Формирование радиальной системы микротрубочек в интерфазных клетках млекопитающих: роль динеина и протеинкиназы LOSK

Коваленко, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Формирование радиальной системы микротрубочек в интерфазных клетках млекопитающих: роль динеина и протеинкиназы LOSK
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Формирование радиальной системы микротрубочек в интерфазных клетках млекопитающих: роль динеина и протеинкиназы LOSK"

На правах рукописи

КОВАЛЕНКО ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

ФОРМИРОВАНИЕ РАДИАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ МИКРОТРУБОЧЕК В ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ: РОЛЬ ДИНЕ И НА И ПРОТЕИНКИНАЗЫ ЬОБК

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории биологии цитоскелета отдела функциональной биохимии биополимеров НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Ведущая организация:

Елена Сергеевна Надеждина

Наталья Александровна Глушанкова Игорь Викторович Коробко

Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится К февраля 2006г. в ч. на заседании

диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992 г. Москва, Ленинские горы, стр.1, корп.1, Биологический факультет МГУ, ауд.

Ж.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан /3 января 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

T^F"

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для большинства интерфазных клеток млекопитающих характерна радиально-симметричная система микротрубочек (МТ): МТ отходят от центра организации (ЦОМТ) к периферии клетки. При этом в ЦОМТ располагаются минус-концы, а по периферии - плюс-концы МТ. Радиальная сеть МТ необходима для организации внутриклеточного движения органелл по эцдоцитозному и экзоцитозному пути, для поддержания поляризованной формы клеток при их передвижении по субстрату и для функциональной компартментализации клетки.

Центром радиальной сети МТ в животной клетке является центросома, представленная парой центриолей и окружающим их перицентриолярн ым материалом. На центросоме происходит нуклеация МТ (Moudjou et al., 1996; Stearns and Kirschner, 1994) и их заякоривание (связывание их минус-концов) (Mogensen et al., 1997; Mogensen et al., 1999; Quintyne et al., 1999; Mogensen et ai, 2000; Bornens et al., 2002; Dammermann and Merdes, 2002). Молекулярные механизмы этих процессов, также как и функции многих белков перицентриолярного материала, до сих пор остаются неясными. Был опубликован ряд работ, показывающих, что дисфункция многих белков с центросомной локализацией ведёт к утрате центросомой функции центра организации МТ. В частности, это было показано для динеин-динактинового комплекса (Quintyne et al., 1999) и для протеинкиназы LOSK (по данным, полученным ранее в лаборатории).

МТ на центросоме. Разрушение радиальной сети МТ при ингибировании динеина ранее объясняли тем, что динеин доставляет в центросому ее функционально важные белки, и при дисфункции динеина происходит деплеция центросомы по этим белкам (Young et al., 2000). Поэтому важным представлялось исследовать ранние эффекты ингибирования динеина в клетках, когда деплеция центросомы по функционально важным белкам еще маловероятна.

Выраженность радиальной сети МТ в клетках бывает разной: в одних типах клеток она почти строго радиальная, а в других - значительно более хаотичная. Это заставляет предположить, что степень радиальности сети МТ регулируется клеткой. Вероятно, что в регулировании радиальной сети МТ могут принимать участие протеинкиназы, связанные с центросомой и МТ. Протеинкиназы - одно из самых обширных белковых суперсемейств эукариот, насчитывающее до тысячи представителей. Протеинкиназы катализируют реакцию переноса у-фосфатной группы АТФ (или ГТФ) на спиртовые группы серина/треонина (или фенольную группу тирозина) в белках для образования фосфомоноэфиров. Большинство протеинкиназ - минорные клеточные белки, которые удается идентифицировать только молекулярно-биологическими методами. Однако экспериментально вызванная дисфункция многих протеинкиназ ведет к фатальным последствиям для клеток. Протеинкиназы регулируют клеточный цикл, дифференцировку, метаболические пути, морфогенез, участвуют в цепях передачи внутриклеточых сигналов и в запуске апоптоза.

Ранее идентифицированная в нашей лаборатории серин-треониновая протеинкиназа LOSK (LOng Ste20-like Kinase) ассоциирована с МТ и центросомой (Zinovkina et al., 1997), и были получены предварительные данные о том, что ингибирование функций LOSK приводит к нарушению радиальной организации системы МТ в клетках. Это позволило предположить, что LOSK является протеинкиназой, участвующей в процессе регулирования организации радиальной системы МТ.

Цели и задачи исследования. Работа направлена на выяснение молекулярных механизмов формирования сети интерфазных МТ клеток, в том числе на выяснение молекулярных механизмов функционирования центросомы. Целями работы было определение роли динеина и его кофактора динактина в работе центросомы, а также установление участия протеинкиназы LOSK в формировании радиальной системы МТ. В рамках этих двух направлений исследований нами были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Подобрать способы ингибирования динеина и динактина, подходящие для прижизненных исследований системы интерфазных микротрубочек.

2. Исследовать методами видео- и иммунофлуоресцентной микроскопии, как изменяется система МТ интерфазной клетки на ранних сроках после ингибирования динеина и динактина.

3. Исследовать влияние ингибирования динеина и динактина на МТ-нуклеирукмцую способность центросомы in vivo.

4. Исследовать влияние ингибирования динеина и динактина на ассоциацию с центросомой ее функционально важных белков - у-тубулина, перицентрина, найнеина, динеина и динактина.

5. Установить, одинаково ли ингибирование динеина влияет на систему МТ в различных периодах интерфазы, а также выяснить, стабильно ли ассоциирован динеин с центросомой в интерфазе.

6. Выяснить возможное влияние структурных частей молекулы протеинкиназы LOSK на фосфотрансферазную активность ее каталитического домена; установить, обладает ли мутант K63R доминантно-негативным действием.

7. Изучить влияние подавления функции протеинкиназы LOSK на актиновые стресс-фибриллы и на систему интерфазных МТ.

8. Исследовать влияние ингибирования функции протеинкиназы LOSK на ассоциацию у-тубулина, перицентрина, динеина и динактина с центросомой.

9. Идентифицировать субстрат протеинкиназы LOSK среди белков, ассоциированных с центросомой.

10. Установить участок взаимодействия с МТ в молекуле протеинкиназы LOSK.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе получены принципиально новые, мирового уровня результаты, позволяющие по-новому взглянуть на механизмы работы центросомы, на процесс формирования радиальной системы МТ в интерфазных клетках животных, а также на функции цитоплазматического динеина. Впервые показано, что подавление активности динеина, приводящее к дезорганизации системы МТ в интерфазе, не влияет на МТ-нуклеирующую способность центросомы. Продемонстрировано, что ингибирование протеинкиназы LOSK также приводит к дезорганизации интерфазных МТ, причем вероятной мишенью LOSK является кофактор динеина динактин. Эти данные впервые показывают роль белкового фосфорилирования в регуляции сети интерфазных МТ. Впервые получены данные, что белок

динактинового комплекса pl50(Glued) является субстратом протеинкиназы LOSK. Установлено, что участок связывания микротрубочек расположен в С-концевой части молекулы протеинкиназы LOSK.

Полученные в диссертационной работе результаты существенны для понимания регуляции цитоскелета, структуры, определяющей форму и подвижнось животных клеток. Они могут послужить основой для дальнейших исследований молекулярных механизмов формирования радиальной системы интерфазных МТ, а также функций молекулярного мотора динеина. Приведенные в работе данные могут быть использованы для поиска фармакологических препаратов нового поколения, а также в учебном процессе в курсах клеточной и молекулярной биологии.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на расширенном заседании лаборатории биологии цитоскелета отдела функциональной биохимии биополимеров НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ от 25 октябра 2005 г. Результаты работы были доложены на EMBO/EMBL конференции по центросоме и полярному тельцу (Гейдельберг, Германия, 2002), EMBO/EMBL конференции «Рубежи исследований цитоскелета» (Tocay, Австрия, 2003), 1 съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, Россия, 2003), 8-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века» (Пущино-на-Оке, 2004), 45й ежегодной конференции Американского общества клеточных биологов (Сан-Франциско, США, 2005), а также на Московском городском семинаре по клеточной биологии (2004), на семинарах группы клеточной биологии Института белка РАН и лаборатории биологии цитоскелета НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова.

Публикации. По теме диссертации опубликованно 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация написана по традиционному плану. Рукопись включает главы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы». В рукописи приведено подборок оригинальных

микрофотографий, диаграмм и £ таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Антитела. В работе использовали коммерчески доступные моноклональные антитела (монАТ) DM1A к а-тубулину (Sigma), монАТ GFP-20 к зеленому флуоресцентному белку (green fluorescent protein - GFP (Sigma)), монАТ к ацетилированному тубулину (Sigma), монАТ 74.1 к промежуточной цепи динеина (Covance Research Products Inc.), монАТ к pl50(Glued) (BD Biosciences), монАТ к

p50 (BD Biosciences), кроличьи поликлональные AT (полАТ) к перицентрину (Abeam), найнеину (Abeam), ACTRl/Arpl (Abeam), маннозидазе-И, маркеру аппарата Гольджи (Abeam), козьи полАТ к pl50(Glued) (Abeam). Кроличьи полАТ к гамма-тубулину, к тирозилированному тубулину и к тяжелой цепи динеина были любезно предоставлены д.б.н. В.И. Родионовым, кроличьи полАТ к GFP - к.б.н. А.В. Бураковым. Для непрямого флуоресцентного окрашивания использовали AT против иммуноглобулинов мыши, коньюгированные с Alexa-488 (Molecular Probes), против иммуноглобулинов кролика, коньюгированные с родамином (KPL Inc.), а так же AT против иммуноглобулинов мыши, кролика или козы, коньюгированные с FITC, TRITC или Су5 (Jackson Immunoresearch).

ДНК. Полноразмерная кДНК протеинкиназы LOSK и кДНК отдельных фрагментов этой киназы были ранее клонированы в лаборатории в векторах pGEX2T (Amersham Bioscience), pEGFPCl и pEGFPC2 (Clontech). Плазмиды pEGFP-Centrin2 и pEGFP-EBl были любезно предоставлены д.б.н. В.И. Родионовым.

Оборудование и компьютерные программы. В работе использовали микроскоп Axiophot (Zeiss) с 12-битной видеокамерой CCD MicroMax (Roper Scientific), объективы Plan-Neofluar ЮОх, Plan-Apochromat 40x, Plan-Apochromat 63x, а также инвертированный микроскоп Nikon Eclipse 300, снабжённый системой терморегуляции Biopteh, с использованием объективов Plan хЮО, 1.25 N.A., and PlanApo х40, 1.4 N.A., CCD-камера с 512x512 чипом (СН350, Photometrix), микроинъектор и микроманипулятор (Eppendorf), центрифуги Beckman J2-21 и Optima TLX. Полученные данные обрабатывали специализированными компьютерными программами Metamorph (Universal Imaging), Adobe Photoshop CS (Adobe Systems Inc.), Scion Image (Scion Corporation), WinView 32 (Princeton Instruments), SPSS (SPSS Inc.), Exel 2003 (Microsoft Inc.).

Работа с белками. Для исследования протеинкиназной активности LOSK использовали слитый с GST рекомбинантный каталитический домен 1-342аа LOSK-ДТ, очищенный методом ионообменной хроматографии на глутатион-агарозе. Протеинкиназную реакцию проводили в присутствии [у-иР] АТФ (ГНЦ РФ ФЭИ Обнинск) с добавлением либо неспецифического белкового субстрата (myelin basic protein - МВР); либо предполагаемых белковых субстратов.

Работа с культивируемыми клетками. Клетки культур Vero (эпителий почки зеленой мартышки), CV-1 (фибробласты почки зеленой мартышки), COS-1 (фибробласты почки зеленой мартышки с постоянной экспрессией большого Т-

антигена вируса SV-40) вели при стандартных условиях (37°С, содержание С02 в среде - 5%).

Для липосомных трансфекций использовали реагенты Мультифектин и Унифектин-56 (Унифект), Lipofectamin 2000 (Invitrogen), Fugenö (Roche), которые применяли по инструкции производителя. Для трансфекций методом микроинъекции в цитоплазму клеток инъецировали водный раствор плазмидной ДНК в концентрации 25 мкг/мл.

Для непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания клетки фиксировали и окрашивали описанными выше антителами по стандартным методикам.

Для прижизненных экспериментов клетки рассаживали на ДТСЗ Bioptechs чашки, предназначенные для поддержания постоянной температуры (Bioptech). Чтобы визуализировать в живых клетках систему МТ, клетки микроинъецировали раствором очищенного тубулина, конъюгированного с флуорохромом СуЗ (Amersham). Для уменьшения фотоповреждения клеток в среду культивирования добавляли раствор оксиразы (Oxyrase Company) и её субстрат - молочную кислоту (Sigma).

Интерфазные клетки с ярко выраженным радиальным расположением МТ инъецировали монАТ 74.1, очищенным рекомбинантным белком динамитином (любезно предоставленным д.б.н. В.И.Родионовым), монАТ к pl50(Glued) и, в качестве контроля, неиммунными монАТ. Концентрация раствора монАТ 74.1 и монАТ к pl50(Glued) неиммунных монАТ в капилляре микроинъектора составляла 5 мг/мл; раствора динамитина - 20-25 мг/мл. Видеоклип снимали в течение 60-100 минут после инъекции. Время между кадрами составляло 1 минуту, выдержка - 0,5 или 1 секунду.

Для анализа МТ-нуклеирующей активности центросомы использовали клетки, экспрессирующие белок GFP-EB1, в которых подсчитывали количество GFP-EB1-«комет», отходящих от центросомы в минуту.

Содержание белков в центросоме подсчитывали путем измерения интенсивности флуоресценции центросомы при иммунофлуоресцентном окрашивании AT к тому или иному белку. Для этого изготовляли 12- или 16-битовые микрофотографии окрашенных препаратов (объектив ЮОх). С помощью программного обеспечения Metamorph вокруг центросомы обводили окружность диаметром 10 pxl, высчитывали среднюю интенсивность флуоресценции в этом круге, и из нее вычитали среднюю интенсивность флуоресценции по 10 значениям фона вне клетки. Подсчеты проводили минимум для 30 клеток. Среднее значение интенсивности флуоресценции в контрольных клетках

принимали за 100%. Иногда измерения проводили с помощью программы Scion Image. Для этого изображения инвертировали, и далее проводили измерения как описано выше. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ WinView32 и SPSS.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Экпериментальные подходы к исследованию формирования и поддержания радиальной организации МТ в интерфазных клетках. Для установления роли динеина в формировании и поддержании радиальной организации МТ в интерфазных клетках Vero, CV-1 мы визуализировали эндогенные МТ путем микроинъекции СуЗ-тубулина. 1-2 часа спустя повторно инъецировали клетки с ярко выраженным радиальным расположением МТ ингибиторами динеина и прослеживали изменения в состоянии сети МТ.

В настоящей работе использовали два пути ингибирования активности динеина. Один из них заключался в разрушении динактинового комплекса избытком динамитина (Echeverri et al., 1996; Wittman et al., 1999). Считается, что разрушение динактинового комплекса приводит к нарушению связи динеина с грузом, и тем самым ингибирует динеин-зависимый транспорт в клетке. Из-за того, что этот путь ингибирования активности динеина косвенный, возможна неоднозначная интерпретация результатов. Известно, что часть цитоплазматического динеина и динактина локализованы в центросоме, но до сих пор остается неясным, находятся ли они в центросоме в комплексе между собой. У динеина, кроме сайта связывания с белком динактинового комплекса plSO(Glued), установлен сайт взаимодействия с центросомным белком перицентрином (Purohit et al., 1999; Tynan et al., 2000). Динактин может связываться с центросомой через центросомный белок Сер135 (Uetaki et al., 2004). Полагали, что он непосредственно участвует в связывании и закреплении МТ на центросоме (Quintyne et al., 2002), поскольку CAP-Gly домен plSO(Glued) субъединицы динактина может связывать МТ In vitro. Т.о., при инъекции в клетки рекомбинантного динамитина возникала вероятность того, что нарушение радиальной системы МТ может произойти вследствие диссоциации от центросомы динактинового комплекса, связывающего МТ. Исключить подобный механизм воздействия избытка динамитина мы не могли, поэтому поставили контрольный эксперимент, инъецировав клетки непосредственно монАТ к pl50(Glued). Эти AT связываются с N-концом молекулы pl50(Glued), где расположен МТ-связывающий CAP-Gly домен, тем самым ингибируя способность динактина связывать МТ (King et al., 2000).

Второй подход к ингибированию динеина заключался в микроинъекции монАТ 74.1 к промежуточной цепи динеина, которые специфично ингибируют динеин-зависимый транспорт мембранных органелл вдоль МТ (Paschal et al., 1992; Steffen et al., 1997). Методом иммунопреципитации было установлено, что связывание этих монАТ с промежуточной цепью динеина не блокирует взаимодействие динеина с динактином (д.б.н В.И.Родионов, персональное сообщение). Т.о., мы полагали, что монАТ 74.1 специфично и непосредственно выключают активность динеина. Для отслеживания неспецифических эффектов, возникающих при введении мышиных монАТ в клетку, в качестве контроля использовали неиммунные мышиные монАТ (Sigma).

Влияние ингибирования активности динеина путем микроинъекции монАТ 74.1 и рекомбинантного динамитина на радиальную организацию МТ в интерфазных клетках. Микроинъекции в клетки монАТ 74.1 (5 мг/мл) или рекомбинантного динамитина (20-25 мг/мл) приводили к распаду радиальной системы МТ в течение 40-60 мин (рис.1 А, Б). В клетках исчезал четкий центр схождения МТ (рис.1 А, нижняя линиями падала интенсивность флуоресценции СуЗ-тубулина в районе центросомы (рис.1 Б). Для количественной оценки воздействия клетки разделили на две визуально оцениваемые группы: с радиальной и с хаотической системой МТ. Статистический анализ выявил, что динамитин индуцировал примерно двукратное, а монАТ 74.1 — трехкратное уменьшение количества клеток с выраженной радиальностью сети МТ по сравнению с контрольными неиньецированными клетками (р<0.01) (рис.1В). Инъекция неиммунных монАТ или монАТ к plSO(Glued) не имели столь явно выраженного эффекта на организацию МТ (р>0.01) (рис.1А-В). Эти данные подтвердили наше предположение о том, что эффект воздействия ингибиторов динеина специфический. Т.о. мы пришли к заключению, что активность цитоплазматического динеина требуется для поддержания радиальной организации МТ в интерфазных клетках.

Содержание основных белков перицентриолярного материала в центросоме после воздействия ингибиторов динеина. Разрушение радиальности МТ при воздействии ингибиторов динеина можно было бы объяснить уменьшением или прекращением доставки на центросому ее белков, отвечающих за нуклеацию и заякоривание минус-концов МТ на центросоме, вследствие нарушения динеин-опосредованного транспорта. Чтобы проверить такую возможность, мы инъецировали клетки ингибиторами динеина, а затем определяли содержание в центросоме ее основных белков: у-тубулина, перицентрина и найнеина; а также

НеиммАТ 74.1 АТ Динамитин р150АТ

"4 t ' зг

W 20 / у* ■ f Jf * с^ШИР 20 ^ 1.

1<" 42 у / • тШ- wjífaF 43 40

УШм, ^¡г 58 59 4"^'' /

LA .А

10 20 30

100 «о

60 40 20

1 2 3 4 5

Рнс.1. Распад радиальной системы МТ в клетках Vero (А), инъецированых (слева направо): неиммунными монАТ, монАТ 74.1, рекомбинантным динамитином, монАТ к plS0(GIued). В нижнем правом углу указано минуты после инъекции. МТ выявлены с помощью СуЗ-тубулина. Приведены графики интенсивности флуоресценции на линии, проведенной через центросому клеток (Б). Процент клеток, сохранивших радиальное распределение МТ (В). 1 - без инъекции, 2 - после инъеции неиммунными монАТ, 3 - мон АТ 74.1, 4 - рекомбинантным динамитином, 5 - монАТ к pl50(Glued). Шкала -10 цт.

Таблица 1. Содержание в центросоме ее функционально важных белков в клетках, инъецированных монАТ 74.1 или рекомбинантным динамитином, и в клетках, экспрессирующих ОТТ-ШЭК-ДТ или СРР-ЬОЗК-ДТ-КбЗЯ.

Опыт Белок Неимм AT 74.1 AT динамитин LOSKAT LOSKAT-K63R

у-тубулин 105.7±6.9 96.Ш3.5 88.1±8.4 85.4±5.7 92.7±5.9

перицентрин 98±9.1 123.4±11.3 62.3±5* 70.3±9.3 73.9±9.3

найнеин 97.5±8.4 109.3±8.3 72.4±4.1* N/A N/A

DHC 105.4±6.3 107.2±7.7 65.5±5.4* 51±5.4* 78.5±7.1

Arpl 92.7±6 97.7±7.1 89.6±7.8 N/A N/A

P150(Glued) 110.3±7.4 84±6.5 64±4.7* 127±8.9 72±6*

динамитин N/A N/A N/A 81±9.3 57.5±5.8*

Привезено (среднее ± стандартная ошибка) в % от контроля, * - достоверное отличие от контроля (р<0.01), К/А - не определяли.

динеина (DHC - dynein heavy chain) и субъединиц динактина (pl50(Glued) и Arpl) по описанной выше методике.

Мы обнаружили, что вышеперечисленные центросомные белки, а также центросомный динеин и субьединицы динактина сохраняют связь с центросомой в клетках, инъецированных монАТ 74.1 или рекомбинантным динамитином. Однако измерение интенсивности флуоресценции центросомы показало, что в случае микроинъеции рекомбинантного динамитина в клетках статистически достоверно снижался центросомный пул перицентрина, найнеина, pl50(Glued) и DHC по сравнению с контрольными неинъецированными клетками (р<0.01) (таб.1). Содержание у-тубулина и белка динактинового комплекса Arpl достоверно не отличалось (р>0.01) от контрольных клеток (таб.1). Истощение центросомного пула белков при избыточном количестве динамитина в цитоплазме может быть результатом ингибирования динеин-опосредованного транспорта этих белков по МТ к центросоме или же следствием потери центросомой целостности из-за разрушения динактинового комплекса, который может играть структурную роль в центросоме.

В случае инъекции монАТ 74.1 центросомный уровень у-тубулина, перицентрина, найнеина, pl50(Glued), Arpl и динеина по сравнению с контрольными неинъецированными клетками (таб.1) достоверно не отличался, (р>0.01). Т.о., в случае инъекции монАТ 74.1 быстрый развал радиальной сети МТ нельзя объяснить ингибированием внутриклеточного динеин-зависимого

транспорта основных компонентов центросомы по МТ или нарушением структурной целостности центросомы.

Влияние ингибиторов динеина на нуклеашио МТ на центросоме. Так как ранее было показано, что динеин может участвовать в нуклеации микротрубочек in vitro (Malikov et al., 2004), мы решили проверить, влияют ли ингибирование динеина или диссоциация динактинового комплекса на МТ-нуклеирующую активность центросомы. Известно, что белок ЕВ1 специфически связывается с растущими (плюс) концами МТ. Чтобы измерить уровень нуклеации МТ на центросоме, в клетках Vero экспрессировапи белок ЕВ1, слитый с GFP. Трансфицированные клетки инъецировали ингибиторами динеина, и через 60-90 минут после воздействия вели наблюдение.

Рнс.2. «Кометы» из белка GFP-EB1 вокруг центросомы ¡слетки Vero (А), инъецированных (слева направо) неиммунными монАТ, монАТ 741, рекомбинантным динамитином На диаграмме показано среднее число «комет», возникающих за 1 минуту (Б) в клетках: 1 -неинъецированных, 2 - инъецированных неиммунными монАТ, 3 - монАТ 74.1, 4-рекомбинантным динамитином. Шкала -10 цт.

Мы выяснили, что как в контрольных, так и в инъецированных ингибиторами динеина клетках «кометы» ЕВ1 образуются в одной или двух точках (рис.2А), а затем быстро двигаются по направлению к периферии. Подсчитывая количество образованных de novo флуоресцентных точек, отходящих от центросомы, мы смогли оценить уровень нуклеирующей активности центросомы. Статистический анализ показал, что средняя частота образования новых МТ на центросоме (появления «комет» из GFP-EB1) статистически не отличается (р>0.01) в контрольных и инъецированых ингибиторами динеина клетках (рис.2Б). Т.о., подавление активности динеина или диссоциация динактинового комплекса не влияли на уровень нуклеации МТ на центросоме.

Ассоциация динеина с центросомой в интерфазе. При изучении воздействия монАТ 74.1 на интерфазную организацию системы МТ было замечено, что 20% инъецированных клеток обладали устойчивостью, то есть в таких клетках радиальность сети МТ не была разрушена (Рис.1 В). В

предшествующих работах было показано, что центросома обогащается динеином в поздней S - G2-периодах интерфазы в клеточном цикле, и предполагалось, что динеин аккумулируется на центросоме, когда клетка приближается к митозу, для обеспечения функции фокусирования МТ в полюсах веретена деления (Quintyne et al., 2002). Устойчивость фракции клеток к монАТ 74.1 могла коррелировать с отсутствием динеина на центросоме в ранней интерфазе. Чтобы проверить необходимость активности динеина для сохранения организации МТ на протяжении всей интерфазы, мы трансфицировали клетки плазмидой, несущей вставку кДНК белка, ассоциированного с центриолями центросомы, центрина-2, слитого с GFP; и подсчитывали количество флуоресцирующих точек -центриолей - в трансфицированных клетках. Мы обнаружили, что в клетках Vero содержатся 2 или 4 центриоли, и предположили, что клетки с 2 центриолями находятся в Gl или ранней S-фазе клеточного цикла, а с 4 центриолями - в поздней S-фазе или в G2. Чтобы оценить количество ассоциированного с центросомой динеина, клетки, экспрессирующие центрин-GFP, фиксировали и окрашивали AT к DHC. Оказалось, что динеин, связанный с центросомой, присутствует во всех клетках Vero, и содержание центросомного DHC в 2х- и 4х-центриолярных клетках достоверно не различается (р>0.01) (рис.ЗА). Т.о., мы заключили, что динеин ассоциирован с центросомой в клетках Vero как в S/G2, так и в G1/S.

Бч

центриоли 4 цеатршми

2 цс&трноош 4 центриоли

Рис.3. Динеин ассоциирован с центросомой на протяжении всей интерфазы в клеточном цикле (А) и ингибирование его активности вызывает разрушение радиальной системы МТ в любой из периодов (Gl, S или G2) интерфазы (Б) А - средняя интенсивность флуоресценции центросомального пула динеина, выявленного иммунофлуоресцентным окрашиванием, в клетках Vero, экспрессирующих центрин-GFP и содержащих или 2, или 4 центриоли. Б -среднее количество клеток, экспрессирующих центрин-GFP и содержащих или 2, или 4 центриоли, в которых не сохранилась радиальная организация МТ после инъекции монАТ 74.1

Для подтверждения предположения о том, что активность динеина требуется для сохранения радиальной структуры сети МТ на протяжении всей

интерфазы, мы инъецировали монАТ 74.1 в клетки с маркированными GFP-центрином центриолями, фиксировали клетки через 1 час и окрашивали AT к тубулину. Подсчеты показали, что инъекция монАТ 74.1 разрушает организацию МТ в клетках как с двумя, так и с четырьмя центриолями (р>0.01) (Рис.ЗБ). Т.о., активность динеина требуется для поддержания радиальной системы МТ в клетках Vero на протяжении всей интерфазы.

Ферментативная активность протеинкиназы LOSK in vitro, доминантно-негативный мутант и участок связывания ее с МТ. Ранее было показано, что фрагмент LOSK-ДТ обладает фосфотрансферазной активностью in vitro (Потехина и др., 2003). Из сопоставления структуры каталитического домена LOSK с известными каталитическими доменами других протеинкиназ (Hardie and Hanks, 1995) мы сделали вывод, что лизин-63 участвует в ориентации а, р - фосфатных групп молекулы АТФ. По аналогии с другими протеинкиназами (Li et al., 1995), точечная замена лизина-63 на аргинин должна привести к нарушению ориентации АТФ в активном центре киназы, не оказывая влияние на субстрат-связывающую способность каталитического центра. Т.о., КбЗЯ-мутант должен связывать АТФ и субстрат, но фосфотрансферазная реакция не может пройти. Подобная мутация обычно является доминантно-негативной.

ш) с

] LOSK

дт

К63Я дт 4TAN Ml М2 — CI

Рис.4. Строение молекулы протеинкиназы LOSK и использованные в работе фрагменты молекулы.

Экспрессированный в E.coli и очищенный на глутатион-агарозе фрагмент LOSK-AT-K63R, слитый с GST, не обнаруживал какой-либо протеинкиназной активности (рис.5А, 2, 2'). Более того, его пятикратный избыток полностью подавлял ферментативную активность GST-LOSK-AT (Рис.5А, 6, 6'). Слитый с GST каталитический домен, с транкированным N-концом, LOSK-ANAT, а также другие фрагменты протеинкиназы GST-LOSK-M1 и GST-LOSK-M2, не обнаруживали протеинкиназной активности (не показано), но и не подавляли

Консервативный Вариабельный Скрученная

каталитический домен видоспецифический домен спираль

N I__ 300 600 900

шик

активность С8Т-Ь08К-ДТ (рис.5Б). Фрагмент С8Т-Ь08К-М1 даже усиливал активность фермента (рис.5Б). Эти данные показывают, что эффект Ь08К-ДТ-К63Я является специфическим доминантно-негативным. В наших экспериментах нам не удалось подтвердить ингибирующее действие С-концевой части ЬОБК на активность фермента, предполагавшееся ранее в работах других авторов (БаЬоипп я/., 2000).

-LOSK

-МБР

GST-LOSK-AT + - + + + + +- + + + + GST-LOSK-AT-K63R - 03 015 03 0.6 15 - 03 015 03 06 15

ПЛАТ РА 1 2 i 2"

ПЛАТ РА 1 2 1 t

GST -LOSK.-A\'Al

GST-LOSK-M2

GST-LOSK.-M1

(GST-LOSK-Ct ► МБР

Рис.5. Влияние мутанта LOSK-K63-AT (А) и отдельных фрагментов молекулы протеинкиназы LOSK на активность ее каталитического домена (Б) А' 1-6 - Кумасси окрашенный ПААГ, 1'-6'-радиоавтограф к ПААГ. Каждая пробирка содержала 0 5 мкг МБР и 0 3 мкг LOSK-ДТ, кроме 2, 2' колонок с 0.3 мкг LOSK-AT-K63R. 3-6 and 3-6' - было добавлено 0.1S, 0.3, 0.6 and 1.5 мкг LOSK-AT-K63R соответственно. LOSK - указывает LOSK-ДТ и/или GST-LOSK-AT-K63R. Б: 1,2 - ПААГ, окрашенные Кумасси, Г, 2'- радиоавтографы к этим гелям 1, Г - в пробу были добавлены LOSK-ДТ (обозначен ki) и МБР; 2, 2' - LOSK-ДТ, МВР и фрагмента LOSK (подписаны слева и указаны толстой стрелкой)

Влияние инактивации протеинкиназы LOSK на систему МТ. Сродство С-концевого фрагмента LOSK к МТ. Ранее в нашей лаборатории было показано, что клетки, экспрессирующие активный GFP-LOSK-ДТ или транкированный GFP-LOSK-ANAT киназный домен, содержат нормальную систему МТ, которая не отличается от таковой в контрольных клетках. Совершенно иную картину

наблюдали в клетках с инактивированной LOSK в случае экспрессии доминантно-негативного фрагмента GFP-LOSK-AT-K63 R. В таких клетках радиальная организация системы МТ была нарушена кардинальным образом: мы не обнаружили в большинстве клеток ни радиального расположения МТ, ни видимых центров организации. Известно, что подобью изменения могут быть вызваны стабилизацией МТ, что часто случается при экспрессии в клетках МТ-связывающих белков (Takemura et al., 1995; Bu and Su, 2001). Поэтому мы проверили содержание в трансфицированных клетках ацетилированного тубулина, характерного для стабильных МТ. Оказалось, что при экспрессии в клетках GFP-LOSK-ДТ или GFP-LOSK-AT-K63R количество ацетилированных МТ не отличалось от контроля (Рис.6, верхняя и средняя панели). При экспрессии же в клетках GFP-LOSK-Ct количество ацетилированных МТ возрастало, но эти МТ часто сохраняли свое радиальное расположение (рис.6). К тому же четко определялась со-локализация GFP-LOSK-Ct с МТ. Вместе с данными по со-осаждению этого фрагмента с экзогенными МТ (не приведены), мы получили доказательства того, что связь протеинкиназы LOSK с МТ осуществляется через С-концевой участок.

GFP

АцТуб

Рнс.6. Ацетилированный тубулин в клетках Vero, экспрессирующих (слева направо) GFP-LOSK-ДТ, GFP-LOSK-AT-K63R, GFP-LOSK-Ct На верхней панели показана флуоресценция GFP, на нижней - имммунофлуоресцентное окрашивание на ацетилированный тубулин В маленьком квадрате указаны места отчетливой со-локолизации с МТ. Шкала -10 цю

Влияние инактивации протеинкиназы LOSK на Формирование актиновых стресс-Фибрилл в интерфазных клетках. Поскольку способность протеинкиназы LOSK влиять на систему актинового цитоскелета была продемонстрирована в предыдущих работах (Sabourin et al., 2000), мы решили проверить возможность опосредованного влияния реорганизации актинового цитоскелета на нарушение радиальной организации сети МТ. Для этого мы изучили распределения актиновых стресс-фибрилл в клетках с инактивированной функцией протеинкиназы LOSK. Клетки Vero с экспрессией GFP-LOSK-ДТ и GFP-LOSK-AT-K63R были окрашены родамин-фаллоидином. В качестве контроля использовали клетки, трансфицированные пустым вектором pEGFPC2 и экспрессирующие GFP.

Рис.7. Актиновые стресс-фибриллы в клетках Vero при экспрессии в них GFP, GFP-LOSK-ДТ, GFP-LOSK-ДТ-K63R. На диаграмме показано распределение клеток по степени выраженности в них актиновых стресс-фибрилл' 1, 2,3 -объяснения в тексте

GFP

LOSK ДТ LOSK K65R ДТ

В таких клетках было выявлено три популяции клеток: 1) с развитыми стресс-фибриллами, занимающими всю площадь клетки; 2) с укороченными, тонкими стресс-фибриллами, или занимающими только часть площади клетки; 3) практически без стресс-фибрилл. Подсчеты показали, что в случаях экспрессии и ОРР-ШвК-ДТ, и ОРР-ЬОвК-ДТ-КбЗЯ, и вРР, доля клеток с тем или иным вариантом выраженности стресс-фибрилл достоверно не отличалась (р>0.01) (рис.7). Это означает, что ни активная протеинкиназа, ни ее инактивированная модификация не влияли на состояние актиновых стресс-фибрилл, что говорит о специфичности эффекта влияния инактивированной Ь08К именно на систему МТ.

Влияние инактивации протеинкиназы Ь05К на содержание основных белков центросомы. Идентификация нового субстрата протеинкиназы ЬР8К. Поскольку было показана специфичность влияния ингибирования протеикиназы Ь08К на систему интерфазных МТ, мы предположили, что подобные фатальные

изменения могли произойти вследствие потери целостности центросомы и/или потери ассоциации с ней функционально-важных белков.

контроль

ЬОЯК-ДТ

ШНК-ДТ-КбЗЛ

Рнс.8. Белки, ассоциированные с центросомой при ингибировании активности ЬОЯК Выявлены иммунофлуоресценцией.

Мы решили попытаться выяснить, отличаются ли центросомы в контрольных клетках и в клетках, синтезирующих 0РР-Ь08К-ДТ, от центросом в клетках, синтезирующих СРР-Ш8К-ДТ-К63Л, по содержанию основных белков. Оказалось, что в клетках, экспрессирующих вРР-ШвК-ЛТ или СРР-Ь08К-ДТ-К63Я, содержание у-тубулина и перицентрина достоверно не отличалось (р>0.01) от контрольных нетрансфицированных клеток (рис.8, таб.1). Клетки с экспрессией ОРР-ЬОвК-ДТ-КбЗЯ статистически достоверно отличались от контроля по содержанию в центросомах белка динактинового комплекса р150(С1ие<1) (р<0.01), а также другого компонента этого комплекса - динамитина (р<0.01): экспрессия СРР-ЬОЗК-ДТ-КбЗЯ вызывала резкое снижение содержания в центросомах этих белков (рис.8, табл.1). Интересно, что количество центросомного динеина достоверно снижалось в клетках с экспрессией СРР-Ь08К-ДТ (р<0.01) и достоверно не отличалось от контроля (р>0.01) в клетках с экспрессией СРР-Ш8К-ДТ-К63Я (рис.8, табл.1).

Исходя из полученных данных, мы предположили, что субстратом изучаемой протеинкиназы могут быть динеин или динактиновый комплекс. Для

проверки этой гипотезы провели киназную реакцию с рекомбинантным очищенным каталитическим доменом LOSK и очищенными препаратами динеина и динактина. Оказалось, что белок динактинового комплекса pl50(Glued) является субстратом протеинкиназы LOSK in vitro (рис.9). Остальные белки динактинового комплекса (рис.9) и пептиды, входящие в состав динеина, субстратами LOSK не являются (не приведено).

Рис.9. Протеинкиназа LOSK фосфорилирует белок pl50(Glued) in vitro 1, 2 - Кумасси окрашенный ПААГ, Г, 2'- радиоавтограф к ПААГ 1, 1* - в пробу добавлен динактин; 2, 2* -династии и каталитический домен LOSK-ДТ, 3, 3' - LOSK-ДТ и неспецифический субстрат МБР.» - белок plSO(Glued).

Из результатов, полученных в настоящей работе, следует, что действие протеинкиназы LOSK на интерфазную систему МТ клеток может быть опосредовано тем, что LOSK регулирует (прямо или же косвенно, через каскад регуляторных белков) ассоциацию с центросомой динактина. При деплеции динактина в центросоме, как мы показали в наших экспериментах, радиальная система МТ должна разрушаться. Ингибирование динеина/динактина приводит, вероятно, к уменьшению способности центросомы заякоривать, т.е. удерживать вокруг себя, МТ. Возможно, что центросомный динеин/динактин необходимы для этой заякоривающей функции центросомы, и что они могут регулироваться клеточными механизмами, что приводит к регуляции системы МТ.

Установление сайта фосфорилирования plSO(Glued) протеинкиназой LOSK и влияния фосфорилирования по этому сайту на ассоциацию с центросомой должно бьггь предметом наших последующих исследований.

выводы

1. Ингибирование активности динеина и диссоциация динактинового комплекса приводят к быстрому (за 40-60 мин.) разрушению радиальной системы МТ в интерфазных клетках, но не подавляют при этом МТ-нуклеирующую активность центросомы.

2. Ингибирование активности динеина и диссоциация динактинового комплекса не оказывают влияния на содержание в центросоме у-тубулина, перицентрина, найнеина, динактина и самого динеина за 60 мин. воздействия.

3. Динеин ассоциирован с центросомой на протяжении всей интерфазы клеточного цикла. Ингибирование его активности вызывает разрушение радиальной системы МТ в любом периоде интерфазы.

4. Ингибирование активности серин-треониновой протеинкиназы LOSK в интерфазных клетках вызывает разрушение радиальной системы МТ, сопровождающееся уменьшением содержания в центросоме белков динактинового комплекса.

5. Белок динактинового комплекса pl50(Glued) является субстратом протеинкиназы LOSK in vitro. Остальные белки динактинового комплекса и пептиды, входящие в состав динеина, субстратами LOSK не являются.

6. Участок связывания микротрубочек расположен в С-концевой части молекулы протеинкиназы LOSK. Этот фрагмент молекулы, а также остальные фрагменты структурного домена LOSK, не оказывают ингибирующего действия на ее активность. Центральный участок молекулы LOSK (аминокислотные остатки 339663) обладает способностью повышать активность LOSK.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Коваленко О.В., Бураков А.В., Зиновкина Л.А., Потехина Е.С, Надеждина Е.С. Протеинкиназа LOSK/SLK участвует в регуляции радиальной системы микротрубочек в клетке. //Цитология. 2003. т. 43, с. 886-887.

2. Андреева Н.С., Коваленко О.В., Зиновкина Л.А., Шанина Н.А., Надеждина Е.С. Идентификация сайта связывания с микротрубочками LOSK/SLK. //Цитология. 2003. т. 43, с.844-845.

3. Бураков А.В., Коваленко О.В., Потехина Е.С., Надеждина Е.С., Зиновкина Л.А. Для организации микротрубочек на центросоме интерфазных клеток in vivo необходима активность протеинкиназы LOSK (SLK). Доклады Академии Наук. 2005. т. 403. №6, с.317-319.

4. Zinovkina L., Burakov A., Kovalenko О., Potekhina Е., Nadezhdina Е. Catalytically Dead LOSK (SLK) Kinase Domain Inhibits Microtubule Organization Activity of Centrosome (Abstracts presented at the EMBO/EMBL Conference on Centrosomes and Spindle Pole Bodies). Cell Motility and the Cytoskeleton. 2003. v.54, p. 182.

5. Kovalenko O.V., Zinovkina L.A., Burakov A.V., Nadezhdina E.S. Long Ste20-related proteinkinase (LOSK/SLK) is involved in development and maintence of cellular microtubule radial array; EMBO/FEBS Workshop on Fronties in Cytoskeleton Research; Gosau (Austria), 2003; p. 131.

6. Burakov A.V., Kovalenko O.V., Zinovkina L.A., Potekhina E.S., Zhapparova O.N., Kuznetsov S.A. Nadezhdina E.S. Ste20-related Mammalian Protein Kinase LOSK is Involved in Development of Cellular Microtubule Radual Array. 45th Annual Meeting of ASCB; San-Francisco (USA), 2005; p.671a-672a

7. Kovalenko O., Nadezhdina E., Rodionov V.I. Dynein and Dynactin are Involved in Anchoring of Microtubules at the Centrosome in Interphase Cells; 45th Annual Meeting of ASCB; San-Francisco (USA), 2005; p.76a.

Подписано в печать 12 января 2006 г. Заказ 515. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коваленко, Ольга Викторовна

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Динеин.

2.1.1 Введение.

2.1.2 Устройство молекулы цитоплазматического динеина.

2.1.2.1 Тяжелые цепи динеина.

2.1.2.2 Промежуточные цепи динеина.

2.1.2.3 Легкие промежуточные цепи и легкие цепи динеина. 15 2.2 Динактиновый комплекс.

2.2.1 Arpl «плечо»:.

• 2.2.2 Подвижное «предплечье».

2.3 Функции динеин-динактинового комплекса.

2.3.1 Внутриклеточная локализация динактина.

2.3.2 Процессы внутриклеточного движения.

2.3.2.1 Динамика внутриклеточных мембран.

2.3.2.2 Ядро.

2.3.2.3 Другие цитоплазматические частицы.

2.3.2 Участие динеин-динактина в других процессах.

2.3.2.1 Центросома и организация системы интерфазных микротрубочек.

2.3.2.2 Плюс-концы МТ.

2.4 Семейство 81е20-подобных протеинкиназ: классификация и основные свойства.

2.5 GCK-подобные протеинкиназы: классификация.

2.6 Протеинкиназы LOK/xPlkk и LOSK.

3 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 Материалы.

4.1.1 Культуры клеток.

4.1.2 Штаммы E.coli.

4.1.3 Антитела.

4.1.4 ДНК-конструкты.

4.1.5 Химреактивы.

4.1.5.1 Для работы с Е. coli.

4.1.5.2 Для работы с культурами клеток.

4.1.5.3 Для электрофореза белков в ПААГ.

4.1.5.4 Для полусухого переноса.

4.1.5.5 Для со-осаждения с экзогенными МТ.

4.1.5.6 Для аффинного выделения рекомбинантных белков

4.1.5.7 Для киназной реакции.

4.1.5.8 Для микроинъекций.

4.1.5.9 Другие материалы.

4.1.6 Приборы.

4.1.7 Специализированные компьютерные программы.

4.2 Методы.

4.2.1 Трансформация Е. coli.

4.2.1.1 Получение компетентных клеток Е. coli.

4.2.1.2 Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

4.2.2 Очистка плазмидной ДНК.

4.2.3 Получение рекомбинантных белков (протеинкиназа LOSK, pl50(Glued).

4.2.3.1 Экспрессия белков в Е. coli.

4.2.3.2 Очистка рекомбинантных белков, слитых с GST, на глутатион-8-агарозе.

4.2.3.3 Очистка рекомбинантного белка, слитого с 6His, на Ni-NTA-агарозе (в нативных условиях).

4.2.4 Проведение киназной реакции.

4.2.5 Со-осаждение с микротрубочками.

4.2.5.1 Полимеризация микротрубочек из очищенного тубулина.

4.2.5.2 Со-осаждение с экзогенными микротрубочками.

4.2.6 Электрофорез белков в полиакриламидном геле и окраска гелей.

4.2.7 Иммуноблотинг.

4.2.8 Коньюгирование флуорохрома СуЗ с тубулином.

4.2.9 Ведение клеточной культуры.

4.2.10 Трансфекции культивируемых клеток.

4.2.10.1 Липосомная трансфекция.

4.2.10.2 Микроинъекции плазмидных ДНК.

4.2.11 Микроинъекции антител и рекомбинантного белка.

4.2.12 Фиксация клеток.

4.2.12.1 Моделирование клеток перед фиксацией.

4.2.12.2 Фиксация клеток параформальдегидом.

4.2.12.3 Фиксация метанолом.

4.2.12.4 Фиксация формалин-метанолом.

4.2.12.5 Фиксация метанол-формалином.

4.2.13 Иммунофлуоресцентное окрашивание.

4.2.14 Прижизненные наблюдения клеток.

4.2.14.1 Организация системы микротрубочек в интерфазной клетке.

4.2.14.2 Нуклеирующая активность центросомы.

4.2.15 Анализ изображения.

4.2.16 Статистическая обработка данных.

5 РЕЗУЛЬТАТЫ.

5.1 Экпериментальные подходы к исследованию формирования и поддержания радиальной организации микротрубочек в интерфазных клетках.

5.2 Влияние ингибирования активности динеина путем микроинъекции 74.1 антител и рекомбинантного белка динамитина на радиальную организацию микротрубочек в интерфазных клетках.

5.3 Морфология и внутриклеточное расположение аппарата

Гольджи после воздействия ингибиторов динеина.

5.4 Содержание основных белков перицентриолярного материала в центросоме после воздействия ингибиторов динеина.

5.5 Влияние ингибиторов динеина на нуклеацию микротрубочек на центросоме.

5.6 Ассоциация динеина с центросомой в клеточном цикле.

5.7 Локализация в культивируемых клетках продуктов экспрессии и молекулярные массы полноразмерной протеинкиназы LOSK и ее фрагментов, слитых с GFP.

5.8 Ферментативная активность протеинкиназы LOSK in vitro, доминантно-негативный мутант и участок связывания ее с микротрубочками.

5.9 Влияние инактивации протеинкиназы LOSK на систему микротрубочек.

5.10 Влияние инактивации протеинкиназы LOSK на формирование актиновых стресс-фибрилл в интерфазных клетках.

5.11 Влияние инактивации протеинкиназы LOSK на содержание основных белков центросомы.

5.12 Идентификация нового субстрата протеинкиназы LOSK.

6 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

8 ВЫВОДЫ.

9 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Формирование радиальной системы микротрубочек в интерфазных клетках млекопитающих: роль динеина и протеинкиназы LOSK"

Для большинства интерфазных клеток млекопитающих характерна радиально-симметричная система микротрубочек (МТ): МТ отходят от центра организации (ЦОМТ) к периферии клетки. При этом в ЦОМТ располагаются минус-концы, а по периферии клеток - плюс-концы МТ. Радиальная сеть МТ необходима для организации внутриклеточного движения органелл по эндоцитозному и экзоцитозному пути, для поддержания поляризованной формы клеток при их передвижении по субстрату и для функциональной компартментализации клетки.

Центром радиальной сети МТ в животной клетке обычно является центросома, представленная парой центриолей и окружающим их перицентриолярным материалом. На центросоме происходит нуклеация МТ (Moudjou et al., 1996; Stearns & Kirschner, 1994) и их заякоривание (связывание их минус-концов) (Mogensen et al., 1997; Mogensen et al., 1999; Quintyne et al., 1999; Mogensen et al., 2000; Bornens et al., 2002; Dammermann & Merdes, 2002). Молекулярные механизмы нуклеации и заякоривания МТ, также как и функции многих белков перицентриолярного материала, до сих пор остаются неясными. Был опубликован ряд работ, показывающих, что дисфункция многих белков с центросомной локализацией ведёт к утрате центросомой функции центра организации МТ. В частности, это было показано для динеин-динактинового комплекса (Quintyne et al., 1999) и для протеинкиназы LOSK (по данным, полученным ранее в лаборатории).

Цитоплазматический динеин представляет собой моторный белок, АТФ-зависимо перемещающийся по МТ по направлению к ее минус-концу. Он осуществляет ретроградный транспорт молекул и s органелл, взаимодействуя с ними через свой кофактор - белковый комплекс динактин. В митозе и в интерфазе динеин и динактин ассоциированы с центросомой, причем, вероятно, независимо друг от друга (Purohit et al., 1999; Quintyne et al., 1999; Tynan et al., 2000, Quintyne et al., 2002; Uetaki et al, 2004). В опытах, в которых добивались ингибирования активности динеина или разрушения динактинового комплекса, наблюдали дезорганизацию полюсов митотического веретена и разрушение радиального расположения МТ в интерфазных клетках, сопровождавшееся нарушением связи МТ с центросомой (Gaglio et al., 1996; Gaglio et al., 1997; Burkhard et al., 1997; Quintyne et al., 1999). Роль динеина в формировании радиальной сети МТ в интерфазных клетках, тем не менее, пока исследована недостаточно. В частности, неясно, участвует ли непосредственно динеин в нуклеации или в заякоривании МТ на центросоме. Разрушение радиальной сети МТ при ингибировании динеина ранее объясняли тем, что динеин доставляет в центросому ее функционально важные белки, и при дисфункции динеина происходит деплеция центросомы по этим белкам (Young et al., 2000). Поэтому важным представлялось исследовать ранние эффекты ингибирования динеина в клетках, когда деплеция центросомы по функционально важным белкам еще маловероятна.

Выраженность радиальной сети МТ в клетках бывает разной: в одних типах клеток она почти строго радиальная, а в других -значительно более хаотичная. Это заставляет предположить, что степень радиальности сети МТ регулируется клеткой. Вероятно, что в регулировании радиальной сети МТ могут принимать участие протеинкиназы, связанные с центросомой и МТ. Протеинкиназы одно из самых обширных белковых суперсемейств эукариот, насчитывающее до тысячи представителей. Протеинкиназы катализируют реакцию переноса у-фосфатной группы АТФ (или ГТФ) на спиртовые группы серина/треонина (или фенольную группу тирозина) в белках для образования фосфомоноэфиров. Большинство протеинкиназ - минорные клеточные белки, которые удается идентифицировать только молекулярно-биологическими методами. Однако экспериментально вызванная дисфункция многих протеинкиназ ведет к фатальным последствиям для клеток. Протеинкиназы регулируют клеточный цикл, дифференцировку, метаболические пути, морфогенез, участвуют в цепях передачи внутриклеточых сигналов и в запуске апоптоза.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 ДИНЕИН 2.1.1 Введение

Цитоскелетные молекулярные моторы в эукариотической клетке представлены тремя основными классами: динеинов, кинезинов и миозинов. Они используют освобожденную энергию гидролиза АТФ для перемещения по цитоскелетным фибриллам: динеины двигаются вдоль МТ по направлению к их минус-концу (Paschal & Vallee, 1987), кинезины - вдоль МТ к плюс-концу, а миозины перемещаются вдоль актиновых филаментов (Vale & Milligan 2000). В настоящее время наблюдается большой прогресс в изучении биохимии и механохимических циклов кинезина и миозина (Vale & Milligan 2000), но гораздо меньше известно о динеине. Одной из причин этого могло послужить более сложное устройство молекулы динеина по сравнению с другими молекулярными моторами. В многочисленных семействах кинезинов и миозинов отдельные энзимы отличаются по строению тяжелых цепей (Hirokawa, 1998; Sellers, 2000), а гетерогенность наиболее широко распространенного у эукариотов класса динеинов заключается в разнообразии дополнительных полипептидов, которые связаны с ограниченным количеством консервативно устроенных тяжелых цепей.

Пока все еще остается неизвестным, как много биохимически разных изоформ динеина существует в клетке. Тем не менее, на данный момент в клетках различают два типа динеинов, встречающихся в разных клеточных компартментах: цитоплазме и аксонемах ресничек и жгутиков, которые так и называют - цитоплазматический динеин и аксонемный. В геноме челове содержится восемь генов для тяжелой цепи динеина DHC (Dynein Heavy Chain), из которых шесть кодируют аксонемные динеины и два - цитоплазматический динеин. В клетках превалирует цитоплазматический динеин-1, который мы далее и будем для краткости называть динеином. Цитоплазматический динеин-2 -минорный белок, характерный для клеток с неподвижными измененными ресничками, например, для палочек сетчатки. В геноме человека имеется один ген для промежуточной цепи динеина DIC (Dynein Intermediate Chain), хотя экспрессируется несколько сплайс-вариантов этого белка. В геноме мыши, однако, найдено два гена DIC. Два гена у человека кодируют легкие промежуточные цепи динеина DLIC (Dynein Light Intermediate Chains) (Mikami et al., 1993; Zhang et al., 1993; Gill et al., 1994; Hughes et al., 1995; Vaughan & Vallee, 1995). Идентифицированы три семейства легких цепей динеина DLC (Dynein Light Chains) (King et al., 1996a,b, 1998; Bowman et al, 1999; Wilson et al., 2001).

В цитоплазме динеины ответственны за минус-направленный МТ транспорт (Holzbaur & Vallee, 1994; Hirokawa, 1998), позиционирование мембранных органелл (например, аппарата Гольджи) внутри клетки, формирование митотического веретена деления , а также, возможно, принимают участие в формировании радиальной организации интерфазных МТ и нуклеации МТ на центросоме (Malikov et al., 2004). Аксонемные динеины обеспечивают движение жгутиков и ресничек в клетках эукариот.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Коваленко, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ

6. Участок связывания микротрубочек расположен в С-концевой части молекулы протеинкиназы LOSK. Этот фрагмент молекулы, а также остальные фрагменты структурного домена LOSK, не оказывают ингибирующего действия на ее активность. Центральный участок молекулы LOSK (аминокислотные остатки 339-663) обладает способностью повышать активность LOSK.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коваленко, Ольга Викторовна, Москва

1. Зиновкина, J1.A., Полтараус, А.Б., Соловьянова, О.Б. и Надеждина, Е.С. (1998) Новая предполагаеамя протеинкиназа, ассоциированная с микротрубочками в клетках. Мол Биол, 32: 341-8.

2. Потехина Е.С. (2001) Субстратная специфичность и регуляция активности Ste20-noflo6Hbix протеинкиназ LOSK, участвующих в индукции апоптоза. Дисс на соискуч степ к.б.н., 3-105.

3. Потехина Е., Зиновкина Л., Надеждина Е.С. (2003) Ферментативная активность протеинкиназы LOSK: возможная регуляторная роль структурного домена. Биохимия, 68(2): 188-95.

4. Потехина Е., Надеждина Е. (2002) Митоген-активируемые протеинкиназные каскады и участие в них 81е20-подобных протеинкиназ. Успехи биологической химии, 42: 235-56.

5. Akhmanova A., Hoogenraad С.С. (2005) Microtubule plus-end-tracking proteins: mechanisms and functions. Current Opinion in Cell Biology, 17: 47-54

6. Allan, V. (1995). Protein phosphatase 1 regulates the cytoplasmic dynein-driven formation of endoplasmic reticulum networks in vitro. J. Cell Biol., 128, 179-191.

7. Alves P., Gordinho S., Tavares. (2006) The Drosophila orthologue of xPlkkl is not essential for Polo activation and is necessary for proper contractile ring formation. Exp Cell Res, 312(3): 308-21

8. Anafi M., Kiefer F., Gish G.D., Mbamalu G., Iscove N.N. and Pawson T. (1997) SH2/SH3 adaptor proteins can link tyrosine kinases to a Ste20-related protein kinase, HPK1. Biol, 272: 27804-11.

9. Benashski, S. E., Patel-King, R. S. and King, S. M. (1999). Light chain 1 from the Chlamydomonas outer dynein arm is a leucine-rich repeat protein associated with the motor domain of the a-heavy chain. Biochemistry, 38: 7253-7264

10. Berns M., Meredith R. (1977) Continuation of mitosis after selective laser microbeam destruction of the centriolar region. J. Cell Biol, 75: 977-82

11. Berrueta L, Tirnauer JS, Schuyler SC, Pellman D, Bierer BE. (1999) The APC-associated protein EB1 associates with components of the dynactin complex and cytoplasmic dynein intermediate chain. Curr. Biol, 9: 425-28

12. Bingham J.B., King S.J., Schroer T.A. (1998) Purification of dynein and dynactin from brain tissue. Methods Enzymol, 298, 171 184 Bingham JB, Schroer ТА. 1999. Self-regulated polymerization of the actin-relatedprotein, Arpl. Curr. Biol. 9: 223-26

13. Bowman, A.B., Patel-King, R.S., Benashski, S.E., McCaffery, J.M., Goldstein, L.S.B., and King, S.M. (1999) Drosophila roadblock and

14. Chlamydomonas LC7: A conserved family of dynein-associated proteins involved in axonal transport, flagellar motility, and mitosis. J. Cell Biol., 146: 165-179.

15. Boylan K., Serr M., Hays T. (2000) A molecular genetic analysis of the interaction between the cytoplasmic dynein intermediate chain and the Glued (dynactin) complex. Molecular Biology of the Cell, 11 6 3791-3803

16. Blangy A, Arnaud L, Nigg EA. (1997) Phosphorylation by p34cdc2 protein kinase regulates binding of the kinesin-related motor HsEg5 to the dynactin subunit pi50. J. Biol. Chem., 272: 19418-24

17. Bu W, Su LK. (2003) Characterization of functional domains of human EB1 family proteins. J. Biol. Chem., 278: 49721-31

18. Burgess SA, Walker ML, Sakakibara H, Knight PJ, Oiwa K. (2003) Dynein structure and power stroke. Nature, 421: 715-718.

19. Burgess SA, Walker ML, Sakakibara H, Oiwa K, Knight PJ: The structure of dynein-c by negative stain electron microscopy. J Struct Biol (2004), 272: 198-211.

20. Burkhard J., Echeverri C., Nilsson Т., Valee B. (1997) Overexpression of the Dynamitin (p50) subunit of the dynactin complex disrupts dynein-dependent maintenance of membrane organelle distribution. J. Cell Biol., 139: 469-84.

21. Cantalupo G, Alifano P, Roberti V, Bruni CB, Bucci C. (2001) Rab-interacting lysosomal protein (RILP): the Rab7 effector required for transport to lysosomes. EMBOJ., 20: 683- 93

22. Centonze V.E. and Borisy G.G. (1990) Nucleation of microtubules from mitotic centrosomes is modulated by a phosphorylated epitope. J. Cell Sci, 95: 405-411

23. Cau J., Faure S., Comps M., Delsert C. and Morin N. (2001) A novel p21-activated kinase binds the actin and microtubule networks and induces microtubule stabilization. J Cell Biol, 155(6): 1029-42

24. Chadee D.N., Yuasa T. and Kyriakis J.M. (2002) Direct activation of mitogen-activated protein kinase kinase kinase MEKK1 by the Ste20p homologue GCK and the adapter protein TRAF2. Mol Cell Biol, 22: 737-49

25. Chang L. and Karin M. (2001) Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature, 410: 37-40

26. Cheung P., Zhang Y., Long J., Lin S., Zhang M., Jiang Y., and Wu Z. (2004) pl50Glued, Dynein, and Microtubules Are Specifically Required for Activation of MKK3/6 and p38 MAPKs J. Biol Chem, 279(44): 45308-45311

27. Chung C.Y. and Firtel R.A. (1999) PAKa, a putative РАК family member, is required for cytokinesis and the regulation of the cytoskeleton in Dictyostelium discoideum cells during chemotaxis. J Cell Biol, 147: 559-76.

28. Clark S.W., Meyer D.I. (1992). Centractin is an actin homologue associated with the centrosome. Nature, 359: 246-50

29. Corcoran L.J., Mitchison T.J., Liu Q. (2004) A novel action of histone deacetylase inhibitors in a protein aggresome disease model. Curr. Biol., 12: 488-92

30. Creasy C.L., Ambrose D.M. and Chernoff J. (1996) The Ste20-like protein kinase, Mstl, dimerizes and contains an inhibitory domain. J BiolChem, 271:21049-53.

31. Criswell, P.S. and Asai, D.J. (1998) Evidence for four cytoplasmic dynein heavy chain isoforms in rat testis. Mol. Biol. Cell. 9: 237-247.

32. Cytrynbaum E., Rodionov V., Mogilner A. (2004) Computational model of dynein-dependent self-organization of microtubule asters. J. Cell Sci., 117(8): 1381-97.

33. Dan I., Watanabe N.M. and Kusumi A. (2001) The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trend Cell Biol, 116 220-30.

34. De Brabander M, Nuydens R, Geerts H, Hopkins CR. (1988) Dynamic behavior of the transferrin receptor followed in living epidermoid carcinoma (A431) cells with nanovid microscopy. Cell Motil. Cytoskelet., 9: 30^7

35. Deacon SW, Serpinskaya AS, Vaughan PS, Lopez FanarragaM,Vernos I, (2003) Dynactin is required for bidirectional organelle transport. J. Cell Biol., 160:297-301

36. Diaz-Nido J. and Avila J. (1989) Characterization of proteins immunologically related to brain microtubule-associated protein MAP-IB in non-neural cells. J. Cell Sci., 92: 607-620.

37. Dick, Т., Ray, K., Salz, H.K., and Chia, W. (1996) Cytoplasmic dynein (ddlcl) mutations cause morphogenetic defects and apoptoticcell death in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 16: 19661977.

38. Dictenberg J., Zimmerman W. (1998) Pericentrin and D—tubulin form a protein complex and are organized into a novel lattice at the centrosome. J.Cell Biol., 141(1): 163-174.

39. Diener K., Wang X.S., Chen C., Meyer C.F., Keesler G., Zukowski M., Tan Т.Н. and Yao Z. (1997) Activation of the c-Jun N-terminal kinase pathway by a novel protein kinase related to human germinal center kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 9687-92.

40. Dominguez J.E., Buendia В., Lopez-Otin C., Antony C., Karsenti E., Avila J. (1994) A protein related to brain microtubule-associated protein MAP IB is a component of the mammalian centrosome. J. Cell Sci., 107(2): 601-11.

41. Dohner K, Wolfstein A, Prank U, Echeverri C, Dujardin D, (2002) Function of dynein and dynactin in herpes simplex virus capsid transport. Mol. Biol. Cell, 13: 2795-809.

42. Dujardin D.L., Barnhart L.E., Stehman S.A., Gomes E.R., Gundersen G.G. (2003) A role for cytoplasmic dynein and LIS1 in directed cell movement. J. Cell Biol., 163:1205-11.

43. Dujardin D.L., Vallee R.B. (2002) Dynein at the cortex. Curr. Opin. Cell Biol., 14: 44^49.

44. Duncan J.E., Warrior R. (2002) The cytoplasmic dynein and kinesin motors have interdependent roles in patterning the Drosophila oocyte. Curr. Biol, 12: 1982-91.

45. Ebneth A., Godemann R., Stamer K., Illenberger S., Trinczek B.1998) Overexpression of tau protein inhibits kinesin-dependent trafficking of vesicles, mitochondria, and endoplasmic reticulum— implications for Alzheimers-disease. J. Cell Biol, 143:777-94

46. Echeverri C., Paschal В., Vaughan K., Vallee R. (1996) Molecular characterization of 50kD subunit of dynactin reveals function for the complex in chromosome alignment and spindle organization during mitosis. J. Cell Biol, 132: 617-633

47. Echeverri C.J., Vallee R.B. (1996) Domain analysis of dynamitin, the 50 kD subunit of dynactin.M?/. Biol Cell, 7: 404a (Abst.)

48. Eckley D.M, Gill S.R, Melkonian K.A., Bingham J.B., Goodson H.V.,1999) Analysis of dynactin subcomplexes reveals a novel actin-related protein associated with the Arpl filament pointed end. J. Cell Biol, 147: 307-19

49. Eckley D.M., Schroer T.A. (2003) Interactions between the evolutionarily conserved, actin-related protein, Arpll, actin, and Arpl. Mol. Biol Cel,l 14: 2645-54

50. Ellinger-Ziegelbauer H., Karasuyama H., Yamada E., Tsujikawa K., Todokoro K. and Nishida E. (2000) Ste20-like kinase (SLK), a regulatory kinase for polo-like kinase (Plk) during the G2/M transition in somatic cells .Genes Cells, 5(6): 491-8.

51. Engelender S, Sharp AH, Colomer V, Tokito MK, Lanahan A, (1997) Huntingtin-associated protein 1 (HAP1) interacts with the pl50Glued subunit of dynactin. Hum.Mol. Genet., 6: 2205-12

52. Fashori and Holzbaur (1997)

53. Faulkner N.E., D.L. Dujardin, C.Y. Tai, K.T. Vaughan, C.B. O'Connell, Y. Wang, R.B. Vallee, (2000) A role for the lissencephaly gene LIS1 in mitosis and cytoplasmic dynein function, Nat. Cell. Biol., 2: 784-791.

54. Feldman J., Marshall W. (2004) Centrioles: bad to be bald? Curr. Biol., 14(16): R659-60

55. Felix M.A., Antony C., Wright M. and Maro B. (1994) Centrosome assembly in vitro: role of gamma-tubulin recruitment in Xenopus sperm aster formation. J. Cell Biol., 124: 19-31

56. Friesen H., Lunz R., Doyle S. and Segall J. (1994) Mutation of SPS-encoded protein kinase of Sacharimyces cerevisiae lead to defects in transcription and morphology during spore firmatioa Genes Dev, 8: 2162-75.

57. Gaglio Т., Dionne M., Compton D. (1997) Mitotic spindle poles are organized by structural and motor proteins in addition to centrosomes. J. Cell Biol, 138 (5): 055-66.

58. Gaglio Т., Saredi J. (1996) Opposing motor activities are required for the organization of the mammalian mitotic spindle pole. J. Cell Biol., 135:399^114.

59. Garces JA, Clark IB, Meyer DI, Vallee RB. (1999) Interaction of the p62 subunit of dynactin with Arpl and the cortical actin cytoskeleton. Curr. Biol., 9: 1497-500.

60. Garcia-Mata R, Gao YS, Sztul E. (2002) Hassles with taking out the garbage: aggravating aggresomes. Traffic, 3: 388-96

61. Gee MA, Heuser JE, Vallee RB. (1997) An extended microtubule-binding structure within the dynein motor dom&m.Nature, 390:636639.

62. Geiser JR, Schott EJ, Kingsbury TJ, Cole NB, Totis LJ. (1997) Saccharomyces cerevisiae genes required in the absence of the CIN8-encoded spindle motor act in functionally diverse mitotic pathways. Mol. Biol. Cell, 8: 1035-50

63. Gergely F., Karlsson C., Still I., Cowell J., Kilmartin J. and Raff J. W. (2000) The TACC domain identifies a family of centrosomal proteins that can interact with microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97: 14352-14357

64. Gibbons IR, Lee-Eiford A, Mocz G, Phillipson С A, Tang W-JY, Gibbons ВН. (1987) Photosensitized cleavage of dynein heavy chains: cleavage at the "VI site" by irradiation at 365 nm in the presence of ATP and vanadate. J Biol Chem 262:2780 -2786.

65. Giet R., McLean D., Descamps S., Lee M.J., Raff J.W., Prigent C. and Glover D.M. (2002) Drosophila Aurora A kinase is required to localize D-TACC to centrosomes and to regulate astral microtubules. J. Cell Biol., 156:437-451.

66. Gill, S.R., Cleveland, D.W., and Schroer, T.A. (1994) Characterization of DLC-A and DLC-B, two families of cytoplasmic dynein light chain subunits. Mol. Biol. Cell. 5: 645-654.

67. Gill S.R., Schroer T.A., Szilak I, Steuer E.R., Sheetz M.P., and Cleveland D.W. (1991) Dynactin, a conserved, ubiquitously expressed component of an activator of vesicle motility mediated by cytoplasmic dynein. J. Cell Biol., 115: 1639-50

68. Goto H., Tanabe K., Manser E., Lim L., Yasui Y. and Inagaki M. (2002) Phosphorylation and reorganization of vimentin by p21-activated kinase (РАК).Genes Cells, 7(2), 91-7.

69. Habermann A, Schroer ТА, Griffiths G, Burkhardt JK. (2001) Immunolocalization of cytoplasmic dynein and dynactin subunits in cultured macrophages: enrichment on early endocytic organelles. J. Cell Sci., 114:229^10

70. Hafezparast M, Klocke R, Ruhrberg C, Marquardt A, Ahmad-Annuar A, (2003) Mutations in dynein link motor neuron degeneration to defects in retrograde transport. Science, 300: 808-12

71. Hannak E., Oegema K. (2002) The kinetically dominant assembly pathway for centrosomal asters in Caenorhabditis elegans is gamma-tubulin dependent. J. Cell Biol., 157 (4): 591-602, 2002.

72. Hayashi I.,l, Wilde A., Kumar Mai Т., Ikura M. (2005) Structural Basis for the Activation of Microtubule Assembly by the EB1 and pl50Glued Complex. Molecular Cell, 19: 449-460

73. Heald R., Tournebize R., Blank Т., Sandaltzopoulos R., Becker P., Hyman A., Karsenti E. (1996)Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature, 382(6590): 420-5

74. Helfand ВТ, Chang L, Goldman RD. (2004) Intermediate filaments are dynamic and motile elements of cellular architecture. J. Cell Sci., 117: 133-41

75. Helfand ВТ, Loomis P, Yoon M, Goldman RD. (2003) Rapid transport of neural intermediate filament protein. J. Cell Sci., 116: 2345-5

76. Helfand ВТ, Mikami A, Vallee RB, Goldman RD. (2002) A requirement for cytoplasmic dynein and dynactin in intermediate filament network assembly and organization. J. Cell Biol., 157: 795806

77. Herskowits, I. (1995) MAP kinase pathway in yeast: for mating and more. Cell, 80: 187-97.

78. Hirokawa N. (1998) Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science, 279: 519-27.

79. Holleran E.A., Karki S., Holzbaur E.L. (1998). The role of the dynactin complex in intracellular motility. Int. Rev. Cytol., 182: 69109

80. Holleran E.A., Ligon L.A., Tokito M., Stankewich M.C., Morrow J.S. (2001). Beta III spectrin binds to the Arpl subunit of dynactin. J. Biol.Chem., 276: 36598-605

81. Holleran E.A., Tokito M.K., Karki S., Holzbaur E.L.F. (1996). Centractin (Arpl) associates with spectrin revealing a potential mechanism to link dynactin to intracellular organelles. J.Cell Biol., 135:1815-29

82. Holzbaur E.L, Hammarback J.A., Paschal B.M., Kravit N.G., Pfister K.K., Vallee R.B. (1991) Homology of a 150K cytoplasmic dyneinassociated polypeptide with the Drosophila gene Glued, Nature (Lond.), 351: 579-583 .

83. Hoogenraad C.C., P. Wulf, N. Schiefermeier, T. Stepanova, N. Galjart, J.V. Small, F. Grosveld, C.I. de Zeeuw, A. Akhmanova (2003) Bicaudal D induces selective dynein-mediated microtubule minus end-directed transport, EMBO J., 22: 6004-6015.

84. Hu, M.C., Qiu, W.R., Wang, X., Meyer, C.F. and Tan, Т.Н. (1996) Human HPK1, a novel human hematopoietic progenitor kinase that actives the JNK/SAPK kinase cascade. Genes Dev, 10: 2251-64

85. Hughes, S.M., Vaughan, K.T., Herskovits, J.S., and Vallee, R.B. (1995) Molecular analysis of a cytoplasmic dynein light intermediate chain reveals homology to a family of ATPases. J. Cell Sci. 108: 17-2

86. Jang J., Ma S., Terada Y., and Erikson R. (2002) Phosphorylation of threonine 210 and the role of serine 137 in the regulation of mammalian polo-like kinase. J. Biol. Chem., 277(46): 44115-44120

87. Januschke J, Gervais L, Dass S, Kaltschmidt JA, Lopez-Schier H (2002) Polar transport in the Drosophila oocyte requires Dynein and Kinesin I cooperation. Curr. Biol., 12: 1971-81

88. Jin T, Yue L, Li J. (2001) In vivo interaction between dynamitin and MacMARCKS detected by the fluorescent resonance energy transfer method. J. Biol. Chem., 276: 12879-84

89. Johnston JA, Illing ME,Kopito RR. (2002) Cytoplasmic dynein/dynactin mediates the assembly of aggresomes. Cell Motil. Cytoskelet., 53: 26-38

90. Jordens I, Fernandez-Borja M, Marsman M, Dusseljee S, Janssen L (2001) The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors. Curr. Biol. , 11: 1680-95

91. Joshi H., Palacios M., McNamara L., Cleveland D. (1992) Gamma-tubulin is a centrosomal protein required for cell cycle-dependent microtubule nucleation. Nature, 356, 80-83

92. Itoh, S., Kameda, Y., Yamada, E., Tsujikawa, K., Mimura, T. and Kohama, Y. (1997) Molecular cloning and characterization of a novel putative STE20-like kinase in guinea pigs. Arch Biochem Biophys, 340: 201-7.

93. Karki S, Holzbaur E. (1995) Affinity chromatography demonstrates a direct binding between cytoplasmic dynein and the dynactin complex. J. Biol. Chem., 270: 28806-11 b

94. Karki, S. and Holzbaur, E.L.F. (1999) Cytoplasmic dynein and dynactin in cell division and intracellular transport. Curr. Opin. Cell Biol. 11:45-53.

95. Karki S, LaMonte B, Holzbaur ELF. (1998) Characterization of the p22 subunit of dynactin reveals the localization of cytoplasmic dynein and dynactin to the midbody of dividing cells. J. Cell Biol., 142:1023-34

96. Karki S, Tokito MK, Holzbaur EL. (2000) A dynactin subunit with a highly conserved cysteine-rich motif interacts directly with Arpl. J. Biol Chem., 275: 4834-39

97. Keating Т.J., Borisy G.G. (2000) Immunostructural evidence for the template mechanism of microtubule nucleation. Nat Cell Biol., 2(6), 352-357

98. Kelm, O., Wind, M., Lehmann, W.D. and Nigg EA. (2002) Cell cycle-regulated phosphorylation of the Xenopus Polo-like kinase Plxl. J Biol Chem, 227 (28): 25247-25256

99. Kennelly, P.J. and Krebs, E.G. (1991) Consensus sequencas as substrate specificity determinants for protein kinases and protein phosphotases. J Biol Chem, 266: 1555-8.

100. Khodjakov A., Cole R., Oakley В., Rieder C. (2000) Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Curr. Biol., 10(2): 59-67

101. King, S.M., Barbarese, E., Dillman, III, J.F., Patel-King, R.S., Carson, J.H., and Pfister, K.K. (1996a) Brain cytoplasmic and flagellar outer arm dyneins share a highly conserved Mr 8,000 light chain. J. Biol. Chem. 271: 19358-19366.

102. King, S.M., Dillman III, J.F., Benashski, S.E., Lye, R.J., Patel-King, R.S., and Pfister, K.K. (1996b) The mouse t-complex-encoded protein Tctex-1 is a light chain of brain cytoplasmic dynein. J. Biol. Chem. 271:32281-32287.

103. King, S.M., and Patel-King, R.S. (1995) The M(R) 8,000 and 11,000 outer arm dynein light chains from Chlamydomonas flagella have cytoplasmic homologues. J. Biol. Chem. 270: 11445-11452.

104. King, S. M. (2000). The dynein molecular motor. Biochim. Biophys. Acta differentially expressed light chains. Biochemistry 37: 15033-15041.

105. King S., Brown C., Kerstin C., Quintyne N., Schroer T.(2003) Analysis of the dynein-dynactin interaction in vitro and in vivo. Mol Biol of the Cell, 14: 5089-97.

106. King, S. M., Haley, В. E. and Witman, G. B. (1989). Structure of the a. and b. heavy chains of the outer arm dynein from Chlamydomonas flagella. Nucleotide binding sites. J. Biol. Chem. 264, 10210-10218.

107. King SJ, Schroer ТА. (2000) Dynactin increases the processivity of the cytoplasmic dynein motor. Nat. Cell Biol., 2: 2024

108. Kiosses, W.B., Daniels, R.H., Otey, C., Bokoch, G.M. and Schwartz, M.A. (1999) A role for p21-activated kinase in endothelial cell migration. J Cell Bio, 147(4): 831-44.

109. Kloc M, Zearfoss NR, Etkin LD. (2002). Mechanisms of subcellular mRNA localization. Cell, 108: 533-44

110. Koonce, M. P. (1997). Identification of a microtubule-binding domain in a cytoplasmic dynein heavy chain. J. Biol. Chem. 272, 19714-19718.

111. Koonce, M. P. and Tikhonenko, I. (2000). Functional elements within the dynein microtubule-binding domain. Mol. Biol. Cell 11, 523-529.

112. Kopito R. (2003). The missing linker: an unexpected role for a histone deacetylase. Mol.Cell 12:1349-51

113. Kuhle V, Jackel D, Hensel M. (2004) Effector proteins encoded by Salmonella pathogenicity island 2 interfere with the microtubule cytoskeleton after translocation into host cells. Traffic, 5: 356-70

114. Kumar S, ZhouY, Plamann M. (2001) Dynactin membrane interaction is regulated by the C-terminal domains of pl50(Glued). EMBORep., 2: 939^4

115. Kuramochi, S., Moriguchi, Т., Kuida, K., Endo, J., Semba, K., Nishida, E. and Karasuyama, H. (1997) LOK is novel mouse STE20-like protein that is expressed predominantly in lymphocytes. J Biol Chem, 272: 22679-84.

116. Kuriyama R. (1989) 225-Kilodalton phosphoprotein associated with mitotic centrosomes in sea urchin eggs. Cell Motil. Cytoskeleton., 12: 90-103.

117. Kyhse-Andersen, J. (1984) Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of protein from polyacrylamide to nitrocellulose. JBiochem Biophys Methods, 1: 2039.

118. Kyriakis, J.M. (1999) Signaling by the germinal center kinase family of protein kinases. J Biol Chem, 274: 5259-62.

119. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 221: 680-5

120. Lafont F, Burkhardt JK, Simons K. (1994) Involvement of microtubule motors in basolateral and apical transport in kidney cells. Nature, 372:801-3

121. LaMonte BH, Wallace KE, Holloway BA. (2002) Disruption of dynein/dynactin inhibits axonal transport in motor neurons causing late-onset progressive degeneration. Neuron; 34: 715-727

122. Lane JD, Vergnolle MA, Woodman PG, Allan VJ. (2001). Apoptotic cleavage of cytoplasmic dynein intermediate chain andpl50(Glued) stops dynein-dependent membrane motility .J. Cell Biol., 153: 1415-26

123. Lange BM. (2002). Integration of the centrosome in cell cycle control, stress response and signal transduction pathways. Curr. Opin. Cell Biol., 14: 35-43

124. Li S, Finley J, Liu ZJ, Qiu SH, Chen H, et al. (2002). Crystal structure of the cytoskeletonassociated protein (CAP-Gly) domain. J.Biol. Chem., 277: 48596-601

125. Li S., Gutekunst C., Hersch S.M., Li X. (1998) Interaction of Huntingtin-associated protein with dynactin pl50Glued. The Journal of Neuro science, 18(4), 1261-1269

126. Liang Y, Yang Z, Yan X. (2004) Nudel functions in membrane traffic mainly through association with Lisl and cytoplasmic dynein. J. Cell Biol., 164: 557-66

127. Ligon LA, Shelly SS, Tokito M, Holzbaur EL. (2003) The microtubule plus-end proteins EB1 and dynactin have differential effects on microtubule polymerization. Mol. Biol. Cell, 14: 1405-17

128. Liu J., Mailer J. (2005) Xenopus Polo-like kinase Plxl: a multifunctional mitotic kinase. Oncogene, 24: 238-247

129. Lo KW, Naisbitt S, Fan JS, Sheng M, Zhang M. (2001) The 8-kDa dynein light chain binds to its targets via a conserved (K/R)XTQT motif. J Biol Chem 276:14059- 14066.

130. Ma S., Trivinos-Lagos L. (1999) Dynein intermediate chain mediated dynein-dynactin interaction is required for interphase microtubule organizationand centrosome replication and separation in Dictyostelium. J. Cell Biol., 147: 1261-73.

131. MacDougall N, Clark A, MacDougall E, Davis I. (2003). Drosophila gurken (TGFalpha) mRNAlocalizes as particles thatmove within the oocyte in two dynein-dependent steps. Dev. Cell, 4: 307-19

132. Mallik R., Gross S. (2004) Molecular motors:strategies to get along. Curr. Biol, 14: R971-82,

133. Malikov V., Kashina A., Rodionov V. (2004) Cytoplasmic dynein nucleates microtubules to organize them into radial arrays in vivo. Mol Biol Cell., 15(6): 2742-9.

134. Matanis T, Akhmanova A,Wulf P, Del Nery E, Weide T. (2002) Bicaudal-D regulates COPI-independent Golgi-ER transport by recruiting the dynein-dynactin motor complex. Nat. Cell Biol., 4: 986-92

135. Matteoni R, Kreis ТЕ. (1987) Translocation and clustering of endosomes and lysosomes depends on microtubules. J. Cell Biol., 105: 1253-65

136. Meraldi P. and Nigg E.A. (2002) The centrosome cycle. FEBS Lett., 521: 9-13.

137. McDonald D, Vodicka MA, Lucero G, Svitkina TM, Borisy GG. (2002) Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J. Cell Biol., 159:441-52

138. McGrail M., Gepner J. (1995) Regulation of cytoplasmic dynein function in vivo by the Drosophila Glued complex. J. Cell Biol., 1316 411-25

139. Mikami A, Tynan SH, Hama T, Luby-Phelps K, Saito T, Crandall JE, Besharse JC, Vallee RB. (2002) Molecular structure of cytoplasmic dynein 2 and its distribution in neuronal and ciliated cells. J Cell Sci 115:4801-4808.

140. Мок YK, Lo KW, Zhang M. (2001) Structure of Tctex-1 and its interaction with cytoplasmic dynein intermediate chain. J Biol Chem 276:14067-1407

141. Mogensen M.M., Malik A., Piel M., Bouckson-Castaing V. and Bornens M. (2000) Microtubule minus-end anchorage at centrosomal and non-centrosomal sites: the role of ninein. J. Cell Sci., 113: 30133023

142. Moritz M., Braunfeld M., Sedat J., Alberts В., Agar D. (1995) Microtubule nucleation by gamma-tubulin-containing rings in the centrosome. Nature, 378(6557): 638-40.

143. Morris JA, Kandpal G, Ma L, Austin CP. (2003) DISCI (Disrupted-In-Schizophrenia 1) is a centrosome-associated protein that interacts with MAPI A, MIPT3, ATF4/5 and NUDEL: regulation and loss of interaction with mutation. Hum. Mol. Genet., 12:1591-608

144. Munch C., Sedlmeier R., Meyer Т., Homberg V., Sperfeld A.D., Kurt A., Prudlo J., Peraus G., Hanemann C.O., Stamm G., Ludolph A.C. (2004) Point mutations of the pl50 subunit of dynactin (DCTN1) gene in ALS. Neurology, 63: 724 726

145. Muresan V, Stankewich MC, Steffen W, Morrow JS, Holzbaur EL. (2001) Dynactin-dependent, dynein-driven vesicle transport in theabsence of membrane proteins: a role for spectrin and acidic phospholipids. Mol. Cell, 7: 173-83

146. Neer, E.J., Schmidt, C.J., Nambudripad, R., and Smith, T.F. (1994) The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins. Nature 371:297-300.

147. Neuwald AF, Aravind L, Spouge JL, Koonin EV. (1999) AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res 9:27-43

148. O'Reilly P.G., Wagner S., Franks D., Cailliau K., Browaeys E., Dissous C., and Sabourin L. (2005) The Ste20-like Kinase SLK Is Required for Cell Cycle Progression through G2. J. Biol. Chem., 280 (51): 42383-42390

149. Ogura T, Wilkinson AJ: (2001) AAAR superfamily ATPases: common structure-diverse function. Genes Cells, 6:575-597.

150. Ozeki Y, Tomoda T, Kleiderlein J, Kamiya A, Bord L. (2003) Disrupted-in-Schizophrenia-1 (DISC-1): mutant truncation prevents binding to NudE-like (NUDEL) and inhibits neurite outgrowth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 100: 289-94

151. Parisi G, Fornasari M, Echave J. (2004). Dynactins p25 and p27 would be LbH proteins. FEBS Lett., 562:

152. Paschal BM, Holzbaur ELF, Pfister KK, Clark S, Meyer DI. (1993) Characterization of a 50-kDa polypeptide in cytoplasmic dynein preparations reveals a complex with pl50Glued and a novel actin. J. Biol. Chem., 268: 15318-23

153. Paschal BM, Shpetner HS, Vallee RB. 1987. MAP 1С is a microtubule-activated ATPase which translocates microtubules in vitro and has dynein-like properties. J Cell Biol 105:1273-1282.

154. Paschal BM, Vallee RB. 1987. Retrograde transport by the microtubule associated protein MAP 1С. Nature 330:181-183.

155. Purohit A, Tynan SH, Vallee R, Doxsey SJ. 1999. Direct interaction of pericentrin with cytoplasmic dynein light intermediate chain contributes to mitotic spindle organization. J Cell Biol 147:481— 492.

156. Pawson T, Scott JD. (1997) Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor proteins. Science, 278(5346): 2075-80

157. Perez-Ferreiro C.M., Vernos I., Correas I. Protein 4.1R regulates interphase microtubule organization at the centrosome. J. Cell Sci. 2004. V.117. P.6197-6206.

158. Pfister KK, Benashski SE, Dillman JF III, Patel-King RS, King SM. (1998) Identification and molecular characterization of the p24 dynactin light chain. Cell. Motil. Cytoskelet., 41: 154-67

159. Pfister, K.K., M.W. Salata, J.F. Dillman III, E. Torre, and R.J. Lye. (1996a) Identification and developmental regulation of a neuron-specific subunit of cytoplasmic dynein. Mol. Biol. Cell. 7:331-343.

160. Pombo C.M., Kehrl J.H., Sanchez L., Katz P., Avruch, Zon L.I., Woodgett J.R., Force T. and Kyriakis J.M. (1995) Activation of the МАРК pathway by the human STE20 homologue germinal centre kinase. Nature, 377: 750-4.

161. Pombo C.M., Bonventre J.V., Molnar A., Kyriakis J. and Force T. (1996) Activation of a human Ste20-like kinase by oxidant stress defines a novel stress response pathway. EMBOJ, 15: 4537-46.

162. Popov A.V., Severin F. and Karsenti E. (2002) XMAP215 is required for the microtubule-nucleating activity of centrosomes. Curr. Biol., 12: 1326-1330

163. Presley JF, Zaal KJM, Schroer ТА, Cole NB, Lippincott-Schwartz J. ((1997) ER to Golgi transport visualized in living cells. Nature, 389: 81-85

164. Puis I., Jonnakuty C., LaMonte B.H., Holzbaur E.L.F., Tokito M., Mann E., Floeter M.K., Bidus K., Drayna D., Oh S.J., Brown R.H., Ludlow C.H., Fischbeck K.H. (2003) Mutant dynactin in motor neuron disease. Nature genetics, 33: 455 456

165. Puis I., Oh S.J., Sumner C.J., Wallace K.E., Floeter M.K., Mann E.A., Kennedy W.R., Wendelschafer-Crabb G., Vortmeyer A., Powers R., Finnegan K., Holzbaur E.L.F., Fischbeck K.H., Ludlow

166. C.L. (2005) Distal spinal and bulbar atrophy caused by dynactin mutation. Ann Neurol, 57: 687 694

167. Purchit A., Tynan S.H., Vallee R. and Doxsey S.J. (1999) Direct interaction of pericentrin with cytoplasmic dynein light intermediate chain contributes to mitotic spindle organization. J. Cell Biol., 147:481-491

168. Qian Y.W., Erikson E. and Mailer J.L. (1998) Purification and cloning of a protein kinase that phosphorylates and activates the pololike kinase Plxl. Science, 282: 1701-4.

169. Quintyne N., Gill S., Schroer Т. (1999) Dynactin is required for microtubule anchoring at fibroblast centrosomes. J. Cell Biol., 147: 321-34.

170. Quintyne N., Schroer T. (2002) Distinct cell cycle-dependent roles for dynactin and dynein at centrosomes. J. Cell Biol., 159: 24554.

171. Rattner J.B. and Bazett-Jones D.P. (1988) Electron spectroscopic imaging of the centrosome in cells of the Indian muntjac. J. Cell Sci., 91:5-11

172. Reinsch S, Karsenti E. (1997) Movement of nuclei along microtubules in Xenopus egg extracts. Curr. Biol., 7: 211-14

173. Riehemann K, Sorg C. (1993) Sequence homologies between four cytoskeleton-associated proteins. Trends Biochem. Sci. ,18: 82-83

174. Rodionov V., Borisy G. (1997) Self-centring activity of cytoplasm. Nature, 386(6621): 170-173.

175. Rodionov V., Nadezhdina E., Borisy G. (1999) Centrosomal control of microtubule dynamics. PNAS, 966: 115-120

176. Sakato M, King SM: (2004) Design and regulation of the AAAR microtubule motor dynein. J Struct Biol

177. Sabourin, L.A. and Rudnichi, M.A. (1999) Induction of apoptosis by SLK, a Ste20-related kinase. Oncogene, 18: 7566-75.

178. Sabourin, L.A., Tamai, K., Seale, P., Wagner, J. and Rudnichi, M.A. (2000) Caspase3 cleavage of the Ste20-related kinase SLK release and activates an apoptosis-inducing kinase domain and an actin-disassembling region. Mol Cell Biol, 20: 684-96.

179. Salina D, Bodoor K, Eckley DM, Schroer ТА, Rattner JB. (2002) Cytoplasmic dynein as a facilitator of nuclear envelope breakdown. Cell, 108: 97-107

180. Salisbury J. (2003) Centrosomes: coiled-coil organize the cell center. Curr. Biol., 13: R88-90.

181. Samso M, Radermacher M, Frank J, Koonce MP. (1998) Structural characterization of a dynein motor domain. J Mol Biol 276:927-937.

182. Schafer DA, Gill SR, Cooper JA, Heuser JE, Schroer ТА. (1994a). Ultrastructural analysis of the dynactin complex: An actin-related protein is a component of a filament that resembles F-actin. J. Cell Biol. ,126:403-12

183. Schafer DA, Korshunova YO, Schroer ТА, Cooper JA. (1994b) Differential localization and sequence analysis of capping protein /?-subunit isoforms of vertebrates. J. Cell Biol., 127: 453-65

184. Scheich C, Niesen FH, Seckler R, Bussow K. (2004) An automated in vitro protein folding screen applied to a human dynactin subunit./Vo/еш Sci. ,13: 370-80

185. Schnapp BJ, Reese TS. (1989) Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1548-52

186. Schrader M, King SJ, Stroh ТА, Schroer ТА. (2000) Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells. J. Cell Sci., 113:3663-71

187. Schroer, T.A. 1996. Structure and function of dynactin. Semin. Cell Devel. Biol.l: 321-328.

188. Schroer, T.A. (2001). Microtubules don and doff their caps: dynamic attachments at plus and minus ends. Curr. Opin. Cell Biol., 13, 92-96.

189. Schroer T. (2004) Dynactin. Annu. Rev. Cell Biol., 20: 159-79.

190. Schroer Т., Sheetz M. (1991) Two activators of microtubule-based vesicle transport J. Cell Biol., 115: 1309-18.

191. Schuyler SC, Pellman D. (2001) Microtubule "plus-end-tracking proteins": The end is just the beginning. Cell, 105:421-24

192. Sellers, J.R. 2000. Myosins: A diverse superfamily. Biochim. Biophys. Acta. 1496: 3-22.

193. Shiroguchi, K., and Toyoshima, Y.Y. (2001). Regulation of monomeric dynein activity by ATP and ADP concentrations. Cell Motil. Cytoskel. 49, 189-19

194. Short В., С. Preisinger, J. Schaletzky, R. Kopajtich, F.A. Barr, (2002) The Rab6 GTPase regulates recruitment of the dynactin complex to Golgi membranes, Curr. Biol., 12: 1792- 1795

195. Silvanovich A, Li MG, Serr M, Mische S, Hays TS: (2003)The third P-loop domain in cytoplasmic dynein heavy chain is essential for dynein motor function and ATP-sensitive microtubule binding. Mol Biol Cell, 14:1355-1365.

196. Smith GA, Enquist LW. (2002). Break ins and break outs: viral interactions with the cytoskeleton of mammalian cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 18:135-61

197. Sondek, J., Bohm, A., Lambright, D.G., Hamm, H.E., and

198. Sigler, P.B. (1996) Crystal structure of a GA proteindimer at 2.1angstrom resolution. Nature 379: 369-374.

199. Song Y., Mandelkow E. (1993) Recombinant kinesin motor domain binds to beta-tubulin and ddecorates microtubules with а В surface lattice. PNAS, 90 (5): 1671-5

200. Starr DA, Williams ВС, Hays TS, Goldberg ML. (1998) ZW10 helps recruit dynactin and dynein to the kinetochore. J. Cell Biol, 142: 763-74

201. Su, Y.C., Han, J., Xu, S., Cobb, M. and Skolnik, Е.У. (1997) NIK is a new Ste20-related kinase that binds NCK and MEKK1 and activates the SAPK/JNK cascade via a conserved regulatory domain. EMBOJ, 16: 1279-90.

202. Suomalainen M, NakanoMY, Keller S, Войске K, Stidwill RP. (1999) Microtubule-dependent plus- and minus end-directed motilities are competing processes for nuclear targeting of adenovirus. J. Cell Biol, 144: 657-72

203. Susalka SJ, Hancock WO, Pfister KK. (2000) Distinct cytoplasmic dynein complexes are transported by different Dynein: An Ancient Motor Protein 199 mechanisms in axons. Biochim Biophys Acta 1496:76-88.

204. Swaroop A, Swaroop M, Garen A. (1987). Sequence analysis of the complete cDNA and encoded polypeptide for the glued gene of Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 6501-5

205. Tai AW, Chuang JZ, Bode C, Wolfrum U, Sung CH. (1999)Rhodopsin's carboxy-terminal cytoplasmic tail acts as a membrane receptor for cytoplasmic dynein by binding to the dynein light chain Tctex-1. Cell 97:877- 887.

206. Tai AW, Chuang JZ, Sung CH. 2001. Cytoplasmic dynein regulation by subunit heterogeneity and its role in apical transport. J Cell Biol 153:1499-1509.

207. Tokito MK, Holzbaur EL. (1998) The genomic structure of DCTN1, a candidate gene for limb-girdle muscular dystrophy (LGMD2B). Biochim. Biophys. Acta, 1442: 432-36

208. Tokito MK, Howland DS, Lee VM-Y, Holzbaur ELF. (1996) Functionally distinct isoforms of dynactin are expressed in human neurons. Mol. Biol. Cell, 7: 1167-80

209. Tynan SH, Gee MA, Vallee RB. (2000a) Distinct but overlapping sites within the cytoplasmic dynein heavy chain fordimerization and for intermediate chain and light intermediate chain binding. J Biol Chem 275:32769- 32774.

210. Tynan SH, Purohit A, Doxsey SJ, Vallee RB. (2000b) Light intermediate chain 1 defines a functional subfraction of cytoplasmic dynein which binds to pericentrin. J Biol Chem 275:32763-32768.

211. Vaisberg EA, Grissom PM, Mcintosh JR. (1996) Mammalian cells express three distinct dynein heavy chains that are localized to different cytoplasmic organelles. J Cell Biol 133:831- 842.

212. Vallee RB, Wall JS, Paschal BM, Shpetner HS. (1988) Microtubule-associated protein 1С from brain is a two headed cytosolic dynein. Nature 332:561-563.

213. Vale, R.D. and Milligan, R.A. (2000) The way things move: Looking under the hood of molecular motor proteins. Science 288: 88-95.

214. Vallee R.B., Williams J.C., Varma D. (2004) Dynein: An ancient motor protein involved in multiple modes of transport. // J. Neurobiol. 58: 189-200

215. Valetti C,Wetzel DM,Schrader M, Hasbani MJ, Gill SR. (1999) Role of dynactin in endocytic traffic: effects of dynamitin overexpression and colocalization with CLIP-170. Mol. Biol. Cell, 10: 4107-20

216. Vandre D.D., Feng Y. and Ding M. (2000) Cell cycle-dependent phosphorylation of centrosomes: localization of phosphopeptide specific antibodies to the centrosome. Microsc. Res. Tech., 49: 458-466.

217. Vaughan К. T. (2005) Microtubule plus ends, motors, and traffic of Golgi membranes. Biochimica et Biophysica Acta, 1744: 316-324

218. Vaughan P., Miura P., Henderson M., Byrne В., Vaughan K. (2002) A role for regulated binding of pl50(Glued) to microtubule plus ends in organelle transport. J. Cell Biol., 158: 305-1.

219. Vaughan KT, Tynan SH, Faulkner NE, Echeverri CJ, Vallee RB. (1999) Colocalization of cytoplasmic dynein with dynactin and CLIP- 170 at microtubule distal ends. J. Cell Sci., 112: 1437-47

220. Vaughan KT, Vallee RB. (1995) Cytoplasmic dynein binds dynactin through a direct interaction between the intermediate chains and p 150Glued. J. Cell Biol. 131:1507-16.

221. Vorobjev I., Malikov V., Rodionov V. (2001) Self-organization of a radial microtubule array by dynein-dependent nucleation of microtubules. PNAS, 98 (18): 10160-5.

222. Wagner S., Flood Т., O'Reilly P., Sabourin L. (2002) Association of the Ste20-like kinase (SLK) with the microtubule. J. of Biol. Chem., 277 (40): 37685-37692.

223. Wall, M.A., Coleman, D.E., Lee, E., Iniguez-Lluhi, J.A., Posner, B.A., Gilman, A.G., and Sprang, S.R. 1995. The structure of the G protein heterotrimer Gill2. Cell 83: 1047-1058.

224. Walczak CE, Vernos I, Mitchison TJ, Karsenti E, Heald R. (1998). A model for the proposed roles of different microtubule-based motor proteins in establishing spindle bipolarity. Curr. Biol., 8: 90313

225. Wang L, Ho CL, Sun D, Liem RK, Brown A. 2000. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nat. Cell Biol., 2: 137-41

226. Wang Y, Jerdeva G, Yarber FA, da Costa SR, Xie J, et al. 2003. Cytoplasmic dynein participates in apically targeted stimulated secretory traffic in primary rabbit lacrimal acinar epithelial cells. J. Cell Sci., 116:2051-65

227. Wang Z., Khan, S., Sheetz, M.P. (1995) Single cytoplasmic dynein molecule movements: characterization and comparison with kinesin. Biophys, 69: 2011-2023

228. Waterman-Storer C., Karki S., Holzbaur E. (1995) The pl50Glued component of the dynactin complex binds to both microtubules and the actin-related protein centractin (Arp-1). PNAS, 92: 1634-38.

229. Waterman-Storer C., Salmon E. (1997) Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr. Biol., 7(6): R369-72

230. Watson P., R. Forster, K.J. Palmer, R. Pepperkok, D.J. Stephens (2005) Coupling of ER exit to microtubules through direct interaction of COPII with dynactin, Nat. Cell Biol., 7: 48- 55.

231. Wiemer EA, Wenzel T, Deerinck TJ, Ellisman MH, Subramani S. 1997. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell Biol., 136: 71-80

232. Wilkie G.S., Davis I. 2001. Drosophila wingless and pair-rule transcripts localize apically by dynein-mediated transport of RNA particles. Cell, 105: 209-19

233. Wilson, K.L., Zastrow, M.S., and Lee, K.K. (2001). Lamins and dis- ease: insights into nuclear infrastructure. Cell 104, 647-650

234. Wittman Т., Hyman A. (1999) Recombinant p50/dynamitin as a tool to examine the role of dynactin in intracellular processes. San Diego: Academic Press, 137—143.

235. Xiang X, Plamann M. 2003. Cytoskeleton and motor proteins in filamentous fungi. Curr. Opin. Microbiol., 6: 628-33

236. Yamada, E., Tsujikawa, K., Itoh, S., Kameda, Y., Kohama, Y. and Yamamoto, H. (2000) Molecular cloning and characterization of a novel human STE20-like kinase, hSLK. Biochim Biophys Act, 1495: 250-62.

237. Yamamoto A, Hiraoka Y. 2003. Cytoplasmic dynein in fungi: insights from nuclear migration. J. Cell ScL, 116: 4501-12

238. Young A, Dictenberg JB, Purohit A, Tuft R, Doxsey SJ. 2000. Cytoplasmic dyneinmediated assembly of pericentrin and gamma tubulin onto centrosomes. Mol. Biol. Cell, 11: 2047-56

239. Young MR, D'Arcy Hart P. 1986. Movements and other distinguishing features of small vesicles identified by darkfield microscopy in living macrophages. Exp. Cell Res., 164: 199-210

240. Yustein, J.T., Li, D., Robinson, D. and Kung, H3. (2000) KFC, a Ste20-like kinase with mitogenic potential and capability to activate the SAPK/JNK pathway. Oncogene, 19: 710-8

241. Zhang, J., G. Han, and X. Xiang. 2002. Cytoplasmic dynein intermediate chain and heavy chain are dependent upon each other for microtubule end localization in Aspergillus nidulans. Mol. Microbiol. 44:381-392.

242. Zheng Y., Wong M., Alberts В., Mitchison T. (1995) Nueleation of microtubule assembly by a gamma-tubulin-contaning ring complex. Nature, 378: 578-83.

243. ZimmermanW, Doxsey SJ. (2000) Construction of centrosomes and spindle poles by molecular motor-driven assembly of protein particles. Traffic, 1: 927-34

244. Zinovkina, L.A., Poltaraus, A.B., Solovyanova, O.B. and Nadezhdina, E.S. (1997) Chinese hamster protein homologous to human putative protein kinase KIAA0204 is associated with nuclei, microtubules and centrosomes in CHO-K1 cells. FEBS Lett, 414: 1359Щ

Информация о работе

Коваленко, Ольга Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.25

Диссертация

Формирование радиальной системы микротрубочек в интерфазных клетках млекопитающих: роль динеина и протеинкиназы LOSK - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы