Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГО-БОИХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВАСILLUS MEGATERIUM ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ РОСТА ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ЗНАЧЕНИЯМИ РН

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГО-БОИХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВАСILLUS MEGATERIUM ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ РОСТА ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ЗНАЧЕНИЯМИ РН"

академия наук сс8р

институт иикроглологии

Л а правах руковиси

сахарова Зинаида Васильевна

«шшю го-шо химически к свойсша адсхшш ивоатвшш при иищщроилтш юс та экстремалпшш значения ми ]1н

( 03,00.07 - иикробиологап )

, ' а Н 'Т О р к ф К Р- а 1' диссертации из соискание ученой степени ■ кандидат Оиологнческих наук

• I *

иосква -

J/tC jw ÛCty uA^Ast-JrJ

î.

Работа вкполнвнй в Инсщт/тв микробиологии ЛН СССР

Научный руководитель : .

... доатар d «логических неук, профессор, Я.Д.РАЮТНОВА

Офицкыьяке оппонент» : . f- ' -

і ¿s

доктор биологических наук, профессор Е.Л.РУБАН l

доктор биологических наук, профессор Л.Й.ВОРОБЬЕВА

Ведущее учреждение - Ивотжтут бИОХИМИИ К ^МЗЙОЛОПП!

микроорганизмов АН СССР

Запита состоится 1980 г, в часов на заседают Специализированного совета 'Д,002.64.01 в Институте микробиологии АН СССР. Адрес : II73Î2, г.Москва, проспект 60-летия Октября,7, корп. 2.

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Институте микробиологии ÀH СССР

* ■ ч - . Гореферат разослан -и сиЛиил*

^ Т __1900 *г.

-у ' ' ---— _----

?Г\

сглр арь Специализированного совета ,

дологических . наук (;> Çf-Ku ^ .К.ОСШЦКАЯ «

0БЩ4Я ХАРАКТЕРИСТИКА. ВОПРОСА

Актуальность проблемы, в последние 10-15 дет значительно возрос интерес микробиологов к изучению влияния , факторов, лимитирующих и нагибирущих рост шкроорганиамов, на кинетику ох роста и метаболизм.

Изучение влияний каждого из исследуемых факторов на различные функции клетка без учета действия других факторов в обычных периодических культурах невозможно, так как по ходу развития происходит аепрерывная смена условий культивирования, влияющих на состояние клеток» Метод хешстатво-го культивирования позволяет виращнпать микроорганизмы при действии на них внбраниого исследователей фастора при опти— муме всех остальных.

И микробиологической промышленности в основе регуляции микробиологических процессов лежит управление поведение« популяций. Несомненно, что успехи молекулярной биологии способствуют расшифровке механизмов синтеза различных биологически активных веществ микроорганизмами, но не заменяют понимание законов поведении целых клеток.

Изучение физиологического состояния микроорганизмов в зависимости от условий культивирования, т.е. ингредиентов среди, , рП, ингибиторов роста, давления и т.д. имеет теоретическое и практическое значение, способствуя создании основ регуляции метаболизма клеток» Это необходимо для получения биомассы с заданным составам клеток и усиления биосинтеза ряда ценных продуктов обмена.

К настоящему времени ваянленн ивкоторые факторы, которые лимитируют рост развнващейся популяции и направляв! метаболизм вместо синтеза биомассы на биосинтез продуктов обмена, необходимых народному хозяйству. Однако, для многих процессов, идущих в промышленном масштабе, все ещё остаитея неясным, на каком уровне надо поддерживать концентрации) элементов питания и другие внешние условии, чтобы неирериино пиршцивать культуру в состоянии максимальной октинности *о-лаешй функции.

IIонрос о состоянии клеток, роог которых ингвби(Ул1.чи Мг*~

Цеитр, иггч^я НаЗ.гатиа Мое», срд. ¿¡¡¡¡¡¡за езяьзоз. шд. кн. К. А. Тйя^рязаза

благоприятным! физико-химическими факторами такими, как повышенная t°. значительная кислотность или щелочность среды е т.д..недостаточно выяснен, хотя внгивирование роста — , »то обычное явление при внращиванш! микроорганазмов. Кроме того, мало данных о поведении лиэогеннах культур в условиях. лимитирования роста. Выявление новых путей регулирования к направления хода метаболизма микроорганизмов под действием лимитирующих и ишэибирующих рост факторов будет содвйство-^ вать рациональному использовании микроорганизмов в михробжо-логической промышленности. Настоящая работа посвящена нэуче-шш поведения микробной популяции в различных условиях»

Состояние вопроса, цель и задачи. Исследование посвящено выяснению влияния рН на кинетику роста, физиологию я химический состав Eeclllua aegafcerium ори выращивания В хе— ностатз сравнательно с клетками, рост которых замедлен недостатком элемента питания - цитратом. Аналогичных данных в литературе почти нет, также отсутствуют сведения о лизогекнос-ти бактерий при непрерывном культивировании их*

Влияние ингибарущего действия величины рН на скорость роста, потребление элементов питания, экономический коэффициент, на энергетический и конструктивный обмен микроорганизмов изучено крайне слабо и мнения исследователей противоречивы. Дискуссионными являь.ся следующие вопросы: изменяются ли вкономическиЯ коэффициент, активности катабодических фер— ментов, дыхательная активность микроорганизмов, происходит ля переключение путей метаболизма с одного направленна на другое, изменяются ли конструктивный обмен и состав нлеток? Эти общие принципиальные вопросы фяэиолагии микроорганизмов иагеют важное значение; для нахождения физиологических способов регулирования жизнедеятельности и интенсификации синтеза различных продуктов метаболизма.

Научная новизна. В результате проведенной работы било показано, что рост ¿вух ютаммов БасIllus aegaterium В реазцге хемостата при лимитации недостатков углеродного субстрата подчиняется уравнений Моно я не подчиняется ему при ингибироваипи величиной рН. Впервые показано, что в нелре-

равных условиях выращивания при действии низких значений pH шхно получать устойчивое состояние вигибврованной культуры Baciilua megateriua . Цра ингибировации щелочностью среЛы устойчивого состояния не наблюдалось. Экстремальные величини pH приводят к изменения физиолого-ö иохишче с кого состояния клеток: снижается экономический коэффициент, увеличивается дыхательный коэффициент, активизируется ATФаза, усиливается синтез лидядов, несколько снижается синтез (5елка, содержание ДЗК не меняется. Jth перестройки внутриклеточного метаболизма являются следствием реакции культуры на неблагоприятные условия pH и характеризуют жизнь популяций в условиях стресса.

Впервые проведенное изучение особенностей роста лизигенной культуры в периодических условиях выращивания и в хемостате показало« что в условиях хемостата, в отличие от периодических, лиэогенные псамш всегда сохраняли способность продуцировать зрелые (фаговые частица в результате спонтанной индукции. При лимитация роста фосфором лизис ¡слеток усиливается по сравнению с лимитацией роста цнтратои. ß связи с широкий распространением лизогении среда всех систематических групп микроорганизмов этому явлению следует уделить внимание в исследованиях по непрерывному культивированию.

Практическая ценность. Исследование поставленных вопросов велось на культуре Bacillus megaterium , взятой в качестве модели. Известны штаммы Bacillus megateгімн - продуценты таких биологически активных веществ, как витамин Üj2> гибберелдины, антибиотик мегадлн, нейтральные протеази и т.д. Перспективно также применение биомассы Bacillus mesateГIura в качестве кормового белка, содержащего комплекс витаминов и полный набор аминокислот, включая лизин, трнлтофьн и метаонин. Закономерности, полученние на основании опытои с культурой Bacillus me^aterium , могут послужить основой ддк других микроорганизмов, иредотавл-шщв* практический интерес. .Так данные о влиянии сред с определенном постоянным значением pit на рост и метаболизм бактерий могут заинтересовать микробиологов, работающих на заводе, хот 11 Ли потоку, что низкие ал-і-

чевия рН снижают опасность зараженая промышленных ферментация посторонней микрофлорой. При этои заранее можно предмг йеть результати влияния кислотности среды на физколого-биохимические свойства микроорганизмов» Данная работа показывает, какав изменения роста к развития бактерий ыожно ожидать в результате влияния экстремальны* значении рН»

Различная способность клеток образовывать зрелые фаговые частицы в зависимости от скорости роста к от характера лимитирующего рост фактора, обнаруженная нами* является теоретической основой для разработка метода непрерывного виращившшя лазогзнных культур в промыаденшх условиях*

Атообашш работ». Основные- положения диссертационной работа докладывались: на Всесоюзной конференции молодых ученых, посвященной ХОО-латню со дня рождения Е. И.Ленива, Цущиио,1Э70, на научно!) конференции ІНШІ! АН СССР, Иосква, 1372, на московской отделении Всесоюзного микробиологического общества, 1974. на школе по "Лимитировании и ингнбированио роста иикроорганиэ-мое". Пугано, 1975. на Усъезде ВМО, Ереван, 1375, па II Сове-[давии но теории и практике непрерывного культивирования микроорганизмов, Москва,1978»

Публикааая. Па теме работы опубликовано 13 статей. Структура и ойСіМ диссертации; Диссертация состоит из ой;чеЯ характеристика работы, владения, обзора литературы, изложения собственного эксперимеитального ¡¿атераала /6 глав/, обсуждения результатов и выводов. Гайота содерант 245 страниц машинописного текста, 60 рисунков в 17 таблиц. Список литератур« содержит 250 названия, в том числе 167 иностранны*

ившсгы и исояйшашя.

Объектом исследования служила штампи Весі Низ шееабегіипі от, а к лияогкк'шіі ВасіНия гаерзіегіию ік899 » 1) качества

яii.lt¡катерноЯ культур« 'в последнему Зыд использован тот;:* РлсіЛІиз пеєїіЬлгіиоі віи(гі1а*е.

Исшл ьз на ин сиктєтичсскум среду следующего сгзстдаа: г/л іЛііКпау - ¡іптгкг дшоїшотаслуЙ - І.о, НН^СХ -1.5, КСІ-

С'.йГі, Ка.Ш'О, - С,>Т.<1, К^їО^ - 0,ІШ, Цса04- 0,005, соси~о,от.

водопроводами воду. . ,

і Дяя изучения влияния рН на скорость роста пришеаяди метод острых, оштов Иерусалимского. Дія исследования физиолог о- биазсимических и лшагешшх свойств ас пользовали метод хецостатаога выранишаияя» Хеиостатное кульгаваро вание велось па лабораторной установке ИШИ-1, при 30°С»

В процессе работы бшіи приценено следующие методы анализов. Морфология клеток исследовалась б оптической к адек-тровном микроскопах, Интенсивность дыхания намерял» у наша— во& культуры Вас, negaterium маноштрически в аппарате Вар-бурга. В культурадыюй жидкости определяли исходное и оста» точное количество глюкозы гддаозоо ксидаз вы и методой, лимонную кислоту - колориметричаски с пиридином, фосфор - катодом Варен-Олюма и ЧаДна в модификации Вейд-Ейадербе и Грииа» Летучие кис-доты определили отгонкой с водяшм парой, кетокислоти — по катоду КеВла it Шорыовой, общий азот - методом Ньелъдади и taw «окийныЯ азот: — методом Конвея» Содержание веществ типа нукдао-■гидов в культуральной жидкости устанавливали по поглощению У^-света ори 26Q ны.

В клетках анализировали количества белка по Лоури, полисахаридов - с ацтроноши реактивом, лшшдов по методу Фолча, оояв-^-оксииасляной кислоти - оо методу Слепецкого и lay. Нуклеиновые кислоты фракционировали ио методу Шмидта и Тан-гауэера. Дробное фракционирование полифосфатов проводили по кодифицированному Кулasbum методу Дантеаа и Лисса, Овределе-ние катионов Са, Mg, fe, AI, Си, Зг, Ба проводили методом спектрального анализа на спектрографа ИС0-30 в дуге постоші-ного тока. Калий определяли чет одой пламенное фотометрии после предвари тельного растворения, в 2N 11СІ. Натрий - колориметрическим методом с реагентом ІМЛ-Ашіфееи,

АТФ определяли светлячконцм методом с количественной регистрацией биолюминесценции, А'ГІачную активность иэшрлли тем же методом па скорости («свала АТЇ в присутствии (інтактних клеток. Проводилась количественная оценка удельной акгвй-ности следуичцих внут ри клсточя u х ферментов чзтчЗляических путей; пируилтдвгвдрогеннпц, і, -миЛтд^гидрогеназн, t -»попит—

ратдегшдрогеназы» елекозо—S-^юсфатдагядрогеназы» Определение количества зрелых фаговых частиц, освобож^аешх культурой Вас» jneg&terlum v 399 • производили двуслойным методом, Вааник— пав впив вирулентны! мутантов умеренных фагов анализировал* ж средний урожай. фага^ т,е» выход фаговых частиц, на клетку, определяла so методу одиночного омяла развитая» Ори атом применяли умеренный фаг лизогеяяой культуры Вас» negetertum W выделенные и розмноженный на индикаторной культуре Bacillus negaterium mutllate*'

ЭКСПЕРШШГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .

I» Рост Baelllua megaterlvm шт*3 в хемостате При лимитации недостатком цитрата*

Характеристика хемостатноЗ кулътуш. В качестве контроля при изучении влиянии pH на физиологическое состояние Вас» aegateriua шг.З использовали культуру, лимитированную цитратом, Цитрат является источником углерода и без него рост почти невоэ! лен, но при его недостатке клетка остается, обеспеченной источником углерода и энергии — глюкозой и основными биогенными аленентами я в наибольшей степени кокет противостоять действии ингибиторов»

Выращивание культур/ проводили при оптимальной значении ЕЙ 7,0 и скоростях протока 0,4 и 0,7 чао"1. Как

видно на рисунка IA /а/ вес сухой биомассы с увеличением скорости роста мало изменяется, остаточная концентрация ди— матирующего рост субстрата была минимальной и почти постоянной» Особенность!) роста Bac.negaterlum является то, что с увеличением скорости роста, в отличие от других микроорганизмов, не наблюдается линейного изменения экономического коэффициента У и активности рада ферментов катаболизма!' ггируштдегидрогеназы, азоштратдегидрогеааэа, мадатдегидро- • геназы и глюкаэо-й-фосфатдегидрогеназц. фи Д 0,4 час"* происходят отклонения, свидетельствующие об изменениях в энергетическом метаболизме, при увеличении скорости роста /рис.2/.

- -а -

11 « н

Рис, 1 Из не оде физкаааго-йиохн»« ческах показ&теде к культур« Нас, »ецаЪеПшп при нейтральном И шсоких порогашк аи&чеи'л>и рИ»

I -¿баои*сса,г/л, 2 - остаточная глюкоза, г/л,

3 - остаточныЯ циттт, г/л, 4 - У, 5 - потреблен-пая глюкоза, г/г, Б - иотробдаишй цитрат» г/г, ? - У - Н1К, 3 - бйлак, 10 - йао«с!Ш1радц»

II - ноли-кемьясл-шан кислоти, 12 » лмп&цц, 12 - Дос.^ушииш.

РисНзмевеекё адтиввостйяеяаторцх ферыентов при увалячеим скорости роста.

I - ,й£ маштдегвдрогеназа, 2. - fiS паруватдегидро-геяазв, 3 -ДЕ изо цитратдегддроге«аза, 4 -¿Е гдо-щэзо-б-фосфаящегацрогеяааа

Црв увалитенкя Д а условиях дямвтацик роста шггратом поглощена а я^лорода культурой возрастает от 220 до ЗООш/ иг/час» а дыхазелы-Я воэ^ициеит /Ж/ незначительна уменьшается от 1,08 до 0,9» Можно i—еддолоиеть, что при увелжче-вше скорости роста происходит небольшое повышение окислитель— них функция культуры в метайсймэыв ГЛЮКОЗЫ. При всех скоростях роста в кужыуральяой среде обнаружены в йебояьшсщг количестве промажуточный щрсщукты окисления глюкозы! уксусная, пврог"вограшшя и /,-яетог.лутаровад кислоты- Но wepe уваян-чецшх скорости роста выделение уксусвоЯ кислоты upe пересчете на граш образованной биомассы upe рН 7,0 равномерно уменьшается от 0.9 да 0,35 г/г биомасс«. Образована« вие-клелочиих плро и ил оградно й и jL-íteTomyrapoBoí* кислот вр» раз-сах скоростях роста ^.ша низким л не прешй&яэ 0,1 г/г биомассы.

Пряв еде simia даяяые шжазнвалт, что при нитрат-

том pOCTQ Bao. Tüneitfl ritas происходят коли че с г о ч иные изменения ЗОРТНОИШПкД ртзличну x ВН^КЛвТОЧЯНЛ продукте в ЭНРргегИЧЙСКОГО It-tesa, и о ил качсагвйНйые, так как метг-боллзм остался •ровным щт разких скоростях роста.

Рис. 1 Изменение фиаиалого-бнохимических показателей культуры l)ac. megoterluja при нейтральном и buccïuix шрогошх значениях pli,

I -ономасси.г/д, 2 - остаточная глюкоза, г/л,

3 - остаточный цитиаг, г/л, 4 - У. 5 - потребленная глюкоза, г/г, б - потребленный цитрат, г/г, 7 - JDlri, 6 - Н1К, 9 - белок, 10 - полисахариды,

II - поди-^г-оксимзсляшш кислота, 12 - л и падл, L2 - 4oc.[<uMiiajyj,

Рас»2 Изменение аатгавоста* некоторых. ферментов при увеличена« скорости роста.

I ~ йВ малатдвгадрогеваза, 2. - ¿Е пируватдегидро-геваза, 3 —изоцитратдегвдрогецаза, 4 —¿В глю— козо-6-фосфагдегвдрогевааа

Ври увеличения Д в условиях лимитации ^юста цитратом поглощение кь.-лорода культурой возрастает от 220 до 300мл/ мг/Час» а дахательР"-Д коэффициент /ДК/ незначительна уменьшается от 1»08 до 0,3. Можно г^едположить, что при увелнче-аии скорости роста происходит небольшое вовывепиь окислительных функций. культуры а метаболизме глюкозы. При всех скоростях роста в культуральиоЗ среде обнаружены в небольшом- количестве промежуточные, продукты окисления глюкозы: уксусная, пиров"коградцая и X-кетоглутаропая кислоты. По мере увеличения скорости роста выделение уксусной кислоты вра пересчете на. грамм образованной биомассы аре рН 7,0 равномерно уменьшается от 0,9 до 0,35 г/г биомассы. Образование внеклеточных пяровиноградаой и Х-кетоглутарово^ кислот при разных скоростях роста ¿;гло низким я не превышало 0,1 г/г биомассы.

Приведенные данные покйзнкапт, что при лимитация цитратом роста Вас. юедпЪеПит происходят количественны« изменения соотношений разЛИЧНИХ внйадгеточных продуктов энергетического обмена, но нл начсотаенние, так пак метаболизм остатс-Ч а^родкчм при риз км 7. скоростях рост.

Химический состав биомассы.Содегаание ДНК в клетках Вас .ее ваЪегХш не изшвяется, а содержание РНК и белка увеличивается о увеличеалеи скорости роста /рис. 1д/. Количество лшшдоа а фосфолиаидов уменьшается, количество поли-^-оксшласляной кислоты увеличивается* Содержание полисахаридов изменяется неравномерно /рис. 1д/. Полифосфаты. которые являются запасными резервами ортофосфата в клетке,.составляют 0,3-0,4 < от веса сухих клеток Вас.дееа-1ег1ипц Содержание суммарцоЯ кислотонерастворимой фракции полифосфатов увеличивается с повышением Д, а наибольшие количества суммарной кислото растворимоЯ фракция обнаружена в клетках при час""1.

Следовательно, ври лимитшши роста Вас. ше£а£ег1ит цитратом изменяетел химические состав клеток в зависимости от скорости роста.

Срдердшше металлов в клетках. Различнее металлы имеют существенное значение для. роста клеток, синтеза белка, регуляции внутриклеточного осмотического данления и для функции энзимов. Поэтому целесообразно било определить их содержание в клетках Нас. июкагег^ип в разных условиях культивировании. Результаты определения К, На, и^ , Са и Ре показали, что в клетках Вас,тисаг^Н'шI в больших количествах находится К, содержание которого составляет 900-П00 кг/100г биомасси» Содержание К не меняется при увеличении скорости роста, а содержание На уменьшается от 160 до 40 мг/100г биошссы. Содержание Са и Не повышается с увеличением скорости роста в 4 и а раз соответственно. Нами было показано, что содержание 1Ш И высокомолекулярных пол* [«сватов увеличивается с уаеличе-нием Д. Вследствие этого матэ предположить, что Сн и М,; В клетках Нао.ы-^.ии^Иим наладятся в пол1Цх»С11лт но- ну клеи новом комплексе и их величины иоячиъштсл тоЯ яе закансу.ерности, как РНК и полисе.)атн. Соде рл» ни»: Ге так же возрастает, поскольку дихагалышя активность у Ь:1с. л,*. въегЬиа унеличиыитен с иони'лениол; и предположить, что увеличение скорости

роста приводит к чкт:п1а!1ии иитохромюЯ цепи, за счет чего и уымачинаетсл оице^ини.е тр.д';?-1, г->г'-рхпадг и ['оин'^^шу цитохроюи.

Суммируя полученииа данные можно »аключить, что при роста культуры Bao. aegnterlum s режиме хемостата црв ограничении роста недостатком цитрата получена хемостатная кривая, т.е. о почти постоянными концентрациями биомассы /%/ и остаточной концентрации лимитирующего рост субстрата -нитрата /ё / при скоростях роста Д^к0(2г 0,4 и 0,7 чао-1* При разных скоростях роста происходило некоторое изменение путей метаболизма глюкозы и менялся химический состав клеток Вас» яе gate rlum.t

Подученная характеристика хеыостатноЯ культура Бас.«в<»-t.erlun- сравнивалась далее с теки изменениями, кбторыв вызывают экстремальные значения рН в метаболизме Вас. negaterlun.

2» Кинетика подавления скорости роста периодической культурі Вес ill un toegateriura шг.З величиной pIU

Методом острых опытов по Иерусалимскому было установлено, что Вас. ne ее teri.ua растет в широких пределах рН от 4,8 до 0,6. Угнетение скорости роста на 50 % происходит при рН 5,0 и 8,2.

Для Еыясаеяи' характера угнетения скорости роота Вас. gaterlum ионами водорода " гидроксилышми, полученные данные (імли обработаны по методу Лпйнуивора и Берка. Известно, что в случаи замедления скорости роста может тормозиться одна какая-нибудь реакция в метаболизме клетке, ответственная за весь процесс роста* II атом случае торможение скорости рос .г подчиняется уравнению неконкурентного торможения или прдрилу "узкого места*, и зависимость скорости роста J/ji. от нонистроняй аспыtyowora янгибитора носит лиизЧпмй характер. І) «гштах с Baa. meçeterlum ли но Л пост и не оказалось, значит еклроеть роста не подчинялась ураьиени« неконкурентного тср-мояенял /рис.Я/. M .шо думать, что при разни* значениях pit проноjолит смрн.ч "зпкого места" дли тормозигла сразу несколько рчакняЯ. Вер'.'итно, это находит свое отрадГіпие в изг мнении irfif.tiitm промыт (іменних лр&шх»

fu fie'*

fue. 3 Зависимость обратной величины скорости роста от малярной концентрации водородного и гидро-«сильного нона.

1 - ü-часовая культура fcac. megaterium

2 - З-часовал культура Вас. megaterium

Таким образом, величина pll окааиьлет сложное воздействие на метаболизм и рост Вас. megaterina

3. Рост Laclllua megaterium шт.З и жемостата при ингибироцании нмэшши значениями рН.

изучение ШШШШ1 ингибиторов на шкрооргшшэш ыри иира-шьании в хсмостате мало осващецо в научной литературе. Иьост-ны лишь работы, ироведещше в лаборатории, руковйцимо.1 1'абат-новоЯ н <JCCS' и работы, выполненные в лаборатории Диял, в Англии

Неизвестно, можно ли получить стационарное состгшше культур» в хеьостате нри ограничении скорости роста толща ингибитором. 1к:зу словно, можно изучать дайотимс ангибагора на культуре, ал1лиглроь.чнной недостатком какого-нибудь -ллм..ен-

та патаняя в вагоджейся в стационарном состоянии в хемоста-те» Тахвы путем можно получить информацию о характера действия ингибитора на метаболизи,

роввденае Вас» авкаЕвг1цт шг .3 при .подкисления рН среды. Характеристика развития проточной культуры во времени при скорости, роста Д=>,2 час~^ при различных значениях рН подаваемой среды» представленная на рисунке 4, показывает, тго во всех 1шого|фатяо повторяемых опытах снижение значения рН подаваемой среды приводит к понижению рН среды в культиватора в соотвествуюцему ванилевая плотности популяции.

1 - рН даваемой питательной среды,

2 — рН среды в культиваторе,

3 — ЕЛОТКОСТЬ популяции

При оптс^Альном эв.>1ениа рН подаваемой сре.ад клетки опытной культуры имеют обычный вид палочек, соединенных в цепочки, т.е. характерную для вида Вас. тгцв^еПчш щт.з ,|орму.

Сшдеадие до 4,7, обусловленное $иаиолсгической кислотности« источника азота /иН-С! /, вызывало гущчстлс-иное

- IS -

изменение формы клеток. Они принимают шарообразную форму. В виду того* что клетка на отделится друг от друга и продолжает увеличиваться а размерах, образуются конгломераты клеток, не кмешщде определенной фории» Б таком виде популяция существует без изменений несколько генераций.

Цри дальне Швеи увеличении концентрации водородных ионов в ферментера до рй 4,2 популяция состоят хэ нитевидных клеток с редка встречающимися перегородками. При возвращении к оптимальному значению pH /6,0-7,0/ клетки за 1&20 часов принимают обычный вид палочек, соединенных в цепочки. Повторное снижение pH подаваемой питательное среды сопровождается повторением описанных выше изменений.

Снижение pH в ферментере ниже 4,2 приводит к вымыванию клеток из культиватора.

Сравнительное исследование аналогов митохондрий, специфически выявляемых с помощью тетрациклина, показало, что существенного изменения в качестве этих структур в клетках, поддерживаемых в разных условиях кислотности среды, не наблюдалось. Шгектроцко-шн рос копи чес кие наблюдения показали, что при кислотности среды 4,7 у шарообразных клеток капеульни 1 слов часто отсутствует, клеточная стенка становится неравномерной толщины. Образовавашеся скопления клеток возникают преимущественно из-за незавершенного клеточного деления и заторможенной способности клеток отдаляться друг от друга. Внутриклеточные мембраны испытывают существенные изменения. Строение клеточных стенок, а также внутриклеточных структур у нитевидных 4орь>. характерных для рП 4,2 приближается к норме, клетки не выглядит поврежденными, хоти и отличаются от исходной культуры. Плеточная стенка имеет одинаковую толкану на протяжении всего периметра среза . На поверхности нитевидных форм постоянно присутствует материал ипкрокапсулы. Ii и у триплет очные мембранные структуры развиты слабо. lia основании алектрошю-микроскопических каргии создается ипе-чатлеиие, что при з|1ачении pli 4,2 у клеток Uac.roeenteriun происходит восстановление или, скорее всего, приспособление поврежденных или не|уакционирующих систем к houuu условием КИСЛОТНОСТИ среды.

V 16 -

Такэш образам» повышение концетраядя ионов водорода в среде сопровождается определенными изменениями клеток, которые обратимы- Измененные клетка жизнеспособны и размножаются. в хемостахе с постоянное скоростью .- 0,2 пае"* в течение ряда генераций,, ' '■*-_ .

Потребление субстратов, Иигябированив роста Вас» тввв-ївхіиївковам» водорода в хемостате ври 0,2 проис-

ходит в узки границах рН от 4,7 до 4,2* Икгибирующие низкие значения ра среды снизили в 5 раз концентрацию клеток,и ато сопровождалось усилением потребления, углеродных субстратов и фосфора, снижением экономического коэффициента У , рассчитанного по суыме потребленных углеродных субстратов /рие.5 и : ;■"

Гис.5 йэмерепие количества биомассы, потребленных уг.чродлых ісу бстратов и эконогадческого коэффициента в зависимости от ріі среды.

■I - бисгасса, г/л, 2 - Естр»цитрат, г/г, 3 — штр. глюкоза, г/г, 4-Х

Потребленле азот» в ріссчете на грам/ биомассы при крайне ішзпех зн^че.чиях рН с.р^ди значительно гаде, ч°м пр*

(!И

Рис.6 Изменение оотаточного а потребленного азота к фосфора при различных значениях рИ,

Концентрация! X - потребленного азота, ыг/г,

2 - остаточного, «г/л,

3 — потреблешюго Фосфора, мг/г,

4 - остаточного, мг/д

Ц Й рн

оптимальном значении рИ среды, Ути данные дают основание предположить, что анергетические процессы, которые сш1эшш а потреблением глюкозы и фосфора, усалнааютсн дли пооиержа-пня жизнедеятельности шичЮарошшшх клеток, а конструктивные процессы, которые связаны с потреблением азота, затормаживаются,

рнвргетичеокие процессы. Снижение кислотности среды от нейтрального значения до 4,6 вызывало репрессию всех исследуемых ферментов, но в разной степени.

Дыхательная активность клеток Вас. тева1ег1иш так же изменяется. Набладается увеличение поглощение С 119,82 до 1131.44 мкл/час/мг веса сухих клеток и повылена способность бактерий к выделении С02 с 112,66 до 225,Щ мкл/час/мг веса сухих клеток. Дыхательный коэффициент возрос от 0,75 до 1,24. Пул АТФ снизился в 5,5 раза.

Таким образом, можно предположить, что при экстремальных низки* уЬдовлнх рЦ происходит холостое сжигание углер<ж» с

- 19 -

дополнительными затрахана aneргетяческого матеряала, что проводят к. снижения цуда АТФ.

Ввделенка продукта неполного окдпляндя глюкозы - уксус-ноЯ кислоты» кстокжслот в веществ нувлеотадноВ природы вна— чжтвльно овха ври вязком значение рН» чем прж нейтральном /габл,1/.

Тайлша I

Выделение к. сроду ацетата, кетокнслот «веществ нуклеотадвов природа в зависимости от рН /иг/т веса сухоЯ биомассы/

>

ра уксусная кислота паровжноград-ная. кислота •С-кетоглу*» таровая кислота нуклеотнды

7,0 630 0,98 0,45 22,4

4,9 142 0(67 0,36 16,2

4,6 100 0,В0 0,04 б,г

Оря культявированаа в кзслых условиях у Bac.megateriun отсутствует утечка метаболитов на клетки, которые необходимы для синтеза снеточного тала»

^жмжче кий, .состав,биомассц» Иягибарованаа роста кислотностью среди вргв^тш к снижении содержания белка в незначительному увеличена» содержанка PHIt в щетках» Содержание ДНК не меняется rtpa кзмзнешш рЗ среда от 7*0 да 4,i /рис»?/»

Изменение синтеза запасных, веществ клетки Вас. uegateriim при различных значениях рН представлено на таблице 2. Зиа— читальное уменьшенаа количества поли—^-оксимасляной кжслота» "уикн липидсв ■ фос^олипидов няйлддалось при значении рц 4,7, когда культура образует конгломераты округлих клеток* При сильном иягибирушзм дейстр.л'л низкого значения рц /4,2/» когда клетки натягиваются, происходят резкое увеличение трех личадных фракций. Зге извдяенка в содержаний лппидов можно сгязатьс состоянием,клеточной ыембранч. Упелаченне катачест-оа липидов при атом значении рН, возможно, гогшетсп эащатгым ПриспособленИРМ против кислотности среда. Сагер.*ллиа полиса-хпрлдов но из^лшттся.

-г 1ST -

с

г

«u л>

I

___а 1

Ряс. ? Влияние различных значений pH на синтез основних биополимеров клетв» Bao.mege-terlwm в.белок-сжнтезиругщеЯ активности ШК

I- ДНК. 2 - РНК.

3- белок.

4- бслосаятеэярую— щая активность

РНК

______* t

>t

жижижпж:

Изменение синтеза, аапплшх вецвств клетки Bac.stegaterluai щэд различных значениях pH к Д 0.2 час ( % )

pH поха-р ок-сиїласляная кислота сумма■ лвпидов фосфоляпилы полисахариди

7.0 4.62 3.23 0.069 10,60

4.9 4.52 3,52 O.Œ5 11.53

4.7 1.45 1,66 0,065 *

4.2 6,29 6.26 0,133 9.33

Ингмбируїлдвг рост^ кислые условия среды привели к вамет-ныы изменепиям фракций ишшфосфатов /тайл.З/,

Иря значении рБ 4,7, когда клетки приобретают шарообразную форму, количество кислоторастворишх полмфосфатов увеличивается, и котечество кпслотонерастворвкыг умеяьпмет-

2Q -

> Таблица 3

Содержание ортофосфата и полифосфатоа в клетках Вас» mega-terlun тпри различных значениях рН, при Д 0,2 час~А /шх/мг сухого веса/

рй р .opta кислого— растворимые ПФ1 ИШ кислотоне— растворимые ПФХУ хш сумма ПИ и ПФ1Х сумма 1Й1У и ШУ общая сумма

4.9 1,34 0,20 0,26 0,06 2,76 0.45 2,82 3,28

4,7 1,02 0,56 0,22 0,00 г,36. 0,78 1,36 2,13

4,2 0,31 0,23 0,17 0,00 3,3â. 0,46 3,36 3,64

ся» ЛвльыеОшее снижение кислотности среди до 4,2 привело и воестаноаленню всех Фракций высокомолекулярных полифосфатов. Вероатно, это явление обусловлено восстановление« штоолаз-магической мембраны» Можно предположить, что при низкой значении рН некоторый избыток энергии, получаамнй' при окислении углеродного субстрата, резервируется в ьвдв ыакроэргяческжх связей полифосфатбв, ори атом ортофосфат расходуется на их построение,

Содпрдщше штддлоа. Содержание К по сравнению с контролем уменьшается от 1200 до 400 мГ/ЮОг биомассы, в' содержание ш незначительно увеличивается при изменении величины рЦ в кислую зону /рН 4,2/. Ионы К необходами для синтез» белка клеток, Ингибируюцио рост низкие значения рН среди /4,2/ снижают содержание белка в клетках Вас. areget«-riue , следовательно кохно предположить, что снижение содержания к частично связано с этим явлением.

При низкой значении рН 4,2 наблюдаетсл увеличение количества днухвалентних ыетшпоп Си и [¿g н 2 pa:iu по сравнению t Hef.ri'iuij.HNM значением ptl. уто пбуславлииается тец, что каин Са н Ug нвднится кошлекгопб^зстатанш палим ое-1атов и И IU количества, иорснтио, «тзани с увеличением садзрллнан irax HtMUHrru,

Кислые yc.WiiH't о рилы HpiiHOjyiT К резкому cHiiaeHiui содс[.-ищна Pt) cri U0Q no 60 ni'/lCOr fuomccu» Прц действии низ-

кого значения Ей окислительны& процессы становятся ыанее эффективными, Возможно» что это сопровождается уменьшением содержания цжтохроыов в клетках, вследствие чего наблюдается уменьшение содержания жаоеза»

4» Ррст БаеШиа швеа£«гіші шт*3 а хемостате при . ангжбнраваниж щелочность» среды .

Обзор литератур* показал, что почт в нет* дашшх о влжя-тш щелочных. условий среди на физиолого-биояшаческиа свов-ства микроорганизмов» Поэтому било предпринято исследование влияния, щелочных условий среди на физиолог о-<5иохимическнв свойства хемостатноВ культури Вас. пеДОегілиі^

Поведение Bac>дegateгiтlШ доа сиуд»» щелочных условий птіядмі Характер роста. Вс в щелочных ус— лавках, культивирования. отличался от того, что до на&тдазя прж действии кислотности среды» Превышение пороговых эва-чениЯрЕ вызывала вышваняа культуры из ферментера /рас .6/. Дла скоростей: роста 0,2, 0,4 я 0,7 час"*1 пороговые значения. рН составляли, соответственно, 9,6, 9,3 и 7,6»

Следовательно, нам не удалось получить ^стационарном состоянии культуру, активированную щелочностью среды, а только наложить действие ингибитора на культуру» ладатаро-ваняую цитратом»

Потребление субстратов. Несмотря на постоянство плот— поста биомассы при экстремальных щелочных ;словиях вироди— вания произошли существенные изменения в характере метаболизма Бас» тее^егіша /ряс.І ІУ. Остаточная концентрация цитрата возросла более чем в 2 раза, а остаточная концентрация глюкозы уменьшилась.. Увеличение щелочности среды вызывало повышенное потреЯдгние глюкози, которое, достегало 6,5 г/г биоиассм+оо сравнении с нейтральным значением рН /2,2 г/г бжомасснУ',. Потреблений цитрата осталось почта аа том я« уровне, что пра рН 7,0, Экономический коэффициент, рассчитанный ш использовании глюкозы н цитрата, снизался более чем в 4 раза по сравнения с контролем и был почта одинак»-

>

: tl II

u u u

M

»

Г/1

___

ь-агмг"'

______T-f

л- aw.

Рмс.в Поведение культуры Вас. negeterlua в хемостате под даКт

СТВНвМ puqnyyy

значения рН X - рН

2 - плотность популл-цжд

« Г-Г

и

$>•0,1**-'

*1

-Я;

E T'"¡F'ï* А'вЗГ" '—

вш при всех скоростях роста /рнс.1 б,г/.

U отдичне от источников углерода к ааергии, вотреОлеине азота в фосфора на грамм образованной биомассы практически це изменяется ш срванпикп с нейтральных значением pli,

Энергетически^ цроаессн» Увеличение щелочности среды от 7,0 до рН 3,6 ори Д 0,2 час-* вызывало репрессии активности вс&х исследуешх ферментов. Это макет быть причиной снижения акоаоыачесвого коэффициента,

Днхательвая активность клеток сильно меняется в щелочной среде /рис.9/. Снижается скорость поглощения кислорода, тогда как способность клеток и выделению СО-, менее угнетена. ^Ыхательний коэффициент /М/ увеличивается, что говорит о снижении окислительных фу)ищий и появлении продуктов неполного окисления /ДД Содержание пула АТ<1 в биомассе значительно снижалось и возрастала АТ1*злая активность.

Рас.9 іЬіхатвльнал активность. содержание пула АТФ і ІТФаз-ной активности у; Вас .веса*« пик в зависимости ot т рН При Д 0,2 чао 1

1 — поглощение Оо»

2 — выделение СОЙ,

; 3 - Ж. 4 - пул2*™ і 5 — АтФазная актив— і ность

При щелочных условиях культивирования происходило яакоо-ление уксусной кислоты, количество которой тозросло в 2 разя по сравнению с контролем.

РВ

уксусная кислота.

кг/л

мг/г

7,0

€30 696

8.8 640 В20

9,6 895 Е377

Можно предположить, что при щелочных условиях вреди происходят переключение внсргетических путей окисления глюкози на менее эффективный путь неполного окисления о образованием ацетата, в отлячйе от действия кислотности сред», когда ацетат ае выделялся к среду, но клетка обогощались лвпвдями.

Іккичпский состав клеток, (блочные условна, среды овижа— ■ рт содержание белка, а содержание РЦК немного увеличивают. . Содержание ДПС в клетках не меняется /рис* 1л/, Такие же изменения были обнаружены и при действия низких значений рН. При экстремальных щелочных условиях, среды в клетках Вас» ««-

ts&terluu накапливается. sou»fl-о«*имя^.ц^няц кислота, возрастает сумма ляпидов, содержание фосфолшшдов к полисахаридов. Особенно заметна увеличение резервных веществ клетки ори низких скоростях роста, когда контакт клетки с ингибитором наиболее длительный /рис. 1а/. изменения, возможно, связаны с защитной функцией атих биополимеров против неблагоприятного действие рН.

Пороговые высокие значения рН в небольшой степени ока— 'зш влияние на содержание высокомолекулярных полмфоофатов.

Содержание металлов в клетках. Количество К, ва, Us » U& и Fe уменьшается при пороговых высоких значениях рЦ по сравнении с нейтральным* Ц&дочные условия культивирования, вероятно, приводят и нарушении проницаемости клеточной мембраны* Модно думать, что этим объясняемся снижение содержания атих металлов. Кроме того уменьшение содержания металлов, вероятно, связано с изменениями содержания белка, РНК, нолифос^втов»

Таким образом, характер роста Вас. »egaterluab щелочных условиях культивирования, резко отличается от того, что мы обнаружили при низком значении рН*

5. Рост лизигенной культуры Bacillus aegaterium Ш 699 при лимитации недостатком цитрата и фосфора

Baolllua megaterium является лизогенноИ культу-

рой. Неизвестно, как проявляется это свойство при непрерывном культивировании микроорганизмов. На исключена возможность, что изменение энергетического метаболизма у Вас* megateriwi шт.3 1Ш ходу хвыостатной кривой связано с явлением лизогенви. Цозтому ми решили проследить за выделением Зшчзвых частиц, продуцируемы! опытной культурой в результате спонтанной индукции, при хемостагвом культивировании* Нами били исследованы культуры при лимитировании роста цитратом, а также для сравнения - фосфором, Цы не могли исиользоьагь штамм, с которым велись выше приведенные исследования, так как для иго 4ага ье били индикаторной культуры. Нами был визран хорошо изученный лизигенный штамм Bacillus ae^sterlius w 0i>9.

рцрап^яяий а вврисцр^вскя^ условиях

Риа.Ю Кривая роста лвзогенной культуры Вас» тв-""и^егіит 099 ж образование зрелых фагофых частиц.

І -їй г

сутой Оно Е/Л, 3 -

— вес биомассы, ____ 3 — количество фаговых чаотац в мя,

4 — остаточный цитрат, г/л. *

5 — остатотаая глюкоза» г/л

1 і

Шла использована синтетическая среда, на которой выращивали Вас*. швеаЬегіша игг^З. Кривая роста ж образование зрелых, фаговых частиц культурой Вас. шв5а-ь«гіим представлена на рис» 10* Рост культуры заканчивался через 12 часов* Остановка его вызвана недостатков цитрата. Определение количества зрелых фаговых частиц* продупируешх опытной культурой в результате спонтанной индукция части клеток с последующим их .низвсем, показало, что в течение первых Є .часов роста количество свободных фаговых частиц увеличивается от 7-Ю* до 6-10^ в ил культурзльчой жидкости, затем в теч«яка последующих б часов культивирования количество умеренных.'{агов держится на одном уровне в пределах около І06мл. Таким обреяом, спонтанная индукция с образованием зрелых фаговых чзегпц наблюдается в размножгшаияся клеткаі. физиологическое состояние ?сдеток в стгшиснрноИ фазе таково, что опи не способны

рост культуры Вас, aegatarlmi дом яимитапи» цитратом.

Рже. II Хвмосткг-ные кривые лжзо-генно! культуры Вас. ювгайег1и» «893 ш образование количества зрелых фаговых частиц в ыл в зависшюсти от скорости роста

1 - остаточный

цитрат, г/л,

2 - остаточная

глюкоза, г/л,

3 - биомасса,г/л,

4 - количество

фаговых частиц в ыл

5 - У

¿час"

Ври ограничены роста культуры недостатком цитрата была получена хемостатнаа кривая с постоянным экономическим коэффициентом. Количество недоиспользованной глюкозы равномерно увеличивалось с изменением скорости нротока, чего ые наблюдали у bac. megateriun шт.З. Следовательно, изменении энергетического метаболизма при увеличении скорости роста у Вас. oegaterium ит.З ввились особенностью »того штамма.

Скорость роста оказывает существенное влияние на спонтанную индукцию части клеток с последующи их лизисом. В □радела* скорости роста ог О,07b до 0,3 количество

гоыл частиц в мл увеличивается С l'iu^ ДО З'ХО7 в мл, т.е. ft 300 раз. При увеличении скорости роста от 0,3 до 0,6 час-' наблюдается снижение титра фага. Уто, по-нидммому, с шпако с уменьшением количества клеток, а следовательно и клеток, сиососиыж к спонтанной индукции умести го ^агн.

Оирчлел-н*« у (чипа ноет и умеренного .}нгн личоп'нноЯ куль-

туры Вав» вева*егіил показало» что в среднем ова равна около 50 частиц на хлетяу. Прп выращивая» это9 культур" в условиях хямостата количество фаговых частяц в ил культуральяо! жкдяостя достигало 3-Ю7. Исходя жз урожайности, ножно зак-лвчить» что в атях условиях культивирования в результате яя-дуклии лжзжроваяось значительное количество клеток — около 6*10® в мл. Поэтому отмечаемо« снижение количества клеток вря шращжванжж Бас* те gateri.ua в условиях хемостата при больших скоростях роста зависит ва тожьжа от специфики рост«, в хемостате» во в значительно! степеня я от лжэжса клеток в результате яцдухцщж хх умеренных фагов*

^ост кудьттры іВас>.пеааЬерітд> в хемостате прилит—

таям недостатком фосфора.

Рвс.12 Измене сіле ! веса сухоа бяомае-^ си я количества зрелых: фаговых частиц в зависимости от Д.

, Г -» остаточный фосфор,г/д.

2 - биомасса»г/л,

3 - количество фа-

говых частиц в иж

............. .....ч.; ч ; л«^/

Хемоетатвая кривая культурн Вас.пе Ьег1гш , выращенной при лимитации роста недостатком фосфора» представлена ря рис* 12*. Как видно из этого рисунка, вес сухих клеток лкиеЙно снж— жнется с увеличением скорости роста«. Низкая остаточная коидян-тралжя фосфора в среде свидетельствует о ламяташге роста фосфором. Такой характер хяиюстатнса крквоЯ иря лимэгеацаж роста МЖнерЛЛ1КММЖ к вря избытке источников углчродн из—

В»! стен.

Способность клеток к индукции с образованиек зрелых фаговых частиц имеет тот же характер, что и при лимитации роста цитратом. Важно отметить, что в условиях сильного голодания /при малых скоростях роста/ по цитрату и фосфору клетки сохраняли способность индуцироваться и образовывать зрелые фаговые частицы. Эта способность несколько выше у клеток, го-ледащих по фосфору. Хотя ври лимитации роста фосфором при Д=.

от 0,2 до 0,4 час"* клеток меньше, чем при лимитации роста цртратом, количество зрелых фаговых частиц больше на порядок. Следовательно, недостаток фосфора в среде усиливает освобождение зрелых фаговых частиц по сравнению о условиями, когда рост ограничен недостатком цитрата. Возможно, что ниспадающий характер кривой плотности популяции связан с увеличением распада клеток в результате усиления образования умеренных фаговых частиц.

Опыты по определению возникновения вирулентных мутантов у умеренных фаговых частиц лиэогеняой культуры Вас.щец^егіоі показали, что ни в периодических, ни в проточных условиях выращивания они не возникали. Следовательно, всё количество фага, обнаруженного в культуральаой жидкостях опытной культуры в разных условиях культивирования, возникало за счет индукции умеренного фага и не связано с лизисом клеток вирулентными фагами. Если бы имело место образование вирулентных мутантов, то при проточном культивировании, когда клетки находятся в ііи-.іиологически активном состоянии, наблюдался бы мас-СОІїЬй лизис культуры.

Таким образом, пеобцчниа характер хемостатной кривой Вас, ■вб^еПш» шт.іі не связан с лизогенибй культуры, а являлся особенности!) данного штамма, оставшейся не вполне ясной. Характер лимитировании роста бактерий влияет н» количество ос-вэбоадшощихся фаговых частиц при одной и той же скорости роста. Следовательно, на этот процесс влияет физиапогическое состояние клеток и его можно усиливать или ослаблять, изменяя питание бактерий.

виводи

I. Нссленоиано ьдилние рИ на Змзислогичііскоє состошіие Бис. ■иваЬегіи» , К"К модельного органигн&і, в режимах хек.остита и ь периодических условиях культивирован*.! острых осо-

тов, Нроиьдени сравнение ісм^гнтниї культу. при лимишиии рос-

- 29 ~

та углеродом - цитратом ири нейтральном рН и культур, ингиби-рованных низким ж высоким значениях рН.

2. Зависимость обратной величины удельной скорости роста от концентрации ингибиторов /И*а СНГ*/ по ЛаЯнуиверу и Бзрку не носит линейного характера, следовательно, скорость роста не подчиняется уравнению неконкурентного торможения. При определенных величинах рН происходит смена "узкого'места". Таким образам, величина рН оказывает сложное воздействие на метаболизм Вас Шив т«в&Ъег1ит*

3. Получена устойчивая хемостатная культура ВаоЩц© «е-багаг!ит шт.З при ингибированяи роста кислотноатьо средн. Кис- ■ лотность Среда приводит к изменениям морфологи клеток, которые обратный при изменении величины рН в благоприятную сторону. Таким образом, жягибирутие рост величины рН не затрагивают генотип.

4. Ингибирушая рост кислотность среды приводят к холостому сжиганию углеродных субстратов в падению экономического коэффициента от 0,35 до 0,1, что связано с увеличением затрат источников углерода и анергия на синтез биомасс« в экстремальных условиях холостым сжиганием глюкозы. Падает пул АТФ, усиливается синтез лилвдов.

5. В отлач1е от действия кислотности сррод не удается получить в хемостатв в стационарном состоянии культуру, ингибв-ровааную щелочностью среды, но можно наложить ингибирушее дей- . ствие высокого значения рН на культуру, лимитированную цитратом.

6. Несмотря на постоянство одотности популяции при увеличении щелочности среды до порогового значения рН, происходит существенные изменения в метаболизме бактериЯ: увеличивается потребление углеродных субстратов. Снижается экономический коэффициент, что связано о переключением путей метаболизма на энергетически менее- выгодные, В среде накапливается ацетат, снида-т ется пул А1Ф а увеличивается активность АТФазы.

7.Экстре мал ьиае кислые и щелочные условия среды изменяют химический состав биомассы вас1Д1иа явваЪ*г1и* шт.З* Увеличивается содержание РНК. липидов, фосфолидидо» я поли-^ -оксвмгю-ляной ни слоты и снижается содержание белка. Содержание ДНК постоянно.

- зо -

В. Приведенные исследования показали, что Ери состоянии стресса, вызванном иесвецифическам ингибитором, т.е. величиной рН, у микроорганизмов происходит перестройка метаболизма, что является условием успешной борьбы микроорганизмов с неблагоприятными факторами при росте в экстремальных условиях,

9. Содержание К, На, Ce, Mg» Ре, Си. , а т&кхе Ва ИВгВ клетках Бас il lu a megateriua шт.3 изменяется 8 зависимости от рЦ. Возможно, что это связано с изменениями содержания полимеров : белка, РНК, полифосфатов, активностей ферментов il нарушением проницаемости клеточной меиЗраш.

10. Вперьие проведено сравнительное изучение особенностей роста лизогенной культури в периодических условиях выращивания и в хемостыте. Эта исследования показали, что в условиях хемос-тата, в отличие от периодических, лизогенше культуры сохраняли способность продуцировать зрелые фаговые частицы в результате спонтанной индукции при всех условиях выращивания, а а периодических условиях культура теряет способность индуцировать умеренный фот в стационарной фазе роста. Исходя из урогайьости фага в условиях хемостата видно, что в результата индукции ли-эируется значительное количество клеток/ Û* 10е/. Лизогенность культуры не связана с изменением физиологических свойств популяции при средни* скоростях роста, но, возможно, обуславливает сннпение плотности биомассы при високих скоростях роста в режиме хемостата.

Цо__митеї:налам диссертации опубликованы следующие pa6of;t{:

ï. CujtapitBu 3.1), 1У71) Торможение ¡госта Bacillue açgateriua

H* и йенам). Микробиологии, US, G. У7Й. lî, (Ьшірчнм 3,11. I9VI Цлиляне pli на ііиаиологичсскоо состодіже Bftcllîue «egateriui» , Сб. І'егулшіиіі в биологических ґйі:т»'!,п*. Тезиоіі. Пущина. I to, Ч, и«*н(ч>ип , il^j'iii'Hft'cu.'t і:, h hi'i;;ntoiv і il» jï. l'j'Ai

ltm.-ii<tu> и^Н'Ч» H<vi-j-rri1' lia Bacillub подя^ні-ііів , fa'f-

множащуюся в хемостате. U»RpmJ*^üi>riM, 6, 1ш2. 4» Сахарова З.В.. Ибрагимова С.И. 1975 Влвяаиа и«акого значения рй ил хикячесха! сосг»в хемостатнов культуры Bacillus megstorium . ИнКрОб»ОЛОГИЯ, I» 91*

5. Паглазава H.H., Сахарове ÖJJ. 1975 Нлавнвв аовсв водорода, на морфологию и улхтраструктуру BiOillue »egÄte-rium. Микробиология, 4, 645» в» Сахарова 3+В** Шафоростова J.iU и Иванова И. И. 1975 Кнгибжровани* роста Baoillue negatocltmt ще«очным значением pH в режиме хгиостата. Сб. Рост » рчзвятаа микроорганизмов. Бревен, Т съезд UliQ, 59» 7. Сахароза 3»В», Шафоростова Л.Д» 1976 Действие «елочных значеяиЯ рЯ на хемостатнув культуру Bacillus negatoria um» Сб. Гзматаровзна« я иягибпровал»« роста иакробяо-логического синтеза» Вучхао, 314.

Ivanova.I.I., Sbaforoetqrva Х>.В., ßabiarova Z.V. und Billiger U. i9?5 fhyeiologischer Zuatand von JSacilÜue megafceriu® 1и Obeaootatan unter- alkalischen Beflircßunßen. Ze lt. für Alle, MltooWLol* 16« 53* 9. ßahkarova i.V.( Shaforoatova b.D. t llilllgor Ц. und Per«-wesjenaev T.P. WÄCbetUÄ von BecLllui ua^atärlnu i.ia

СЬепюв taten unter a Uelleben Bedingungen. Zelt, für А13r. Ulkroblol. 86. 1, 4?. 10. Сахарова 3»B* а Работнова Н»Л» £977 Ф*зи cutoro-б «охими-чейхаа свойства Beoillue n^gaterltu* Dpa различим* значениях рЦ» Ыивробяалогжя, 4g» I, 15» II» Сахарова 3»В» 1977 Химический состав клиток хемостатной культуры Bacillus megaterlira при различных значениях рИ» Викробиология 3, 550» 12. Сахарова З.В,, Шафоростова 1.Д.. Кочетков Г.1. 1978 Содержание металлов в клетках . Baotllus «aeeaterrlun trpn различных ус-товтя* культивирования. МиирснЗвоггогия,

KT» Cunpcna 3.0,", Блохош Т.Н., ГаутептатеКя Я.П., Рдбртпо-br VUJT. 19*70 Особ* FT« ости роста лизогекной культуры Bacillen игОЭЭ в периодически* ж к<?ггрирк«(их fry.4tryit4j'Ыикр^чвлогяя, 47, 4, 614*

i- uhui II« ijm.bl», iibaí ^іж Tjvajk Ф^.ьшТ l*i*M/JI> І тич ыи lA\f МШЛ Х^нтгиц^ек^нй j» üíl