Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологический анализ доззависимости сосудистых эффектов эндотелина-1

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологический анализ доззависимости сосудистых эффектов эндотелина-1"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 591.111.8; 617.172.1

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДОЗОЗАВИСИМОСТИ СОСУДИСТЫХ ЭФФЕКТОВ ЭНДОТЕЛИНА-1

03.00.13. - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных (заведующий -академик РАМН, проф.И.П. Ашмарин) Московского Государственного Университета им.М.В .Ломоносова

Научные руководители:

доктор биологических наук Н.А.Медведева доктор медицинских наук, профессор О.С.Медведев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.И.Капелько академик РАМН, профессор Ю.А.Владимиров

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт Общей патологии и патофизиологии

Защита состоится 9 декабря 1996 г. в 15 часов 30 минут на заседат специализированного Ученого Совета Д.053.05.35. по защите диссертаци Биологического факультета Московского Государственного Университета иг М.В.Ломоносова по адресу:

119899 Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическо! факультета МГУ.

Автореферат разослан 9 ноября 1996 г.

Ученый секретарь специализированного Совета: кандидат биологических наук

О

/

/Б.А.Умаров;

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Функционирование сердечно-сосудистой системы в норме определяется балансом воздействий регуляторных факторов различной природы. Изменение соотношения этих влияний в различных условиях обусловливает широкий спектр адаптивных реакций гемодинамики. В то же время, нарушение продукции какого-либо из вазоактивных факторов приводит к смещению равновесия в регуляции работы сердца и сосудов и - как следствие - развитию патологии.

Одним из основных источников гуморальных факторов, обеспечивающих локальную регуляция тонуса сосудов, является эндотелий сосудистой стенки. В эндотелиальных клетках под влиянием различных стимулов синтезируются и выделяются в кровоток оксид азота, простагландины, тромбоксаны, эндотелии, эндотелий-зависимый фактор гиперполяризации и некоторые другие вазоактивные агенты. Среди них эндотелии-1 имеет самый широкий и до сих пор относительно малоизученный спектр физиологической активности.

Впервые этот пептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка был выделен из культуры эндотелиальных клеток аорты свиньи в 1988 году (Yanagisawa et al.). После 8 лет интенсивного изучения он характеризуется как мощный эндогенный регулятор самых разнообразных функций организма. В фармакологических исследованиях показано, что эндотелии-1 оказывает положительные ино- и хронотропные эффекты на сердце (Firth et al, 1990; Qiu et al, 1992), разнонаправленно изменяет тонус сосудов (Мартынова и др., ¡991; Mac Lean et al., 1989), принимает участие в регуляции основных параметров крови и процессов тромбообразования (Filep et al, ¡991), а также модулирует другие регуляторные воздействия на сердечнососудистую систему. Однако, ввиду крайне низкого содержания пептида в крови и тканях его физиологическая роль в регуляции гемодинамики достаточно плохо изучена.

В нормальных условиях концентрация эндотелина-1 в плазме крови определяется в пределах 0.3 ■*■ 1.5 фмоль/ мл. Уровень циркулирующего пептида может увеличиваться в 10-50 раз при разнообразных физиологических и патологических состояниях организма (Горбачева и др., 1991; обзоры - Battistini et al, 1993; Lusher et al, ¡993). Значение повышенных концентраций пептида остается предметом дискуссии. С одной стороны, эндотелии-1 является самым мощным сосудосуживающим фактором и, хотя эти данные получены с использованием

фармакологических доз пептида, вполне вероятно его участие в индуцировании ишемии органов и гипертонических изменений гемодинамики при патологии. С другой стороны, в силу проадаптивной направленности ряда эффектов эндотелина-1 повышение его концентрации в крови может отражать компенсаторные реакции организма различной длительности. Несомненным представляется лишь факт, что циркулирующий пептид оказывает основное влияние на сосуды, их тонус (и в первую очередь - на сосудистый эндотелий), и что это влияние может изменяться с изменением концентрации эндотелина-1 в крови.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышесказанного целью настоящего исследования явилось изучение значения различных концентраций эндотелина-1 в регуляции тонуса сосудов. Для ее решения были поставлены следующие задачи:

1. Определить изменения сопротивления коронарных сосудов наркотизированных крыс в зависимости от дозы вводимого эндотелина-1.

2. Изучить влияние пептида на функционирование эндотелия изолированной аорты крыс.

3. Исследовать действие высоких доз пептида на культивируемые клетки эндотелия и гладких мышц сосудов.

4. Проанализировать возможные мембранотропные эффекты эндотелина-1.

Научная повита работы. При выполнении данной работы была впервые

изучена роль точных концентраций эндотелина крови в регуляции сопротивления коронарных сосудов крыс и дозозависимости этих эффектов. Данные об отставленном угнетении пептидом эндотелий-зависимого расслабления и независимости этого эффекта от известных типов эндотелиновых рецепторов не имеют аналогов в литературе. Новыми являются также сведения о возможности эндотелина взаимодействовать с липидными структурами и изменять их основные свойства.

Научно-практическое значение работы. Представляемое исследование выполнено в рамках фундаментальной проблемы изучения регуляции сердечнососудистой системы. Полученные результаты расширяют современные представления о роли различных коцентраций эндотелина-1 в регуляции тонуса сосудов. Анализ данных указывает на наличие краткосрочных и отставленных эффектов пептида. Быстро проявляющиеся воздействия эндотелина-1 на тонус сосудов по-видимому опосредуются рецепторами ЕТа и Е'ГЬ типов, расположенными в эндотелиальных и гладкомышечных клетках. Отставленные эффекты заключаются в угнетении

эндотелий-зависимого расслабления аорты через 1ч после ее инкубации с эндотелином-1, которое сохраняется на фоне неселективной блокады известных эндотелиновых рецепторов. Эти данные свидетельствуют о наличии неизученного механизма действия пептида: либо через невыявленный тип рецепторов, либо по пути независимому от активации рецепторов вообще. В пользу последнего свидетельствует способность эндотелина-1 увеличивать удельную электропроводность бислойных липидных мембран.

Обобщенные результаты позволяют сформулировать представление о различной физиологической роли циркулирующего эндотелина-1 в норме и при повышении его содержания в крови.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ом и 3-м международных симпозиумах "Механизмы действия ультрамалых доз" (Москва, 1992; Бордо, Франция, 1993); VIII международном симпозиуме "Сосудистые нейроэффекторные механизмы" (Кананаскис, Канада, 1994); конференции "Артериальная гипертензия. Эксперименталальные и клиническиие аспекты" (Санкт-Петербург, 1995); конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (Санкт-Петербург, 1995); международном симпозиуме "Рецепторы пептидов" (Монреаль, Канада, 1996). Результаты неоднократно докладывались на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Объем и структура работы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и иллюстрирована 14 рисунками и 6 таблицами. Диссертация состоит из вступления, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, изложения материалов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает 175 отечественных и иностранных публикаций.

Автор глубоко признателен сотруднице НИИ общей патологии и патофизиологии Евгении Борисовне Манухиной, сотрудникам ИЭК кардиологического научного центра Александру Лапшину, Ольге Степановой, Юрию Романову, сотруднице Московского медицинского университета Евгении Александровне Корепановои, чья неоценимая помощь позволила состояться данной работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Аутоперфузия коронарных сосудов наркотизированных крыс. Исследования выполнены на 10 самцах нелинейных белых крыс (питомник Крюково) массой 250 -330 г., наркотизированных нембуталом (50 мг/кг, внугрибрюшшшо). Аутоперфузию коронарных сосудов проводили по модифицированному нами методу VetterleinSchmidt (Vetterlein, Schmidt, 1985: Медведева и др., 1992). Кровь для аутоперфузии забирали из левой сонной артерии с помощью катетера, соединенного с системой шунта (Рис. la, 1), включавшую в себя последовательно соединенные силиконовую трубку с 20 МГц пьезокерамическим кристаллом допплеровского расходомера (Рис.1а, 2), отведение для введения веществ (3), датчик для измерения перфузионного давления ("Statham", США; Рис. 1а, 4), а также стеклянный катетер специальной формы (Рис. 16), который через правую сонную артерию вводили в остиум левой коронарной артерии.

Временное падение артериального давления и начало кровотока в системе левая сонная артерия - шунт - коронарное русло свидетельствовали о точном введении катетера. В ходе эксперимента непрерывно регистрировали артериальное давление, перфузионное давление и кровоток через систему шунта. Сопротивление коронарных сосудов определяли как отношение перфузионного давления к коронарному кровотоку, из которого вычитали сопротивление собственно системы шунта. Внутрикоронарную инфузию веществ проводили в течение 4-х минут со скоростью 0.04 ил/мин., что составляло в среднем 2-4% от исходного уровня кровотока через систему и при введении физиологического раствора не приводило к достоверным изменениям регистрируемых параметров. Эндотелии-1 (Sigma) разводили в 0.9% растворе NaCl и вводили в 4-х суммарных дозах: 0.2 фмоль/кг, 20 фмоль/кг, 2 пмоль/кг и 0.2 нмоль/кг. В ходе каждого эксперимента изучали эффекты внутрикоронарного введения физиологического раствора и не более двух разных доз пептида. Интервал между введениями эндотелина-1 составлял 30 - 40 мин. По окончании эксперимента животному вводили увеличенную дозу нембутала и выполняли процедуру морфоконтроля.

Рисунок 1. Экспериментальная схема аутоперфузии коронарных сосудов наркотизированных крыс.

И

Обозначения: а - общий вид: 1- система шунта, 2 - допплеровский расходомер, 3 - инфузор, 4 - датчик давления; б - стеклянный катетер, увеличенный вид.

Эксперименты на колечках аорты крыс. В работе использовали самцов крыс линии \Vistar весом 200 - 350 г. (виварий Института общей патологии и патофизиологии). Немедленно после декапитации у животного извлекали нисходящую аорту и помещали в ледяной раствор Кребса. Колечки сосуда длиной 3.5 мм помещали в термостатируемую (37 ± 1°С), непрерывно аэрируемую (95% Ог и 5% СО2) камеру, заполненную физиологическим раствором и вертикально растягивали на стальных зажимах с нагрузкой 1.2 г. Физиологический раствор (раствор Кребса)

имел следующий состав: КаС1-130 мМ, глюкоза - 11 мМ, ЫаНСОз -14.9 мМ, К.С1 - 4.7 мМ, СаСЬ - 2.5 мМ, MgS04 - 1.2 мМ, КН2РО-| -1.18 мМ (рН = 7.4).

Рисунок 2. Стандартный протокол экспериментов на колечках изолированной аорты.

Ацетиптопин

1Ш

Эндотелии-1,10 пМ

Эндотелии-1,1 пМ

Ацетипхолин 5М0+5-Ю'ЧМ

1Ш

Физ.раствор

Норадренапин

1 *10'8, 5«10'7 М

ООО ^

С I РБ 142893, Диметипсупьфоксид)

оооооооооооооо

Норадреналин

5-10'' И

Обозначения: РО 142893 - неселективный антагонист эндотелиновых рецепторов;

- введение веществ; о - смена физ.раствора в камере

Стандартный протокол экспериментов на изолированных колечках аорты представлен на рис.2. В ходе экспериментов оценку эндотелий-зависимого расслабления как показатель функционального состояния эндотелия и эндотелий-независимого расслабления как показатель чувствительности гладких мышц сосуда к N0 производили на препаратах предварительно сокращенных норадреналином, 5х 10"7М. При достижении плато сократительного ответа вводили сосудорасширительные вещества в следующих рангах суммируемых концентраций: ацетилхолин - 5х10"9+5х10"5М, АТФ - 10"7+ 10"4М, нитропруссид натрия - 10"1О+ 10 6 М. Через 15 - 20 мин. после отмывки препарата вводили одну из концентраций эндотелина-1 (001, 0.1, 1 или 10 нМ) или деполяризующий раствор КС1 (80 мМ), или растворитель (10% раствор С2Н5ОН). Объем введения составлял 15 мкл (для КС1 - 600

мкл в физиологическом растворе), время инкубации с веществами - 35 мин. Последующий период отмывки составлял 60 мин, во время которых раствор в рабочей камере сменялся каждые 5 мин. Эта процедура приводила к полному возврату тонуса сосуда, увеличенного констрикторными веществами, к исходному уровню. На этом фоне расширительный резерв препаратов анализировался еще раз по схеме, описанной выше (см. рис.2).

Б отдельной серии экспериментов за 10 мин. до эндотелина-1 вводили неселективный антагонист эндотелиновых ЕТа/ЕТЬ рецепторов - PD 142893 (Acetyl-D-Dip-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH; D-dip = 3,3-D-diphenylaIanine, "California peptides", США), контролем служило введение растворителя - 30 мкл. ДМСО.

Величины изометрического сокращения оценивали в мг., уровень расслабления сосуда - в % по отношению к значению предварительно вызванного сокращения. Математическую обработку результатов проводили с помощью нелинейного регрессионного анализа; для каждой кривой, выражающей зависимость доза-эффект вычисляли индивидуальную величину ЕС ¡о - концентрации агониста, введение которой вызывает эффект равный половине максимального значения. Для статистического анализа полученных результатов использовали t-критернй Стьюдента для парных и непарных выборок.

Исследования с использованием клеточных культур. Исследование возможной токсичности высоких доз эндотелшт-1 проводили с использованием культивируемых эндотелиальных клеток пупочной вены человека и гладкомышечных клеток аорты кролика. Выделение клеток проводили по общепринятой стандартной методике (Chamley-Campbell et al., 1979; Maciag et al., 1979; Antonov et al, 1986; Birukov et al, ¡991). В ходе 4х-дневной инкубации с эндотелином-1 в концентрациях 0.1 и 10 нМ отдельно и в совокупности с антагонистом его рецепторов изучали изменение морфологии клеток и их плотности.

Изучение проводимости модельных яипидных мембран. Модельные бислойные мембраны формировали на основе раствора липидов (азолектин, Sigma) в сквалсне или н-декане (15 мг/мл). В экспериментах использовали стандартную установку для определения проводимости мембран (Корепанова и др., 1989; 1994). Формирование искусственной мембраны контролировали с помощью светового микроскопа. Генерация напряжения происходила через определенные промежутки времени попеременно через один из электродов или постоянно с помощью одного из них.

После установления бислойной мембраны эндотелии-1 или растворитель (10% раствор С2Н5ОН) вводили в обе камеры в одинаковом объеме (до 150 мкл) для избежания её выдавливания. Возможные изменения проводимости мембраны (падение разности напряжений) фиксировались в течение 20-ти минут, после чего липидный бислой механически разрушали. Сопротивление мембраны оценивали по формуле Mmller с сотр. (¡962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние эндотелина-1 различных концентраций на сопротивление коронарных сосудов крыс. Общее сопротивление перфузируемых коронарных сосудов в среднем по 10 опытам было равно 52.7 ± 9.6 мм рт.ст./мл./мин. (пределы 16.4V70.5 мм рт.ст./мл./мин.), величина среднего артериального давления составила 125.9 + 4.9 мм рт. ст. Внутрикоронарпая инфузия физиологического раствора (0.9-% NaC!) не вызывала достоверных изменений ни одного из регистрируемых параметров. Введение эндотелина-1 в дозах от 0.2 фмоль/кг до 2 пмоль/кг не приводило к значимым изменениям системного артериального давления. Это позволило нам сделать предположение о том, что регистрируемые с помощью данного метода изменения сопротивления коронарного русла в ответ на эндотелии-1 отражают непосредственное влияние пептида на тонус сосудов, а не обусловлены адаптивными механизмами при изменении параметров системной гемодинамики.

Другим преимуществом данной методики является возможность создания точно расчитываемого (на основании непрерывно регистрируемых значений кровотока в системе шунта) уровня разведения экзогенно вводимого пептида в коронарной циркуляции. Это позволило нам моделировать сдвиги концентрации циркулирующего эндотелина-1 до значений, которые наблюдаются при различных физиологических и патофизиологических условиях.

Основываясь на литературных данных, мы использовали параметры инфузии эндотелина-1, которые позволяли создавать нормальные или патофизиологические сдвиги концентраций пептида в коронарной циркуляции: 0.01 4- 0.02 фмоль/мл (при суммарной дозе вводимого эндотелина-1 0.2 фмоль/кг), 1 -г 2 фмоль/ мл (20 фмоль/ кг), 0.1 -г 0.2 пмоль/ мл (2 пмоль/ кг). Инфузия в течение 4 мин

Рисунок 3. Влияние инфузин физиологических концентраций эндотелина-1 (ЕТ-1) на коронарное сопротивление наркотизированных крыс.

20-

а 10-

1

<е 0-

с

о

& -10-

2

| -20-

\ -30-

---о— физ.раствор — ЕТ-1

5 10

Время, мин

15

20-

* ЕЕ 10-

£

в 0-

£

О. С -10-1

V

1 -20-

ё

I -30-

ЕТ-1, 20 фмо.и/кг .

1 I-------Ь-Г

--о-- физ .раствор —•— ЕТ-1

5 10

Время, мин

15

двух наиболее низких из изучаемых концентраций вызывала только расширение коронарных сосудов: максимальное уменьшение общего коронарного сопротивления (на 13.6 ± 4.9%, п=6 и 20.6 ± 6.5%, п=6 по сравнению с исходным уровнем для каждой дозы, соответственно) достоверно отличалось от изменений сопротивления при контрольной инфузии физиологического раствора (р<0.05, рис.3). Вероятно, такая высокая чувствительность сосудов к довольно низким дозам гуморального фактора может быть объяснена на основании данных о распределении разных типов эндотелиновых рецепторов. Согласно литературе, рецепторы ЕТв класса в сосудистой системе представлены преимущественно в эндотелиальных клетках и опосредуют

*

* *

(через стимулированное выделение эндотелий-зависимых факторов расслабления) пшотензивное действие эндотелина (Takayanagi et al., 1991). Другой тип - ЕТд -широко представлен в гладких мышцах сосудов и его активация селективными лигандами вызывает сосудосуживающую реакцию (Arai et al., 1990; Takayanagi et al..

1991). Представляется вероятным, что увеличите концентрации циркулирующего в крови эндотелина-1 может приводить к увеличению его связывания только с рецепторами эндотелиальных клеток и, как следствие, усилению секреции эндотелий-зависимых факторов расслабления и уменьшению тонуса сосудов. Чувствительность к таким незначительным для других гормонов концентрациям может обеспечивать подкласс рецепторов, характеризующийся высокой степенью аффинности. Данные о существовании в одном и том же типе ткани рецепторов с одинаковой селективностью к лигандам, но различающихся в 100 -1 ООО раз по уровню чувствительности представлены в нескольких работах (Sokolovsky et al., 1992; Hiley, 1995; Warner et al., ¡996). Таким образом, эндотелин-1 в коцентрациях, которые наблюдаются при физиологических и патофизиологических условиях, вызывает только расширение коронарных сосудов наркотизированных крыс. Можно предположить, что у животных с нормальной реактивностью сосудов пептид не может приводить к ишемии миокарда.

Увеличение суммарной концентрации вводимого пептида до 2 пмоль/кг (разведение в коронарном русле до 0.1 0.2 пмоль/мл, п-5) приводило к исчезновению его сосудорасширяющего эффекта, и даже вызывало увеличение сопротивления коронарных сосудов после окончания инфузии, которое все же не было достоверным (рис.4). Мы предполагаем, что при данной концентрации циркулирующий пептид способен проникать через эндотелий сосудов в количестве, достаточном для активации специфических рецепторов гладких мышц и достижения значимого сокращения сосудов. Этот поздний сократительный ответ по-видимому маскирует быстро проявляющийся расширительный (Медведева и др..

1992). Более того, эндотелин-1 в самой высокой дозе 0.2 нмоль/кг (сдвиг концентрации в коронарном русле до 10 + 20 нмоль/мл, п=2) вызывал только мощное сокращение коронарных сосудов (на 62.0% ), которое наблюдалось уже во время инфузии пептида (рис.4).

Подобное проишемичекое действие высоких доз пептида отмечалось уже целым рядом авторов (Ezra et al., 19Н9; Larkin et al., 19H9; Clozel J.-P.. Clozel M„ 19H9).

В описываемой серии экспериментов мы показали, что данный эффект проявляется лишь при введении эндотелина-1 в фармакологических количествах, т.е. в условиях, которые не зарегистрированы при изучении концентраций эндогенного гормона. Тем не менее, сосудосуживающее действие пептида привлекает пристальный интерес. В наших опытах значительное увеличение сопротивления коронарных сосудов наблюдалось в течение длительного периода ремени после окончания инфузии.

Рисунок 4. Влияние инфузии фармакологических доз эндотелина-1 на сопротивление коронарных сосудов наркотизированных крыс.

о 5 10 15

Времш, мин

Согласно литературе, экзогенно вводимый эндотелии достаточно быстро элиминируется из кровотока и его концентрации в крови снижаются до значений, близких к исходным (Пе Ыиса ег а!., 1(Ш). Таким образом его длительное

сосудосуживающее действие должно опосредоваться изменением состояния какой-либо из систем, принимающих участие в регуляции сердечно-сосудистой системы. В связи с тем, что мы изучали эффекты внутрисосудистого введения эндотелина-1, логично предположить, что основным местом его воздействия является эндотелий сосудов.

Эндотелиальный монослой в силу своего ключевого положения между кровотоком и гладкими мышцами, а также благодаря значительной секреторной активности играет важную роль в регуляции гемодинамики. Нарушение его функционирования сопровождает многие заболевания сердечно-сосудистой системы, а в некоторых случаях - лежит в основе их патогенеза (Чазова, 1996; Rubanyi. 1993). Между тем практически все подобные патологические состояния сопровождаются увеличенным содержанием эндотелина-I в крови. Учитывая это, в следующей серии экспериментов мы изучали влияние различных доз эндотелина-1 на состояние эндотелия.

Влияние эндотелина-1 на эндотелий-зависимое и эндотелий-независимое расашбление сосудов. В опытах на изолированных колечках аорты крыс состояние эндотелия оценивалось по величине расслабления сосудов на ацетилхолин и АТФ, действие которых опосредуется выделением эндотелий-зависимых факторов релаксации (Furchgott, Zawadski, 1980; обзоры - Медведева, Медведев, 1990; Rubanyi, 1993; Bredt, Snyder, ¡994). В наших экспериментах такая оценка проводилась дважды: до и через 1 час после 35-минутной инкубации сосудов с исследуемыми веществами (рис.2).

Основные параметры вызванного ацетилхолином расслабления изолированной аорты и их изменение после инкубации сосуда с исследуемыми веществами представлены в табл.1. Тестирование эндотелий-зависимого расслабления проводили после достижения плато сократительного ответа колечек аорты на норадреналин (см. Протокол экспериментов, рис.2). Среднее значение вызванного норадреналином, 5х10"7 М увеличения изометрического напряжения сосудов составило 418.5 ± 17.0 мг. Достоверных различий по этому показателю между отдельными группами не наблюдалось. На фоне увеличенного тонуса сосудов введение ацетилхолина в ранге суммируемых концентраций 5х10-9+5х10"5 М приводило к дозозависимому расслаблению препаратов. Максимальные значения падения тонуса варьировали в среднем по группам от 46.6 ± 6.6 % до 53.6 ± 6.6 % от

его исходного уровня (табл.1) и также не различались между собой. Введение эндотелииа в низких дозах (концентрации в камере Ю-11, Ю'10 М) и 15 мкл Ю-% раствора этилового спирта (контрольные условия) практически не изменяло изометрическое напряжение препаратов в течение всего 35 мин. периода инкубации. Содержание сосудов в контрольных условиях не приводило к значимым изменениям регистрируемых параметров эндотелий-зависимого расслабления при повторном тестировании, что указывает на адекватность использовавшегося протокола экспериментов. Инкубация колечек аорты с эндотелином-1 в концентрациях 10"" М и Ю"10 М (наиболее близко отражающих его физиологический уровень в крови) вызывала лишь незначительное увеличение расслабления в ответ на максимальные концентрации ацетилхолина (табл.1). Вероятно, в основе этого эффекта лежит способность эндотелина-1 стимулировать синтез и секрецию эндотелнальных факторов расслабления как in xitro (Warner el al., 1992), так и in vivo (De Nucci et al., 1988).

Таблица 1. Основные характеристики вызванного ацетилхолнном расслабления сосудов до и после их инкубации в контрольных условиях и с исследуемыми веществами.

Условия Расслабление. 1 й тест Изменение Изменение Расслабление. 2й тест

инкубации напряжения ответов на

ECso. цМ максимум. при инкуба- NA, 5Х10-7М, ECso, цМ максимум.

о 0 ции св-ми. мг в "о к 1-му тесту;

контроль 0.18 53.6 ± 6.6 0 14.4+ 4.6 0.22 53.5+ 7.5

ЕТ-1. ЮрМ 0.27 51.2+ 5.7 0 14.5± 0.5 0.27 60.0+ 5.8

ЕТ-1,0.1 пМ 0.20 46.6 ± 7.6 0 15.9 ± 3.5 0.22 65.4 ± 10.9

ЕТ-1,1 пМ 0.22 53.0+ 4.1 101.6 ± 11.0 35.1 + 3.8" 0.59» 45.8+ 3.2

ЕТ-1, 10 пМ 0.27 50.4+ 3.9 486.2 ± 37.1 26.0 ± 3.9 0.19* 58.2 ± 4.0

КС1, »0 тМ 0.22 45.7 ± 6.4 500.7 + 27.0 5.5 ± 3.7 0.14* 64.0 + 6.2*

Обозначения: ЫА - норадреналин; ЕТ-1 - эндотелин-1; * - р < 0.05. ** - р < 0.01 - по сравнению с аналогичными значениями для 1-го теста в этой же группе; 4+ - р < 0.01 по сравнению с изменениями в контрольной группе.

Увеличение концентрации пептида до 10^10"8 М приводило к дозозависимому увеличению тонуса сосудов до 101.6 ± 11.0 мг (п=18) и 486.2 ± 37.1 мг (п=17), соответственно (табл.1). Инкубация сосудов с эндотелином-1, 10"9 М сдвигала кривую доза-эффект расслабления сосуда вправо (р<0.05) с относительным уменьшением максимальной величины ответа (Рис.5). Угнетающее действие пептида на состояние эндотелия проявилось также в более чем двухкратном увеличении величины ЕС so (с 0.22 рМ до 0.59 цМ, р < 0.05). Этот эффект не является избирательным по отношению к вызываемому ацетилхолином расслаблению сосудов, т.к. аналогичные данные получены в опытах с АТФ. У сосудов предсокращенных норадреналином введение АТФ в ранге суммируемых концентраций Ю-7 н- 10"4 М вызывало развитие дозозависимого расслабления в среднем до 81.9 ± 6.1% (ЕСзо = 9.7 |дМ). Инкубация препаратов аорты с эндотелином-1 в концентрации 10"9 М приводила к уменьшению их чувствительности к АТФ: величина ECso увеличивалась с 12.2 цМ до 40.7 цМ (р < 0.01) при практически неизменных максимальные зарегистрированных значениях расслабления (77.1 ± 4.6% - в первом и 74.7 + 10.5% -во втором тестах).

Несколько противоречивым с этой точки зрения являются результаты инкубирования сосудов с эндотелином-1 в концентрации Ю-8 М (Рис.5). В этих экспериментах после действия пептида наблюдали увеличение и эндотелий-зависимого расслабления, и обшей чувствительности к ацегалхолину (р<0.05; табл.1). Основным различием эффектов двух доз эндотелина-1 является значительно более мощная констрикция, вызываемая максимальной концентрацией (486.2 ± 37.1 мг против 101.6 ± 11.0 мг, р < 0.001). Согласно литературным данным, длительное, сильное увеличение тонуса сосудов приводит к компенсаторным реакциям, выражающимся в увеличении продукции эндотелиальных факторов расслабления и усилении чувствительности сосудистых гладких мышц к их влиянию (Медведева, Медведев, 1988; Rubanyi, 1993). Вероятно, что данное явление лежит и в основе различного действия двух высоких концентраций эндотелина-1. Для проверки предположения провели серию экспериментов, в которых в качестве сосудосуживающего фактора использовали деполяризующий раствор KCl. В концентрации 80 мМ KCl вызывал увеличение изометрического напряжения сосудов близкое по величине с действием эндотелина-1, 10"8 М (500.7 ± 27.0 мг, табл.1). После

инкубации препаратов аорты в этих условиях эндотелий-зависимое расслабление также увеличивалось. Это выразилось как в усилении максимальных ответов на ацетилхолин (р < 0.05), так и в уменьшении величины ЕСзо(с 0.22 цМ до 0.14 цМ, р < 0.05).

Рнсунок 5. Изменение вызванного ацетилхолином (Ach) расслабления

изолированной аорты после инкубации с эндотелином-1 (ЕТ-1) высоких концентраций.

75-

'50

ч

>225.

ЕТ-1,1пМ

75-,

.50-

• БС50 =0.22цМ

• BCso = 0.59|.iM*

ю25-

О. 0-

ЕГ-1, 10 М

ЕС» = 0.27цМ ЕС» = 0.19рМ*

-8-7-6-5-4 log [Ach], М

о- 1-й тест; <

-8-7-6-5 log [Ach], М

• 2-ой тест

Подтверждением того, что увеличение вызванного ацетилхолином расслабления после инкубации сосудов с эндотелином-1, Ю-8 М не опосредуется прямым действием пептида на состояние эндотелия, стали опыты с нитропруссидом натрия. Это вещество в физиологических условиях распадается с образованием оксида азота и, таким образом, относится к классу эндотелий-независимых сосудорасширяющих факторов. Следовательно, изменения вызываемого нитропруссидом натрия расслабления отражает изменение чувствительности гладких мышц к действию оксида азота эндогенной или экзогенной природы. В наших опытах эндотелии-1 в концентрации 10"8 М вызывал отставленное увеличение эндотелий-независимого расслабления. Как и в случае действия ацетилхолина, возрастали максимальные ответы на нитропруссид (с 89.2 ± 7.6% до 105.7 ± 1.8%, р < 0.05; п=6) и значительно уменьшалась величина ECso (с 14.2 пМ до 4.8 11M, р < 0.01). Блокада эндотелиновых рецепторов неселективным антагонистом PD 142893 примерно в 10

о

раз снижала сосудосуживающее действие максимальной дозы пептида и одновременно предотвращала развитие обоих эффектов. Таким образом, эндотелии-1 в концентрации 10"8 М вызывает увеличение чувствительности гладких мышц к сосудорасширяющим факторам опосредованно через развитие высокого напряжения сосудов.

В работах других авторов было показа но, что пептид способен уменьшать эндотелий-независимое расслабление изолированных сосудов (Macdonald et al., 1989) и эндотелий-зависимое расширение сосудов in vho (Hagar, 1994). Однако, в этих экспериментах введение нигропруссида натрия и ацетилхолина осуществлялось в присутствии повышенных концентраций эндотелина-1 и, следовательно, эффект пептида мог опосредоваться его прямым сосудосуживающим действием. В наших экспериментах определение состояния эндотелия проводилось через 60 мин после инкубации колечек аорты с пептидом и, следовательно, зарегистрированные изменения отражают отставленные эффекты пептида.

Вызываемое эндотелином-1 угнетение эндотелий-зависимого расслабления наблюдалось и при совместной инкубации сосудов с пептидом и неселективным антагонистом эндотелиновых рецепторов PD 142893. На фоне предварительно введенного антагониста эндотелии-1, 10*9 М не проявлял сосудосуживающего действия вообще (п=8; по сравнению с 101.6 ± 11.0 мг в опытах без блокады рецепторов), а эффекты пептида в концентрации 10"8 М снижались в несколько раз (с 486.2 ± 37.1 мг до 92.9 ±21.9 мг, n=9; р < 0.0001). Тем не менее, в этих условиях пептид как в концентрации 10"9 М, так и в концентрации 10"8 М вызывал гораздо более значительное угнетение эффектов ацетилхолина (Рис.6). Достоверные значения получены как для изменения холиночувствителыюсти в целом (ЕС50 увеличивалась с 0.22 до 0.38 цМ, р < 0.05 и с 0.16 до 0.37 цМ, р < 0.01, соответственно), так и для уменьшения расслабления на максимальные дозы агониста (р < 0.05 и р < 0.001, соответственно).

Таким образом, эндотелин-1 вызывает угнетение эндотелий-зависимого расслабления сосудов даже на фоне блокады обоих типов его рецепторов. Данные о подобном эффекте в доступной нам литературе отсутствуют. Представляется вероятным, что данное воздействие либо опосредуется неизвестным в настоящий момент типом рецепторов, либо не зависит от их активации вообще. Назначение данной реакции, как и ее механизмы, представляется неоднозначным. Вызванное

эндотелином уменьшение эндотелий-зависимого расслабления может лежать как в основе патологического угнетения эндотелия (например, при повреждении миокарда, вызванном ишемией-реперфузией - 1л/ег ег а1„ 1991), так и служить комненсаторной реакцией при заболеваниях, сопровождаемых гиперактивацией эндотелия (например, при эндотоксиновом шоке - Маес1а е/ а!.. 1995). Примечательно, что и развитие эндотоксинового шока, и повреждение миокарда характеризуются повышением уровня эндогенного эндотелина-1 в плазме крови (обзор - Вшйшт е! а!., 1993).

Рисунок 6. Изменение вызванного ацетилхолином (АсЬ) расслабления изолированной аорты после инкубации с эндотелином-1 (ЕТ-1) на фоне блокады эндотелиновых рецепторов.

75-

«Г 50г

О

ч ю

я 25ч о

V

я а.

0-

Изучение возможных механизмов вызываемой пептидом дисфункции эндотелия мы провели на основании данных о близком структурном родстве пептидов эндотелиновой группы и токсинов яда змеи А¡гаскири ещаМсгт*. обозначаемые как сарафотоксины а, Ь, с, <1 [или Бба, БбЬ, Ббс, БбсЗ] (У'апа^хака ег а!.. 1988; ЯокоЬпку, 1991). Согласно ЗоШохьку с сотр. (1992) кроме прямой гомологии для этих веществ существует еще и общий спектр физиологической и патофизиологической активности. Исходя из этого в следующей серии экспериментов мы изучали возможное токсическое влияние эндотелина-1 на культивируемые клетки сосудов.

Влияние эпдотелина-1 на состояние культивируемых гладкомышечных и эндотелиальных клеток сосудов. Эксперименты проводили на гладкомышечных

РП&ЕГ-1,1пМ

^Л-Л

> ЕС» = 0.22цМ • ЕСзо = 0.38цМ*

751

г?

«Г 50-

а>

"я 25-

и и

я ь

РО&ЕТ-1, 10 пМ

-8-7-6-5-4 [АсЬ|, М

о-1 -Й тест; • - 2-ой тест

У"

д-

• БСзо = 0.16 цМ ■ ЕС5о = 0.37Ц\Р

-6-7-6-5 1ощ | л с ь |, м

клетках аорты кролика и эндотелиальных клетках пупочной вены человека. Эндотелии-1 в концентрациях 10 9 М и !0~7 М добавляли в культуральную среду в течение 4-х дней, после чего анализировали морфологию и изменение плотности клеток. Добавление пептида в высоких дозах никак не повлияло на прикрепление и распластывание клеток во всех опытах. Нарушение морфологии или значительное изменение плотности клеток также не было отмечено ни в одной из экспериментальных групп. Между тем как достоверное токсическое влияние других веществ приводит к более чем десятикратному уменьшению последнего показателя.

Полученные результаты соответствуют данным о влиянии пептида на клетки нейронального происхождения (МИа/Ьх с! а1, 1993). Как было показано повреждение мозговых структур, наблюдаемое ш у ко при системном введении эндотелина-1, объясняется сильной ишемией вследствие сосудосуживающего действия пептида. Прямого токсического действия в этих экспериментах также не было обнаружено. Таким образом, согласно литературным данным и результатам, полученным в наших экспериментах, эндотелин-1 даже в очень высоких (фармакологических) концентрациях не оказывает токсического влияния на клетки сосудистой природы и, как следствие, на функционирование тканей.

Другим предположением о механизме угнетающего действия пептида на эндотелий явилось допущение о том, что эндотелин-1 может накапливаться в липидных мембранах клеток и изменять либо их свойства, либо функционирование белков, встроенных в такие мембраны. Согласно литературе такая форма активности характерна для большого спектра эндогенных пептидов (вещество Р, брадикинин, кальцитонин-ген-родетвенный пептид и др.) и некоторых токсинов пептидной природы (обзор - МошН ег а!., 1990). Общим свойством таких веществ является наличие гидрофобной последовательности в структуре молекулы и суммарный положительный заряд аминокислотных последовательностей (чаще всего +1+2). Данных о подобной активности для эндотелина мы не обнаружили. Тем не менее, согласно литературе, СООН-конец молекулы пептида образует гидрофобный "хвост", перед которым расположены два положительно заряженных аминокислотных остатка (Уат^ака е! а1„ 1988). Исходя из этого, следующим шагом в нашей работе стал анализ возможного взаимодействия пептида с липидными структурами.

Взаимодействия эндотелииа-1 с липидными структурами. Определение возможности для эндотелина-1 накапливаться в липидных структурах мы провели по принципу биотестирования, в которых эффекторным органом служили колечки

изолированной аорты крыс, а измеряемым параметром - сохранение сосудосуживающей активности раствора эндотелина-1. Как показали результаты, присутствие липидов в инкубационной камере, а еще в большей степени -предварительное выдерживание пептида в среде липиды-вода приводят к уменьшению эффектов 10 нМ раствора эндотелина в несколько раз. Уровень вызываемого в этом случае сокращения сосудов приблизительно равен эффекту эндотелина-1, 5 * Ю'10 М -г- 1 х 10"9 М в контрольных условиях. Следовательно, молекулы пептида в растворе липиды-вода распределяются преимущественно в гидрофобной фазе в возможном соотношении 10:1. Это позволило нам высказать предположение, что эндотелии-1 может накапливаться в природных липидных структурах в результате как-либо изменяя их свойства. Анализ этой гипотезы был проведен при исследовании изменений удельной электропроводности искусственных липидных мембран под действием эндотелина-1.

Основным способом их получения является растворение азолсктина (смеси природных липидов) в и-декане или сквалене. В зависимости от растворителя можно получить практически полностью бислоиные сткруктуры (сквален) или мембраны с вкраплениями жидкости между слоями липидов (н-декан). В наших экспериментах использовались обе эти модели. В ходе эксперимента мембраны формировали на отверстии в тефлоновой пластинке и в течение 20 мин регистрировали изменения ее удельной электропроводности. В контрольных экспериментах этот показатель практически не изменялся со временем. В опытах со скваленом введение эндотелина-1 в концентрациях 1 х Ю-8 т5х 10"8 М также не приводило к значимым изменениям свойств мембран.

В противовес этому в опытах с н-деканом пептид дозозависимо (с максимумом примерно в 100 раз) увеличивал удельную электропроводность искусственных мембран. Согласно литературе, такая активность может отражать либо изменение свойств липидов (и прежде всего - температуру фазового перехода), либо каналообразующие свойства самого пептида (обзоры - Крепе, 1981; Eriksson, 1992). Тем не менее, последнее свойственно преимущественно лишь широкому кругу антибиотикоов (Коретнова и др., ¡989; 1994), но не эндогенным регуляториым гормонам. Вероятно, встраивание эндотелина-1 в мембраны может вызывать информационные изменения липидов и, как следствие, изменение их состояния. В любом случае мы считаем, что увеличение удельного сопротивления мембран под действием эндотелина-1 может быть ассоциировано с его независимым от рецепторов

угнетающим влиянием на состояние эндотелия. Как уже говорилось, пептид способен изменять потенциал сосудистых клеток, но механизм осуществления этого эффекта практически не выяснен (Ма.чакй Yanagisaкa, 1993). Несомненно, и определение характера действия эндотелина-1, и его возможная связь с вызываемым пептидом изменением функционального состояния эндотелия нуждаются в проведении дополнительных, более тщательных экспериментов.

ВЫВОДЫ

1. Эндотелии-1 при увеличении его концентраций в крови до 0.02 ^ 2 фмоль/мл вызывает только расширение коронарных сосудов наркотизированных крыс.

2. Инкубация изолированных сосудов с эндотелином-1 в концентрациях 1 - 10 пМ вызывает угнетение эндотелий-зависимого расслабления, которое сохраняется на фоне блокады эндотелиновых рецепторов.

3. Эндотелии-1 в концентрациях до 100 пМ не оказывает токсического влияния на культивируемые эндотелиальные и гладкомышечные клетки.

4. Эндотелин-1 способен накапливаться в липидных структурах и, в концентрациях 8-40 пМ вызывать увеличение электропроводности бислойных липидных мембран.

5. Эндотелин-1 в низких (физиологических) концентрациях вызывает уменьшение сопротивления сосудов в ответ на введение пептида, и потенциацию эндотелий-зависимого расслабления в ответ на другие вазомоторные факторы. Увеличение концентрации пептида приводит к значительному сужению сосудов и угнетению эндотелий-зависимого расслабления. Полученные результаты позволяют сделать предположение о различной физиологической роли циркулирующего эндотелина-1 в норме и при повышении его содержания в крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Medvedeva N.A., Grafov М.А., Medvedev O.S. Effects of low doses of cndothelin-1 on the coronary vascular resistance of anesthetized rats. // Abstracts of the 2-nd International Congress on Ultra Low Doses. Bordeaux, France. 1-2.10.1993. p.29.

2. Medvedeva N.A., Grafov M.A., Medvedev O.S. Physiological concentrations of endothelin-1 produce only coronary vessels dilation- in anesthetized rats. U Canadian J.Physiol.Pharmacol. v.72, Suppl.4, p.39.1994 (Abstract).

3. Графов M.A., Медведева H.A., Медведев O.C. К вопросу о роли эндотелина-1 различных концентраций в регуляции сопротивления коронарных сосудов у крыс. II В сб.:"Артериальная гипертензия. Эксперименталальные и клиническиие аспекты". Тезисы докладов конференции. Санкт-Петербург, 30 мая - 1 июня 1995 г. стр.19.

4. Графов М.А., Медведева Н.А., Медведев О.С. Физиологические концентрации эндотелина-1 вызывают только расширение коронарных сосудов наркотизированных крыс. Н Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. т.120, ном.7. стр.16-19.1995.

5. Графов М.А., Лапшин А.В. Эндотелшг-1 угнетает эндотелий-зависимое расслабление через нерецепторный механизм. // В сб.: "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций." Материалы конференции молодых физиологов и биохимиков России. Санкт-Петербург, 19.-21.09.1995. стр.52.

6. Medvedeva N.A., Grafov М.А., Davydova S.A., Medvedev O.S. Physiological role of endothelin-1 in coronary vessels control in anesthetized rats. II In: Universities as Centres of Fundamental Research. Book II. Medicine. Moscow University Press. P. 149-156. 1995.

7. Grafov M.A, Lapshin A.V., Rubina A.Yu., Manukhina E.B., Medvedeva N.A., Medvedev O.S. No role for PD 142893 in prevention of delayed endothelial dysfunction due to endothelin-1. II Abstracts of the International Symposium "Peptide Receptors". Montreal, Canada. 28.07.-01.08.1996. p.70.

8. Графов M.A., Лапшин A.B., Рубина А.Ю., Манухина Е.Б., Медведева Н.А., Медведев О.С. Эндотелии-1 модулирует вызванное ацетилхолином расслабление изолированной аорты крысы. II Доклады АН. т.351, ном.1. 1996.