Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная структура популяции микроводорослей как показатель ее состояния

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Функциональная структура популяции микроводорослей как показатель ее состояния"

2 ц ФЕВ

На правах рукописи УДК: 581.132.1:581.174.1

АНДРЕЕВА Марина Александровна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ЕЕ СОСТОЯНИЯ

Специальность 03.00.02 - Биофизика 03.00.16 - Экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Максимов В.Н. кандидат биологических наук, доцент Погосян С.И.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Алексеев В.В. Лаборатория возобновляемых источников энергии МГУ им. М.В. Ломоносова кандидат биологических наук, с. н. с. Микаэлян A.C., Институт Океанологии им. П.П.Ширшова.

Ведущее учреждение:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 13 марта 1997 г. в fS ч.ЗО мин. на заседании Диссертационного совета К.053.05.68 по защите дисертаций на соискание ученой crenemi кандидата наук по специальности "биофизика" в Московском Госудаствешюм Университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119899, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

МГУ.

Автореферат разослан " Т "

1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Гуляев Б.А.

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Фенотипическое разнообразие популяций - это одна из фундаментальных особенностей их организации. Систематические исследования внутривидовой изменчивости особей привели к возникновению таких широко известных направлений современной биологии, как популяционная генетика, популя-ционная биометрия, фенетика популяций (Тимофеев - Ресовский и др., 1973; Яблоков,1980; Животовский,1991). Внутрипопуляционная неоднородность (гетерогенность) особей, как морфологическая, так и физиологическая, может служить не только одной из многих экологических характеристик популяции, но и должна быть чрезвычайно чувствительным показателем состояния этой популяции, ее жизнеспособности и устойчивости к внешним воздействиям.

Между тем, при изучении популяций микроорганизмов, в частности микроводорослей, количественное описание ответных реакций микроводорослей на внешние воздействия ограничивается обычно регистрацией суммарных, интегральных показателей, таких как численность и биомасса, скорость фотосинтеза в популяции, содержание пигментов и т.п. Это связано, конечно, с очевидными методическими трудностями в измерении соответствующих индивидуальных характеристик клеток.

Современные микроспектрофотометрические и микрофлуори-метрические методы позволяют определять содержание фотосинтетических пигментов и оценивать эффективность процессов фотосинтеза в каждой отдельной клетке. Благодаря этим методам открывается путь к внедрению в экспериментальную альгологию подходов и методов фенетики популяций и популяционной биометрии. В част-

поста, оказывается возможным изучить своего рода функциональную структуру популяции, т.е. закономерности распределения клеток в культуре водорослей по фотосинтетической активности и характеристикам функционирования их фотосинтетического аппарата. Для такого исследования особенно перспективной представляется регистрация кривых индукции флуоресценции, форма которых является интегральным показателем состояния фотосинтетического аппарата клетки (Уокер,1989; Bradbury, 1984).

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение функциональной структуры популяции микроводорослей по параметрам кривых индукции флуоресценции хлорофилла, полученных от отдельных клеток и обоснование рекомендаций к использованию микрофлуориметрического метода в работах по мониторингу водных экосистем.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1). Разработать метод классификации кривых индукции флуоресценции хлорофилла, полученных от отдельных клеток популяции микроводорослей, по их параметрам.

2). Провести анализ структуры и динамики популяции микроводорослей в различных условиях среды.

3). Оценить возможность использования разработанных методических приемов для оценки состояния природных популяций микроводорослей.

Научная новизна. Впервые проведен анализ и классификация кривых индукции флуоресценции хлорофилла отдельных клеток микроводорослей с целью выяснения функционального состояния популяции. Предложен математический алгоритм для классифика-

ции индукционных кривых, позволяющий изучать структуру популяции микроводорослей как в условиях выращиваемой культуры, так и в природных условиях. Показано, что соотношение разных типов индукционных кривых в процессе роста культуры меняется. Исследовано воздействие ингибиторов фотосинтеза, используемых в качестве гербицидов - диурона и метилвиологена на форму кривых индукции флуоресценции хлорофилла.

Впервые проведен анализ состояния природных популяций микроводорослей путем измерения кривых индукции флуоресценции хлорофилла отдельных клеток популяции. Показана возможность использования микрофлуориметрического метода измерения индукционных кривых для изучения состояния природных популяций микроводорослей.

Практическое значение. На основании полученных в работе результатов предложен метод оценки состояния природных популяций микроводорослей. С помощью предложенного математического алгоритма исследованы различные формы кривых индукции флуоресценции хлорофилла и проведена их классификация.

Полученные данные расширяют возможности применения микрофлуориметрического метода для оценки природного состояния среды и могут служить методической основой для экологического мониторинга популяций микроводорослей.

Апробация работы. Основные рультаты работы были доложены на заседании секции биофизики Московского общества испытателей природы (2 марта 1995г.). Обсуждены на научных семинарах кафедры биофизики Биологического факультета МГУ; на ежегодном симпозиуме Общества физиологов растений в г. Пенза (6 февраля 1996 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методики работ, 3 глав по результатам исследований, обсуждения, заключения, выводов, списка литературных источников, включающем НО наименований. Работа изложена на /2 X страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и /с?таблицами.

объекты и методы исследований

Подготовка объектов и способ регистрации кривых индукции флуоресценции хлорофилла "а".Объектом лабораторных исследований служила культура зеленой водоросли 8сепес1е5ти5 quadгicauda из коллекции кафедры гидробиологии Биологического факультета МГУ.

Выращивание проводилось на 10% среде Тамия (Тагшуа, 1953) в колбах объемом 300 мл при температуре 27-28°С и освещении люминесцентными лампами дневного света ЛДЦ-80 при интенсивности

8 Вт/м 2. Исследования велись с двумя разными плотностями посева культуры 5сепсс1езтш quadгicauda: при количестве ценобиев

9 104 т1-1 частиц (далее обозначение условно кл./мл) в начале культивирования и с разбавленной культурой Scenedesmus я1^пса1^а, когда начальная плотность посадки была 3-Ю4 кл./мл. Численность 4-клеточных ценобиев измеряли методом прямого счета в камере Нажотта (Федоров, 1979). В той же камере проводились измерения кривой индукции флуоресценции хлорофилла при помощи люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ, оснащенного флуориметрической насадкой ФМЭЛ 1-А (ЛОМО, Ленинград,

СССР). В качестве детектора излучения использовали фотоумножитель ФЭУ-79 (МЭЛЗ, Москва, СССР), чувствительный в о бласти от 300 до 820 им. Система регистрации интенсивности флуоресценции объекта обеспечивала временное разрешение 0.1 сек. Возбуждение флуоресценции клеток осуществляли галогенопой лампой накаливания КГМ 9-70 через светофильтр СЗС-22, пропускающий только сине-зеленый участок спектра. В качестве запирающего использовали светофильтр КС-18, пропускающий излучение в области длин воли больше 670 нм. Для выбора объекта пользовались нижней подсветкой препарата светом лампы накаливания через светофильтр СЗС-22, интенсивностью меньше 0.2 Вт/м2. Интенсивность света, возбуждающего индукцию флуоресценции хлорофилла в плоскости обьекта, была выбрана 10 Вт/м2. Она соответствовала получению визуально наиболее разнообразных форм кривых индукции флуоресценции хлорофилла в предварительных экспериментах с данным видом водорослей. Диаметр фотометрируемой зоны в плоскости препарата составлял 37.5 мкм. Перед началом измерений клетки адаптировали в темноте 15-20 мин. Запись кривой индукции флуоресценции проводили в течение 200 сск.

Для изучения влияния гербицидов на функциональную структуру популяции Зсепес1е5ти5 диас1пса11с1а использовались диурон (3-(3,4-В1сЫогорЬепу1)-1,1-с11те1Ьу1игеа) концентрацией З Ю 3М и ме-тилвиологен (1,1-В1те1;Ьу1-4,4-Ырупс1тшт с!юЫопс1е), концентрация которого составляла 10~6М. За время инкубации микроводорослей Бсепес^тиз quadricauda проведено 2547 измерений индукции флуоресценции одиночных ценобиев по 50-60 штук.

В качестве объекта природных популяций использовались два вида пиридиниевых водорослей: РугосуяиБ рБеисЬпосШиса ( Атлан-

тический океан) и Ceratium fusus (Черное море). Измерение параметров индукции флуоресценции у Pyrocystis pseudonoctiluca проводились аналогично лабораторной культуре Scenedesmus quadricauda. Индукция флуоресценции каждой отдельной клетки Ceratium fusus измерялась с помощью аналого-цифрового преобразователя посеку ндно, с усреднением по 10 измерений, информация записывалась в память компьютера в течение 20 сек. Всего в изучении функциональной структуры природных популяций было иссследовано 2738 индукционных кривых.

Выбор признаков для классификации индукционных кривых. Исходными признаками, но которым оценивали форму кривых индукции флуоресценции, были величины интенсивности флуоресценции (I), измеренные в моменты времени 0, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, и 200 сек. от начала кривой.

Для формализации разбиения совокупности кривых на типы был разработан маматический алгоритм классификации индукционных кривых, который позволил обрабатывать одновременно несколько тысяч данных. В качестве переменных для оценки различных типов кривых индукции использовали разности логарифмов амплитуд в последовательные моменты времени. Таким образом, 10 исходных значений амплитуд преобразовали в 9 разностей их логарифмов: А! = ln(Iio) " ln(Io)

Д2 = ln(l2s) - Indio) и т- Д-

Анализ коэффициентов корреляции дал возможность сократить количество признаков до б, исключив из рассмотрения 7-ю г 9-ю разности логарифмов, так как коэффициенты корреляции у них были достаточно высоки: - 0.46 - 0.85.

Преобразование переменных. Для классификации был использован один из методов кластер-анализа - метод К-средних (К-means method) (Дгоран, 1977). Алгоритм этого метода не требует расчета матрицы расстояний или матрицы сходства и поэтому позволяет разбивать на группы большое число объектов.

Было произведено линейное преобразование шкал всех б признаков: для каждого признака находили минимальное и максимальное значение, Amjn и Лтах и округляли их, обозначая Д10 и А;1 соответственно. Тогда линейное преобразование имело вид:

' Д„-Дм

В табл.1 приведены минимальные и максимальные значения логарифмических разностей, найденные для исходного массива, содержащего результаты

Таблица 1.

Минимальные и максимальные значения разностей логарифмов исходных переменных кривых индукции флуоресценции хлорофилла

Scenedesmus quadricauda

измерения 2547 кривых индукции. На основе этих значений были получены формулы для преобразования исходных данных в новые переменные д ¡: Д, = (Д1 + 1.7)/1.7 л2 = (А2 + 0.9)/1.3 д3 = (АЗ + 0.6)/1.3 Д4 = (Д4 + 0.4)/1.0 д5 = (Д5 + 0.1)/0.6 Д6 = (Д6 + 0.1)/0.5

Amin Ащах

Ai 1.729 0.000

Д2 0.860 0.475

А3 0.636 0.380

А.1 0.353 0.597

А3 0.143 0.543

лб 0.133 0.369

Выбор критерия классификации кривых индукции в метоле К-средних. Метод К-средних предусматривает априорное задание числа кластеров. В связи с этим, небходимо было провести несколько вариантов расчетов с разным числом кластеров. Был проведен анализ по методу К-средних для 7, 8, 9, 12, 18, 48, 100 кластеров. Результаты дисперсионного анализа кластеризации на 7, 8, 9, 12, 18, 48, 100 показали во всех случаях высокую значимость различий между кластерами, показав тем самым, что дисперсионный анализ в нашем случае не может служить достаточным критерием качества кластеризации,

В качестве критерия "удачности" кластеризации было предложено отношение среднего межкластерного евклидова расстояния (Е)

Таблица 2.

Результаты группировки массива данных. Критерии

кластеризации.

Количество Среднее Среднее Отношение Количество

кластеров расстояние расстояние Ь/Н кластеров,

между от центра содержащих

кластерами кластера до менее 10

( Ь ), отн.ед. крайнего элементов

элемента

(Н), отн.ед

7 0.3949 0.1616 2.4437 0

8 0.4027 0.1452 2.7734 0

9 0.4263 0.1554 2.7432 1

12 0.4496 0.1387 3.2415 3

18 0.4988 0.1325 3.7645 3

48 0.6073 0.1058 5.74 12

100 0.5464 0.0882 6.195 42

к среднему евклидову расстоянию от центров кластеров до их крайних элементов (н). В таблице 2 представлены результаты кластер-

1, отн.ед. I, отн.ед.

25 1 25(

20« 20( 2

15<)\ 15 \

10С

5 5С

С 0 50 100 150 200 1 Э 50 100 150 200

время, с время.с

I, отн.ед. I, отн.ед.

200 250

гоо 3 200 160 \ 4

100 100 V

50 —' 50 ——-

с 5 50 100 1Ь0 200 0 50 100 1ЬО 200

время, с время.с

I, отн.ед. I, отн.ед.

25С 250

?£Х 5 200 \ 6

15! 150

50 б"

С 50 100 150 200 ° 50 100 1Й0 200

время, с время.с

1, отн.ед. I, отн.ед.

200 Л 7 200 8

100 50 \ ^ 100 $0 --

50 100 153 200 "Э 60 100 150 200

время, с время.с

Рис.1. Типы кривых индукции

флуоресценции хлорофилла.

анализа с разным количеством кластеров. Видно, что отношение С./Н растет с ростом числа кластеров, но при числе кластеров более 9 появляются кластеры с очень малым (1-3) числом элементов, что снижает эффективность статистического анализа. Таким образом, по вышеназванным критериям наиболее "удачным" является разделение имеющегося массива данных на 8 кластеров.

На рис.1 представлены типы кривых индукции флуоресценции хлорофилла цено-биев 5сепеёеБти5 quadricauda, полученные при их разделении

на 8 кластеров. Все типы кривых индукции визуально различаются, что убеждает в правильности выбранных способов обработки первичных данных.

функциональная структура лабораторной популяции зсепесЬзтиз диаёпсаиёа в различных условиях культивирования Особенности функциональной структуры популяции

Бсет^еятия quadгicauda при культивирования с разной плотностью посадки. Получение 8 типов кривых индукции флуоресценции дало возможность, сравнивая относительное обилие клеток каждого типа

на разных этапах роста культуры, изучить динамику изменения функционального сотояния популяции (табл.3).

Таблица 3.

Соотношения типов индукционных кривых в процессе роста культуры Зсспесквтиэ quadricauda (плотность посева 9 104кл./мл)

Сопоставление динамики роста культуры (рис.2) с изменением соотношения типов кривых индукции показывает, что на стадии экспонециально-го роста присутствуют практически все типы кривых, с преобладанием б-го

типа; линейный рост сопровождается увеличением вначале 3-го типа и уменьшением количества б-го типа, далее 3-й тип смеяется 5-м до почти полного преобладания последнего над остальными (91-95%). На стадии замедления роста преобладает 6-й тип (около 70-80%), как и в начале культивирования, наблюдаются остальные типы кривых индукции, указывая тем самым на увеличение гетерогенности популяции при небольшой скорости роста.

сут. культив Типы индукционных кривых,%

1 2 3 4 5 6 7 8

4 9.8 0.0 15.7 11.8 7.8 54.9 0.0 0.0

5 2.0 0.9 16.0 6.4 3.7 71.0 0.0 0.0

6 0.0 6.0 46.0 0.0 4.0 44.0 0.0 0.0

10 21.2 5.8 51.9 0.0 3.9 17.3 0.0 0.0

12 0.0 0.0 0.0 4.0 95.0 1 .0 0.0 0.0

14 0.0 0.0 0.0 2.8 91.0 6.2 0.0 0.0

19 0.0 0.0 0.0 0.0 79.3 20.8 0.0 0.0

21 0.0 0.0 0.0 7.8 58.8 31.4 2.0 0.0

24 0.0 0.0 0.0 0.0 37.5 62.5 0.0 0.0

26 0.0 0.0 2.6 0.0 18.4 79.0 0.0 0.0

28 0.0 0.0 0.0 0.0 8.6 91.4 0.0 0.0

31 0.0 0.0 0.0 0.0 18.2 81.8 0.0 0.0

33 0.0 0.0 0.0 0.0 18.2 81.8 0.0 0.0

35 0.0 4.2 0.0 0.0 8.3 87.5 0.0 0.0

38 0.0 0.0 8.5 0.0 19.2 72.3 0.0 0.0

40 0.0 0.0 11.1 2.8 13.9 72.2 0.0 0.0

42 0.0 0.0 8.3 0.0 11.1 80.6 0.0 0.0

45 0.0 3.2 3.2 6.5 3.2 83.9 0.0 0.0

47 0.0 2.7 10.8 2.7 2.7 81.1 0.0 0.0

49 0.0 7.4 11.1 0.0 11.1 70.4 0.0 0.0

52 2.9 0.0 8.7 2.9 14.3 71.4 0.0 0.0

Количество клеток в 1 мл, 105 20

15--

10--

Количество клеток в 1 мл, 105

4

4 5 6 7 8

сут. культивирования

40 50 60

сут. культявир овання

Рис.2 Динамика численности культуры Зсепеёеэшиз quadricauda при разных условиях культивирования:

▼ - при плотности посадки 9 104 кл/мл, А -с диуроном (9-1О4 кл/мл), X - с метилвио-логеном (9 104 кл/мл), ® - при плотности посадки 3104 кл/мл.

В опыте с культурой малой плотности посадки скорость прироста была существенно ниже (рис. 2) и рост численности так же сопровождался изменением соотношения типов кривых индукции флуоресценции. Лаг-фаза характеризовалась преобладанием 2, 3, 6-го типов, причем количество 2-го типа уменьшалось от 50 до 9%, а содержание 3-го и 6-го соответственно увеличивалось (табл.4). Фаза линейного роста сопрвождалась увеличением доли 5-го и 4-го типов. Далее рост культуры происходил с постепенным увеличением доли 5-го и 6-го типов, что было сходным с развитием той же культуры

большей плотности посева, причем к концу эксперимента происходила замена 5-го типа 6-м до почти полного его пребладания (95.8%) над остальными ти-иами.

Таблица 4. Соотношения типов индукционных кривых в процессе роста культуры Бсепескэтиз quadricauda (плотность посева 3 104 кл./мл).

сут. культив. Типы индукционных кривых, %

1 2 3 4 5 6 7 8

1 7.7 50.0 26.9 0.0 0.0 15.4 0.0 0.0

2 10.3 37.9 27.6 1.7 3.5 19.0 0.0 0.0

3 2.0 20.0 46.0 0.0 0.0 32.0 0.0 0.0

4 2.6 9.2 34.2 15.8 5.3 32.9 0.0 0.0

6 2.9 5.9 29.4 29.4 11.8 20.6 0.0 0.0

8 0.0 12.8 31.9 17.0 14.9 19.2 2.1 2.1

9 9.5 7.1 28.6 17.3 9.5 28.6 0.0 2.4

И 13.2 34.2 18.4 7.9 10.5 15.8 0.0 0.0

12 12.0 18.0 26.0 22.0 6.0 16.0 0.0 0.0

15 17.9 7.1 17.9 0.0 39.3 17.9 0.0 0.0

16 5.9 0.0 0.0 5.9 61.8 23.5 0.0 3.0

20 5.9 0.0 8.8 0.0 26.5 58.8 0.0 0.0

22 3.7 0.0 7.4 0.0 14.8 74.1 0.0 0.0

23 0.0 0.0 4.2 0.0 0.0 95.8 0.0 0.0

При культивировании с диуроном концентрацией 3-10 5М численность клеток, начиная со вторых суток культивирования, практически не менялась и составляла 90 105 кл./мл.

При добавлении диурона наблюдалось резкое замедление роста культуры (рис.4) и преобладание 8-го типа кривой индукции на вторые сутки культивирования (67.7%). Гибель всех клеток в присутствии диурона происходила на четвертые сутки с начала культивирования. Форма кривой индукции флуоресценции (8-й тин) отражает полную инактивацию фотосинтетического аппарата у клеток микроводорослей в результате блокирования оттока электронов от акцепторной части фотосистемы II к фотосистеме I при добавлении диурона. Однако, наблюдение индукционных кривых на 60 день опыта выявило присутствие в пробе ценобиев с индукционными кривыми типов 2, 3, 5, т.е. кривых, характерных для культуры в начале ее развития и в случае культуры с малой численностью вследствие

13

Таблица 5.

Соотношение типов индукционных кривых при действии диурона на растущую культуру Бсепескхтиз quadгicauda.

разбавления при пересадке (см. табл. 4). Это обстоятельство указывает на тот факт, что некоторые клетки способны адаптироваться к действию гербицида, поддерживая высокую эффективность функционирования фотосинтетического аппарата и, т.о. сохранять жизнеспособность популяции.

сут. культив. Типы индукционных кривых, %

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2.0 0.0 2.9 11.8 8.6 0.0 6.9 67.7

4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100

7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100

16 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100

60 0.0 9.1 9.1 0.0 9.1 0.0 0.0 72.7

При исследовании действия метилвиологена на растущую культуру 8сепе(1е5ши5 quadricauda (концентрация метилвиологена составляла 10"бМ) динамика токсического эффекта, как и в опыте с диуроном, характеризовалась замедлением роста (см. рис.4) и существенным изменением функциональной структуры популяции микроводорослей (табл.6). Увеличение доли 7-го типа сопровождалось прекращением роста культуры (см. рис.2). Характерная форма кривой индукции 7-го типа (см.рис.1),"сре

Таблица 6.

Соотношение типов кривых при действии метилвиологена на растущую культуру 5сепе(1е$тиз

quadгicauda.

сут. культив. Типы индукционных кривых, %

1 2 3 4 5 6 7 8

2 28.0 8.0 12.0 22.7 9.3 10.7 9.3 0.0

3 0.0 10.6 0.0 31.6 26.3 0.0 31.6 0.0

4 0.0 0.0 5.3 52.6 5.3 0.0 36.8 0.0

5 0.0 23.1 7.7 23.1 0.0 0.0 46.2 0.0

6 5.0 15.0 5.0 25.0 5.0 5.0 40.0 0.0

13 7.4 14.9 11.1 11.1 3.7 0.0 48.2 3.7

16 0.0 0.0 4.6 36.4 9.1 0.0 50.0 0.0

24 0.0 0.0 0.0 26.7 6.7 0.0 66.7 0.0

25 0.0 0.0 0.0 6.7 6.7 0.0 86.7 0.0

26 0.0 0.0 1.6 13.1 19.7 0.0 52.5 13.1

29 8.3 0.0 0.0 50.0 0.0 0.0 33.3 8.3

35 20.0 0.0 0.0 22.5 27.5 0.0 20.0 10.0

43 32.0 24.0 0.0 20.0 20.0 0.0 4.0 0.0

44 63.6 9.1 0.0 18.2 9.1 0.0 0.0 0.0

51 26.9 26.9 15.4 11.5 19.2 0.0 0.0 0.0

-занность в точке максимальной флуоресценции (Р), может быть обусловлена интенсивным оттоком электронов от фотосистемы II к фотосистеме I под действием метилвиологена. Индукционные кривые 8-го типа, отражающие инактивацию фотосинтетического аппарата и преобладавшие в опыте с диуроном, в случае действия метилвиоло-геном наблюдались, за небольшим исключением, только с 26-го дня воздействия (13.11%), причем их появление пропорционально связано с уменьшением доли 7-го типа, что позволяет сделать предположение об утрате части клеток с индукционной кривой 7-го типа фотосинтетической активности. При дальнейшем инкубировании в присутствии метилвиологена наблюдалось постепенное увеличение вклада 1, 4, 5 типов индукционных кривых, свидетельствующее о восстановлении фотосинтетической активности клеток после повреждений, вызванных метилвиологеном.

анализ результатов исследования функциональной структуры популяции Scenedesmus quadricauda в различных условиях культивирования.

Для удобства анализа данных, приведнных в табл.3-6 мы провели еще один кластер-анализ, используя в качестве меры сходства т.н. манхеттенскую метрику (МНМ):

МНМ =]Г(р,-р1к),

где pik - относительное обилие k-ro типа клеток в г-й день, р^ - то же, но в /-й день.

В экологической практике эта мера хорошо известна (Whittaker, 1980) под названием "процентная разница". Она широко используется при оценке сходства видового состава сообществ. По-

скольку аналогия между таксономическим составом сообщества и типологическим составом популяции вполне оправдана, нам кажется оправданным и выбор данной меры сходства.

Результат кластеризации, т е. наглядное представление матрицы манхеттенских расстояний, мы получили с помощью метода не-

координата2 1.5

■0.0 -0. -0.1 -0. -02 -0. -0.3

sc1_47^ ____sc1 49

----------- 7SC1_52 Js/cl-38

scf26^

-1 -0.95 -0.9 -0.85 -0.8 -0.75 -0.7 -0.65 координата!

О 0.5 1

координата!

Рис.3. Проекция в обобщенных координатах 8-ми мерного образа, отражающего динамику структуры популяции Scenedesmus quadricauda в различных условиях культивирования: du - с диуроном, mv - с метилвиологеном, sel - при плотности посева 9 104кл./мл, se2 - при плотности посева 3101 кл./мл. Цифрами обозначены дни культивирования по порядку._

метрического многомерного шкалирования в пространстве 2-х измерений (рис.3). Расстояния между точками на этой диаграмме линейно скоррелированы с манхеттенскими расстояниями между соответствующими пробами. Над каждой точкой поставлена цифра, указывающая, в какой день от начала опыта взята соответствующая проба. Ломаная линия, соединяющая точки в хронологическом порядке, образует своего рода "траекторию популяции" в пространстве обобщенных переменных.

Соотношение динамики численности ценобиев с процентным содержанием в пробе ценобиев, принадлежащих к каждому из 8 типов кривых индукции флуоресценции, позволяет установить связь между функциональной структурой популяции и ее динамикой но дням культивирования (рис.2). Полученные результаты позволяют предположить возможность прогнозирования динамики численности микроводорослей по данным об их типологическом составе.

применение метода классификации кривых индукции флуоресценции хлорофилла "а" для оценки функционального состояния природных популяций микроводорослей.

Для определения возможности использования разработанного метода классификации индукционных кривых были обработаны данные природных популяций РугосуэНз рзеиёопосШиса и Сегаиит й^ив. Учитывая тот факт, что флуоресценция хлорофилла "а" не видоспецифична, кластер-анализ, как и у лабораторной популяции Зсепеёезтив яиас1псаис1а, проводился на 8 типов. Сравнение форм кривых индукции лабораторной культуры Бсепеёезтиз quadricauda и природной популяции РугосуБИБ рьеисктосШиса подтвердило их сходство. Однородность по данным химического анализа мест оби-

тания РугосуБ^ь рэе^опосЫиса основание объединить данные по горизонтам 15, 50, 80, 150 метров для последующего анализа структуры популяции по разным глубинам.

Проекция распределений типов кривых индукции флуоресценции отдельных клеток РугосуяиБ рвеиёопосШиса по разным глубинам, полученная аналогично проекции функциональной структуры популяции Зсепеёеэтиз quadricauda демонстрирует различия структуры популяции на разных горизонтах(рис.4).

координата 2

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

координата 1

Рис.4. Проекция функциональной структуры популяции РугосуБ^Б рэеисЬпосШиса, полученная для разных горизонтов. Цифры обозначают номер станции и горизонт.

Точки, соединенные ломаной линией, относящиеся к одинаковым глубинам у разных станций, образуют достаточно автономные области, показывающие границы горизонтов данного участка акватории.

Преимущество такого рода представления данных состоит в возможности аппроксимации на эту проекцию анонимной пробы того же вида водорослей и определением таким образом горизонта отбора

пробы, и, наоборот, зная глубину взятия пробы можно предположить характер соотношения типов кривых индукции, т.е. функциональную структуру популяции.

Таблица 7.

Соотношение типов индукционных кривых у Ругосузиврэеи^ЬпосШиса на разных горизонтах.

Типы индукционных кривых,%

горизонт 1 2 3 4 5 6 7 8

до 15 м 2.4 19.3 16.9 15.7 24.1 16.9 3.6 1.2

50 м 0.0 5.4 24.7 9.7 21.5 26.9 3.2 8.6

80 м 0.0 5.6 51.9 0.0 13.0 0.0 9.3 20.4

150 м 0.0 8.5 42.4 0.0 0.0 0.0 15.3 33.9

Распределение типов кривых индукций по заданным горизонтам представлено в табл.7. Видно, что состояние природных популяций отличается от состояния водорослей в культуре наличием 7-го типа кривой индукции на всех горизонтах (от 3.61% на горизонте 15 м до 15.25% на 150 м). В целом же распределение типов кривых в природной популяции Pyrocystis pseudonoctiluca имеет много общего с картиной соотношения типов индукций, полученой в эксперименте с малой плотностью культуры Scenedesmus quadricauda (табл.5).

Следует отметить уменьшение гетерогенности популяции Pyrocystis pseudonoctiluca с увеличением глубины и преобладание на горизонте 150 м кривых 2, 3, 7-го типов, характеризующих, по нашим данным, низкую эффективность фотосинтеза.

С использованием того же алгоритма, была исследована функциональная структура популяции Ceratium fusus. Имея данные химического анализа вод на станциях отбора Ceratium fusus, мы условно разделили их на "чистые" и "грязные", основываясь на показаниях диска Секки и содержании азота в воде (в форме мочевины). Так, в "грязных" водах прозрачность по диску Секки была 4

19

Таблица 9. Соотношения типов шщукциошшх кривых природной популяции СегаЬ'ит Лкиэ

Типы индукционных к ривых,%

горизонты 1 2 3 4 5 6 7 8

"чистые" Юм 6.4 10.9 16.5 18.5 17.5 17.7 4.5 8.0

"чистые" 75 м 5.8 0.0 21.2 9.6 23.1 19.2 5.8 15.4

"грязные" Юм 6.5 7.1 11.6 15.5 11.0 12.3 20.0 16.1

"грязные" 25 м 1.7 3.6 16.1 14.7 16.6 21.5 9.2 16.6

метра, а количество азота в 50100 раз превышало таковое в "чистых" водах.

На иаш взгляд, пред-

ставляет интерес то, что в "грязных" водах в верхнем горизонте (до 10 м) часть кривых индукции (16.1%) относится к 8-му типу (табл.9), т.е. клетки водорослей находятся в инактивированном состоянии. На глубине 25 метров соотношение типов кривых становится сходным с таковым в "чистых" водах.

Следующая проекция в обобщенных координатах функциональной структуры популяции Сегаишп ^иБ (рис.5), сделанная суммарно по всем глубинам, наглядно демонстрирует как соотносятся между собой в координаттпом пространстве "чистые" станции

координата2 0.8

0.6 -

0.4

0.2

0

-0 4

-1 -0 5 0 0.5

координата!

Рис.5. Проекция в обобщенных координатах траектории функциональной структуры популяции Сега^ит Ь^иБ. (Горизонты суммированы, цифрами обозначен номер станции).

(3793 - 3801) и "грязные" (3810 -3811). Такого рода проекция показывает возможность применения предложенного анализа для быстрого тестирования участков акватории.

обсуждение результатов

Гетерогенность клеток в популяции демонстрируется разбиением всего массива данных на кластеры, характеризующиеся соответственными различными между собой формами кривых.

Методы математического моделирования позволяют найти те константы скоростей, при которых наблюдаются те или иные изменения кинетической кривой индукции. В исследованом диапазоне состояний функционирования клеток в популяции Бсепескзтиз quadricauda применение математической модели показало, что во всех случаях изменения кривой флуоресценции на протяжении развития и роста культуры наблюдаются при изменении константы скорости потребления АТФ в цикле Кальвина (Лебедева, 1994). Индукционные кривые с низким стационарным уровнем флуоресценции наблюдаются при относительно высоких скоростях использования АТФ в цикле Кальвина. Если эти скорости становятся небольшими, то АТФ накапливается в системе и уровень флуоресценции увеличивается вследствие замедления потока электронов и накопления восстановленного хинонного акцептора, что соответствует низкой эффективности фотосинтеза.

В эксперименте с разбавленной культурой в начале инкубации преобладали кривые 1, 2, 3 и б-го типов (табл.5), из которых 1, 2, 3 типы имеют высокий стационарный уровень флуоресценции (рис.1) за счет небольших скоростей использования АТФ в цикле Кальвина и накопления АТФ в системе вследствие замедления пото-

ка электронов. С увеличением плотности культуры пропорционально возрастала доля 6-го и 5-го типов, имеющих относительно высокую скорость использования АТФ в цикле Кальвина.

Математические модели, рассматривающие взаимодействие световых и темповых стадий фотосинтеза на основании представлений о физико-химических процессах, протекающих на фотосинтетической мембране и в строме хлоропласта, показывают возможность триггер-ного перехода из одного состояния фотосинтетического аппарата в другое (Плюснина,1994).

Такого рода триггерные переходы из состояния, когда стаци-нарньтй уровень флуоресценции высок в состояние с низким стационарным уровнем флуоресценции и наоборот, происходят, согласно модели, при больших скоростях использования АТФ в цикле Кальвина. У Бсепеёезтиз quadricauda в различных условиях культивирования наблюдается резкое изменение соотношений типов кривых. Так, переход из стадии лаг-фазы в стадию экспоненциального роста сопровождался вытеснением преобладающего 6-го типа индукционной кривой с низким стационарным уровнем флуоресценциии кривыми 1-го и 3-го типов с высоким стационарным уровнем (табл.3, рис.1). Следующее замедление скорости роста культуры от экспоненциального до линейного характеризовалось обратным переходом клеток из состояния с высоким стационарным уровнем (типы 1-3) в состояние с низким стационарным уровнем (тип 5) (рис.1).

В соответствии с экпериментальными данными, у активно растущих в благоприятных условиях водорослей доля типов с высокой фотосинтетической активностью (типы 5 и 6) максимальна, причем 5-й тип кривой характерен для периода экспоненциального роста культуры , а 6-й - линейного.

Снижение доли одного тина кривых индукции происходит с соответствующим увеличением доли других, что свидетельствует о переходе клеток микроводорослей из одного состояния в другое. Спустя два месяца после полного отравления популяции диуроном, 30% клеток восстановило фотосинтетическую активность. В эксперименте с метилвиологеном из табл.6 видно, что после воосстановле-ния фотосинтетической активности популяцией, происходит переход почти 60% клеток из состояния с 1-м типом кривой в состояние, которое отражает 2-й тип кривой индукции флуоресценции, с соответственным, по модели, увеличением скорости потребления АТФ в цикле Кальвина.

Итак, клетки могут совершать переход из одного состояния в другое сообразно условиям среды с изменением константы скорости потребления АТФ.

Приведенные на примере опытов с диуроном и метилвиологеном, характерные для воздействия этих гербицидов типы кривых могут служить для диагностики токсикологического состояния популяции микроводорослей. Проекция 8-ти мерного образа структуры популяции в обобщенных координатах также может быть использована для тестирования функционального состояния популяции Бсс'песк'зтиз quadricauda.

Гетерогенность клеток природных популяций уменьшается с глубиной и при наличии загрязняющих веществ, т.е. при неблагоприятных условиях. У популяции РугосуБиБ рзег^опосШиса доля активно фотосинтезирующих клеток - с 5-м и 6-м типом кривых индукции - выше, чем у обитающей в черноморской акватории СегаШт ГиэиБ, что тоже является показательным для оценки экологического состояния исследуемых районов.

Проведенные на лабораторной культуре и на природных популяциях исследования показали реальную возможность использования разработанного нами метода классификации и анализа кривых индукции флуоресценции хлорофилла для анализа функциональной структуры популяции и оценки экологического состояния водной среды.

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый подход к оценке состояния популяции микроводорослей на основе анализа кривых индукции флуоресценции хлорофилла "а", полученных от отдельных клеток микроводорослей микрофлуориметрическим методом. Показано, что изменения состояния популяции микроводорослей сопровождаются характерными модификациями распределения клеток по фотосинтетическим показателям, проявляющимися в изменении степени гетерогенности, ас-симетрии распределений.

2. Разработан алгоритм, на основе методов многомерного статистического анализа, позволяющий классифицировать кривые индукции флуоресценции хлорофилла "а", полученные от отдельных клеток микроводорослей одного вида по 7 линейно не скоррелированным параметрам интенсивности флуоресценции в фиксированный момент времени. По соотношению типов кривых индукции флуоресценции в пробе предложено оценивать функциональное состояние популяции микроводорослей.

3. Изменение скорости роста культуры сопровождается быстрой сменой соотношений типов кривых индукции флуоресценции в популяции. Применение математической модели для описания различных форм кривых индукции флуоресценции хлорофилла дает

возможность предположить триггерный механизм переключения участков лимитирования электрон-транспортной цепи фотосинтеза.

4. Распределение клеток в популяции микроводорослей в присутствие гербицидов (диурона, метилвиологена) смещается в сторону уменьшения гетерогенности за счет преобладания клеток, кривые индукции флуоресценции которых, имеют форму, характерную для воздействия этих гербицидов и отражающую нарушение фотосинтетических процессов в этих клетках.

5. Применение разработанного метода оценки функционального состояния популяции на природном материале показало сходство структуры природных популяций микроводорослей и лабораторной культуры малой плотности посева в медленной фазе роста. Онару-женные отличия структуры популяции на участках акватории разной степени загрязненности показали возможность применения предложенного метода для мониторинга водных экосистем.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. .Погосян, С.И., Лебедева Г.В., *Сивченко М.А., Ризниченко Г.Ю. Анализ динамики распределения микроводорослей по типам кривых медленной индукции флуоресценции в процессе роста скляночной культуры. / III Съезд Всероссийского общества физиологов растений. Санкт-Петербург, Май, 1993. Тез. докл. Р. 699.

2. Сивченко М.А., Погосян С.И., Максимов В.Н. Исследование функциональной структуры популяции микроводорослей Scenedesmus quadricauda./B сб. МОИП, Биофизика, 1996 - в печати.

* Фамилия автора до вступления в брак.

3. Lebedeva G.V., Riznichenko G.Yu, Pogosyan S.I., Sivchenko M.A. Modeling of interaction between primary and secondary photosynthesis processes in microalgae cells./ In: Seventh Congress on Biomathematics. Buenos Aires. October, 23-27, 1995. Abstacts of communications. P 28.

4. Lebedeva G.V., Riznichenko G.Yu, Pogosyan S.I., Sivchenko M.A. Mathematical model of interaction between primary and secondary photosynthesis processes in microalgae cells./ In: Seventh Congress on Biomathematics. Buenos Aires. October, 23-27, 1995. Proceedings.

5. Погосян С.И., Лебедева Г.В., Сивченко M.А., Максимов В.Н., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Типизация клеток водорослей по параметрам флуоресценции хлорофилла (Эксперименты и модели)./ Физико-химические основы физиологии растений. Пенза, 5-8 февраля, 1996. Тез. докл. С. 40.

6. Погосян С.И., Сивченко М.А., Максимов В.Н. Физиологическая гетерогенность популяции микроводорослей. Классификация цено-биев Scenedesmus quadricauda по типам кривых индукции флуоресценции хлорофилла./ Извест. РАН, Сер. биологическая, 1996, № 3, С. 337-343.

7. Riznichenko G.Yu, Lebedeva G.V., Pogosyan S.I., Sivchenko M.A., Rubin A.B. Fluorescence induction curves registration from individual microalgae cenobiums in the processes of population growth./ Photosynthesis Research, 1996, v. 5, P. 151-157.

8. Pogosyan S.I., Sivchenko M.A., Maximov V.N. Physiological heterogeinity of algal population: classification of Scenedesmus quadricauda cenobia by the features of their photosynthetic apparatus./Oceanología, PAN, 1996 - in print.