ведущих мест по летальности среди населения (Рябинин, 2002). К наиболее тяжелым из них относятся гепатиты различной этиологии и алкогольное поражение печени, вследствие которых зачастую развивается цирроз. Развитие токсического гепатита сопровождается активацией, как процесса дегенерации, так и процесса регенерации печени и соотношение этих процессов оказывает решающее влияние на исход заболевания. Успех регенерации зависит от того, насколько эффективен энергетический метаболизм гепатоцитов, который целиком определяется состоянием дыхательной цепи митохондрий.

Дыхательная цепь представляет собой сложную мультикомпонентную структуру, состоящую из пяти комплексов, локализованных во внутренней мембране митохондрий: НАДН-CoQ-оксидоредуктаза (комплекс I), сукцинат-Со(5-оксидоредуктаза (комплекс II), CoQ-цитохромС-оксидоредуктаза (комплекс III), цитохром с оксидаза (комплекс IV) и АТФ-синтазы. Непосредственный синтез АТФ осуществляет АТФ-синтаза, локализованная во внутренней мембране митохондрий в непосредственной близости к электрон-транспортной цепи (Nicholls, Ferguson, 2002; Rubinstein et al., 2003).

Сведения о состоянии дыхательной цепи при токсическом гепатите весьма противоречивы и недостаточны. Так, некоторые авторы утверждают, что компоненты дыхательной цепи при патологии печени серьезно повреждаются, следствием чего является снижение синтеза АТФ (Krahenbiihl et al., 1989; Nozu et al., 1992; Hwang, Ismail-Beigi, 2003). Однако детальные исследования механизмов этих нарушений не проведены. Другие авторы считают, что компоненты дыхательной цепи не повреждаются, но могут изменять свою функциональную активность (Cederbaum et al., 1974; Bottenus et al., 1982; Yang et al., 2004). Важно подчеркнуть также, что обычно состояние дыхательной цепи митохондрий изучают в рамках уже сложившейся патологии печени, используя модели с длительными сроками отравления животных, когда компенсаторные механизмы в клетке практически истощены и преобладают процессы деградации.

Таким образом, изучение состояния дыхательной цепи при токсическом гепатите является актуальной проблемой. Вместе с тем на наш взгляд важно изучить состояние дыхательной цепи митохондрий в ранний период развития патологии, когда компенсаторные механизмы клетки активированы в ответ на повреждающее воздействие токсических веществ. Такие данные могут помочь в разработке адекватной тактики лечения токсического гепатита.

Патологические процессы, развивающиеся в печени при токсическом гепатите, как вследствие непосредственного воздействия токсинов, так и в результате нарушения механизма их детоксикации, приводят к окислительному стрессу (Noyan et al., 2006; Esrefoglu et al., 2007; Raja et al., 2007). Окислительный стресс приводит к повышению внутриклеточной генерации активных форм кислорода (АФК) и окислительному повреждению молекулярных компонентов клетки (Андреев и др., 2005; Avasarala et al., 2006; Wang, Cederbaum, 2006).

Митохондрии концентрируют в себе большую часть окислительных метаболических путей и содержат многочисленные редокс-переносчики и сайты, потенциально способные к одноэлектронному восстановлению кислорода до супероксидного аниона - предшественника других АФК (Андреев и др., 2005; Cadenas et al., 1977; Lenaz, 2001). В дыхательной цепи митохондрий в норме роль основных генераторов супероксидного аниона отводят комплексам I (Cadenas et al., 1977; Lenaz, 2001) и III (Boveris, Chance, 1973; Turrens, Boveris, 1980). В комплексе I генерацию супероксидного аниона предположительно связывают с железосерными кластерами и семихиноном (Андреев и др., 2005; Herrero,

Barja, 2000). Существует предположение, что источником супероксидного аниона в комплексе III является нестабильный радикал семихинона (Q в центре Qp (Rich, Bonner, 1978), хотя существование этого семихинона до сих пор не продемонстрировано (Turrens, 2003). В гепатоцитах нормальной печени интенсивность продукции супероксидного аниона ничтожно мала. Так, митохондрии в состоянии 4 (V4) по Чансу продуцируют 0.6-1 нмоль Н2С>2 за 1 мин, на 1 мг белка, что составляет примерно 2 % от всего потребляемого ими кислорода (Liu, 1997). Вырабатываемый при этом супероксид анион может быть вовлечен в регуляцию клеточного метаболизма или элиминирован митохондриальной супероксиддисмутазой (Mn-СОД) (Liu, 1997; Turrens, 1997). При патологиях печени уровень продукции АФК в митохондриях гепатоцитов значительно возрастает (Андреев и др., 2005; Yang et al., 2004), однако механизм усиления продукции супероксидного аниона в дыхательной цепи митохондрий практически не изучен.

Исходя из вышесказанного, цель настоящей работы состояла в исследовании состояния дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс с экспериментальным токсическим гепатитом, вызванным комбинированным воздействием этанола и ССЦ. В рамках цели исследования были сформулированы следующие задачи:

1) получить гистологическую и биохимическую характеристики печени крыс, подвергавшихся комбинированному воздействию этанола и CCI4 в течение 1-го месяца;

2) провести ингибиторный анализ скорости дыхания изолированных гепатоцитов и митохондрий крыс с токсическим гепатитом;

3) исследовать продукцию супероксидного аниона различными комплексами дыхательной цепи митохондрий крыс с токсическим гепатитом;

4) изучить состояние антиоксидантной системы митохондрий гепатоцитов крыс с токсическим гепатитом;

5) исследовать энергообразующую функцию печени крыс с токсическим гепатитом.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ширяева, Анна Петровна

6. выводы

1. Хроническая интоксикация крыс этанолом и СО4 в течение месяца приводит к развитию гепатита, фиброза и жировой дистрофии ткани печени, усилению процессов перекисного окисления липидов, а также гипертрофии гепатоцитов.

2. Скорость дыхания изолированных гепатоцитов и митохондрий при токсическом гепатите повышена. При этом степень сопряжения окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи митохондрий остается высокой.

3. Продукция супероксидного аниона дыхательной цепью митохондрий гепатоцитов при токсическом гепатите повышена; основной вклад в эту продукцию вносит комплекс I дыхательной цепи, вследствие частичного блокирования переноса электронов в этом комплексе.

4. Усиление продукции супероксидного аниона можно рассматривать не только в качестве основной составляющей патологического процесса, но также как компенсаторный механизм, позволяющий поддерживать электрон-транспортную функцию дыхательной цепи митохондрий в условиях ее частичной блокады в комплексе I.

5. Активность антиоксидантной системы митохондрий гепатоцитов при токсическом гепатите снижена.

6. Энергообразующая функция митохондрий гепатоцитов при токсическом гепатите ослаблена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ширяева, Анна Петровна, Санкт-Петербург

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., УотсонДж. (1994) Молекулярная биология клетки, т. 1. М.: Мир, 515 с.

2. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков A.A. (2005) Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях (обзор). Биохимия. 70: 246 264.

3. Арчаков А.И. (1975) Микросомальное окисление. М.: Наука, 327 с.

4. Афанасьева Ю.И., Кузнецова С.Л., Юрина H.A. (2004) Гистология, цитология и эмбриология. М.: Медицина, 766 с.

5. Белокуров Ю.И., Рыбачков В.В. (1982) Клиника и лечение острой печеночной недостаточности. Ярославль, 95 с.

6. Березовский В.А., Бернштейн С.А., Гуревич М.И., Кочерга Д.А. (1974) Полярографическое определение кислорода в биологических объектах. Материалы 2-го Всесоюзного симпозиума. Киев: Наукова думка, 292 с.

7. Берсенев A.B., Сипливый В.А., Мельникова- С.М., Череватова С.Х. (1993) Прогнозирование печеночной недостаточности у больных с циррозом печени при хирургическом лечении портальной гипертензии. Клиническая хирургия. 11:38 — 40.

8. Блюгер А.Ф., Майоре А.Я. (1978) Проблема перекисного окисления в гепатологии. Успехи гепатологии. Рига, 15 — 18.

9. Бреслер В.М., Черноградская H.A., Пильщук Е.М., Пылдвере Э.И. (1969) Нормальная и патологическая цитология паренхимы печени. Л.: Наука, 272 с.

10. Венгеровский А.И., Батурина Н.О., Чучалин B.C., Саратиков A.C. (1996) Роль перекисного окисления липидов в механизме пролифирации фиброзной ткани при экспериментальном хроническом гепатите. Пат. Физиол. Экстр. Терапия. 2: 37 39.

11. Верин B.K. (1984) Дивергентная дифференцировка гепатоцитов и холангиоцитов в эмбриональном и репаративном гистогенезе печени. Дисс. докт. наук. Л.: ВИЭМ, 280 с.

12. Верин В.К. (2001) Печень. Руководство по гистологии, т.2. СПб.: СпецЛит,. с. 64 78.

13. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. (1983) Спектрофотометрическое определение содержание липидов в плазме крови. Лаб. Дело. 3, с 33 -36.

14. Гилберт С. (1993) Биология развития, т. 1. М.: Мир, 228 с.

15. Гривенникова В.Г., Виноградов АД. (2003) Митохондриальный комплекс I. Успехи биологической химии. 43: 19 — 57.

16. Гулак П.В., Дудченко A.M., Зайцев В.В, Лукьянова Л.Д. и др. (1985) Гепатоцит: Функционально-метаболические свойства. М.: Наука, 270 с.

17. Завадская Е.Э. (1989) Цитологические механизмы репаративного роста печени в условиях ее хронического повреждения и частичной гепатэктомии: Автореф. канд. дис. Л., 22 с.

18. Змызгова A.B. (1999) Вирусные гепатиты. М.: Медицина, 154 с.

19. Карташева О.Я. (1985) Экспериментальная патология печени. Рига: Зинатне, 148 с.

20. Ковальчук В.И. (1982) Патогенез функциональной недостаточности печени при остром панкреатите. Вестник хир. 6: 26 29.

21. Ковальчук В.И. (1993) Печень при остром панкреатите. Челябинск, 217 с.

22. Марри Р., Греинер Д., Мейес П., Родуэлл В. (1993) Биология человека: В 2-х т. Пер. с англ. М.: Мир, 384 с.

23. Маянский Д.Н. (1981) Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. Новосибирск: Наука, 172 с.

24. Нурмухаметов Р. (2000) Новые перспективы лечения алкогольной болезни печени. Consilium medicum. 7(2).

25. Пирс Э. (1962) Гистохимия. Теоретическая и прикладная. М.: Изд-во иностр. лит., 962 с.

26. Подымова С. Д. (1999) Болезни печени. Руководство для врачей. М.: Медицина, 704 с.

27. Прохорова М.И. (1982) Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). JL: Изд. Лен. Университета. 68 с.

28. Роскин Г.И. (1957) Микроскопическая техника. М.: Советская наука, 467 с.

29. Рябинин В.Е. (2002) Использование методов клеточной и эфферентной терапии при лечении печеночной недостаточности. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 1: 42 — 49.

30. Рябова< С.С., Александрова В.П. (1981) Микроциркуляция печени при экспериментальном внепеченочном холестазе. Хирургия. 10: 78 — 80.

31. СеверинЕ.С. (2005) Биохимия. М.: ГЭОТАР-Медиа, 779 с.

32. Серов В.В. (1980) Морфология дистрофических процессов. Итоги науки и техники. Сер. "Патологическая анатомия", т. 2. М.: ВИНИТИ, с 13.

33. Серое В.В., Дрозд Т.Н., Лебедев С.П., Попова И.А., Попов М.С. (1987) Цирроз печени. Клиническая морфология заболеваний печени, т. 6. М.: ВИНИТИ, с.77- 132.

34. Солопаев Б.П. (1985) Сравнительное изучение регенерации нормальных и патологически измененных органов. Сравнительные аспекты изучения регенерации и клеточной пролиферации, 4.2. Горький, с. 279-281.

35. Соринсон С.Н. (1998) Вирусные гепатиты. СПб.: Теза, 325 с.

36. Таранова Н.П., Нилова Н.Ч. (1986) Перекисное окисление липидов синаптосом головного мозга крыс при нарушении сна. Физиол. Журн. 72(8): 1065- 1063.

37. Хэм А., КормакД (1983) Гистология, т. 4. М.: Мир, 245 с.

38. Ширяева А.П., Байдюк Е.В., Аркадьева A.B., Оковитый С.В., Морозов В.И., Сакута Г.А. (2007) Состояние дыхательной цепи митохондрийпечени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом. Цитология. 47: 125 132.

39. Шулутко Б.И. (1995) Болезни печени и почек. СПб.: Изд. Ренкор, 479 с.

40. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts К., Watson J.D. (1983) Molecular biology of the cell. NY: Garland Publishing, 756 p.

41. Anderson S., de Bruijn M.H., Coulson A.R., Eperon I.C., Sanger F., Young I. G. (1982) Complete sequence of bovine mitochondrial DNA. Conserved features of the mammalian mitochondrial genome. J. Mol. Biol. 156(4): 683-717.

42. Arias I.M., Popper H., Schachter D., Shafritz D.A. (1994) The liver: Biology and pathobiology. NY: Raven Press, 1009 p.

43. Arosio В., Santambrogio D., Gagliano N., Annoni G. (1993) Changes in expression of the albumin, fibronectin and type I procollagen genes in CCl4-induced liver fibrosis: effect of pyridoxol L,2-pyrrolidon-5 carboxylate. Pharmacol.Toxicol. 73: 301 -304.

44. AzziA., Muller M. (1990) Cytochrome с oxidases: polypeptide composition, role of subunits, and location of active metal centers. Arch. Biochem. Biophys. 280(2): 242-251.

45. Avasarala S., Yang L., Sun Y, Leung A.W., Chan W.Y., Cheung W.T., Lee S.S. (2006) A temporal study on the histopathological, biochemical and molecular responses of CCLpinduced hepatotoxicity in Cyp2el-null mice. Toxicology. 228: 310-322.

46. Bailey S.M., Cunningham. C.C. (1998) Acute and chronic ethanol increases reactive oxygen species generation and decreases viability in fresh, isolated rat hepatocytes. Hepatology. 28(5): 1318 1326.

47. Bailey S.M., Patel V.B., Young T.A., Asayama K., Cunningham C.C. (2001) Chronic ethanol consumption alters the glutathione/glutathione peroxidase-1 system and protein oxidation status in rat liver. Alcohol. Clin. Exp. Res. 25: 276 733.

48. Bailey S.M. (2003) A review of the role of reactive oxygen and nitrogen species in alcohol-induced mitochondrial dysfunction. Free Radic. Res. 37(6): 585-596.

49. Balkan J., Dogru-Abbasoglu S., Kanbagli O., Cevikbas U., Aykac-Toker G., Uysal M. (2001) Taurine has a protective effect against thioacetamide-induced liver cirrhosis by decreasing oxidative stress. Hum. Exp. Toxicol. 20: 251 -254.

50. Barja G. (1999) Mitochondrial oxygen radical generation and leak: sites of production in states 4 and 3, organ specificity, and relation to aging and longevity. J. Bioenerg. Biomembr. 31(4): 347 366.

51. Benhold H. (1967) La fonction de transport des proteines du serum. Ann. Biol. Chem. 25(2): 311-314.

52. Bioulac-Sage P., Le Bail B., Balabaud C. (1999) Liver and biliary-tract histology. Oxford textbook of clinical hepatology. Oxford, UK: Oxford University Press, p. 13 — 23.

53. Bircher J., Benhamou J-P., Mclntyre N., Rizzetto M., Rodes J. (1999) Oxford textbook of clinical hepatology. Oxford, UK: Oxford University Press, 1086 p.

54. Bota D.A., Davies K.J. (2002) Lon protease preferentially degrades oxidized mitochondrial aconitase by an ATP-stimulated mechanism. Nat. Cell. Biol. 4: 674-680.

55. Bottenus R., Spach P., Filus S., Cunningham C. (1982) Effect of chronic ethanol consumption on energy-linked processed associated with oxidative phosphorylation: proton translocation and ATP-Pi exchange. Biochem. Biophys. Res. Commun. 105: 1368 1373.

56. Boveris A., Chance B. (1973) The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem. J. 134(3): 707-716.

57. Boyer P.D. (1993) The binding change mechanism for ATO synthase some probabilities and possibilities. Biochim. Biophys. Acta. 1140(3): 215 — 50.

58. Bradford MM (1976) Rapid and sensitive method for the quantitation quantity of protein utilizing the principle of protein dye binding. Analytical. Biochem. 72: 248 254.

59. Brittom R.S., Bacon B.R. (1994) Role of free radicals in liver diseases and hepatic fibrosis. Hepatogastroenterology. 41: 343 348.

60. Cadenas E., Boveris A., Ragan C.I., Stoppani A.O. (1977) Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by HA,ZJH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome c reductase from beef-heart mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 180: 248 — 257.

61. Canturk N.Z., CanturkZ., Utkan N.Z., Yenisey C., Ozbilim G., Gelen T., Yalman Y. (1999) The protective effect of vitamin E on gastric mucosal injury in rats with cirrhosis of the liver. Chin Med J (Engl). 112: 56 60.

62. Cederbaum A., Lieber C., Rubin E. (1974) Effects of chronic ethanol treatment on mitochondrial functions damage to coupling site I. Arch. Biochem. Biophys. 165: 560-569.

63. Chance B., Williams G. (1956) The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzimol. 17: 65 134.

64. Chen Z., Lash L.H. (1998) Evidence for mitochondrial uptake of glutathione by dicarboxylate and 2-oxoglutarate carriers. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285: 608-618.

65. Chen M.F., Hwang T.L. (1994) The regeneration of cirrhotic liver after partial hepatectomy: a study using the rat carbon tetrachloride-induced cirrhotic model. Proc. Natl. Sci. Counc. Repub. China B. 18:71- 75.

66. Chiarpotto E., Olivero J., Albano E. (1981) Studies on lipid peroxidation using whole liver cells. Experientia. 37: 396 — 397.

67. Cignoli E., Castro J. (1971) Lipid peroxidation, necrosis and the in vivo depression of liver glucose-6-phosphatase by carbon tetrachloride. Exp. Mol. Pathol. 14: 43 56.

68. Coleman W. B., Cunningham C.C. (1990) Effects of chronic ethanol consumption on the synthesis of polypeptides encoded by the hepatic mitochondrial genome. Biochim. Biophys. Acta. 1019: 142 — 150.

69. Cunningham C.C., Coleman W.B., Spach P.I. (1990) The effects of chronic ethanol consumption on hepatic mitochondrial energy metabolism. Alcohol. Alcohol. 25: 127-136.

70. Cunningham C.C., Ivester P. (1999) Chronic ethanol, oxygen tension and hepatocyte energy metabolism. Front. Biosci. 4: 551 — 556.

71. David H., Reinke P. (1987) Die Heterogenitat der Leber und das Konzept der "Perisinusoidalen Funktionseinheit". Sitzungsberichte der Akademie der Wissenschaften der DDR. Berlin: Academie-Verlag, H.6. S.60.

72. Desmet V.J., Van Eyken P., Roskams T. (1999) Embryology of the liver and intrahepatic biliary tract. Oxford textbook of clinical hepatology. Oxford, UK: Oxford University Press, p. 51 65.

73. Douce F.H., Vieth K.P. (1985) Benefits and costs to hospitals affiliating with a respiratory therapist educational program. Respir. Care. 30(8): 685 -690.

74. Esrefoglu M., GulM., DogruM.I., DogruA., Yurekli M. (2007) Adrenomedullin fails to reduce cadmium-induced oxidative damage in rat liver. Exp. Toxicol. Pathol. 58(5): 367 374.

75. EstabrookR.W. (1967) Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurement of ADP:0 ratios. Methods Enzymol. 10: 41 47.

76. Farrell G.C., Zaluzny L. (1985) Hepatic heme metabolism and cytochrome P-450 in cirrhotic rat liver. Gastroent. 89: 172 179.

77. Flohe L., Otting. F. (1984) Superoxide dismutase assays. Meth. Enzymol. 105: 93- 104.

78. Flohe L., Gunzler W.A. (1984) Assays of glutathione peroxidase. Meth. Enzymol. 105: 114-121.

79. Fridovich I. (1984) Superoxide and evolution. Horiz. Biochem. Biophys. 1:137.

80. Gardner P.R., Raineri I., Epstein L.B., White C.W. (1995) Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. J. Biol. Chem. 270: 13399- 13405.

81. Gille L., Starnberg W., Jäger W., Reznicek G., Netscher T., Rosenau T. (2007) A new ubiquinone metabolite and its activity at the mitochondrial bcl complex. Chem Res Toxicol. 20(4): 591 -599.

82. Gregory R.B., Berry M.N. (1991) On the thyroid hormone-induced increase in respiratory capacity of isolated rat hepatocytes. Biochim. Biophys. Acta. 1098: 61-67.

83. Gressner A.M., Schuppan D. (1999) Cellular and molecular pathobiology, pharmacological intervention, and biochemical assessment of liver fibrosis. Oxford textbook of clinical hepatology. Oxford, UK: Oxford University Press, p. 607 629.

84. Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. (2006) Generation of superoxide by the mitochondrial Complex I. Biochim. Biophys. Acta. 1757: 553 561.

85. Hackenbrock C.R., Chazotte B., Gupte S.S. (1986) The random collision model and a critical assessment of diffusion and collision in mitochondrial electron transport. J. Bioenerg. Biomembr. 18: 331 368.

86. Harvey P.J., Gready J.E., Yin Z, Couteur D.G., McLean A.J. (2000) Acute oxygen supplementation restores markers of hepatocyte energy status and hypoxia in cirrhotic.rats. J. Pharmacol. Exp. Therap. 293: 641 — 645.

87. Hazelton G.A., Lang C.A. (1980) Glutathione contents of tissues in the aging mouse. Biochem. J. 188(1): 25 30.

88. Heinemeyer J., Braun H.P., Boekema E.J., Kouril R. (2007) A structural model of the cytochrome C reductase/oxidase supercomplex from yeast mitochondria J Biol Chem. 282(16):12240 12248.

89. Heron C., Smith S., Ragan C.I. (1979) An analysis of the polypeptide composition of bovine heart mitochondrial HA^H-ubiquinone oxidoreductase by two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis. Biochem. J. 181(2): 435-43.

90. Herrero A., Barja G. (1998) H202 production of heart mitochondria and aging rate are slower in canaries and parakeets than in mice: sites of free radical generation and mechanisms involved. Mech. Ageing. Dev. 103(2): 133- 146.

91. Herrero A., Barja G. (2000) Localization of the Site of Oxygen Radical Generation inside the Complex I of Heart and Nonsynaptic Brain Mammalian Mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr. 32: 609 615.

92. Henderson M.J. (1999) Anatomy of the portal venous system in portal hypertension. Oxford textbook of clinical hepathology. Oxford, UK: Oxford University Press, p. 645 653.

93. Hemet J., Dubois J.P., Lemoine F. (1983) Aspects morphometriques de la tracte hepatocytaire du foie humain normal. Biol. Cell. 47: 239 242.

94. Hoek J.B. (1994) Mitochondrial energy metabolism in chronic alcoholism . Curr. Topics. inBioenerg. 17: 197 — 241.

95. Jikko A., Taki Y., Nakamura N., Tanaka J., Kamiyama Y., Ozawa K., Tobe T. (1984) Adenylate energy charge and cytochrom a (+a3) in the cirrhotic rat liver. J. Surg. Res. 37: 361 368.

96. Joliot P., Joliot A. (1994) Mechanism of electron transfer in the cytochrome b/f complex of algae: evidence for a semiquinone cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(3): 1034- 1038.

97. Johnson L.V., Walsh M.L., Chen L.B. (1980) Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77(2): 990 -994.

98. Jonson D., Lardy H. (1969) Isolation of liver or kidney mitochondria. In: Methods in Enzymology. N.-Y.: Acad. Press. 10: 94 96.

99. Kessl J.J., Moskalev N. V., Gribble G. W., Nasr M., Meshnick S.R., Trumpower B.L. (2007) Parameters determining the relative efficacy of hydroxy-naphthoquinone inhibitors of the cytochrome bcl complex Biochim. Biophys. Acta. 1767(4): 319 326.

100. Kim HJ., Odenthal S., Bruckner J.V. (1990) Effect of oral dosing vehicles on the acute hepatotoxicity of carbon tetrachloride in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. 102: 34-49.

101. Knox W.E. (1976) Enzyme pattern in fetal, adult and neoplastic rat tissues. 2nd ed. Basel: S.Karger, 324 p.

102. Korshunov S.S., Krasnikov B.F., Pereverzev M.O., Skulachev V.P. (1999) The antioxidant functions of cytochrome c. FEBS Lett. 462: 192 198.

103. Kotlyar A.B., Sled F.D., Burbaev D.S., Moroz I.A., Vinogradov A.D. (1990) Coupling site I and the rotenone-sensitive ubisemiquinone in tightly coupled submitochondrial particles. FEBS Lett. 264(1): 17-20.

104. Kowaltowski A.J., Vercesi A.E. (1999) Mitochondrial damage induced by conditions of oxidative stress. Free Radic. Biol. Med. 26: 463 — 71.

105. Koyama K, Takagi Y., Ito K, Sato T. (1981) Experimental and clinical studies on the effects of biliary drainage in obstructive jaundice. Am. J. Surg. 142: 293-299.

106. Krähenbühl S., Stucki J., Reichen J. (1989) Mitochondrial function in carbon tetrachloride-induced cirrhosis in the rat: qualitative and quantitative defects. Biochem. Pharmacol. 38: 1583 1588.

107. Krähenbühl S.,Reichen J., Zimmermann A., Gehr P., Stucki J. (1990) Mitochondrial structure and function in CCl4-induced cirrhosis in the rat. Hepatology. 12: 526 532.

108. Krähenbühl S., Brass E.P. (1991) Fuel homeostasis and carnitine metabolism in rats with secondary biliary cirrhosis. Hepatology. 14: 927 — 934.

109. Kràhenbiihl S., Stucki J., Reichen J. (1992 b) Reduced activity of the electron transport chain in liver mitochondria isolated from rats with secondary biliary cirrhosis. Hepatology. 15: 1160- 1166.

110. Krahenbuhl S., Reichen J. (1993) Decreased hepatic glucose production in rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis. J. Hepatol. 19: 64 — 70.

111. Kus L, Colakoglu N., Pekmez H., Seckin D., Ogeturk M., Sarsilmaz M: (2004) Protective effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rats. Acta. Histochem. 106: 289 -297.

112. Page R.N., Cheeseman K.H., Osman N., Slater T.F. (1988) Lipid peroxidation in purified plasma membrane fractions of rat liver in relation to the hepatoxicity of carbon tetrachloride. Cell. Biochem. Funct. 6: 87-99.

113. Maarse A.C., Grivell L.A. (1987) Nucleotide sequence of the gene encoding the 11-kDa subunit of the ubiquinol-cytochrome-c oxidoreductase in Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 165(2): 419 425.

114. Mailer K. (1990) Superoxide radical as electron donor for oxidative phosphorylation of ADP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170: 59 -64.

115. Masson S., Scotte M, Francois A., Coeffier M., Provot F., Hiron M., Teniere P., Fallu J., Salier J.P., Daveau M. (1999) Changes in growth factor and cytokine mRNA levels after hepatectomy in rat with CCl4-induced cirrhosis. Am J Physiol. 277: G838 846.

116. Matsumoto T., Kawakami M. (1982) The unit-concept of hepatic parenchyma. Are-examination based on angioarchitectural studies. Acta Pathol. Jpn. 32:285 -314.

117. Meyer-Alber A., Hartmann H., St AM® el F., Creutzfeldt W. (1992) Mechanism of insulin resistencein CCl4-induced cirrhosis of rats. Gastroenterology. 102:223-229.

118. McLennan H.R. Degli Esposti M. (2000) The contribution of mitochondrial respiratory complexes to the production of reactive oxygen species. J. Bioenerg. Biomembr. 32: 153 162.

119. Mion F., Galoun A., Agosto E., Minaire Y. (1996) Carbon tetrachloride-induced cirrhosis in rats: influence of the acute effects of the toxin on glucose metabolism. Hepatology. 23: 582 588.

120. Misra H.P., Fridovich I. (1972) The generation of superoxide radical during the autoxidation of hemoglobin. J. Biol. Chem. 247(21): 6960 6962.

121. Mitchell P. (1975) The protonmotive Q cycle: a general formulation. FEBS Lett. 59(2): 137- 139.

122. Möller B., Dargel R. (1984) Structural and functional impairment of mitochondria from rat livers chronically injured by thioacetamide. Acta. Pharmacol. Toxicol. 55: 126 32.

123. Mossman T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survive: application to proliferation cytotoxity assays. J. Immunol. Methods. 65: 55-63.

124. Nalecz M.J., Azzi A. (1985) Functional characterization of the mitochondrial cytochrome b-cl complex: steady-state kinetics of the monomeric and dimeric forms. Arch. Biochem. Biophys. 240(2): 921 —931.

125. Nicholls D.G., Ferguson S.J. (1992) Bioenergetics 2. London: Academic Press.

126. Nicholls D.G., Budd S.L. (2000) Mitochondria and neuronal survival. Physiol. Rev. 80(1): 315-360.

127. Nicholls D.G. (2002) Mitochondrial function and dysfunction in the cell: its relevance to aging and aging-related disease. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 34(11): 1372- 1381.

128. Nozu F., Takeyama N., Tanaka T. (1992). Changes of hepatic fatty acid metabolism produced by chronic thioacetamide administration in rats. Hepatology. 15: 1099 1106.

129. Noyan T., Komuroglu U., Bayram I., Sekeroglu M.R. (2006) Comparison of the effects of melatonin and pentoxifylline on carbon tetrachloride-induced liver toxicity in mice. Cell Biol. Toxicol. 22(6): 381 -391.

130. Okazaki I., Maruyama K. (1985) Formation of liver fibrosis to cirrhosis from the aspect of collagen degradation. Exp. Pathol. 28: 137 138.

131. Omokawa S., Koyama K., Suzuki K., Asanuma Y. (1989) Mitochondrial function of isolated rat hepatocytes from normal and cirrhotic liver. Tohoku. J. Esp. Med. 158:256-258.

132. Onori P., Morini S., Franchitto A., Sferra R., Alvaro D., Gaudio E. (2000) Hepatic microvascular features in experimental cirrhosis. J. Hepatol. 33: 555-563.

133. Ortega-Sáenz P., Pardal R., García-Fernandez M., López-Barneo J. (2003) Rotenone selectively occludes sensitivity to hypoxia in rat carotid body glomus cells. J Physiol. 548(Pt 3): 789 800.

134. Packer L., Weber S.U., Rimbach G. (2001) Molecular aspects of alpha-tocotrienol antioxidant action and cell signalling. J. Nutr. 131: 369S — 373S.

135. Quistorff B., Romert P. (1989) High zone-selectivity of cell permeabilization following digitonin-pulse perfusion of rat liver. A re-interpretation of microcirculatory zones. Histochemistry. 92: 487 — 498.

136. Ragan C.I. (1990) Structure and function of an archetypal respiratory chain complex: HA^H-ubiquinone reductase. Biochem. Soc. Transact. 18: 513-516.

137. Raja S., Ahamed K.F., Kumar V., Mukherjee K., Bandyopadhyay A., Mukherjee P.K. (2007) Antioxidant effect of Cytisus scoparius against carbon tetrachloride treated liver injury in rats. J. Ethnopharmacol. 109(1): 41 -47.

138. Rappaport A.M., Borowy Z.J., Lougheed W.M., Lotto N. (1954) Subdivision of hexagonal liver lobules into a structural and functional unit. Anat. Rec. 119: 11-34.

139. Raza H., Robin M.A., Fang J.K., Avadhani N.G. (2002) Multiple isoforms of mitochondrial glutathione S-transferases and their differential induction under oxidative stress. Biochem. J. 366: 45 — 55.

140. Recknagel R.O., Grende E.A. (1973) Carbon tetrachloride hepatotoxicity: an exAMOle of lethal cleavage. GRC Crit. Rev. Toxicol. 2: 263 297.

141. Rich P.R., Bonner W.D. (1978) The sites of superoxide anion generation in higher plant mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 188: 206 213.

142. Romert P., Quistorff B., Behnke O. (1993) Histological evaluation of the zonation of colloidal gold uptake by the rat liver. Tissue Cell. 25: 1932.

143. Rubinstein J.L., Walker J.E., Henderson R. (2003) Structure of the mitochondrial ATO synthase by electron cryomicroscopy. EMBO J. 22(23): 6182-6192.

144. Sasse D., Spornitz U.M., Maty LP. (1992) Liver architecture. Enzyme. 46: 832.

145. Schäfer E., Dencher N.A., Vonck J., Parcej D.N. (2007) Three-Dimensional Structure of the Respiratory Chain Supercomplex I( 1)111(2)1 V(l) from Bovine Heart. Mitoch. Biochem. Oct in Press.

146. Schreiber G., Urban J., Zhringer J., Reutter W, Frosch U. (1971) The secretion of serum protein and the synthesis of albumin and total protein in regenerating rat liver. J. Biol. Chem. 246: 4531 4538.

147. Seglen P.O. (1973) Preparation of rat liver cells. Exp. Cell Res. 82: 391 398.

148. Son G., Iimuro Y., Seki E., Hirano T., Kaneda Y., Fujimoto J. (2007) Selective inactivation of NF-kappaB in the liver using NF-kappaB decoy suppresses CCl4-induced liver injury and fibrosis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293(3): G631 639.

149. Spach P.L, Herbert J.S., Cunningham C.C. (1991) The interaction between chronic ethanol consumption and oxygen tension in influencing the energy state of rat liver. Biochim. Biophys. Acta. 1056: 40 46.

150. Stock D., Gibbons C., Arechaga I., Leslie A.G., Walker J.E. (2000) The rotary mechanism of ATO synthase. Curr. Opin. Struct. Biol. 10(6): 672 679.

151. Strubelt O., Obermeier F., Siegers, C.P., Vopel M. (1978) Increased carbon tetrachloride hepatotoxicity after low-level ethanol consumption. Toxicology. 10(3): 261 -270.

152. Sun F., Huo X, Zhai Y., Wang A., Xu J., Su D., Bartlam M, Rao Z. (2005) Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121(7): 1043 1057.

153. Taketa K., Tanaka A., Watanabe A., Takesue A., Aoe H., Kosaka K. (1976) Undifferentiated patterns of key carbohydrate-metabolizing enzymes in injured livers. Acute carbon-tetrachloride intoxication of rat. Enzyme. 21: 158-173.

154. Teutsch H.F., Schuerfeld D., Groezinger E. (1999) Three-dimensional reconstruction of parenchymal units in the liver of the rat. Hepatology. 29: 494-505.

155. Teutsch H.F. (2005) The modular microarchitecture of human liver. Hepatology. 42:317-325.

156. Thurman R.G., Bradford B.U., Iimuro Y., Frankenberg M.V., Knecht K.T., Connor H.D., Adachi Y., Wall C., Arteel G.E., Raleigh J.A., Forman D.T., Mason R.P. (1999) Mechanisms of alcohol-induced hepatotoxicity: studies in rats. Front Biosci. 4: e42 46.

157. Tietze F. (1969) Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Anal. Biochem. 27(3): 502 522.

158. Tongiani R., Lopek N., Puccianelli E. (1976) Hepatocyte population dynamics during hydrocortisene and thioacetamide treatment. Histochemistry. 47: 1-21.

159. Trojanowski J.Q. (2003) Rotenone neurotoxicity: a new window on environmental causes of Parkinson's disease and related brain amyloidoses. Exp. Neurol. 179(1): 6-8.

160. Turrens J.F., Boveris A. (1980) Generation of superoxide anion by the HA^H dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochem. J. 191: 421 — 427.

161. Turrens J.F., Alexandre A., Lehninger A.L. (1985) Ubisemiquinone is the electron donor for superoxide formation by complex III of heart mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 237(2): 408-414.

162. Turrens J.F. (1997) Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.Biosci. Rep. 17: 3-8.

163. Turrens J.F. (2003) Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J. Physiol. 552: 335-344.

164. Van Remmen H., Salvador C., Yang H., Huang T.T., Epstein C.J., Richardson A. (1999) Characterization of the antioxidant status of the heterozygous manganese superoxide dismutase knockout mouse. Arch. Biochem. Biophys. 363:91 -97.

165. Vazquez-Memije M.E., Capin R., Tolosa A., El-Hafidi M. (2007) Analysis of age-associated changes in mitochondrial free radical generation by rat testis. Mol Cell Biochem. Sep in Press.

166. Videira A., Tropschug M., Wachter E., Schneider H., Werner S. (1990) Molecular cloning of subunits of complex I from Neurospora crassa. Primary structure and in vitro expression of a 22-kDa polypeptide. J Biol Chem. 265(22): 13060 5.

167. Walker J.E., Lutter R., Dupuis A., Runswick M.J. (1991) Identification of the subunits of FIFO-ATPase from bovine heart mitochondria. Biochemistry. 30: 5369 5378.

168. Walker J.E., Collinson I.R. (1994) The role of the stalk in the coupling mechanism of FIFO-ATPases. FEBS Lett. 346(1): 39 43.

169. Ward J. (2003) Mitochondria and oxygen sensing: fueling the controversy. J. Physiol. 548: 664.

170. Wang X, Cederbaum A.I. (2006) S-adenosyl-L-methionine attenuates hepatotoxicity induced by agonistic Jo2 Fas antibody following CYP2E1 induction in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 317(1): 44 52.

171. Weiss H., Friedrich Т., Hofhaus G., Preis D. (1991) The respiratory-chain НАДН dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur. J. Biochem. 197(3): 563-576.

172. Yang S., Tan T.M.C., Wee A., Leow C.K. (2004) Mitochondrial respiratory , function and antioxidant capacity in normal and cirrhotic livers following partial hepatectomy. Cell. Mol. Life Sci. 61: 220 — 229.

173. Yuki Т., Thurman R.G. (1980) The swift increase in alcohol metabolism: Time course for the increase in hepatic oxygen uptake and the involvement of glycolysis. Biochem. J. 186: 119—126.

174. Zhu W., Fung P. C. (2000) The roles played by crucial free radicals like lipid free radicals, nitric oxide, and enzymes NOS and НАДФН in CC1(4)-induced acute liver injury of mice. Free Radic. Biol. Med. 29(9): 870 — 880.

175. Zimmerman H.J. (1978) Hepatotoxicity. N.Y.: Appleton-Centaiy Crofits, 530 p.

176. Zoccarato F., Cavallini L., Alexandre A. (2004) Respiration-dependent removal of exogenous H202 in brain mitochondria: inhibition by Ca2+. J. Biol. Chem. 279: 4166-4174.

177. Wikstrom M. (1988) Protonic sidedness of the binuclear iron-copper centre in cytochrome oxidase. FEBS Lett. 231(1): 247 252.

178. Wikstrom M., Verkhovsky M.I., Hummer G. (2003) Water-gated mechanism of proton translocation by cytochrome с oxidase. Biochim. Biophys. Acta. 1604(2): 61 -65.

179. Wu J.A., Danielsson A. (1995) Detection of hepatic fibrogenesis: a review of available techniques. Scand. J. Gastroenterol. 30: 817 825.