Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование коллекции природных микромицетов и выявление штаммов с антибактериальными и москитоцидными свойствами

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Формирование коллекции природных микромицетов и выявление штаммов с антибактериальными и москитоцидными свойствами"



На правах рукописи

Юскевнч Виктория Викторовна

ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ПРИРОДНЫХ МИКРОМИЦЕТОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ШТАММОВ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ И МОСКИТОЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ

03.02.03 — микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

005050830

Оболенск - 2012

005050830

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Дятлов Иван Алексеевич;

кандидат биологических наук Володпма Лариса Ивановна

Официальные оппопенты:

Теплякова Тамара Владимировна - доктор биологических наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор», заведующая лабораторией микологии отдела биофизики и экологических исследований

Коломбет Любовь Васильевна - доктор биологических наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», учёный секретарь

Ведущая организация:

Институт систематики и экологии животных, Сибирское отделение Российской академии наук

Защита состоится « 1 » марта 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск, info@oho1ensk.org

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ)

Автореферат разослан января 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Фурсова Надежда Константиновна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Микроскопические грибы привлекают всё более пристальное внимание биотехнологов. Они продуцируют биологически активные вещества (БАВ) различной химической природы и специфики действия (антибиотики, ферменты, липиды, алкалоиды и другие метаболиты), нашедшие применение в сельском хозяйстве (Коломбет, 2007), медицине (Holliday, Cleaver, 2008) и пищевой промышленности (Сас-сон, 1987). Доля метаболитов грибов составляет более 50% от всех открываемых биологически активных природных соединений (Бибикова, Катлинский, 2008). Число известных видов грибов увеличивается с каждым годом (Hibbett, 2011) и, вероятно, достигает 1,5 миллионов видов (Hawksworth, 2001). Однако большинство видов микроскопических грибов остаётся ещё слабо изученным и невостребованным потенциалом.

Коллекции чистых культур являются важнейшими средствами для сохранения микробиологических ресурсов и поиска высокоэффективных штаммов грибов - антагонистов, перспективных для создания новых биопрепаратов. В ГНЦ ПМБ сформирована рабочая коллекция мицелиальных грибов. Коллекция создана на основе изолятов из погибших насекомых и образцов почв, собранных в ходе экспедиций в заповедники разных регионов России и СНГ. Целью этих экспедиций являлось создание коллекции культур энтомопатогенных и почвенных грибов из разных природно-климатических зон для последующего их изучения как возможных продуцентов биологически активных веществ. Значительная часть коллекции грибных культур состоит из представителей родов, использующихся в биотехнологической промышленности (при производстве средств защиты растений, антибактериальных препаратов, ферментов и т. д.). Представители рода Cordyceps являются богатыми источниками биологически активных веществ и издавна применяются в традиционной китайской медицине (Holliday, Cleaver, 2008). Экстракты, выделенные из культуры этого гриба, проявляют антиоксидантные, иммуномодулирующие, гипогликемические, гипотензивные, сосудорасширяющие и противораковые свойства, препятствуют процессам старения (Бабицкая и др., 2009).

При проведении научно-исследовательских работ в ГНЦ ПМБ выявлен ряд грибов, обладающих активностью против патогенных микроорганизмов, таких как Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, Pseudomonas ßuorescens, Bacillus cereus и Candida albicans, а также особо опасных патогенов Bacillus anthracis и Francisella tularensis. Кроме того, выявлен ряд штаммов и их метаболитов, активных в отношении личинок кровососущих комаров, которые могут быть использованы для производства инсектицидов нового поколения, не содержащих живых культур. В коллекции содержится также большое количество условно - патогенных грибов, которые могут быть использованы в качестве тест-культур для поиска продуцентов новых противогрибных препаратов.

Главной задачей любой микробиологической коллекции является поддержание и сохранение биологического материала в условиях, обеспечивающих неизменность основных свойств штаммов. Штаммы некоторых видов грибов, заложенные на хранение традиционными методами, не удается сохранить даже на протяжении одного-двух лет. Необходима дополнительная работа по оптимизации защитных сред и режимов заклад-

3

ки на хранение, а также по выбору питательных сред и стадий развития гриба, обеспечивающих наибольшую стабильность в процессе хранения.

Одним из перспективных для длительного хранения мицелиальных культур можно считать метод контактно-сорбционного обезвоживания (КСО). В ГНЦ ПМБ разработан метод КСО с применением ионообменной смолы для бактериальных штаммов (Пат. SU 1831498 A3, 1991). Экспериментально показано, что данный метод применим и для большинства видов мицелиальных грибов. Метод не является энергоемким, не требует сложного технологического и лабораторного оборудования и может быть использован даже в полевых условиях.

Цель исследования — формирование коллекции природных микромицетов, изучение биологических свойств коллекционных культур и отбор штаммов, перспективных для разработки новых бактерицидных, фунгицидных или москитоцидных препаратов.

Задачи исследования:

1. Сформировать коллекцию мицелиальных грибов. Идентифицировать выделенные культуры.

2. Усовершенствовать состав питательной среды для выделения и культивирования мицелиальных грибов.

3. Определить стадии развития грибов, оптимальные для закладки их на длительное хранение.

4. Адаптировать метод контактно-сорбционного обезвоживания для длительного хранения мицелиальных грибов разных таксономических групп.

5. Провести исследование коллекции микромицетов на наличие продуцентов биологически активных веществ, перспективных для разработки новых бактерицидных, фунгицидных и москитоцидных препаратов.

Научная новизна:

Создана коллекция паспортизованных штаммов мицелиальных грибов, являющаяся основой для разработки новых антибактериальных и москитоцидных препаратов.

Показано, что метод контактно-сорбционного обезвоживания обеспечивает длительное хранение (не менее 5 лет) мицелиальных грибов разных таксономических групп без утраты их свойств.

Впервые установлено, что грибы Calcarisporium arbuscula Preuss, Clonostachys candelabrum (Bonord.) Schroers и их метаболиты обладают москитоцидными свойствами.

Установлено, что 19 штаммов грибов, относящихся к классу Ascomycetes, обладают одновременно москитоцидными, бактерицидными и фунгицидными свойствами.

Практическая значимость:

В государственную коллекцию «ГКПМ - Оболенск» депонированы 38 штаммов мицелиальных грибов с высокой антагонистической или москитоцидной активностью.

4

Разработаны методические подходы для долгосрочного хранения мицелиальных грибов, включающие состав питательной среды, стадии развития грибной культуры и метод КСО.

148 культур грибов депонированы и включены в каталог центральной коллекции энтомопатогенных грибов Департамента сельского хозяйства США - ARSEF (международный уровень внедрения) http://arsef.fpsnl.cornell.edu.

Положения, выносимые на защиту:

1. Созданная рабочая коллекция микромицетов, насчитывающая 1336 паспортизованных штаммов, является потенциальным источником для отбора штаммов - продуцентов биологически активных веществ.

2. Метод контактно-сорбционного обезвоживания пригоден для длительного хранения мицелиальных грибов разных таксономических групп.

3. Усовершенствованная питательная среда обеспечивает рост и спорообразование 320 видов микромицетов.

4. Микромицеты, обладающие антагонистической активностью: 120 штаммов с фунгицидной активностью в отношении С. albicans, 202 штамма - антагониста S. aureus, S. marcescens или В. cereus; 105 штаммов - антагонистов В. anthracis, 95 штаммов - антагонистов F, lularensis и 182 штамма с москитоцидной активностью.

Работа выполнена в отделе коллекционных культур ФБУН ГНЦПМБ в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 2011-2015 гг.): НИР 035 «Идентификация и изучение биологических, молекулярно-генетических, биохимических характеристик возбудителя туляремии, в том числе культур с атипичными свойствами», номер гос. регистрации 01201172652; НИР 042 «Совершенствование деятельности коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ в соответствии с современными достижениями науки и технологии», номер гос. регистрации 01201172659; НИР 045 «Разработка и исследование новых дезинфектантов, антимикробных и инсектицидных препаратов», номер гос. регистрации 01201172662; в рамках ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2014 годы)»: государственный контракт № 39-Д от 30.05.2012 «Разработка средств обеззараживания сибиреязвенных почвенных очагов с использованием новых композиций дезинфектантов и биологических препаратов», номер гос. регистрации 01201267512.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором. Экспериментальные результаты, представленные в отдельных главах, получены совместно с сотрудниками ФБУН ГНЦ ПМБ: к.б.н. Л. И. Володиной, к.б.н. В. Е. Лиховидо-вым, Е. В. Быстровой, к.б.н. А. Н. Наумовым, Е. М. Асланян, Н. А. Коробовой, к.м.н. Л. И. Марининым, к.б.н. Н. А. Шишковой, д.б.н. В. М. Павловым, Г. М. Вахрамеевой,

к.б.н. Е. И. Асташкиным, к.б.н. Д. М. Пачкуновым; а также к.б.н. А. В. Александровой (МГУ) и Б. А. Борисовым (ИПЭЭ РАН).

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на семи российских и международных конференциях: УП-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); Международной конференции «Горные экосистемы и их компоненты» (13-18 сентября 2007 г., Нальчик); Междисциплинарном Микологическом Форуме ( 23 апреля 2009 г., Москва); Международной конференции «Почвы и растительный мир горных территорий» (24-29 августа 2009г., Нальчик); Международной научно - практической конференции «Интегрированная защита растений: стратегия и тактика» (5-8 июля 2011 г., Минск); Международном научном симпозиуме «Защита растений: проблемы и перспективы» (29-31 октября 2012 г., Кишинёв); Третьем съезде микологов (12-15 октября 2012 г., Москва).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Учёного совета ГНЦ ПМБ от 15 ноября 2007 г. (протокол № 8, приказ № 135 от 30.11.2007 г.) с изменениями, утверждёнными на заседании Учёного совета ГНЦ ПМБ от 19 ноября 2012 г. (протокол № 11). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 27 от 19 ноября 2012 г.).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 научных публикациях, в том числе в одной статье, опубликованной в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждения, выводы и список литературы, включающий 101 работу отечественных и 123 работы зарубежных авторов, список сокращений и четыре приложения. Работа иллюстрирована 59 рисунками и 14 таблицами. Приложения состоят из списка видов микромицетов, хранящихся в коллекции (А); 38 справок о депонировании (Б); списка штаммов, депонированных в американскую коллекцию энтомопатогенных грибов - АКЗЕР (В) и списка публикаций по теме диссертации (Г).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовали рабочую коллекцию микромицетов, состоящую из 1336 штаммов, относящихся к 333 видам 130 родов. Исследовали биологические свойства 505 штаммов микромицетов, относящихся к 225 видам 115 родов.

Тест - объектами служили бактериальные штаммы, полученные из государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ - Оболенск): P. fluoresces В - 3785, 5. marcescens В - 6498 (АТСС 13880), В. cereus В - 1447, метициллинрезистентный штамм S. aureus В - 4849, вакцинный штамм В. anthracis СТИ - 1, вакцинный штамм F. tularensis 15/10 Paenibacillus macerans В - 1410, Paenibacillus polymyxa В - 1999, Pectobacterium caro-tovorum ssp. carotovorum В - 4966; дрожжи С albicans В - 4845; личинки второго возраста комаров Aedes aegypti, Culex plpiens, Culex piplens molestus, Anopheles messeae. Видовое соответствие тест - культур было проверено с использованием тест - систем PLIVA-LACHEMA, фотометра Multiskan Ascent (Финляндия) и программы «Микроб Автомат», а

также системы MALDI Biotyper.

Полевые образцы погибших насекомых, перед выделением из них грибов, фотографировали на экспедиционной базе в день сбора. Затем мицелий и конидии инокулировали на твёрдую питательную среду в чашки Петри. Посевы инкубировали в термостате при температуре (24 ± 0,5) °С в течение 10 - 20 дней до массового спорообразования. Для выделения чистых культур грибов применяли среды: Сабуро, Чапека, картофельно - декстрозный агар, мальт-экстрат агар, микологический бульон, рисовый агар, среду с добавлением мучного хрущака, среду для энтомофторовых грибов (СМЖ), среду Сабуро с почвенной вытяжкой, модифицированную микологическую среду (ММС). Тест - культуры выращивали на средах: ГРМ - агаре, мясо - пептонном агаре, агаре Хоттингера.

Питательную среду расфасовывали в чашки Петри диаметром 60 мм, установленные с небольшим наклоном. Это позволяло получить свободный от питательной среды участок дна чашки, через который можно было микроскогшровать культуру и следить за процессом

образования конидий, не открывая чашку.

Идентифицировали выделенные культуры по макро - и микроморфологическим признакам. Для детального изучения микроморфологии готовили препараты на стекле, используя молочную кислоту. Микрофотографирование производили с использованием фотоаппарата Olympus, встроенного в микроскоп Биолам П2-1, при общем увеличении в 500 и 1000 раз.

В отдельных случаях, для уточнения видовой принадлежности культур, а также для установления идентичности выделенных анаморфных изолятов собранным телеоморфным образцам использовали молекулярно - генетические методы идентификации - RFLP и RAPD-PCR.

Для хранения штаммов использовали методы криоконсервации, лиофилизации, КСО, а также хранение под минеральным маслом и в дистиллированной воде. Для хранения в жидком азоте использовали в качестве криопротектора 10 % водный раствор глицерина с добав-

7

лением 5% лактозы и ультрабыстрый режим замораживания. При лиофилизации в качестве защитной среды использовали 10 % раствор сахарозы с 1,5 % желатины или 10 % обезжиренное молоко.

При КСО в качестве сорбента влаги использовали ионообменную смолу КБ4-П2. Жизнеспособность проверяли через 1-3 суток после консервации, затем периодически в процессе хранения.

Стабильность биологических свойств штаммов оценивали по морфологическим характеристикам при высеве на стандартные питательные среды и наличию антагонистической активности после длительного хранения.

Для определения антимикробного спектра действия грибных культур использовали метод блоков, основанный на способности веществ диффундировать в толщу агара и задерживать рост тест-объектов, находящихся в зоне диффузии. Тестируемые штаммы культивировали на агаризованной питательной среде ММС в течение 5-13 дней. Вырезанные из агара блоки с исследуемой культурой гриба помещали на засеянные и подсушенные газоны тест-культуры. Каждый опыт проводили в трёх давторностях. Активность грибных штаммов определяли по среднему значению диаметра зоны подавления роста микробных культур.

Москитоцидную активность определяли на личинках второго возраста комаров Aedes aegypti, Culex pipiens, Culex pipiens molestus, Anopheles messeae. На первом этапе определяли активность мицелиальной культуры, выращенной на плотной агаризованной среде ММС до стадии массового спорообразования. Культуру с агара смывали дистиллированной водой. Концентрацию суспензии доводили до 1 х 106 конидий. Разливали по 1 мл смыва конидий в три лунки 24 - луночных планшетов с диаметром лунок 16 мм. В каждую лунку помещали по 10 личинок комаров второго возраста Планшеты инкубировали в термостате при 25° С. Контролем служили личинки, помещённые в 3 лунки с дистиллированной водой. Наблюдение проводили в течение первых суток каждые 30 минут, затем ежесуточно в течение четырёх суток. Производили подсчёт живых и погибших личинок. Оценивали активность мицелиальной культуры грибов по времени наступления гибели 50 % личинок (средне-летальное время смертности LT50). Штаммы, вызывающие гибель личинок комаров в течение первых суток, отмечали как высокоактивные.

На втором этапе определяли активность инсектицидных метаболитов в супернатанте культуральной жидкости по величине средне-летальной концентрации (LC50). Исследовали штаммы, у которых была выявлена активность на первом этапе. Наработку биомассы проводили в качалочных колбах на среде следующего состава (г/л): соевая мука - 20.0; дрожжевой экстракт - 8.0; глюкоза - 30.0; КН2Р04 - 3.0; MgS04 - 0.7. Культивирование проводили при температуре 23°С и pH среды - 6.0 на микробиологической качалке в течение 3-5 дней до выхода культуры на стационарную фазу роста и образования бластоспор. Культуральную жидкость центрифугировали. Для определения LC50 использовали ряд последовательных двукратных разведений супернатанта водой. Далее исследования проводили по методике, описанной для оценки смывов грибов с плотной питательной среды. Смертность личинок учитывали через 24 часа. Подсчет LC50 и LT50 проводили по методу Кербера.

Результаты исследований и их обсуждение Формирование коллекции

На начальных этапах работы коллекцию формировали из изолятов, выделенных из полевых образцов, собранных во время экспедиций в заповедники Приморского Края, Курильских островов, Краснодарского края, Абхазии, Астраханской области, Украины и Белоруссии. За время полевых работ собрали более 2000 погибших насекомых и около 500 образцов почв, из которых нам удалось выделить свыше 1000 изолятов мицели-альных грибов.

Кроме того, в состав коллекции вошли 44 штамма, полученные из отдела средств защиты растений ВНИИПМ, хранившиеся под вазелиновым маслом с 1983 - 2005 гг. и 6 штаммов, заложенные в тот же период на ионообменную смолу. В рамках совместной работы по проекту МНТЦ № 2338 «Энтомопатогенные грибы и их метаболиты» из Американской коллекции ARSEF были получены 125 штаммов энтомопатогенных грибов.

В дальнейшем коллекцию пополняли изолятами из образцов, собранных преимущественно в Московской области, а также грибами, выделенными Александровой A.B. из почв Южного Вьетнама, Якутии, Красноярского края, Ленинградской, Тверской, Астраханской, Ростовской областей и полученными нами в рамках сотрудничества с кафедрой микологии и альгологии МГУ.

На насекомых, собранных в ходе экспедиций, чаще всего встречались анаморфные виды родов Isaria, Paecilomyces, Beauvería, Lecanicillium. Выделили 122 микромицета, относящихся к роду Lecanicillium, 190 штаммов Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., 86 штаммов Isaria farinosa (Holmsk.) Fr. Часто встречались виды I. tenuipes (Peck) Samson, и I. fumosorosea Wize.

Наибольшее количество видов Cordyceps - подобных грибов и их анаморф собрали во время экспедиций на Дальний Восток. В неисследованном прежде Лазовском заповеднике было найдено, по меньшей мере, 32 вида грибов этой группы. Представителей этого рода находили также в горных лесах на Западном Кавказе, в Сочинском и Мостовском районах Краснодарского края. Из них Ophiocordyceps corallomyces (А. Moller) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora и O. stylophora (Berk. & Broome) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora были известны ранее в России только на юге Дальнего Востока. К сожалению, многие виды, например, О. nutans (Pat.) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora, который часто встречался в Приморском Крае, выделить в культуру из стром не удалось. Успешно выделяли С. militaris (L.) Link и Elaphocordyceps ophioglossoides (Ehrh.) G.H. Sung, J.M. Sung & Spatafora (рисунки 1, 2).

При обработке полевых образцов выделили изоляты редких грибов, ранее известных по единичным находкам: Evlachovaea spp. (Borisov, 1999), Paecilomyces borystheni-ctis B.A. Borisov & Tarasov (Borisov, 1997).

Рисунок 1 - Cordyceps militaris F-854, Рисунок 2 - Elaphocordyceps ophioglossoides

средаMMC, 16 суток (ув. 1000) F-147, средаММС, 16 суток (ув. 1000)

Впервые на территории России (в Сочинском районе) найден 1 экземпляр ана-морфного гриба Isaria coleopterora (Samson & Н.С. Evans) Samson & Hywel-Jones, обнаруживаемый обычно в тропических регионах (рисунки 3, 4).

Рисунок 3 - Isaria coleopterora Рисунок 4 - Isaria coleopterora

F- 531 на среде MMC, 21 сутки F- 531, среда MMC, 16 суток (ув. 1000)

В 2001 и 2002 г. выделение грибов в культуру проводили в лабораторных условиях через 40-90 дней после сбора образцов погибших насекомых или стром аскомицетов.

Для более успешного изолирования энтомопатогенных грибов разработали специальный состав питательной среды (ММС), позволяющий выделять в культуру микро-мицеты в экспедиционных условиях. Во время экспедиций, проводившихся в 2004-2005 годах, высевы микологического материала производили на твёрдые питательные среды непосредственно в дни сбора полевых образцов. Изояяты закладывали на хранение на ионообменную смолу в пенициллиновые флаконы прямо в полевых условиях. Эти методические приёмы позволили увеличить результативность выделения микромицетов в чистую культуру с 10 - 20% в 2001 - 2002 гг. до 56 - 74 % в 2004 - 2005 гг. (Володина и др.. 2009).

Идентификация выделенных изолятов

Идентификация анаморфных грибов основана на изучении макро- и микроморфологических признаков. Для того, чтобы стандартизировать полученные результаты, выделенные изоляты пересевали на стандартные питательные среды: Чапека, Сабуро и картофельно - декстрозный агар (Саттон и др., 2001). Идентификацию проводили совместно со специалистами - микологами А. В. Александровой (МГУ) и Б. А. Борисовым (ИПЭЭ РАН). Грибы идентифицировали, используя литературу отечественных и зарубежных авторов. По морфологическим признакам идентифицировали до вида 1270 штаммов и до рода - 66 штаммов.

Для уточнения видовой принадлежности ряда культур, относящихся к родам Веаи-veria, Lecanicillium, Paecilomyces, Cordyceps, Evlachovaea проводили совместную работу с группой молекулярно-генетической идентификации отдела молекулярной микробиологии ГНЦ ПМБ. В результате исследований, проведённых молекулярно-генетическими методами, основанными на PCR (методы RFLP и RAPD-PCR), идентифицировали 116 штаммов микромицетов.

Номенклатура микромицетов уточнена по электронным базам данных Index Fungo-rum http://www.indexfungorum.org и MycoBank http://www.mycobank.org по состоянию на 1 ноября 2012 г.

Состав и паспортизация коллекции

Большую часть коллекции составляют энтомопатогенные грибы (717 штаммов 83 видов 23 родов), выделенные из погибших насекомых, и микромицеты, выделенные из образцов почв, собранных во время экспедиций. В основном, это грибы, являющиеся бесполой стадией развития грибов класса Ascomycetes, и несколько родов класса Zygomycetes (Batkoa, Conidiobolus, Absidia, Gongronella, Mortierella и Zygorhynchus). На сегодняшний день общий номенклатурный объём коллекции составляет 1336 штаммов микромицетов, относящихся к 333 видам 130 родов. 787 штаммов 22 родов являются условно патогенными и могут быть использованы в качестве тест — культур при поиске продуцентов и разработке новых фунгицидов. Штаммы паспортизованы, создан электронный каталог коллекции.

Оптимизация состава питательных сред

Для выделения грибов в культуру применяли традиционные агаризованные питательные среды Сабуро, Чапека, картофельно - декстрозный, рисовый и мальт-агар; среды, содержащие хитин и почвенный экстракт, а также среду с яичным желтком. При этом выделить мицелиапьные грибы в культуру удавалось не всегда. По данным Papie-rok и Hajek (Papierok et al., 1997), для выделения, например, энтомофторовых грибов, классические микологические среды неприемлемы, так как рост на них бедный, либо вообще отсутствует. Такие грибы нуждаются в богатых питательных средах, что обес-

11

печивается добавлением яичных желтков, витаминов и аминокислот, а в отдельных случаях - тканей насекомых. Однако приготовление таких питательных сред довольно трудоёмко и не всегда точно воспроизводимо.

В процессе работы было обнаружено, что среда Сабуро позволяет получать достаточное количество грибной биомассы, но не все культуры на этой среде достаточно быстро образуют споры, что совпадает с литературными данными (Саттон и др., 2001). Быстрое спорообразование обеспечивает среда Чапека, но рост на этой среде скудный. Для выделения грибов из полевых образцов и дальнейшего культивирования разработали питательную среду ММС следующего состава, (г/л): NaN03 — 2.0; КС1 — 0,5; FeS04 х 7Н20 — 0,01; MgS04 х 7Н20 - 0,5; КН2Р04— 1,0; глюкоза — 10.0; мальтоза — 10.0 мясной пептон — 5,0; дрожжевой экстракт— 5,0; бактериальный агар — 15,0; ген-тамицин — 0.04 мг/мл. Конечное значение рН - 7,3 ± 0,2. Гентамицин не оказывал влияния на рост и развитие грибов, и в то же время эффективно подавлял рост бактерий.

При сравнении роста и развития микромицетов на питательных средах Чапека, Сабуро и ММС, оказалось, что даже при одинаковом нарастании грибной биомассы на средах ММС и Сабуро, появление спор на среде Сабуро происходило позже, чем на модифицированной среде. Сравнивая рост исследуемых культур на средах ММС и Чапека, можно сделать вывод, что при одинаковых сроках спорообразования, нарастание грибной биомассы было большим на ММС, чем на среде Чапека (таблица 1).

На рисунках 5, 6 в качестве примера показан рост на обеих средах гриба Simplicil-lium lamellicola (F.E.V. Sm.) Zare & W. Gams.

Рисунок 5 - ЭтрИсИИит 1атеШсо1а, Рисунок 6 - ЗтрИсИИит 1атеШсо1а

Р-504, среда ММС, 7 сут Р-504, среда Чапека, 7 сут

В дальнейшей работе использовали среду ММС как для выделения культур из собранных в экспедициях образцов, так и для культивирования всех коллекционных штаммов. Она является достаточно богатой и стандартизованной питательной средой и позволяет в короткие сроки получить достаточное количество спор, необходимое для закладки культуры на длительное хранение. При проверке грибов на антагонистческую активность тестируемые грибы выращивали на среде ММС без добавления гентамици-на. Данные о росте и развитии некоторых грибов на разных средах представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Сравнение роста и развития микромицетов на разных питательных средах

Род, вид MMC Чапека Сабуро

Рост Появление спор, сутки Рост Появление спор, сутки Рост Появление спор, сутки

Fusarium solani (Mart.) Sacc. +++* 3 + 3 ++ 6

Fusarium sporotrichioides Sherb. +++ 3 ++ 3 ++ 9

Fusarium culmorum (W.G. Sm.) Sacc. +++ 3 + 3 +++ 6

Geomyces pannorum (Link) Sigler & J.W. Carmich. +++ 5 ++ 5 +++ 9

Cordyceps militaris (L.) Link +++ 7 ++ 7 ++ 14

Beauveria amorpha (Höhn.) Samson & H.C. Evans +++ 7 ++ 7 +++ 10

Mariannaea elegans (Corda) Samson +++ 6 + 6 ++ 10

Tolypocladium geodes W. Gams +++ 6 ++ 6 +++ 14

Arthrobotrys oviformis Soprunov -H-+ 7 ++ 7 +++ 14

Примечание: * (+) - скудный рост, (++) - слабый рост, (+++) - обильный рост

Определение стадий развития грибов разных таксономических групп, оптимальных для закладки их на длительное хранение

Хранение культур мицелиальных грибов в коллекции осуществляется дублировано, несколькими способами. С целью обеспечения долговременного сохранения грибов испытаны разные способы хранения - криоконсервация, сублимационное высушивание, хранение под минеральным маслом, в дистиллированной воде, на ионообменной смоле. Все способы оказались приемлемыми и используются для хранения грибов.

Исследовали возможность хранения грибов на разных стадиях развития. В процессе работы выяснили, что самой оптимальной для консервации культур является стадия массового спорообразования, когда конидиогенные структуры хорошо сформированы. Для большинства анаморфных грибов при культивировании их на твёрдых питательных средах она наступает на 10 — 14 сутки. Зрелые конидии успешно сохраняются всеми способами: под минеральным маслом, в дистиллированной воде, в жидком азоте, в лиофилизированном виде, при минус 80 °С и на ионообменной смоле.

Гриб Botrytis cinerea Pers., образующий в чистой культуре склероции, на ионообменной смоле сохранил жизнеспособность в течение 5 лет. По данным Иванушкиной с соавторами, при хранении на силикагеле грибы рода Botrytis оказались наименее устойчивыми из всех других грибов, и даже при низкотемпературном хранении только 60%

изученных штаммов этого рода сохраняли жизнеспособность в течение 10 лет (Ива-нушкина и др., 2010).

Энтомопатогенные грибы родов СотсИоЬо1ия и Всикоа, образующие покоящиеся споры, а также штаммы, не образовывавшие конидий на всех опробованных средах, лучше всего хранились в стадии мицелия в дистиллированной воде (не менее 1 года). НитЬег отмечает, что хранение в воде может быть приемлемо почти для всех микроми-цетов, особенно для сохранения энтомофторовых грибов, и для успешного сохранения культур объём воды должен примерно в 40 раз превышать объём закладываемого материала (НитЬег, 1997).

Сравнение метода контактно -сорбционного обезвоживания с общепринятыми методами хранения микромицетов

Для криоконсервации микромицетов использовали 10 % водный раствор глицерина с добавлением 5% лактозы в качестве криопротектора и ультрабыстрый режим замораживания. Все культуры, заложенные на хранение в жидкий азот, оказались жизнеспособными, независимо от срока хранения.

Для сублимационного высушивания в качестве защитной среды использовали 10 % раствор сахарозы с 1,5 % желатины или 10 % обезжиренное молоко. При проверке жизнеспособности разницы при использовании обеих защитных сред не наблюдали. Все культуры, образующие конидии, успешно сохраняли в лиофилизированном виде, кроме некоторых, представленных в таблице 2. Не удалось также сохранить этим способом энтомофторовые грибы, что соответствует данным других исследователей. Ива-нушкина с соавторами отмечают, что грибы рода СотсИоЬокю и другие виды Еп1оторк-МогЫея теряют жизнеспособность уже в процессе лиофилизации (Иванушкина и др., 2010). НитЬег также отмечает, что энтомофторовые грибы плохо сохраняются в лиофилизированном виде (НитЬег, 1997).

Контрольные высевы показали, что конидии коллекционных штаммов грибов под вазелиновым маслом успешно хранились в течение 5 лет, что совпадает с литературными данными (НитЬег, 1997). Исключением являлись три штамма 1атеШсо1а, которые оказались нежизнеспособными после 44 месяцев хранения, и один штамм Сот<ИоЪо1из ер., не сохранившийся под маслом в течение 1 года.

Достаточно простым в применении является метод хранения культур в высушенном состоянии на адсорбентах. В качестве носителей и адсорбентов используют почву, кварцевый песок, вату, фильтровальную бумагу и др. Указанные носители плохо поддаются стандартизации и, полученные с их использованием, результаты трудно воспроизводимы. Чаще используется КСО с применением стандартных искусственных сорбентов - силикагеля для грибов (Иванушкина и др., 2010) и ионообменной смолы для бактерий. В литературных источниках не найдено упоминаний об использовании ионообменной смолы для хранения грибов.

В исследовании использовали методику КСО на ионообменной смоле марки КБ4-П2 с высокой влагоёмкостью, разработанную сотрудниками ГНЦ ПМБ для хранения

14

бактериальных штаммов (Пат. SU 1831498 A3, 1991). В ходе работы, на разных сроках хранения (от 5 до 18 лет) проверили жизнеспособность 166 штаммов мицелиальных грибов, относящихся к 56 видам 31 рода. Все исследованные культуры сохранили жизнеспособность в течение всех сроков наблюдения. Исключением являлись энтомофто-ровые грибы родов Batkoa и Conidiobolus, а также грибы рода Nectria, образующие многоклеточные макроконидии. Для восстановления штаммов после хранения на ионообменной смоле требовалась разная продолжительность периода регидратации, от одного часа до 14 суток.

В таблице 2 приведены сравнительные данные по проверке жизнеспособности некоторых представителей микромицетов. При контрольных высевах культуры, представленные в таблице, дольше сохраняли жизнеспособность при хранении на ионообменной смоле, чем высушенные лиофильно.

Таблица 2 - Сравнение жизнеспособности микромицетов, заложенных на хранение двумя способами

Вид микромицета Кол. № F- Способ хранения

В лиофилизированном виде На смоле

Срок набл. (мес.) Наличие роста Срок набл. (мес.) Наличие роста

Lecanicillium aphanocladii Zare & W. Gams 252 56 - 90 +

Lecanicillium longisporum (Petch) Zare & W. Gams 224 56 - 84 +

Chaetomium globosum Kunze 51 86 - 96 +

Paecilomyces borysthenicus B.A. Borisov & Tarasov 1063 36 - 41 +

Paecilomyces marquandii (Massee) S. Hughes 266 45 - 82 +

Морфолого - культуральные свойства изученных штаммов после хранения на ионообменной смоле не изменялись. У штаммов микромицетов, обладающих антагонистическими свойствами, после длительного хранения на смоле эти свойства сохранялись на том же уровне, причем в первом пассаже, тогда как после хранения под минеральным маслом нередко культуру приходилось пересевать 2-3 раза, чтобы восстановить исходные свойства. Для культур грибов, не образующих конидии, способ КСО оказался неприемлем. Для хранения мицелия таких культур использовали воду или замораживание при минус 80 °С. По данным Н. Е. Иванушкиной с соавторами (Ивануш-кина и др., 2010), оптимальной для хранения мицелиальных грибов на силикагеле является температура минус 150 °С, однако многие грибы способны храниться и при 4°С. Ластра с соавторами (Lastra et al., 2002) отмечали, что штаммы Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokln сохраняли жизнеспособность на силикагеле при 4 °С в течение 3, а

Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & W. Gams - 12 месяцев. В наших опытах штаммы этих же видов грибов, заложенные на хранение на ионообменной смоле, при той же температуре сохраняли жизнеспособность 120 и 96 месяцев, соответственно.

В коллекции заложены на хранение методом КСО 120 видов мицелиальных грибов. К преимуществам данного метода следует отнести низкую себестоимость, так как метод не требует применения дорогостоящего оборудования; возможность хранения при температуре 4 компактность хранящегося материала; длительность промежутков между перезакладками на новые сроки; удобство при пересылке культур. Простота метода позволяет использовать его в полевых условиях. Продемонстрировали возможность применения этого метода для длительного хранения (не менее 3,5 лет) аскоспор рода Cordyceps, заложенных на хранение во время экспедиций.

Антагонистические свойства грибов по отношению к микроорганизмам медицинского значения. Грибы являются продуцентами большого количества антибиотически активных веществ. Изучение антибактериальной активности мицелиальных грибов в отношении грамположительных кокков проводили на метициллинрезистент-ном штамме S. aureus В - 4849. В результате исследований выявили 120 штаммов 64 видов 26 родов грибов - антагонистов, обладающих бактерицидной активностью. Штаммы с зонами подавления 15 мм и выше обнаружены в родах Acrostalagmus, Chaetomium, Clonostachys, Cylindrocarpon, Drechmeria, Fusarium, Gongronella, Hamigera, Humicola, Malbranchea, Metarhizium, Microdochium, Nodulisporium, Oidiodendron, Pestalotiopsis, Plesiospora, Simplicillium, Stilbella, Trichoderma. Высокоактивными no отношению к 5. aureus являются штаммы Trichoderma harzianum Rifai, S. lamellicola, Purpureocillium lilacinum (Thorn) Luangsa-ard, Houbraken, Hywel-Jones & Samson.

Пример антагонизма приведен на фотографии (рисунок 7). На рисунке 8 представлена микрофотография гриба - антагониста Simplicillium lamellicola.

Анализ коллекции на антибиотическую и москитоцидную активности

Рисунок 7 - Зоны подавления роста S. aureus грибом Simplicillium lamellicola (две повторности)

Рисунок 8 - Simplicillium lamellicola, среда ММС, 12суток (ув. 1000)

Исследование антагонистической активности мицелиальных грибов в отношении грамотрицательных бактерий проводили на культуре S. marcescens В - 6498 (АТСС 13880), относящейся к группе энтеробактерий. Исследовали 245 штаммов микромице-тов - представителей 96 видов 35 родов. В результате выявили 25 культур, относящихся к 21 виду 17 родов: Acremonium, Acrostalagmus, Arachnoderma, Aspergillus, Aureobasi-dium, Cosmospora, Cylindrocarpon, Fusarium, Gongronella, Humicola, Lecanicillium, Mi-crodochium, Pénicillium, Pestalotiopsis, Phoma, Purpureocillium, Trichoderma, обладающих антагонистическими свойствами в отношении данного патогена. Результаты исследований представлены на диаграмме (рисунок 9). Вариация размера зон подавления тест — культуры между штаммами в пределах вида отмечена разными цветами. Почти все штаммы оказались высокоактивными (зоны подавления роста S. marcescens 20 мм и выше). Культуры, подавляющие рост S. marcescens, проявляли также антагонистическую активность и в отношении метициллинрезистентного штамма S. aureus, за исключением Trichoderma viride Pers., Pénicillium sp. и Phoma herbarum Westend..

Рисунок 9 - Микромицеты - антагонисты S. marcescens. Min - зона подавления тест-культуры штаммом гриба с наименьшей активностью, шах - зона подавления тест-культуры штаммом гриба того же вида с наибольшей активностью

Культуру В. cereus В - 1447 использовали в качестве тест-объекта для изучения коллекционных штаммов микромицетов на наличие антагонистических свойств в отношении бацилл. Из исследованных 245 штаммов мицелиальных грибов, выявили наличие активности у 95 культур, которые относятся к 54 видам 25 родов.

Самые высокие зоны подавления роста патогена отмечены у микромицетов в родах Aspergillus, Beauveria, Clonostachys, Oedocephalum, Pénicillium, Simplicillium, Tricho-

derma. Исследования Семёновой и Семёнова подтверждают способность гриба Т. viride подавлять развитие культуры В. cereus в почвенных моделях бинарных культур (Семёнова, Семёнов, 2012).

В результате исследований не обнаружили чёткой корреляции между наличием у мицелиальных грибов ингибирующих свойств, проявленных в отношении бацилл В. cereus и В. anthracis.

Для изучения микромицетов на наличие антагонистической активности по отношению к возбудителю сибирской язвы, в качестве тест - объекта использовали вакцинный штамм В. anthracis СТИ - 1. Оказалось, что культуры микромицетов проявляли ин-гибирующее действие в отношении возбудителя сибирской язвы, подавляя прорастание спор В. anthracis.

Активность штаммов грибов определяли по диаметру зоны подавления роста бактериальной культуры. Диаметр зоны подавления роста от 21 мм и более принимали за высокую активность, 10-20 мм - за умеренную, 8 - 9 мм - за низкую активность. Исследовали 505 грибных штаммов, относящихся к 225 видам 115 родов. Активными против возбудителя сибирской язвы В. anthracis оказались 105 штаммов, относящихся к 69 видам 33 родов. Из них 15 штаммов показали высокую активность. 85 штаммов оказались умеренно активными и 5 штаммов проявили слабую активность. Примеры зон подавления представлены на фотографиях (рисунки 10, 11).

©

Рисунок 10 - Зоны подавления роста В. anthracis грибами:

1 - Drechmeria coniospora (Drechsler) W. Garns & H.-B. Jansson

2 - Ophiocordyceps variabilis

(Petch) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora

3 - Simplicillium sp.

4 - Metarhizium anisoplia (Metschn.) Sorokln

Рисунок 11 - Зоны подавления роста В. anthracis грибом Pénicillium brevicompactum Dierckx (две повторное™)

Наибольшее количество активных видов и штаммов обнаруживается среди почвенных грибов родов Pénicillium (13 видов, 24 штамма) и Trichoderma (7 видов, 17 штаммов). Штаммами с максимальными зонами подавления роста патогена являлись Pénicillium chrysogenum Thom (40 мм) и Р. vulpinum (Cooke & Massee) Seifert & Samson (30 мм); Trichoderma koningii Oudem. (40 мм) и T. harzianum (30 мм). Грибы - антагонисты с высокой ингибирующей активностью отмечаются также в родах Acrostalagmus, Aspergillus, Chaetomium, Hamigera и Paecilomyces.

Штаммы с умеренной активностью обнаружены в родах Beauveria, Geotrichum, Metacordyceps, Metarhizium, Ophiocordyceps Drechmeria, Harposporium, Tolypocladium, Simplicillium, Stibella, Lecanicillium, Cosmospora, Fusarium, Nodulisporium, Purpureocil-lium, Pestalotiopsis, Polycephalomyces, Pseudallescheria, Rotiferophthora, Scopulariopsis, Stachybotrys, Ulocladium.

Среди микроорганизмов, подавляющих развитие возбудителя туляремии, микро-мицеты являются наименее изученной группой. В качестве тест -культуры возбудителя туляремии F. tularensis использовали вакцинный штамм 15/10.

Были исследованы 505 штаммов грибов. Выявили 95 культур, проявляющих антагонистические свойства в отношении F. tularensis. Из них 41 культура показала высокую активность, 54 штамма оказались умеренно активными. Штаммы - антагонисты являются представителями 54 видов 27 родов: Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Beauveria, Calcarisporum, Chaetomium, Clonostachys, Cosmospora, Cylindrocarpon, Drechmeria, Fusarium, Hamigera, Humicola, Metarhizium, Microdochium, Nodulisporium, Paecilomyces, Pénicillium, Pestalotiopsis, Pseudallescheria, Purpureocillium, Simplicillium, Stibella, Synnematium, Tolypocladium, Trichoderma, и Ulocladium.

Наибольшее количество активных штаммов отмечено в родах Clonostachys (6 штаммов), Pénicillium (26 штаммов), Trichoderma (13 штаммов), Fusarium (8 штаммов), Aspergillus (7 штаммов) и Metarhizium (6 штаммов). Наиболее высокую активность проявляли грибы Clonostachys candelabrum. Диаметр зоны подавления роста патогена составил для этих штаммов 42 - 50 мм. Высокоактивными являлись также штаммы В. bas-siana (30 мм), Acremonium pteridii W. Gams & J.C. Frankland (30 мм), Calcarisporum ar-buscula Preuss (35 мм), Cosmospora berkeleyana (P. Karst.) Grafenhan, Seifert & Schroers (30 mm), Fusarium oxysporum Schltdl. (33 мм), Humicola fuscoatra Traaen (32 мм), Microdochium bolleyi (R. Sprague) de Hoog et Herm.-Nijh. (30 мм), P. brevicompactum (30 мм), P. chrysogenum (30 мм), P. vulpinum (42 мм), P. lilacinum (32 мм), T. harzianum и T. aspe-rellum Samuels, Lieckf. & Nirenberg с одинаковой зоной просветления 40 мм.

Исследование мицелиальных грибов на наличие фунгицидных свойств проводили на культуре С. albicans В - 4845. Изучили 505 штаммов 225 видов 115 родов микроми-цетов. Фунгицидные свойства проявляли 120 штаммов, относящихся к 62 видам 24 родов. Наиболее высокой антагонистической активностью (диаметр зоны подавления роста тест - культуры 15 мм и выше) обладали 36 культур 20 видов (диаграмма на рисунке 12). Они относятся к 10 родам микромицетов: Aspergillus, Calcarisporum, Clonostachys, Malbranchea, Mariannaea, Metarhizium, Plesiospora, Trichoderma, Pénicillium, Purpureocillium. Высокоактивные штаммы микромицетов, обладающие сильно выраженными фунгицидными свойствами, можно рассматривать как перспективные для разработки новых противогрибных препаратов.

Рисунок 12 - Наиболее активные грибы - антагонисты С. albicans. Min - зона подавления тест-культуры штаммом гриба с наименьшей активностью, max - зона подавления тест-культуры штаммом гриба того же вида с наибольшей активностью

Антагонистические свойства грибов по отношению к фитопатогенным бактериям. В качестве тест-объектов были выбраны бактериальные культуры, вызывающие мягкие гнили овощей и луковичных P. fluorescens (В - 3785), P. carotovorum ssp. caroto-vorum (В - 4966), P. polymixa (В - 1999), а также P. macerans (B - 1410) - патоген льна Исследовали 125 штаммов грибов, антагонистическая активность выявлена у 40 штаммов, относящихся к 33 видам 20 родов. Наиболее активными в отношении сразу нескольких возбудителей болезней растений оказались штаммы грибов A. pteridii, Clonostachys candelabrum (Bonord.) Schroers, M. anisopliae, Hamigera avellanea (Thom & Turesson) Stolk & Samson, M. bolleyi, P. vulpinum, P. herbarum и нескольких видов рода Trichoderma.

Москитоцидные свойства мицелиальных грибов. Москитоцидную активность штаммов определяли на личинках второго возраста комара Aedes aegypti, являющегося переносчиком жёлтой лихорадки и других тропических лихорадок. Тестируемые штаммы классифицировали по активности: LT50< 24 часа и LC50 < 10 % разведенного супер-натанта на первый день учета - высокоактивные; LT50 < 120 часов и LC50 1< 50 % от разведенного супернатанта - умеренно активные. Из исследованных нами 505 штаммов активностью в отношении личинок кровососущих комаров Aedes aegypti обладали 182 штамма 48 родов микромицетов, из них 117 штаммов с высокой активностью и 65 умеренно активных штаммов. Штаммы с высокой москитоцидной активностью выявлены в

родах Aspergillus, Beauveria, Calcarisporium, Chaunopycnis, Chrisosporium, Clonostachys, Cordyceps, Engyodontium, Evlachovaea, Fusarium, Geomyces, Harposporium, Malbranchea, Metarhizium, Paecilomyces, Polycephalomyces, Pénicillium, Sintplicillium и других. Москитоцидные свойства некоторых грибов этого списка (в тексте они выделены) в литературе не описаны.

Информация о наиболее активных штаммах представлена в таблице 3.

Таблица 3 - Микромицеты с высокой москитоцидной активностью

Штаммы грибов LTJO, сутки LCÎO,%

Calcarisporium arbuscula Preuss, шт.1 0,5 5,5 ±0,4

Chrisosporium keratinophilum D. Frey ex J.W. Carmich., urr.l 0,5 10,0 ±0,6

Clonostachys candelabrum (Bonord.) Schroers, шт.1 0,5 8,5 ± 0, 7

Clonostachys rosea (Link) Schroers, Samuels, Seifert & W. Gams, шт.1 0,5 35,0 ±2,4

Clonostachys rosea, шт.2 0,6 22,5 ± 1,6

Clonostachys rosea, шт.З 0,5 20,0 ± 1,4

Engyodontium album (Limber) de Hoog, шт. 1 1,2 *

Lecanicillium muscarium (Petch) Zare & W. Gams, шт.1 1,2 *

Metarhiziumflavoviride W. Gams &Rozsypal, шт. 1 0,5 10,0 ±0,6

Isaria farinosa (Holmsk.) Fr., шт. 1 0,7 12,0 ± 1, 1

Isaria farinosa, шт. 2 1,2 31,0±1, 1

Pestalotiopsis maculans (Corda) Nag Raj, шт. 1 1,0 10,5 ± 0, 8

Polycephalomyces sp., шт. 1 1,2 *

Polycephalomyces sp., шт.2 1,0 *

Tolypocladium cylindrosporum W. Gams, urr.l 0,5 10,2 ±0, 8

Tolypocladium cylindrosporum, шт.2 1,1 *

Tolypocladium inflatum W. Gams, urr.l 1,2 10,0 ±0,8

Tolypocladium inflatum, шт.2 1,2 10,0 ±0,7

Tolipocladium sp., шт.1 0,8 9,0 ± 0, 6

Примечание: * - активность супернатанта культуральной жидкости отсутствует

Для энтомопатогенных грибов, представленных в таблице 3, активность супернатанта культуральной жидкости составляла LC50 = 5,5-35,0 %; активность смывов LT50 = 0,5-1,2 суток. Наивысшей активностью из этого списка обладали грибы С. arbuscula (LC50 = 5,5 %, LT50= 0,5 суток) и С. candelabrum (LCSo= 8,5 %, LT50 = 0,5 суток). Проверено действие супернатанта культуральной жидкости обоих штаммов на личинках второго возраста четырех видов комаров. Полученные результаты представлены на диаграмме (рисунок 13).

эе

а:

Aedes Culex pipiens Culex pipiens Anopheles aegypti molestus messeae

Вид комаров

aClonostachys candelabrum

aCalcarisporium arbuscula

Рисунок 13 - Москитоцидная активность грибов С. arbuscula и С. candelabrum в отношении разных видов комаров

Активность супернатанта культуральной жидкости гриба С. candelabrum против личинок второго возраста комаров разных видов составляет 8,5 - 15,3 %, гриба С. arbus-cuja _ 5,5 . 6,1 %. Полученные результаты свидетельствуют о том, что оба гриба обладают высокой москитоцидной активностью в отношении личинок различных видов комаров, включая переносчиков малярии и других опасных возбудителей болезней человека и теплокровных животных. Эти грибы следует рассматривать как наиболее перспективные для разработки москитоцидных препаратов метаболитного действия. На рисунках 14 и 15 представлены микрофотографии обеих культур.

Рисунок 14 С. candelabrum, среда ММС, 12 суток (ув.500)

Эти штаммы были переданы в группу биохимического анализа лаборатории биоинсектицидных препаратов для получения метаболитов. В результате очистки и фракционирования полученных из этих грибов экстрактов, из них выделили активные вещества обладающие москитоцидной активностью. На основе коллекционных штаммов

Рисунок 15 С. arbuscula, среда ММС, 12 суток (ув.ЮОО)

грибов С. arbuscula и С. candelabrum и их метаболитов, лабораторией инсектицидных биопрепаратов были получены 2 патента Российской Федерации.

В ходе наших исследований было выявлено, что 19 штаммов грибов, относящихся к классу Ascomycetes, обладают одновременно москитоцидными, бактерицидными и фунгицидными свойствами, например, S. lamellicola, С. berkeleyanum, M. flavoviride, P. lilacinum.

Скринингом на наличие антагонистической и москитоцидной активности было охвачено 37 % коллекционных штаммов. В результате проведённых исследований выявлено в отношении каждого из исследованных тест - объектов порядка 100 культур-антагонистов. Наличие высокоактивных грибов - антагонистов сибиреязвенных бацилл среди родов почвенных грибов Pénicillium, Hamigera, Trichoderma может сыграть немаловажную роль при разработке методов и средств биологической санации скотомогильников и оздоровления почвенных территорий, загрязненных возбудителями инфекционных заболеваний. Поскольку почва является естественной средой обитания грибов, их действие может быть долговременным, а кроме того, экономически выгодным и экологически целесообразным.

Культуры с высокой бактерицидной, фунгицидной и / или москитоцидной активностью (38 штаммов) депонированы в государственную коллекцию «ГКПМ-Оболенск» в качестве потенциальных продуцентов новых биопрепаратов.

148 коллекционных штаммов депонированы в ARSEF (центральную коллекцию энтомопатогенных грибов Департамента Сельского хозяйства США). Перечень принятых на хранение штаммов приведён в каталоге ARSEF 2012 г. http://arsef.fpsnl.cornell.edu.

Учитывая огромное биоразнообразие грибов, всё ещё остаётся большое количество не изученных или слабо изученных видов. Кроме того, разные штаммы одного вида значительно различаются по диаметру зоны подавления тест - культуры, что свидетельствует о целесообразности изучения широкого набора штаммов в пределах вида и продолжения работы по поиску природных источников биологически активных веществ.

ВЫВОДЫ

1. В результате выделения и идентификации природных изолятов микромицетов создана рабочая коллекция, насчитывающая 1336 паспортизованных штаммов мицели-альных грибов, относящихся к 333 видам 130 родов, которая является научным потенциалом для поиска потенциальных продуцентов москитоцидных, антибактериальных и фунгицидных препаратов.

2. Разработан состав питательной среды для выделения и культивирования мице-лиальных грибов, содержащий набор минеральных солей и органических компонентов. В отличие от стандартной среды Чапека, она обеспечивает обильный рост вегетативного мицелия, и в отличие от среды Сабуро, способствует быстрому и обильному спорообразованию 320 видов коллекционных культур.

23

3. Определены стадии развития грибов, оптимальные для закладки их на длительное хранение: зрелые конидии и склероции - методами криоконсервации, лиофилизации и КСО на ионообменной смоле (хранятся не менее 5 лет); вегетативный мицелий - в дистиллированной воде (хранится не менее 1 года).

4. Отработан способ КСО с применением ионообменной смолы, позволяющий без использования дорогостоящего технологического оборудования и высоких энергетических затрат, хранить 120 видов грибных культур на протяжении от 5 до 18 лет (срок наблюдения). Данный метод, наряду с хранением на силикагеле, может быть применен для длительного сохранения многих видов мицелиальных грибов.

5. Выявлены 182 штамма 48 родов микромицетов, проявляющие москитоцидную активность. Впервые установлено наличие москитоцидной активности у представителей 8 родов.

6. Обнаружена фунгицидная активность 120 штаммов грибов в отношении широко распространенного патогена С. albicans.

7. Установлена антагонистическая активность 202 штаммов, относящихся к 109 видам 47 родов, обладающих способностью подавлять рост одного или нескольких видов бактериальных патогенов, в том числе 105 штаммов грибов - антагонистов В. anth-racis, 95 культур — антагонистов F. tularensis, 40 штаммов- антагонистов фитопатоге-нов.

По теме диссертации опубликованы следующие работы

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Юскевич В.В., Володина Л.И., Александрова A.B., Лиховидов В.Е., Баранов A.M. Применение контактно-сорбционного обезвоживания для длительного хранения микромицетов разных таксономических групп // Микология и фитопатология. -2011. - Т. 45, вып. 6. - С. 535-540.

б) тезисы научных конференций

2. Володина Л.И., Лиховидов В.Е., Баранов A.M., Амельченко В.В., Юскевич В.В. Создание и хранение коллекции штаммов микромицетов - потенциальных продуцентов биологически активных веществ с инсектицидными и фармакологическими свойствами // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт - Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников «Содружества Независимых Государств»: Материалы VII Межгосударственной научно - практической конференции государств — участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская область). - Оболенск, 2006. - С. 93-94.

3. Володина Л.И., Юскевич В.В., Амельченко В.В., Баранов A.M., Лиховидов В.Е., Исангалин Ф.Ш., Александрова A.B. Формирование коллекции штаммов микромицетов, выделенных, преимущественно, из насекомых в горных лесных экосистемах Западного Кавказа // Горные экосистемы и их компоненты. Труды международной конференции. Часть 1. М.: Т-во научных изданий КМК. - 2007. - С.143-148.

24

4. Лиховидов В.Е., Володина Л.И., Исангалин Ф.Ш., Юскевич В.В., Леднев Г.Р., Александрова A.B., Ивашов A.B. Энтомопатогенные грибы лесов горного Крыма // Экология горных экосистем: Материалы конференции (13-18 сентября 2007 г., Нальчик). Часть 2. М.: Т-во научных изданий КМК. - 2007. - С. 114-119.

5. Лиховидов В.Е., Володина Л.И., Наумов А.Н., Юскевич В.В., Асланян Е.М., Бы-строва Е.В., Баранов A.M., Александрова A.B., Борисов Б.А. Энтомофильные грибы горных экосистем южных территорий Приморья и Курил // Почвы и растительный мир гонных территорий. Труды международной конференции. М.: Т-во научных изданий КМК. - 2009. - С. 210 - 216.

6. Володина Л.И., Лиховидов В.Е., Борисов Б.А., Юскевич В.В., Наумов А.Н., Амельченко В.В., Асланян Е.М., Быстрова Е.В., Исангалин Ф. Ш., Баранов A.M., Александрова A.B., Леднёв Г.Р., Глупов В.В. Культуры возбудителей микозов беспозвоночных в коллекции в коллекции ГНЦ ПМБ и изучение их в качестве потенциальных продуцентов биологически активных веществ // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2009 . - № 1. - С. 52-53.

7. Борисов Б.А., Володина Л.И., Лиховидов В.Е., Асташкин Е.И., Ковалев Ю.Н., Пачкунов Д.М., Юскевич В.В., Баранов A.M., Тарасов К.Л., Александрова A.B. Энтомопатогенные грибы анаморфного рода Evlachovaea: мировые данные и новые результаты оригинальных исследований // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2009. - № 1. - С. 51-52.

8. Лиховидов В.Е., Володина Л.И., Наумов А.Н., Быстрова Е.В., Юскевич В.В. Научный потенциал коллекции «ГКПМ - Оболенск» для разработки новых биопестицидов и биомоскитоцидов // Интегрированная защита растений: стратегия и тактика: Мат. междунар. науч. - практ. конф. ( Минск, 5-8 июля 2011). - Несвиж, 2011. - С. 288-290.

9. Юскевич В.В., Володина Л.И., Александрова A.B., Быстрова Е.В., Лиховидов В.Е., Дятлов И.А. Создание и анализ коллекции микромицетов на основе энтомопатоген-ных грибов и микроорганизмов - антагонистов возбудителей болезней с/х культур II Материалы Международного научного симпозиума «Защита растений: проблемы и перспективы» ( Кишинёв, 30-31 октября 2012). - Кишинёв, 2012. - С. 293 - 296.

10. Юскевич В.В., Дятлов И.А., Володина Л.И., Александрова A.B., Быстрова Е.В., Лиховидов В.Е. Создание и анализ коллекции микроскопических грибов - антагонистов патогенных микроорганизмов // Современная микология в России. М.: Национальная академия микологии. - 2012. - Т. 3. - С. 401 - 402.

11. Лиховидов В.Е., Володина Л.И., Юскевич В.В., Шишкова H.A., Маринин Л.И., Быстрова Е.В., Наумов А.Н. Поиск штаммов микромицетов, обладающих бактерицидной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы // Современная микология в России. М.: Национальная академия микологии. -2012. - Т. 3. - С. 381.

Благодарности

Приношу глубокую благодарность моим научным руководителям - член-корр. РАМН, д.м.н., проф. Дятлову И. А. и к.б.н. Володиной Л. И. за осуществление руководства и оказание методической помощи в проведении исследовательских работ, а также к.б.н. Лиховидову В. Е. за общую организацию и координацию работы.

Выражаю искреннюю признательность к.б.н. Александровой А. В. (МГУ) за предоставленные образцы почвенных изолятов и участие в идентификации; Борисову Б. А. (ИПЭЭ РАН), к.б.н. Леднёву Г. Р. (ВИЗР) и д.б.н. Глупову В. В. (ИСиЭЖ СО РАН) за помощь в сборе, идентификации и фотографировании полевых образцов.

Благодарю сотрудников к.б.н. Асташкина Е. И. и к.б.н. Пачкунова Д. М. за участие в идентификации изолятов; Быстрову Е. В., к.б.н. Наумова А. Н., Асланян Е. М., Коробову Н. А., к.б.н Мокриевича А. Н., к.м.н. Маринина Л. И., к.б.н. Шишкову Н. А., д.б.н. Павлова В. М., Вахрамееву Г. М. за участие в совместных исследованиях по антагонизму грибов.

Глубоко признательна ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, вопросы и рекомендации.

Подписано в печать:

23.01.2013

Заказ № 8099 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru