Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экзополисахарид бактерий Paenibacillus ehimensis

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Экзополисахарид бактерий Paenibacillus ehimensis"

На правах рукоржи

005007896

ХУДАИГУЛОВ ГАЙСАР ГАРАЕВИЧ

ЭКЗОПОЛИСАХАРИД БАКТЕРИЙ РаешЬасШих еЫтет15: УСЛОВИЯ БИОСИНТЕЗА, СОСТАВ И СВОЙСТВА 03.01.06 - биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 6 ЯНЗ 2012

Уфа-2012

005007896

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Логинов Олег Николаевич

Официальные оппоненты:

• доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович (Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН)

• доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович (Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН);

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Защита состоится «17» февраля 2012 г. в 16:00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 002.136.01 Учреждении Российской Академии Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу. 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 69, тел/факс: 8 (347) 235-62-47, e-mail: ib@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН и на официальном сайте АН РБ по адресу: http: // www.anrb.ru/inbio/dissovet

Автореферат разослан «[£_» Of 2012г.

Ученый секретарь регионального диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Р.В. Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Полисахариды находят широкое применение в таких областях человеческой деятельности как медицина, пищевая, нефтедобывающая и фармацевтическая промышленность. Экзогликаны бактерий широко используются при полимерном заводнении пласта, применение которых дает ощутимый экономический эффект (Сафонов, 1997).

Растворы декстранов используются как заменители плазмы крови в медицине при больших потерях крови (напр.: препарат «Реополиглюкин»). Предложено использование альгинатов в качестве компонентов в системах адресной доставки лекарств (Ciofani et al., 2008).

Рынок водорастворимых полимеров в 1998 году составил 6,8 миллиардов долларов США. Спрос нефтедобывающей отрасли на бактериальные экзополисахариды только в США составляет цифру порядка 1 млн.т (Sabra et al., 2001).

Бактериальные ЭПС, в отличие от большинства химически синтезированных, являются биодеградируемыми и не наносят вреда окружающей среде (Muhammadi, 2008). А возросший интерес к экологически чистым технологиям стимулирует спрос на природные ЭПС.

Бактериальные экзополисахариды представляют группу очень перспективных стимуляторов защитных сил организма. Так экзополисахариды бактерий Paenibacillus polymyxa, обладают антивирусными и противоопухолевыми свойствами, оказывают профилактическое действие при экспериментальной стафилококковой инфекции и пролонгируют действие лекарственных веществ, повышая неспецифическую реактивность организма (Егоренкова и др., 2009).

Таким образом, поиск новых продуцентов экзополисахаридов, несомненно, представляет научный и практический интерес.

Цель исследования.

Выделить и охарактеризовать экзополисахарид бактерий. РаетЪасШиз еЫтйшэ, Определить мономерный состав, свойства и реологические характеристики ЭПС.

Задачи исследования:

отработать режимы и условия культивирования исследуемого штамма для максимального выхода высоковязкого ЭПС. подобрать условия выделения и очистки ЭПС.

установить химическую природу и мономерный состав экзополисахарида.

исследовать физико-химические и реологические свойства гелей ЭПС.

Научная новизна. Впервые выделен и охарактеризован экзогенный полиуронид бактерий РаетЬасШш еЫтетк 739 - продуцента ЭПС (Патент РФ).

Практическая значимость.

Запатентован новый продуцент экзополисахарида. Определены основные технологические подходы производства высоковязкого биополимера и перспективные области применения в различных отраслях народного хозяйства.

Апробация работы.

XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009). XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010), II Всероссийская школа-конференция молодых ученых «Современные методы и подходы в биологии и экологии» (Уфа, 2011).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 97 страницах, содержит 21 таблиц и 19 рисунков. Список использованной литературы включает 135 наименований, из них 40 на русском языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований являлся штамм бактерии Paenibacillus ehimensis 739 из Коллекции микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН, который находится на патентном депонировании во всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-2680D.

Оценку влияния источника углерода на вязкость культуральной жидкости оценивали в среде Федорова имеющей состав, г/л: К2НР04 - 0,3; СаНРО., - 0,2; MgS04 - 0,3; K2S04 - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl3 - 0,01; CaC03 - 5,0;. В качестве субстратов использовали: глюкозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, мелассу, этанол. Культивирование проводили на качалке УВМТ-12-250 (180 мин"1, 120 ч, 30°С).

Оптимизацию условий культивирования проводили с применением метода математического планирования эксперимента (Практикум..., 2005). Факторами варьирования, влияющими на процесс синтеза и накопления ЭПС были выбраны концентрация мелассы в питательной среде, аэрация, температура и продолжительность культивирования, соответственно Хь Х2, Хз, Х4. (Таблица 2.1) Варьирование осуществлялось изменением уровня фактора («верхний» и «нижний» уровни варьирования). Концентрация остальных компонентов среды было зафиксировано. Для оценки влияния был составлен план полного факторного эксперимента четвертого порядка (ПФЭ 24). Матрица планирования эксперимента представлена в табл. 2.2.

Факторы и уровни их варьирования в ПФЭ 24

Параметр культивирования Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «-» Верхний уровень «+» Единица варьирования

Содержание мелассы, г/л X, 40 20 60 20

Перемешивание, мин"1 Х2 160 120 200 40

Температура, °С Х3 30 25 35 5

Продолжительность культивирования, ч х4 96 48 144 48

Таблица 2.2

Матрица планирования ПФЭ 24

№ среды X, Х2 Хз Х4

1 - - - -

2 + - - -

3 - + - -

4 + + - -

5 - - + -

6 + - + -

7 - + + -

8 + + + -

9 - - - +

10 + - - +

11 - + - +

12 + + - +

13 - - + +

14 + - + +

15 - + + +

16 + + + +

17 0 0 0 0

Выделение ЭПС из культуральной жидкости проводили при помощи переосаждения изопропиловым спиртом (0,9 частей). Осадок промывали чистым изопропиловым спиртом, холодной водой и сушили до постоянной массы.

Молекулярные массы ЭПС оценивали методом гельпроникающей хроматографии (ВЭЖХ), на колонке TSK G4000SW В качестве стандартов использовали декстраны с различными молекулярными массами. Для установления типов мономеров применяли гидролиз в 7% HCl.

ИК - спектры записывали на спектрофотометре Specord М 80 (Carl Zeise, Германия) в области 600-4000 см"1 (в пленке толщиной 15-20 ц).

Спектры ЯМР 'Н регистрировали на спектрометре Bruker АМ-300 (Германия) (рабочая частота 300 МГц) для 2 % растворов гидролизата полисахарида при 80 °С, растворитель - D20.

Спектры ЯМР 13С с широкополосным подавлением по протонам регистрировали на спектрометре Bruker АМ-300 (Германия) (рабочая частота 75,47 МГц) для 2 % растворов гидролизата полисахарида, внутренний стандарт — DDS, растворитель — D20.

Для оценки кинематической вязкости культуральной жидкости и растворов экзополисахаридов использовали стеклянный капиллярный вискозиметр Оствальда. Исследования реологических свойств экзополисахаридов проводились на реометре RheoStress-1 (Haake, Германия).

Статистическую обработку результатов проводили, используя t-критерий Стьюдента на 5% уровне значимости. Полученные данные статистически обрабатывались с помощью программы Microsoft Excel-2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Влияние источника углерода на синтез ЭПС РаетЬасШш е/г/тешта При культивировании на индивидуальных углеводах вязкость образцов культуральной жидкости полученных на сахарозе была выше, наилучшие результаты были получены на средах, где в качестве источника углерода использовалась меласса. Вероятно, на продукцию ЭПС влияют факторы роста, которые в большом количестве содержаться в мелассе.

Таблица 3.1

Подбор источника углерода

Источник углерода Вязкость культуральной жидкости, сСт

Глюкоза 48 ±2

Сахароза 67 ±3

Мальтоза 50 ±3

Крахмал 53 ±3

Меласса 765 ±38

Этанол 34 ±2

В ходе экспериментов установлено что меласса, применяемая для биосинтеза ЭПС бактериями РаепгЬасШиз еЫтепзгз 139 должна соответствовать определенным требованиям. Наиболее критичным параметром является содержание сахарозы, которое должно быть не менее - 45%.

Таблица 3.3

Результаты полного факторного эксперимента 4-го порядка

Вариант № Содержание мелассы, г/л Аэрация, об/мин Температура, 'С Продолжительность культивирования, ч Вязкость, сСт

1 10 160 25 72 Вязкость, сСт

2 30 160 25 72 40,02±1,6 0

3 10 200 25 72 50,93±2,0 4

4 30 200 25 72 33,95±1,3 6

5 10 160 35 72 274,05±1 0,96

6 30 160 35 72 20,61±0,8 2

7 10 200 35 72 4,85±0,19

8 30 200 35 72 7,28±0,29

9 10 160 25 168 20,61±0,8 2

10 30 160 25 168 126,11±5, 04

11 10 200 25 168 55,78±2,2 3

12 30 200 25 168 297,09±1 1,88

13 10 160 35 168 30 000±423,00

14 30 160 35 168 14,55±0,5 8

15 10 200 35 168 27,89±1,1 2

16 30 200 35 168 18,19±0,7 3

17 20 180 30 120 13,34±0,5 3

Наиболее оптимальным условиям, с точки зрения накопления экзополисахарида в культуральной жидкости, соответствовали: аэрация - 200 об/мин, температура-25°С, концентрация мелассы -30 г/, продолжительность культивирования -168 ч.

Следует отметить, что такое сочетание факторов неблагоприятно для роста микроорганизмов и ведет к удлинению логарифмической фазы роста. Вероятно, синтез молекул ЭПС с более высокой молекулярной массой и в большем количестве является ответом на стресс, вызванный неблагоприятными условиями роста, например: увеличение продукции экзополисахарида бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae в присутствии Си2+ (Kidambi et al., 1995).

Для установления справедливости данной теории в отношении бактерий Paenibacillus ehimensis 739 был проведен эксперимент о влиянии стрессовых ситуаций на продуктивность биомассы Paenibacillus ehimensis 739. Подобные исследования, только для бактерий рода Pseudomonas, проводили Shrikrishna и William (Shrikrishna et al.б 1995). В качестве компонента вызывающего дегидратацию клеток, как и в оригинальной статье, выбрали этанол, который помимо этого обладает бактерицидным действием. Так при росте на среде содержащей 1 -4% этанола при меньшем титре колониеобразующих единиц вязкость 1% раствора КЖ была выше. Что может быть вызвано большей молекулярной массой синтезируемого ЭПС (рис. 3.1). Как видно из рисунка, при культивировании на среде с добавлением 1% этанола вязкость 1% раствора КЖ выше при меньшем количестве колониеобразующих единиц, в то время как масса препаратов ЭПС была одинаковой, также в данном случае проявлялось совместное ингибирование мелассой и этанолом. Концентрация этанола в среде более 2% ингибировала рост штамма-продуцента. В варианте с 4% содержанием этанола титр был равен 3 млн. КОБ в миллилитре культуральной жидкости масса ЭПС и вязкость 1% раствора КЖ оставались на прежнем уровне.

Рисунок 3.1

Влияние осмотического стресса на продукцию ЭПС Paenibacillus ehimensis 739

Вязкость. сСт 1

0.99 0.96 0.9" fl.46 0.9.< 0.91 0.9Л 0.92

р-рп КЖ. cCi КОЕ

Содсрткашк этанола. 1

Нами установлено, что хранение КЖ не сказывается негативно на вязкостных свойствах постферментационной жидкости. Образцы КЖ сохраняли свои

реологические характеристики более 90 дней при температуре окружающей среды 20-25°С и относительной влажности 75-85%, что является немаловажным при практическом применении и говорит об отсутствии ферментов катализирующих распад ЭПС у РаетЪасШт ек1тет15 739.

В большинстве случаев выделение ЭПС из культуральной жидкости осуществляют добавлением двух или трех объемов полярного смешивающегося с водой растворителя (напр. этанол, ацетон, изопропиловый спирт). Для выбора наиболее оптимальных параметров данного процесса с точки зрения полноты извлечения из культуральной жидкости ЭПС было проведено исследование по влиянию типа растворителя на количество осаждаемого ЭПС. Для этого были выбраны следующие растворители этанол, изопропиловый спирт и ацетон. Был приготовлен раствор ЭПС.

Для приготовления данного раствора использовался экзополисахарид полученный осаждением ацетоном (температура -20°С), после добавления ацетона, КЖ выдерживалась при температуре -20°С в течение 72 часов. За это время сформировывался плотный осадок экзополисахарида, осадок дополнительно промывался ацетоном для удаления оставшейся влаги.

На первом этапе определялся наиболее оптимальный растворитель для осаждения ЭПС. Соотношение раствор ЭПС - осаждающий агент 1:1. Результаты представлены в процентах, масса осажденного ЭПС от массы в растворе (рис. 3.2).

Рисунок 3.2

Выбор оптимального растворителя

80 70 60 50 40 30 20 10 • гЪ

ИПС Ацето Этанол

Как видно из рис 3.2 изопропиловый спирт является наиболее подходящим для этой цели растворителем, ИПС осаждает до 70% экзополисахарида из раствора, для ацетона и этанола 50% и 3% соответственно. Применение бутанола и более высших спиртов, в данном случае, не является возможным, т.к. не происходило

смешивания КЖ и растворителя. Вариант с метанолом не рассматривался изначально ввиду его ядовитости.

На втором этапе проводился выбор количества изопропилового спирта. Результаты представлены в процентах осажденного ЭПС от исходного (рис. 3.3).

Выбор количества изопропилового спирта

ОсажлевоЭПС.

Ч

40 " 30 " 2« " 10 ' 0

КолпчесвтоНПС. оцоб

Таким образом, параметры осаждения следующие: тип полярного растворителя применяемого для осаждения ЭПС из культуральной жидкости -изопропиловый спирт, количество ИПС - 0.9 объемов на 1 объем культуральной жидкости. Температура осаждающего агента -20°С.

Так как сами экзополисахариды бесцветны либо слабоокрашены была предпринята попытка очистить их от красящих веществ. Переосаждение ЭПС не только уменьшала конечный выход экзополисахарида, но и не приводила к желаемому результату. Были выбраны следующие способы очистки ЭПС (Рис.3.4):

Рисунок 3.4

Способы очистки

Обработка растворами перекиси водорода при концентрациях от 3 до 0,3 % приводила к деструкции полимера, многократное переосаждение тоже не привело к желаемым результатам, к тому же это приводит к увеличению потерь ЭПС. При

растворении экзополисахарида в 0,1 М серной кислоте и последующем осаждении получался обесцвеченный продукт, без ухудшения реологических характеристик (Рис. 3.4).

При анализе молекулярной массы методом гельпроникающей хроматографии ЭПС выходил из колонки ассиметричным пиком в интервале 350-300 кДа (Рис 3.5).

Рисунок 3.5

Гельпроникающая хроматография ЭПС РаетЪасШт еЫтет1Э 739

500 300 ZOO 100

кДа кДа кДа «Да

U1 i

колонка TSK G4000SW (300x7,8 мм, "Toyo Soda", Япония) 0,15 М NaCl, расход 1 мл/мин. При гидролизе растворами 2-5 н. серной кислоты (температура 100°С, 5 часов) не удалось добиться полного распада полимерной цепи экзополисахарида, ЭПС расщеплялся на фрагменты с молекулярной массой составляющей примерно 40 000 (рис. 3.6).

Гельпроникающая хроматография гидролизатов ЭПС (гидролиз 4 н. H2SO4)

колонка TSK G4000SW (300x7,8 мм, "Toyo Soda", Япония) 0,15 М NaCI, расход 1 мл/мин. После гидролиза в 7% соляной кислоте хроматографические профили гидролизатов были идентичны результатам гельпроникающей хроматографии растворов сахарозы (рис. 3.7 и рис. 3.8).

Рисунок 3.7

Гельпроникающая хроматография 4% раствора сахарозы

25,58 20 Л

нВ \

Í у

■1,21 ________ . J

2 4 6 Í 10 12 14 ii 16 20 íM

колонка TSK G4000SW (300x7,8 мм, "Toyo Soda", Япония) 0,15 MNaCl, расход 1 мл/мин.

Гельпроникающая хроматография гидролизатов ЭПС (гидролиз 4 н. НС1)

0,15 МТМаС1, расход 1 мл/мин.

При анализе методом ВЭЖХ на колонке ЗПавогЬ - ЮТг, откалиброванной по углеводам, наблюдалось значительное удерживание компонентов гидролизата (рис. 3.9), что вероятно говорит о кислотном характере компонентов входящих в состав полимерной цепи полисахарида продуцируемого штаммом бактерии РаетЬасШш еИ1тет1я 739.

Рисунок 3.9

Хроматограмма гидролизата ЭПС РаетЬасШия еЫтетгв 739

колонка ЗПазогЬ - ЫН2 (290x7,5 мм), ацетонитрил : вода = 75 : 25, расход 1

мл/мин

Однако, в ИК спектрах гидролизатов присутствовали сигналы характерные для уроновых кислот, табл. 3.4.

Таблица 3.4

Данные ИК-спектров ЭПС РаетЬасШш еМтепягз 739

Волновое число ИК- спектра, см"1 Функциональная группа

3400 ОН

2800-2900 -СН3

1730, 1250 -СОСНз

1607-1620 -СОО-

1320, 808 Колебания маннуроновой кислоты (М - блоки)

1290, 787 Колебания гулуроновой кислоты (й- блоки)

Спектры ЯМР 'Н и ПС экзополисахарида также содержат характерные для уронидов сигналы (табл. 3.5, 3.6).

Таблица 3.5

Характерные химические сдвиги спектра ЯМР 'Н ЭПС РаетЬасШт ehimensis 739

Кислота Химические сдвиги, м.д.

Н1 Н2 НЗ Н4 Н5

D - маннуроновая кислота 4,79 4,74 4,69 4,72 4,67

- гулуроновая кислота 4,84 4,72 4,74 4,76 4,82

Таблица 3.6

Характерные химические сдвиги спектра ЯМР ,3С ЭПС Paenibacillus ehimensis 739

Кислота Химические сдвиги, м.д.

Cl С2 СЗ С4 С5

D-маннуроновая кислота 105,82 70,84 71,31 78,70 77,56

L-гулуроновая кислота 106,51 65,72 68,83 82,61 68,83

Из данных ИК-спектроскопии можно рассчитать соотношение уроновых кислот в ЭПС, а именно величины M/G по сигналам интенсивностей полос поглощения при 808 (М) и 787 см"1 (G) (Усов, 1999). Для ЭПС Paenibacillus

ehimensis 739 соотношение мономеров в полисахаридной цепи соответствуют величине M/G-0,64. Степень ацетилирования 10%.

Физико-химические свойства и реология ЭПС Paenibacillas ehimensis 739 Одной из важнейших характеристик полисахаридов с точки зрения практической значимости является характер взаимодействия и поведения полимерной цепи полисахарида в растворах солей, а именно изменение вязкости растворов ЭПС в присутствии моно- и дивалентных ионов металлов. Не менее важны реологические характеристики ЭПС при различных рН растворителя, т.к. возможны изменения конформации молекул экзополисахарида вызывающие как повышение, так и резкое понижение вязкости (Dogsa, 2005). Все это и определяет стратегию и области практического приложения данных веществ.

Для изучения поведения растворов ЭПС в присутствии солей готовили 1% растворы ЭПС. Полученные данные представлены на рис. 3.10.

Рисунок 3.10

Вязкость ЭПС Paenibacillus ehimensis 139 в присутствии солей.

Из графика видно, что в присутствии сульфатов вязкость растворов ЭПС возрастает до 60%, хлориды повышали вязкость раствора ЭПС в среднем на 45% от исходной величины, характер воздействия нитратов в большей степени зависел от катиона так нитрат калия повышал вязкость на 53%, в то время как нитрат аммония всего на 33%. Из представленных на графике солей только хлорид железа (III) вызывал выпадение в осадок экзополисахарида.

Изменение pH раствора также оказывало влияние на вязкость растворов ЭПС рис. 3.11.

Зависимость вязкости ЭПС Paenibacillus ehimensis 739 от кислотности

Вязкость. сСт

О 2 4 6 8 10 12 14

рН

Из графика (рис. 3.11) видно, что наибольшая вязкость наблюдается при рН 78, повышение рН выше этого значения приводило к снижению вязкости ЭПС. Незначительное повышение вязкости происходило в интервале рН от 1 до 5. В целом можно сказать, что молекула ЭПС проявляет свойства полиэлектролитов. Вероятно, в результате взаимодействия с окружением молекула экзополисахарида изменяет свою пространственную структуру, что приводит к повышению, либо понижению вязкости раствора.

Кинематические вязкость растворов ЭПС РаетЬасШш еЫтеп$1$ 739 была вдвое выше продуцента ЭПС Аго1оЬас1ег уте1ап<Ш ИБ 1 при меньшей концентрации (рис. 3.12).

Рисунок 3.12

Кинематические вязкости растворов ЭПС

Изучение реологических свойств на реометре RheoStress-1 показало что ЭПС продуцируемый Paenibacillus ehimensis 139 при 0,5% концентрации имеет более высокие показатели эффективной вязкости чем ЭПС штаммов Azotobacter vinelandii ИБ 1 и Pseudomonasputida ИБ 17 (Рис. 3.13).

Сравнение реологических характеристик

Величина вязкости Ксантана НТ при скорости сдвига 5,4 с"1 составила 2,5 Па-с, аналогичные данные были получены для ЭПС РаетЬасШш еЫтетгз 139 при вдвое меньшей концентрации экзополисахарида равной 0,5% (Хисаметдинов. 2009).

Рисунок 3.14

Сравнение реологических характеристик экзополисахарида РаетЬасШиз еЫтет15 739 и ксантана

ki.Hi ПН

• УПС раеч1Ык:11щ

По совокупности физико-химических свойств данный ЭПС принадлежит к бактериальным экзополисахаридам полиуронидного типа, что подтверждается спектрами ИК-спектроскопии и ЯМР 'Н и 13С.

Токсикологические исследования продуцента ЭПС РаетЪасШю еЫтет1з 739 Одним из важнейших требований при применении продуктов микробного синтеза в пищевой промышленности, медицине и сельском хозяйстве является безопасность, как самого штамма продуцента, так и продуктов метаболизма.

Если рассматривать сами экзополисахариды синтезируемые микробными клетками, то риск минимален (Моагагш, 2001). Ведутся обширные исследования по увеличению их продуктивности, описываются генетически модифицированные штаммы бактерий АгоюЬаМег чтеЬпсШ с повышенным синтезом альгинатов или полигидроксибутирата (ваНпёо с( а1., 2007). Стало обыденным и использование растворов ЭПС продуцируемых Ьеисопо-Мос тевеШегюЛез в качестве заменителей плазмы крови.

В то же время, экзополисахариды бактерий являясь биологически инертными субстанциями, могут обуславливать высокую резистентность продуцента к антибиотикам (Нетпиг^Ьогв):, 2006), тяжелым металлам^аЛпауаке, 2009) и антимикробным пептидам (1ЛоЬе1 й а1., 2008) создавая вокруг бактериальной клетки барьер, защищающий ее от неблагоприятных воздействий.

В опытах доказано что штамм РаетЬасШиз еЫтет1з 739 является не вирулентным, не токсичным, не обладающим токсигенностью, не дессиминирующим во внутренние органы, не имеющим существенного дисбиотического действия на микрофлору организма.

Выявлено иммуномодулирующее влияние и слабовыраженные аллергенные свойства штамма РаетЬасШиэ еМтепз1э 739.

Местный раздражающий эффект на слизистые оболочки глаза и кожные покровы не выражен.

выводы

1. Установлен оптимальный состав среды и условия культивирования, обеспечивающие максимальное продуцирование экзополисахаридов штаммом Paenibacillus ehimensis 739: перемешивание - 200 об/мин, температура-25°С, концентрация мелассы -30 г/, продолжительность культивирования - 168 ч, конечная вязкость культуральной жидкости составила » 30 ООО сСт.

2. Определены условия выделения и очистки экзополисахарида из культуральной жидкости штамма Paenibacillus ehimensis 739. Показано, что очистка ЭПС штамма Paenibacillus ehimensis 739 достигалась при осаждении из подкисленного раствора при pH равном 3 и соотношении КЖ:ЭПС -1:1.

3. Методами жидкостной хроматографии, ИК- и ЯМР - спектроскопии показано, что ЭПС Paenibacillus ehimensis 739 относится к полиуронидам и является гетерополимером, мономерными единицами которого являются гулуроновая и маннуроновая кислоты в соотношении (M/G = 0,62); молекулярная масса ЭПС лежит в интервале 450 - 350 кДа.

4. Установлены физико-химические и реологические характеристики экзополисахарида Paenibacillus ehimensis 739. ЭПС стабилен в диапазоне pH 4,0-9,0 в присутствии нитратов, сульфатов, фосфатов, хлоридов щелочных и щелочноземельных металлов.

5. Проведена сравнительная характеристика с коммерческими образцами ксантана и ЭПС Pseudomonas putida ИБ 17, Azotobacter vinelandii ИБ 1. ЭПС штамма Paenibacillus ehimensis 739 обладает более высокими показателями эффективной вязкости при тех же скоростях сдвига и образует более вязкие гели при меньшей концентрации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Логинов Я.О., Худайгулов Г.Г., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Экзополисахариды бактерий родов Azotobacter, Pseudomonas и Bacillus для создания биофунгицидов пролонгированного действия //Аграрная Россия.-2009,-Специальный выпуск.-С. 125-126.

2. Четвериков С.П., Логинов Я.О., Худайгулов Г.Г., Логинов О.Н. Экзополисахариды бактерий Azotobacter и Pseudomonas - основа биополимеров для увеличения нефтеотдачи //Вестник Оренбургского государственного университета.-2009.-№ 10.-С. 509-511.

3. Худайгулов Г.Г., Четвериков С.П. Высоковязкий экзометаболит бактерий Pseudomonas putida //Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов».-М.: Изд-во МГУ, 2009.-Микробиология.-С. 24.

4. Логинов Я.О., Логинов О.Н., Худайгулов Г.Г., Четвериков С.П., Бактерии родов Azotobacter, Pseudomonas и Paenibacillus как продуценты биополимеров//Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». -М.: Изд-во МаксПресс, 2009.-С.113.

5. Худайгулов Г.Г., Логинов О.Н., Четвериков С.П., Экзополисахариды бактерий родов Pseudomonas и Paenibacillus и их реологические характеристики//Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». -М.: Изд-во МаксПресс, 2009.-С.193.

6. Худайгулов Г.Г., Влияние осмотического стресса на продукцию экзополисахаридов бактериями рода Paenibacillus //Материалы докладов XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов».-М.: Изд-во МГУ, 20Ю.-Микробиология.-С. 189.

7. Логинов Я.О., Худайгулов Г.Г., Четвериков С.П., Мелентьев А.И., Логинов О.Н. Биополимер альгинатной природы с преобладанием L-гулуроновой кислоты // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. - № 3. -С. 343-347.

8. Худайгулов Г.Г., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Экзополисахарид альгинатного типа Paenibacillus ehimensis 739 II Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011- №5. - С. 214-217.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Худайгулов, Гайсар Гараевич, Уфа

61 12-3/529

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАН

На правах рукописи ХУДАЙГУЛОВ ГАЙСАР ГАРАЕВИЧ

ЭКЗОПОЛИСАХАРИД БАКТЕРИЙ РаетЬасШт еИ[тет1х: УСЛОВИЯ БИОСИНТЕЗА, СОСТАВ И СВОЙСТВА

03.01.06 - биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор О.Н. Логинов

Уфа 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Разнообразие и продуценты микробных полисахаридов

1.2.Биосинтез и условия культивирования

1.3.Способы выделения и очистки экзополисахаридов

1.4.Химические и физические свойства экзополисахаридов

1.5. Полиурониды

1.5.1. Характеристика полиуронидов - состав, структура и свойства

1.5.2. Источники полиуронидов

1.5.3. Практическое применение полиуронидов

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 .Объекты исследований

2.2.Условия хранения бактерий РаетЪасШт еЫтети 739

2.3. Исследование влияния источника углерода на синтез экзополисахарида бактериями РаетЪасШт еЫтет1з 739

2.4.Оптимизация условий биосинтеза экзополисахарида бактерий

РаетЪасШт ектетгз 739 2.5.Определение вязкости культуральной жидкости РаетЪасШт еЫтет18 739

2.6.Выделение ЭПС из культуральной жидкости

2.7.Очистка препаратов ЭПС штамма РаетЪасШт е/гшегаи 739 2.8.Методы изучения состава и структуры ЭПС РаетЪасШт е/г/ттш 739 - 2.9.Изучение реологических характеристик ЭПС РаетЪасШт еЫтетгя 739

2.9.1. Изучение влияния солей на стабильность и вязкость ЭПС штамма РаетЪасШт еЫтеп$18 739

2.9.2. Изучение влияния рН и температуры на вязкость раствора ЭПС РаетЪасШт еЫтет18 739

2.10. Токсикологическая оценка штамма РаетЪасШт е/г/тегаи 739

2.10.1. Оценка вирулентности штамма РаетЪасШт еЫтет'м 739

2.10.2. Изучение токсичности штамма РаетЪасШт еШтетгз 739

2.10.3. Оценка токсигенности и способности к дессиминации штамма РаетЪасШт еЫтетгя 739

2.10.4. Дисбиотическое действие штамма РаетЪасШт еЫтет'м 739

2.10.5. Иммунологические исследования штамма РаетЪасШт еЫтет'м 739

2.10.6. Оценка местного раздражающего действия штамма РаетЪасШт еЫтет1з 739

2.10.7. Кожно-резорбтивное действие штамма РаетЪасШт еЫтет1$ 739

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Влияние источника углерода на синтез ЭПС РаетЪасШт еЫтет1з 739

3.2. Оптимизация условий культивирования бактерий РаетЪасШт еЫтетгз 739

3.3.Выделение ЭПС РаетЪасШт еЫтет1з 739 из культуральной жидкости

3.4.Очистка препаратов ЭПС штамма РаетЪасШт еЫтепягя 739

3.5.Мономерный состав и структура ЭПС, продуцируемого штаммом РаетЪасШт еЫтет1& 739

3.6.Физико-химические свойства ЭПС РаетЪасШт еЫтет18 739

3.7.Реологические характеристики экзополисахарида РаетЪасШт еШтетгя 739.

3.8.Результаты токсикологических исследований штамма РаетЪасШт еЫтет18 739

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКМ - всероссийская коллекция микроорганизмов

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ИК - инфракрасная

ИПС - изопропиловый спирт

КЖ - культуральная жидкость

КОЕ - колониеобразующие единицы

ПФЭ - полный факторный эксперимент

ЭПС - экзополисахарид

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

р. - род

в - гулуроновая кислота М - маннуроновая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Полисахариды находят широкое применение в таких областях человеческой деятельности как медицина, пищевая, нефтедобывающая и фармацевтическая промышленность.

Экзогликаны бактерий широко используются при полимерном заводнении пласта, применение которых дает ощутимый экономический эффект (Сафонов, 1997).

Растворы декстранов используются как заменители плазмы крови в медицине при больших потерях крови (напр.: препарат «Реополиглюкин»), Предложено использование альгинатов в качестве компонентов в системах адресной доставки лекарств (Ciofani et al., 2008), противовирусных средств, в т.ч. ВИЧ (Пат. 5089481 США)

Рынок водорастворимых полимеров в 1998 году составил 6,8 миллиардов долларов США. Спрос нефтедобывающей отрасли на бактериальные экзополисахариды только в США составляет цифру порядка 1 млн.т (Sabra et al., 2001).

Бактериальные ЭПС, в отличие от большинства химически синтезированных, являются биодеградируемыми и не наносят вреда окружающей среде (Muhammadi et al., 2008). А возросший интерес к экологически чистым технологиям стимулирует спрос на природные ЭПС.

Бактериальные экзополисахариды представляют группу очень перспективных стимуляторов защитных сил организма. Так экзополисахариды бактерий Paenibacillus polymyxa, обладают антивирусными и противоопухолевыми свойствами, оказывают профилактическое действие при экспериментальной стафилококковой инфекции и пролонгируют действие лекарственных веществ, повышая неспецифическую реактивность организма (Егоренкова и др., 2009).

Таким образом, поиск новых продуцентов экзополисахаридов, несомненно, представляет научный и практический интерес.

Цель исследования.

Выделить и охарактеризовать экзополисахарид бактерий. РаетЬасШш еЫтег^з. Определить мономерный состав, свойства и реологические характеристики ЭПС.

Задачи исследования:

отработать режимы и условия культивирования исследуемого штамма для максимального выхода высоковязкого ЭПС. подобрать условия выделения и очистки ЭПС. установить химическую природу и мономерный состав экзополисахарида.

исследовать физико-химические и реологические свойства гелей ЭПС.

Научная новизна. Впервые выделен и охарактеризован экзогенный полиуронид бактерий РаетЬасШш eh.im.ens¡б 739 - продуцента ЭПС (Патент РФ).

Практическая значимость.

Запатентован новый продуцент экзополисахарида. Определены основные технологические подходы производства высоковязкого биополимера и перспективные области применения в различных отраслях народного хозяйства.

Апробация работы.

XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009). XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010), II Всероссийская школа-конференция молодых ученых «Современные методы и подходы в биологии и экологии» (Уфа, 2011).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 1 патент Российской Федерации.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 97 страницах, содержит 21 таблиц и 19 рисунков. Список использованной литературы включает 135 наименований, из них 40 на русском языке.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Бурное развитие биотехнологии на основе микроорганизмов способствует значительному расширению исследований по поиску новых продуцентов полисахаридов (Van Веек, 1997; Guentas et al., 2000; Oren, 2002; Kumar et al., 2007), используемых в различных областях народного хозяйства и медицины (Sutherland et al., 2002). В свою очередь, все возрастающие потребности в полисахаридах влияют на развитие биотехнологии.

Мировое производство экзополисахаридов достигает десятков тысяч тонн. Увеличение выпуска ЭПС обусловлено тем, что диапазон их использования расширяется в уже ставших традиционными отраслях народного хозяйства (буровой, нефтедобывающей, пищевой промышленности и др.) (Iyer et al, 2005; Iyer et al, 2006). Выявлены и новые области, в которых применение экзополисахаридов может дать значительный экономический эффект (бытовая химия, текстильная промышленность, сельское хозяйство, медицина и др.) (Cambon-Bonavita et al. 2002; Draget et al, 2005). Сейчас легче назвать отрасли народного хозяйства, в которых бы не использовали или не было бы рекомендаций по использованию микробных полисахаридов.

Практическое применение нашли полисахариды растительного (целлюлоза, инулин, крахмал и др.) и животного (гликоген) происхождения. Однако производство микробных экзополисахаридов развивается опережающими темпами по сравнению с производством полисахаридов из высших организмов; для этого имеются веские основания. Микробные полисахариды более разнообразны по своим свойствам, легко воспроизводимы (Sutherland, 2001), могут быть получены в любое время года при значительно меньшей стоимости и любом количестве.

1.1.Разнообразие и продуценты микробных полисахаридов.

Полисахариды - полимеры, состоящие из углеводов. Различают эндо- и экзополисахариды, которые в свою очередь делятся на капсульные -относительно прочно связанные с клеточной стенкой и слизи если такая связь слаба или вовсе отсутствует (Dan,2000).

Микробные экзополисахариды представляют собой в основном линейные полимеры (Sutherland, 1997) длина боковых цепей в большинстве случаев не превышает пяти мономерных единиц (Mironescu, 2003).

Физические, химические и реологические характеристики зависят от мономеров из которых построена цепь ЭПС, от способа соединения их между собой, преобладания того или иного мономера, а в случае гетерополисахаридов и от относительной длины мономерных блоков (Draget, 2005). Всего в полисахаридах различных микроорганизмов обнаружено около 20 моносахаров. Наиболее часто встречаются следующие: глюкоза, галактоза, манноза, глюкозамин, глюкуроновая, маннуроновая и галактуроновая кислоты (Практикум ..., 1976).

Молекулярная масса внеклеточных полисахаридов может достигать нескольких миллионов углеродных единиц. С увеличением молекулярной массы растет сложность и прочность образованных экзополисахаридом структур за счет многочисленных физических и ковалентных взаимодействий возникающих между различными полимерными цепями (Блинов, 1984; Ботвинко, 1985; Семенова, Гречушкина, 1986; Стяжкин и др., 2007).

В таблице 1.1 представлены наиболее известные продуценты ЭПС (Mironescu, 2003; Kumar, 2007).

Продуценты экзополисахаридов

Продуцент Биополимер Применение

Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter vinelandii Альгинат В качестве матрицы для иммобилизации и инкапсулирования клеток и ферментов, гипоаллергенное ранозаживляющие покрытие

Acinetobacter calcoaceticus Эмульсан То же самое

Sphingomonas paucimobüis Геллан Заменитель агар-агара в микробиологии

Xanthomonas sp. Ксантан Вторичная и третичная нефтедобыча, производство красок, пестицидов и детергентов, косметология, фармацевтика, пищевая промышленнсоть

Rhizobium meliloti, Agrobacterium radiobacter Курдлан Желирующий агент, иммобилизационная матрица

Alcaligenes faecalis var. myxogenes Сукциноглюкан То же самое

Leuconostoc mesenteriodes Декстран В медицине и ветеринарии -заменитель плазмы

Aureobasidium pullulans Пуллулан Покрытия для пищевых продуктов

Alcaligenes faecais var. myxogenes Курдлан Желирующее средство для пудингов (низкокалорийно, так как не подвергается расщеплению в кишечнике)

Рассмотрим более подробно некоторые экзогенные микробные биополимеры:

Альгинат - представляет собой линейный полимер, полиуронид, состоящий из (1—>4) связанных остатков P-D-маннуроновой (М) и a-L-гулуроновой кислот (G) которые могут входить в состав полимерной цепи в виде гомополимерных (полиманнуронаты (ММ) и полигулуронаты (GG)) или гетерополимерных (MG) блоков. К тому же в бактериальных альгинатах 2 и/или 3 атом углерода маннуроновой кислоты может быть О-ацетилирован. Молекулярная масса, состав, структура и степень ацетилирования варьируют в широких пределах (Gacesa, 1998) Более подробно альгинаты будут рассмотрены в главе 1.5.

Аубазидан - сложный гликан, который продуцирует Aureobasidium pullulans шт. №8. Предложено использование этого полисахарида в фармацевтической промышленности и исследуются области применения в пищевой промышленности (ссылка).

Геллан - гетерополисахарид, полимерная цепь которого построена из тетрасахаридных единиц, в состав которых входят глюкоза, рамноза, глюкуроновая кислота и О-ацетильные группировки, которые находятся в С-6 положении молекулы глюкозы. В нативной форме геллан формирует слабые, непрочные гели. Для устранения этого недостатка данный экзополисахарид подвергают деацетилированию нагреванием в щелочном растворе с уровнем рН равным 10 (Kang, 1982). В настоящее время геллан выпускается компанией «CP Kelco U.S.., Ink.» под торговой маркой «Гельрит» и «Гельзан» (каталог фирмы «Sigma-aldrich, Inc.» 2010) в качестве заменителя агар-агара в микробиологии (Lin, 1984). Геллан главным образом нашел применение в области фармацевтической промышленности и пищевой индустрии (Mironescu, 2003; Fialho et al., 1999; Pollock, 1993).

Декстран - представляет собой гомополисахарид мономером, которого является глюкоза, молекулярная масса лежит в пределах 15 000 -20 000 кДа. Образуется при росте на средах с сахарозой. Заменитель плазмы

в медицине например препарат «Реополиглюкин» выпускаемый ОАО «Красфарма» (Россия, г. Красноярск), который представляет собой 10% раствор декстрана с молекулярной массой 30 ООО - 40 ООО Да.

Ксантан — построен из повторяющихся пятичленных блоков, содержащих D-глюкозу, D-маннозу, D-глюкуроновую кислоту, в которой большинство или все остатки маннозы О-ацетилированы в положении 6. Основа полимерной цепи ксантана состоит из молекул глюкозы соединенных между собой (3-1,4-гликозидными связями с присоединенными к ней боковыми цепочками трисахаридов (Tait M.I., 1986). Молекулярная масса варьирует от 2 • 106 до 15 • 106 Да. Выпускается под торговыми марками «келтрол», «келцан», «ксантан», «антигум-КС», «родопол 23», «сараксан». Традиционными областями применения ксантана является нефтедобывающая и пищевая промышленность.

Курдлан - линейный полимер, (3 (1 - 3)-глюкан, конформация молекулы курдлана в растворе представляет собой тройную спираль, формирует гели в отсутствие ионов металлов (Sutherland, 1997). Применяется для приготовления низкокалорийных пудингов, супов. А также в медицине как препарат с противовирусной активностью (Kumar, 2007) и стимулятор цитотоксичности полиморфноядерных лейкоцитов in vitro (Беседнова и др., 2000).

Пуллулан - пуллулан способен к стимулированию макрофагов in vitro (Беседнова и др., 2000).

Сукциноглюкан-шшезщуется Sinorhizobium meliïoti. Состоит из D-глюкозы, D-галактозы в соотношении 7:1, этерифицированных сукциниловыми, пируватными и ацетатными кислотами в соотношении 1:1:1.

Полимиксан состоит глюкозы, маннозы, галактозы, глюкуроновой кислоты, а также глюкоманнана с равным содержанием обоих моносахаридов и следовыми количествами уроновых кислот. Полимиксан продуцирует Paenibacillus polymyxa. Используют в качестве пищевых

волокон, полимерного агента для приготовления буровых растворов (Матора и др., 1982).

Комплексный экзополисахарид этаполан - продуцирует штамм бактерий Acinetobacter sp. 12S на основе этанола. Он состоит из нейтрального и двух кислых компонентов, один из которых ацилирован. Ацилированный и неацилированный полисахариды идентичны по молярному соотношению D-глюкозы, D-маннозы, D-галактозы, L-рамнозы, D-глюкуроновой кислот (3:2:1:1:1:1) и структуре повторяющегося фрагмента в углеводной цепи. Ацилированный полисахарид содержит жирные кислоты (C^-Cig) Уникальные свойства водных растворов этаполана предполагают использование этого полисахарида для интенсификации нефтедобычи, в горнодобывающей, пищевой, химической промышленности, косметологии и др. (Гринберг и др., 1992; Пирог и др., 2001; 2004; 2007 а, б; 2009).

Как уже было отмечено, многие микробные экзополисахариды используются в качестве стабилизаторов. Они необходимы для улучшения потребительской привлекательности продукта, упрочения его структуры и обеспечения стойкости при хранении. Действие полисахаридов в роли стабилизаторов проявляется в их способности связывать воду, взаимодействуя с компонентами продукта, в основном с белками, формируя структурные элементы гелевого каркаса. Кроме того, использование стабилизирующих компонентов дает возможность улучшить качественные характеристики и снизить себестоимость готовой продукции (Кочеткова и др., 1992; Роль ..., 2005; Технология ..., 2006).

Целлюлоза - это линейный полисахарид, состоящий из (3-1-4- D-глюкозы, синтезируется Acetobacter xylinum. В зависимости от условий культивирования продуцента можно получить целлюлозу с разной молекулярной массой. Имеются сведения о синтезе фибрилл целлюлозы in vitro. Целлюлоза может быть рекомендована для получения диетической низкокалорийной пищи.

Микробные экзополисахариды и биопродукты на их основе являются одним из объектов внимания нефтяной биотехнологии благодаря коллоидным и клеящим свойствам их растворов, способности к образованию гелей и пленок, воздействию на реологические характеристики жидкостей (Назина, 2000; Сохань и др., 2008).

Исходя из химической структуры и пространственной конфигурации экзополисахаридов и образования сложных комплексов экзополисахарид-тяжелый металл за счет коордиционных связей между -ОН и -СООН группами ЭПС и ионами металлов, предложено использовать их в качестве сорбентов ионов тяжелых металлов (Няникова и др., 2002; Perez, 2008).

В настоящее время актуальным является поиск новых соединений, обладающих физиологической активностью, и создание на их основе препаратов нового поколения с селективным и пролонгированным действием на иммунную и сердечно-сосудистую системы. Перспективными в этом отношении являются биогликаны. Они обладают высокой иммуномодулирующе�