Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экзогенные регуляторы роста и их влияние на геном растений

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Экзогенные регуляторы роста и их влияние на геном растений"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ . СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ХРУСТАЛЕВА Людмила Ивановна

РГ6 ОД

6

ЭКЗОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ГЕНОМ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

I

МОСКВА 1994

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Научный консультант: доктор биологических наук, академик РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. В. Мазин; доктор биологических наук, профессор В. А. Зинчен-ко; доктор биологических наук, профессор Б. Ф. Ванюшин.

Ведущее учреждение — НИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Защита состоится «. _ 1994 г.

в «-» час. на заседании специализированного совета

Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан «__ 1994 г.

Ученый секретар'ь специализированного совета — кандидат биологических наук

А. С. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Средства сельскохозяйственной химии являются факторами внешней среды, которые способны вызывать изменения в наследственных структурах растений. Мутагенная активность найдена у многих пестицидов. В плане генетического риска применения эта группа веществ является наиболее изученной. Анализ литературных данных лишь по 400 пеетицидниы препаратам показал, что 262 из них вызывают мутагенный эффект (Куринный,1983). Экзогенные регуляторы роста, в отличие от пестицидов, изучены меньше на предмет их генетической безопасности. По-видимому, это связано с тем, что фиторегуляторы не обладают "циднш"-убивагадам действием, применяются в малых концентрациях и способствуют росту и развитию растений. ГЬэто-му создалось обманчивое впечатление о том, что эта группа биологически активных веществ безвредна для растений. Однако не следует забывать, что физиологическое действие фиторегуляторов направленно непосредственно на культурное растение, а механизм действия обусловлен- главным образом сдвигом гормонального баланса. Изменение содержания нативных гормонов в организме при воздействии экзогенных регуляторов роста может оказывать как положительное, так и отрицательное действие на растения, проявляющееся в виде различных типов мутаций (Каллах, 1981, Kumari, Vaidyanath, 1989, Nagl, 1S88). Шкааана способность вызывать нарушения в структуре хромосом и для самих фитогормо-нов при их экзогенном внесении в высоких концентрациях (Арара-тян, 1989; D'Anvato, 1985).

Локализация генов в хромосомах определяет ведущую роль ядра в• формировании фенотипа функциональная активность ядра регулируется фитогормонами. Хотя пока ни для одного фитогормо-на не найдены конкретнее локусы ДНК, ответственные за гормональную регуляцию экспрессии генов (Решетников,1992). Однако наличие мутантов с блоками в определенных звеньях гормонального действия дает надежду экспериментального приближения к проблеме растительной гормональной регуляции (Scott,1990).

Экзогенные регуляторы роста, ингибируя или активируя синтез эндогенных гормонов, способны активно влиять на ядерные структуры растений. Кроме того синтетические регуляторы могут непосредственно вызывать изменения в геноме растений

- г -

вследствие специфики их химической природы (Cortes et al. ,1985), наличия в коммерческих препаратах примесей (Grant,1979) и образования мутагенов при их метаболизме в растениях (Plewa, Gent i le,1976).

Одним из последствий такого действия фиторегуляторов является ухудшение основных показателей сортов сельскохозяйственных культур из-за быстрого накопления в них мутаций, ведущэго к потере части ценнейшего генофонда растений.

В связи с этим возникла необходимость обязательной проверки вновь создаваемых и уже применяемых в сельском хозяйстве химических средств на их генетическую безопасность для культурных растений. Агроценоаы, являясь неотьемлимой составной частью биоценозов, активно влияют на состояние дикой флоры. Поэтому особое внимание в настоящее время придается разработке и стандартизации методов оценки на растениях (plant assays) мутагенных и канцерогенных свойств химических соединений, попавших в биосферу (Sandhu S. S. et al. ,1991). Согласно Международной программе безопасности (IPCS) проводится координация исследований в растительных тест-системах и создается банк ■ данных.

Систематические исследования по . оценке генетической активности химических средств регуляции роста и раавития сельскохозяйственных растений в нашей стране не проводились.

Открытыми остаются многие вопросы о влиянии фитогормонов и синтетических регуляторов роста на ядерные структуры растений, нет точных знаний о мутагенной активности последних и степени наследования вызываемых ими повреждений в геноме растений.

Дали и задачи исследования.. В соответствии с изложенным целыо работы было изучение действия фиторегуляторов на геном растений для создания комплексной системы генетического мониторинга, основанной на растительных тест-обьектах и . позволяю-, щая учитывать проявление изменений в геноме растений.на молекулярном, клеточном,, организменном и иопуляционном уровнях биологической организации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие оеновниые задачи:

1. Изучить особенности патогенетического действия экзогенных регуляторов роста в зависимости от концентрации, про-

должительноети кластогьнного последействия и Физиологического состояния растительной клетки.

2. Выяснить способность фиторегуляторов индуцировать генные .мутации и ьыяьшать ;Щ-повреадшсщий эффект (тест Эймса, индикаторные штаммы Е. col i).

3. Научить характер воздействия фиторегуляторов на кинетику клеточного цикла растений.

4. Исследовать особенности проявления цитогенетического действия в зависимости от генотипа сорта.

В. Изучить влияние фиторегуляторов на щхэцесс мейоза и формирование пыльцы; установить степень корреляции кластоген-ного действия фиторегуляторов в генеративных и соматических клетках растений.

6. Выяснить возможность использования в качестве непрямого теста на генные мутации, индуцируемые фиторегуляторами, учет изменений в спектрах белков эндосперма и изоферментов.

7. Определить возможность проявления генетической активности регуляторов роста в последующих поколениях и выяснить особенности их действия при ежегодных многолетних обработках.

На защиту выносятсй следующие положения.

1. Комплексная система оценют генетических последствий применения регуляторов роста растений, основанная на растительных тест-объектах и позволяющая учитывать проявление изменений в геноме растений на молекулярном, клеточном, оргакиз-менном'и популяционном уровнях биологической организации.

2. Основные закономерности воздействия синтетических регуляторов роста на геном растений определяются химической природой и концентрацией веществ, ¡товторностыо обработок и зависят от генома растений, стадии клеточного цикла и физиологического состояния клеток.

3. Синтетические регуляторы роста растений активно влияют на кинетику прохождения клеткой митотического цикла. Ретардант 2-ХЭФК и ГШ-Na увеличивают продолжительность клеточного цикла, угнетают митотическую активность клеток и.образуют блоки на рубеже G1/S и G2/M - фаз. Брассинолид стимулирует вступление клеток в фазу синтеза. Структурный аналог штокининов -картолин обладает доэозависимым воздействием на кинетику клеточного цикла.

4. Шказаяо, что кластогенный эффект регуляторов роста

сохраняется только в первом семенном поколении.

Научная новизна работы. В ходе выполнения исследований дана цитогенетическая характеристика корневой меристемы прорастающего семени лука-батуна (АШит ПвШовит и) и на основании этого разработаны методические подходы использования данной экспериментальной модели в качестве биотеста для скрининга фиторегуляторов на мутагенную активность. Впервые изучен кластогенный эффект у 14 фиторегуляторов в растительной тест-системе. Показана природа кластогенного действия препаратов в зависимости от их концентрации и стадии клеточного цикла Получении данные о характере и продолжительности мутаген-. ного последействия на клеточном уровне. ■ . -

Впервые на индикаторных штаммах бактерий изучены молекулярные основы мутаций, вызываемых картолином. Установлено/ что', препарат индуцирует точковые мутации типа сдвига рамки считывания и замены пар оснований, но не оказывает ДНК- поврежда»-, шего действия. ' .. - > ;

Приоритетными являются полученные данные по цитофизиологическому действию экзогенных регуляторов роста. Впервые изучено влияние ретардантов на прохождение клеткой фаа митоза и продолжительность цикла в целом. Установлено, что ретарданты вызывают образование блоков на рубеже (31/Б- и (32/М-фаз и увеличивают продолжительность клеточного цикла. Брассинолид стимулирует вступление клеток в фазу синтеза Для картолина показана ярко выраженная зависимость цитофизиологического эффекта от дозы препарата, проявляющуюся в ингибировании или стимуля-; ции клеточного цикла ' '-

На основании данных по влиянии, фиторегуляторов на кинети-' " ку активно делящихся клеток предложено дополнение к трактовке . , о системах защиты генетического материала от ошибок и повреждений, заключаются-в остановке клетки в менеее энергоемкой, стадии цикла, где минимальная вероятность . повреждений : (предсинтетическая 21- и постсинтетическая (32- фазы). Показана . возможность использования фиторегуляторов для эксперименталь- : ного манипулирования клеточным циклом.

Получены оригинальные данные по влиянию ретардантов и ан- -тистрессорых препаратов на генеративные структуры у различных генотипов ячменя.

: _ Сделана попытка использования в качестве непрямого теста

ь -

на генные мутации- учет изменений в спектре белков эндосперма и изоферментов.

Выявлены неизвестные ранее закономерности в действии ретардантов и антистрессовых препаратов при постановке многолетних полевых опытов.

Практическая значимость работы. Разработаны практические рекомендации тю генетическому риску применения регуляторов роста растений, которые переданы в Центральный институт агрономического обслуживания сельского хозяйства ЩИНАО) и Государственную межведомственную коммиссию по испытанию и регистрации средств защиты растений, где были использованы для регистрации веществ и обоснования санитарно-гигиенических регламентов безопасного применения.

Материалы по влиянию фиторегуляторов на структуру хромосом, кинетику, клеточного цикла, синтез белков и изоферментов используются в курсе лекций по биотехнологии в разделе "Регуляторы роста и развития растений" и проведения практических занятий (Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии. Методические указания, Ы.: ИЗХЛ, 1991) .

Разработаны Методические рекомендации по комплексной оценке генетического риска применения фиторегуляторов в растениеводстве. Проведение исследований согласно предлагаемым рекомендациям позволит оценить степень генетического риска применения фиторегуляторов на сельскохозяйственных растениях, ограничить сферу применения веществ, проявивших мутагенный эффект, отработать более безопасные технологические регламенты применения и рекомендовать к широкому использованию вещества, беаопасные в генетическом отношении.

Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 253 страницах машинописного текста и содержит 33 таблицы, 25 рисунков, приложение и включает 437 литературных источника.

Автор признателен заведующему кафедры с.-х. биотехнологии, академику РАСХН Е С. Шввелухе за полезные, замечания при обсуждении результатов экспериментов, а также за поддержку при подготовке диссертации.

- 6 - •

Автор искренне благодарит сотрудников сектора генетического контроля кафедры сельскохозяйственной биотехнологии аа помощь в проведении экспериментов по цитогенетике Kl Н. Головкину и H. Е Балахнину, . по цитофизиологии Е. Е Шгорилую и Г. И. Карлова, по биохимии Г. М. Андрееву и А. И. Злобина. Автор сердечно благодарит sa неоценимую помощь и поддержку при подготовке диссертации Г. И. Карлова. -

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" ШП'С при ГКНТ СССР (Ереван 1987); в Пловдивском сельскохозяйственном институте (Болгария, Пловдив,1987); на 2-ой Всесоюзной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Киев,1988); на 1 и Z ежегодном рабочем совещании "Регуляторы роста и развития растений" ( Шсква, 1992, 1993); на Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ" ( Ленинград, 1989); на Всесоювном координационном совещании "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" (Самарканд,1990); на 5-ом Международном симпозиуме . "Регулящш метаболизма у растений" (Варна, 1990) на II совещании "Брассиностероиды" (Минск,1991), на кафедре генетики Гро-нингенского университета (Нидерланды, Грошшген, 1991) ; на научно-практической конференции "Природоохранные аспекты землепользования и сельскохозяйственного производства в свободных экономических вонах (Ленинград, 1991); в институте ботаники Венского университета (Австрия, Вена, 1992); на международном конгрессе "Энтоботаника-92" (Испания, Кордоба, 1992).

содержание работы

При разработке системы оценки генетической активности фи-, торегуляторов мы исходили из положения. что изменения, возникавшее в геному растительной клетки (генные, хромосомные и геномные) могут проявляться в виде изменений морфологических и физиологических свойств растений; биохимических, влияюдах на течение биосинтеза ь клетках; цитогенетических, выявляемых в геноме делящихся клеток и-точкоьых мутаций. Единого метода, с помощью которого можно зарегистрировать все эти категории мутаций, не существует. Поэтому разрабатываемая нами система

оценки воздействия экзогенных регуляторов роста на геном растений включила в себя набор достаточно информативных методов, позволяших выявить вещества-мутагены и оценить генетический риск их применения.

ОСидя схемд испытания экзогенных регуляторов роста

1. Регистрация изменений на уровне хромосом. Выявление аббераций хромосом и геномных нарушений в соматических и генеративных клетках (лук-батун Allium fistulosum L. и яровой ячмень Hordeum vulgare L.).

2. Регистрация генных мутаций.. Выявление точковых мутаций на бактериях Тест Эймса Salmonella/микросомы и ДНК повреждающего действия на индикаторных штаммах Е. coll.

3. Учет биохимических изменений. Выявление изменений в спектрах белков эндосперма и изоферментов ярового ячменя.

4. Регистрация морфо-физиологических изменений. Наблюдение по количественным признакам, (высота растений, длинна колоса, масса 1000 зерен и т. д.) за отклонениями в потомствах И, 1С.

б. Накопление и обработка данных на ЭВМ. Установление генетической безопасности применения фиторегуляторов для культурных растений.

Полевые, эксперименты были выполнены по * . . следшей схеме (Зинченко.1988):

1-ый год 2-ой год 3-ий год

10 0

111.

О 0 1 *

ООО',

- вариант обработки фиторегулятором.

- вариант обработки водой - контроль.

- последняя идфра соответствует варианту обработки те-года.

1. Скрининг фиторогудя торов на мутагенную активность.

1.1. Онтогенетическая характеристика модельного тест-объекта.

Клетки корнезой меристемы проростков семян лука-батуна являются удобной моделью для изучения действия химических ве-шрств на хромосому: стабильность получения качественных цитологических препаратов; крупные хромосомы; достаточно высокая чувствительность к действию мутагенов. . ' .

Для проведения массовых испытаний вешэств в данном биотесте необходимо было точно установить время выхода первых митозов и появления максимального числа клеток в анафазе. О этой целью фиксировали корешки проростков семян лука-батуна каждые 2-3 часа начиная с 45 часов до 72, часов с момента замачивания.

Пзрвыа митоаы были зарегистрированы через 47 часов. Максимум выхода анафаз наблюдали через 66 часов (рис.1). Наибольшее число делящихся клеток найдено в' корешках длиной ббмм. Полученные параметры легли в основу постановки дальнейших экспериментов.

1

О *

куирго

Рис. 1. Динамика выхода анафаз в первых мпгозач корневой меристемы проростков семян All,tum fistulosum.

Т (час.)

I - длина корешка

Т - время фиксации с начала проращтакия А - количество анафаз

2.2. Оценка юастогетюго дайвтвт фиторегулятороа В соответствии с классификацией химических мутагенов, соединения, вызывающие структурные нарушения хромосом, называются кластогенаыи (Шарма, 1989).

Деза-эффект; Анализ аберраций хромосом проводили аяафаз-ным методом (Пауиева,1980), Шли испытаны следующие фиторегу-ляторы в концентрациях 1-10 £%\ XXX (хлорхолинхлорид); ДЯК (2,2-диметилгидразид янтарной гаю,лоты); картолин; брассинолид, спирокарбон, ГМК-На [натриевая соль гидразида -калеиновой кислоты), этилен' продуценты- . 2-ХЭФК (2-хлорэтилфосфоноьая кислота), гидрел (бискислый-г-хлсрэтилфосфоновокислзЛ гидрази-ний), декстред и пять вновь синтезированию соединений из этой

- 10-

Ж0 группы- 3983Н, 4093Н, 3985Н, 6001Н, ситрел.

Проведенный анафааный анализ показал наличие кл^стогеннс го действия у трех из восьми регуляторов роста из группы ат1 ленпродуцеитов. г-ШК, гидрел и препарат 3983Н повышали урс вень хромосомных аберраций по сравнению с контролем в высокс концентрации - IX. Анафазы с нарушениями в варианте с 2-XX составили 9,31 (в контроле- 3,8%), с гидрелом- 15,2% (в кот роле- 6,22,), о 3983- 9,8% (в контроле - 3,21).

Анализ спектра нарушений, индуцируемых зтиленпродуцентг ми, показал, что для 2-ОСЭФК преобладавшим является образован! хроматидных и хромосомных мостов, Гидрел также увеличивал ос разование хроматидных и хромосомных мостов и более чем в 6 р£ по сравнению с контролем повышал'выход анафаз с отставание хромосом. 1 ко-видимому, гидрел не только индуцирует нарушения структуре хромосом, но и влияет на процесс их расхождения. .

У ситрела, декстрела, . 4093Н, 5001Н не зарегистрирова* кластогенного действия. Напротив, при действии препарата 6001 в концентрации 0.01Х снижался спонтанный уровень мутирован! клеток. Препараты 409311 и 3985Н оказались цитогенетически нег тинными соединениями. Ситрел обладал выраженным стимулируюдо действием. В концентрации 0,01Х он заметно снижал спонтаннь уровень мутирования клеток.

Обработка картолилом в концентрации IX и О,IX достовер* привела к увеличению доли, измененных анафаз. В концентрат 0,01Х не было зарегистрировано кдастогенного действия препарг та. Для картолина преобладавшим типом хромосомных перестрое было образование одиночных фрагментов и хроматидных мосты Действие картолина в основном проявлялось в постсинтетическс фане 02, когда хромосома удвоена и представлена двумя нитями.

ШС-Иа в концентрация 1-0. IX обладал цитостатичесга действием, задерживая деление клеток на стадии метафазы и вь вывая сильную спирализацию хромоерм. В варианте с концентравд ей IX доля метафаа составила 80,4% от числа делящихся клетон При снижении концентрации ГШ-количество делящихся, клеток аадержанных в стадии метафазы, "уменьшалось. . ..'■;..

О,01-0,001Х ГМК-Ка индуцировал статистически достовернс увеличение .числа аберрантных анафаз (13,6Х и 10,2 соответственно, контроль- 4,87.). В более низких концентрация 0,0001-0,000001X) не было, зафгистрировано кластогенног

действия препарата

Наблюдается четкая зависимость эффекта от дозы препарата (рис.2). При характеристике мутагенных свойств вепэств имеет

Рис. 2. Зависимость выхода аберраций хромосом в клетках Allium fistul&sum при действии регуляторов роста.

% аберраций

16

и 12

8 6

2

°0 10"^: 10"у ю""1 10"*" 10-* • 1.> ,

концентрация/ У —ПК-Мо 2 -+- 'карго** г-хэж

.5 -е- Гидрм ' Ц Коитрвл),

важное значение понятие о пороговой дозе. Классическим определением пороговой дозы в химическом мутагенезе является такая доза, при уменьшении которой земство уже не индуцирует мутаций. Величина этой дозы всегда будет зависеть от чувствительности метода и биологических/факторов, влияющих на проявление мутагенного действия- метаболическая дезактивация, проницаемость мембран, реакция с компонентами клетки, работа систем репарации. ;

' При реиейии. прикладных вопросов о безвредности применения того, или-иного соединения; мы также пользуемся.понятием порого-

вая доза кластогенного эффекта - недействующая доза, при концентрациях ниже которой не регистрируем статистичеи.си достоверного увеличения аберрантных анафаз над спонтанным уровнем. Однако спуск к минимальной дозе при которой не проявляется побочный "мутагенный эффект имеет смысл, если фиторегуляторы в этой дозе сохраняют свою физиологическую активность, ретарданта, антистрессового препарата и т. д.

1.1. 3. Продамштемность кластогенного последействия.

В данной серии экспериментов мы попытались ответить на вопрос, как долго сохраняются нарушения при снятии действия-неплотно. С этой целью были отобраны вещества проявившие кластогешшй 3i[4«icr, а именно, 0,011 картолин, 0,001% ГЫК-Na, II 2-Ш и П гидрел. 48- часовые проростки лука-батуна были обработаны флторегу литерами^ течение 18 часов, а затем дора-' давались h течение 30 часов lia воде. ' ■

В вариантах-с 0,0017. ГМК-На и 1% 2-ХЭФК уровень мутирований оставался выше спонтанного на протяжении 3-х фиксаций (табл. 1). Одний иа причин такого длительного последействия является повышенное число хромосомных и хроматидных мостов, индуцируемых этими препаратам^. Возникающие в анафазе мосты рвутся и образуются две дочерние клетки с разорванными хро- : мосомами, которые в свою очередь продолжают цикл разрыв-слия-иие-мост. Другая причина последействия, вероятно, овявана с тем, что эти препараты, увеличивая продолжительность клеточного цикла, задерживают продвижение клеток по циклу , И , наконец, это могло быть результатом присутствия регуляторов в клетке. . .

U-й гидрел, индуцировал повышенное число мостов, однако к третьей фиксации уровень мутирования Клеток статистически достоверно не превышал-этот^ показатель в контроле, что, вероятно, связано с более быстрым выводом препарата из организма.

В варианте с картолином уже- ко второй фиксации т.е. через 18 часов после снятия действия, препарата не обнаружено достоверного превышения числа аберрантных анафаз. ' .

Бродоллигельность кластогенного последействия зависит от многих причин, но наиболее .существенные - это характер структурных повреждений кромосом,изменения кинетики прохождения клеточно цикла и биотрансформациа препарата.

. Таблица 1..

Динамика мутирования хромосом в клетках корневых меристем А. П5Ьи1озит в течении 3-х митотических циклов* при воздействии фиторегуляторов.

Препарат Концентрация, % Время пос^е контакта с регулятором (час.)' Количество анафаз с нарушениями,' • % + т Спектр нарушн'ий (на 100 анафаз)

одиночные мосты парные мосты

Картолин ' 0 8,79+1,26* 3,13 2,73

0.01 6,41+1,01 2,03 3,03

36 ■4,82+0,86 .2,06 1,72

ГШ-Ыа 0 10,16+1,23* 9,00 1,50

10- 18 11,25+1,34* . 6,71 1,64

36 10,8611,35* 6,06 1,50

Контроль 0 ' 4,81+0,94 2,54 1,35

18 4,23+0,88 1,54 1,03

• 36 .. 3,92+0,86 1,37 1,37

2-ХЭФК 0. 12,46+1,46* 4,67 2,33

1 18 14,67+1,64* 3,50 7,24

36 12,36+1,43* .2,70 4,-75

Гвдрел 0 .. 19,96+1,65* ' 12,2 2,61

1 18 12,13+1,41* . 6,14- 2,43

36. ; 6,60+1,07 2,14 1,62

Контроль' 0 4,58+0,76 £,73 1,16

18 4,38+0,87 2,39 2,09

36 4,77+0,91 2,39 1,92

* - Р < 0,05

: и -

i. 2. Генные Нутации.

Способность фиторегуляторов индуцировать генные мутации исследовали в тесте Salmonella typhi muri um ТА1Б37, TA98, TAI СЮ. Набор указанных штаммов позволяет зарегистрировать действие мутагенов, вызывающих замены пар оснований в молекуле ДИК (TAI00) и сдвига рамки считывания генетического кода fframeshlft, ТА1537 и ТА98). Учет мутагенеза проводили по индукции реверсий^ от ауксотрофности по гистидину к прототроф-ности (his- his) у использованных штаммов.

Препараты картолин, спирокарбон, ГМК-Na, 2-ХЭФК, XXX, декстрел и гидрел вносили в стандартных разведениях 0,1;. 1; 10; 100; 1000 мкг/на чашку Штри.

В качестве позитивных- контролей, в соответствии с Методическими рекомендациями, использовали соединения, индуцирующие мутации у тест-штаммов в условиях отсутствия или наличия метаболической активации. Для вариантов с неполной микросомальной активирующей смесью (НМАС) - нитрозометилмочевина, 2,7-диами-но-4,9-диокси-Б,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диааопирен (ДЦДГДП) и 0-аминоакридин, а для вариантов с полной микросо-• мальной активирующей смесью (ПМАС) - нитрозоморфолин.

Картолин в разведении 0,013 икг/чажу индуцировал генные мутации типа сдвига рамки считывания и замены пар оснований в условиях наличия или отсутствия метаболической. активации ' (рис.3).

ГМК-На вызывал индукцию генных мутаций на всех тест-штаммах лишь в условиях метаболической активации в рааведении 1 мкг на чашку. /

Препараты 2-ХЭвК. XXX, декстрел и гидрел не вызывал увеличения частоты генных мутаций ни У одного, из индикаторных штаммов S. typhinurium, как в опдаах с нэполной микросомальной активирующей смесью, так и с полной микросомальной активирующей смесью.

1.3. ЛШ- повреждающее действие. '

Изучение ДНК повреждающего' действия препарата картолин проводили на штамме Е. coll ург дикого типа.и его мутантах polA и гесА. ' . л ■.

Этот метод представляет собой суспензионный тест ' in vitro, основанный на регистрации робта бактериальных штаммов,

Рис. а Учет генных мутаций в тесте Ба1топ®11а/микросомы (тест Эймса), индуцируемых картолином.

Число ревертантов на чашку

Штамм ТА 1537

:--Контроль (ШАС)

- Контроль (ШАС)

-*- Картолин (ШАС) . т Картолин (ПМАС)

V

/ \

/ • \

Штамм ТА 98

— - Контроль (НМАС)

- - Контроль (ШАС)

-*- Картолин (НМАС) _м_, Картолин (ПМАС)

.10 10 10 1<У 10'10*10 10 Концентрация

Штамм ТА 100

- - Контроль (НМАС)

- Контроль (ПМАС)

-*- Картолин (НМАС)

щ Картолин (ШАС)

-10 10 10 1~6 10 10' 10 10е Концентрация

несущих мутации в генах, контролирующих различные этапы репарации ДНК. Гены ро1А и гесА контролируют'процессы эксцизионной и пострепликативной репарации соответственно. При наличии ДНК ловреадаюцзго дйствия исследуемого вещества при определенных ' его концентрациях, рост бактерий, несущих мутации ро1А и геоА не регистрируется, тогда как бактерии дикого типа.проявляют нормальную способность к росту.

В качестве позитивного контроля использовали препарат ряда нитрофуранов - фуразолидон - индуцирующий ДНК-повреждающий эффект. Картолин не проявил ДНК-поврелщающзй активности в стандартных разведениях 10-10 , но препарат в разведении 10 оказывал антибактериальное действие, которое может маскировать возможное повреждающее действие картолина в диапазоне разведений 10 10. Для того чтобы исключить эту возможность была проведена дополнительная серия экспериментов с испольеованием более дробной шкалы разведейий. Использование"расширенной шкалы разведений не. выявило ДНК- повреждающего действия картоли-на.

2 . Проявление цигогеьеточеского действия фихорагуляторов в зависимости от генотипа.

Универсальность и единообразие строения хромосом у эука-риот позволяет в определенных пределах экстраполировать данные, полученные при изучении•хромосомных нарушений с.одних растительных объектов на другие.

Представляло интерес выяснить отзывчивость на воздействие фиторегуляторов 4-х сортов растений. ярового ячменя (Носовс-кий-9, Шсковский-й, КЬсковский-З и Московский-121) . Были отобраны два препарата из группы ретардантов - IX XXX, который не проявил кластогенного эффекта в опытах на луке-батуне и 2-ХЭФК - препарат с кластогенным действием. Эксперименты были проведены в два этапа, вначале в' лабораторных опытах методом анафаэного анализа- нарушений в клетках корневой меристемы проростков выявлена чувствительность сортов к препаратам. Затем в полевых экспериментах проведена обработка посевов регуляторами роста в стадии выхода в трубку и изучено влияние препаратов:на геном растений в соматических, и генеративных клетках.

2.1. Кластогениое действие в соматических клетках ячменя

(лабораторные опыты).-Квастогеяный эффект XXX не был обнаружен ни на одной из испытуемых сортов (табл.2). В варианте с 2-ХЭОЖ онтогенетический эффект проявлялся на трех сортах - Носовский - 9, Московский - 2 и Московский - 3 при наибольшей чувствительности сорта Московский - 3: здесь доля анафаз с нарушениями более чем в. 7 раз превышала этот показатель в контроле. Сорт Московский 121 оказался, устойчивым к воздействию 2--ХЭХК.

Таблица 2

Цитогенетическая активность ретардантов в 1 слетках корневой меристемы четырех- сортов ячшня. .

Сорт ячменя Препарат Всего анафаз ^Анафазы с нарушениями М

всего г + ш

Носовский-9 Контроль 2-ХЭФК XXX 530 520 500 10 39 .5 1. 91+0. 59 7. 53+1.16 1.04+0. 44 4.30* 1.22

Мзсковский-2 1 Контроль 2-ХЭФК XXX 500 600. .500 9 36 10 1. 80+0.59 6. 02+0. 94 2. 69+0. 63 3.70* 0.23

Московский-3' Контроль 2-ХЭФК XXX 545 500 600 8 за 3 1.57+0.52 10. 83+1.39 0. 54+0. 28 9. 78* 1.70

Мэсковский-121 Контроль 2-ХЭФК Ш 540 500520 8 15 9 1.57+0. 52 3. 08+0. 76 1.75+0. 56 1.58 0.21

* - Р < 0,05

Спектр структурных изменений хромосом, индуцируемых 2-ХЭФК, также зависел от особенностей генотипа сорта Так, на сорте Носовский - 9 преимущественным типом наруаений были одиночные и двойные мосты, на сорте Московский - 2 препарат визы-

вал образование хроматидных фрагментов и одиночных мостов, а на сорте Московский - 3 были варегистрированы почти все типы аберраций с максимумом одиночных мостов.

2. 2. Сравнительная оценка цитогёнетичесюго действия ретардантов в соматических и генеративных клетках .

С полевые опыты). Влияние ретардантов на процесс мейоэа наблюдала в материнских клетках пыльцы ( ШО в течение двух мейотических делений. Онтогенетический анализ был проведен в метафазе 1 (Ш) , анафазе i (Al) и тетрадах. Увеличение общего числа нарушений в UK1I было зарегистрировано на Носовскоы-9 и Московском-3 в варианте с 2-Ш (табл.3). При атом в Ш. обнаружены следующие нарушения: слипания и фрагментация хромосом, неправильная ориентация бивалентов и унивалентов. Такой спектр нарушений xa-, рактерен для многих пестицидов (Amar, Farah,1987). В Al мы наблюдали фрагменты, неравномерное расхождение хромосом к полюсам, хромосомные мосты и отставание бивалентов. Сравнительный анализ спектров нарушений в Al показал различия в ответе испытуемых сортов на обработку 2-ХЭФК. Так на сорте Носовекий-9 • преимущественным типом нарушений были отставания . фрагменты и неравномерное расхождение хромосом к полюсам. Мэсты были более типичны для сорта Московский-3. .

Типичными нарушениями в тетрадах были микроядра.и редко встречались триады и пентады. Мэсковский-2 и Ыосковский-121 оказались менее чувствительны к цитогенетическому действию 2-ХЗФК. Препарат XXX не вызывал увеличения числа хромосомных аберраций ни на одном из-четырех анализируемых сортов.

Исследование фертильности пыльцы показало, что 2-ХЭвК . увеличивала процент аномальной пыльцы Há всех сортах,, кроме Московский-121. XXX не вызывал увеличения выхода пыльцы с нарушениями и лишь на сорте Московский-3 этот показатель был несколько выше, чем в контроле -(XXX -10,92+1,36; . контроль -6.7Х+1.18). Следует отметить, что в варианте с. 2-ХЭФК наблюдалась задержка в развитии пыльцы, причем, особенно это было выражено на Носовском-9. В большинстве работ, ; касающихся аномалий в мейозе. индуцируемых химическими веществами, авторы указывают на прямую корреляцию между частотой нарушений в мейозе и стерильностью пыльцы ( DeVadas et al..1986; Reddy, Rao,1982) но имеются .и противоположные данные (Amer, Álibnaam,1983).

Таблица 3

Цитогенетические нарушения мейоэа в материнских клетках пыльцы ярового ячменя при обработке ретардантами.

Вариант обработки Всего проанализировано ШЦ1 МКП с нарушениями X нарушений в МКП

Носовский-! 3

Контроль• 4637 56 1,22+0,16 -

2-ХЗЖ 4248 101 2,38+0,23 4,09А

XXX ' 2738 44 ' 1,6.4+0,24 1,34

Шсковский- з-

Контроль 6922 65 0,94+0,12 -

2-Ш 3990 66 1,65+0,20 3,04*

XXX 4831 61 1,26+0,16 1,61

Московский-2

Контроль 2149 36 1,68+0,28 -

2-ХЭОЙ 2093 34 1,62+0,28 -0,14

XXX . 2230 ." 45 2,01+0,30 0,83

Московский- •121

Контроль 4799 40 0,83+0,13 -

2-ХЭФК 5291 52 0,98+0,14 0,81

XXX 4374 28 0,64+0,12 -1,07

* - Р < 0,05

• Хотя вероятность того, что пыльца, несущая аберрантные хромосомы, окажется жизнеспособной и сможет через слияние с нормальной мегаспорой дать потомство с измененной цитогенети-ческой конституцией'чрезвычайно мала И вей же, даже редкие случаи появления таких растений может стать проблемой в семеноводстве, где сохранение единообразия и генетической чистоты имеет первоочередное значение. Подтверждением тону могут быть наши данные двухфакторного дисперсионного анализа биометрических показателей струтуры урожая посевов ячменя, обработанных ретардантами (табл. 4), . 2-УЭШ на всех сортах, кроме Иэсковского-121, вызывала снижение количества зерен в колосе и массы 1000 зерен. Установлена прямая корреляция между частотой

- 20 -

хромосомных нарувен.ий в мейоэе и показателями урожайности.

Представляется интересным и тот факт, что данны по сор-Точувствктельности к обработке'2-ХЭФК в генеративных клетках

Таблица 4

Двухфакторный дисперсионный анализ по биометрическим-показателям.

Вариант Кол-во зерен Масса 1000

опыта в колосе зерен.

Носовсн Ий-9

Контроль 21,07 • 43,00

2-ХЭСЖ 18,60* 37,20*

XXX 21,37 44,08

Московский-3 •

Контроль 20,07 .46,96

2-ХЭФК 15,74*' 41,32*

XXX 18,91 47,44

Московский-2

Контроль ,. 19,57 4§,б9

2-ХЭФК 16,40* ' 47,00*

XXX 17,87 49,31

- Ыосковский-121

Контроль 20,47 45,04

2-ХЭ4К '21,90 46,92

ххх 19,37 46,00

ШР С для сравнения .

частных средних) 1,73 :.'" 2,66

Коэффициент детерминации

по фактору "сорт" 0.07 0,34 ;

Коэффициент детерминации

по фактору "вещество" 0,10 0,17

« статистически достоверная разница мезду контролем и опытом. ■■

коррелируют с таковыми в соматических клетках в лабораторных и полевых экспериментах. При анализе структурных нарушений хромосом в корневой меристеме проростков семян, полученных от обработанных растений было установлено, что XXX не обладал кластогенным действием ни на одном из 4-х сортов. 2-ХЭФК индуцировал увеличение уровня мутирования клеток на трех сортах Ыосковский-2, Московский-3, Нэсовский-9. Сорт иэсковский-121 был не чувствителен к кластогенному действию препарата

Итак, проведенные нами исследования показали, что ретардант 2-ХЭФК вызывал нарушения в генеративных и соматичешшх клетках. Цитогенетический эффект 2-ХЭФК проявился на трех сортах, сорт Мэсковский-121 оказался нечувствительным к негативному действию ретарданта XXX не вызывал достоверных нарушений в ЫКП, не изменял процент фертильности пыльцы и не оказывал отрицательного влияния на структуру урожая. Степень генети-ческиго риска'применения испытуемых ретардантов аависела от их химической природы и от генотипа сорта

;"...'■ а Цнгофмамологичоскос девстшсо.

3.1. Влияние на продолжительность клеточного цикла и прохождение отдельных фаз митоза

Вопросы фитогормональной регуляции клеточного деления давно привлекают внимание исследователей. С открытием генов cdo (cell division' cycle) и белков циклинов была внесена ясность в понимание процессов регулирования вступления клеток в деление и последовательного чередования фаз цикла (Hartwel et al. ,1974, Evans'et al. ,1983, Masul, 1971). Вместе с этим бьша определена роль и место фитогормойов в регуляции клеточного цикла Фитогормоны влияют на стартовый переход, участвуя наряду с другими компонентами клетки !в регуляции накопления циклина (Francis, 1992). |

В сравнительно недавно вышедшей обзоре Й. Е Гудкова( 1985), обобшэны данные о способности фит'огормонов влиять на продолжительность иитотического цикла и отдельных его фаз. Аналогичных исследований по синтетическим регуляторам не было. Хоти их физиологическое действие непосредственно связано с влиянием на баланс эндогенных фитогормонов. Кроме того некоторые из изу-

ченных нами фиторегуляторов имели отрицательное побочное действие на структуру хромосом растений, выбывая повышение уровня мутирования клеток.

В данной серии экспериментов изучено влияние регуляторов роста на состав клеточной популяции и—продолжительность клеточного цикла в клетках корневой меристемы Al. fistulosuir.

Были испытаны следующие фиторегуляторы: ГШ -A&O.OQÎX и 0. IX; XXX - IX; 2-ХЭ®С - IX и 0. IX; Брассинолвд-214 - 0,0001X; Картолин •• О, IX и О,DIX. -

48-часовые проростки семян Al. fistulcsum, пророненные на воде, переносили s растворы фиторегуляторов. Через 18 часов 1/3 часть проросших семян фиксировали в этанол-уксусном фиксаторе 3:1, а оставшийся материал отмывали в воде и доращивали с последующей фиксацией через 18 и 36 часов.

Готовили, окрашенные по Фельгену при холодном гидролизе, постоянные давленные препараты, которые анализировали с помощью ИБАС-2000, используя специально созданные программы. О количестве ДНК в ядре судили по оптической плотности, выраженной в условных единицах 1.0. D. Все полученные данные обрабатывались с помощью статистической программы Classl и Class?, входящих в математическое обеспечение ИБАС-2000. Процент распределения ядер по фазам цикла определяли методом Slater et al. (1977). Измерение продолжительности митотического цикла проводили кофеиновым методом (Glmerwz-Martin et al., 1965). Корешки помещали на 1 час в О,IX р-р кофеина с последующей обработкой фиторегуляторами и фиксацией калдые 2 часа в течение трех суток.

Было показано, < что через 18 часов после обработки IX р-р XXX картина распределения ядер по фазам цикла не отличалась от таковой в контроле (табл.Б). Через 18 часов после снятия непосредственного действия препарата наблюдается падение пуда клеток в S-фазе, что мы связываем с образованием блока на рубеже G1/S. Спустя 36 часов после снятия действия препарата, блок G1/S снимался. Продолжительность клеточного цикла под воздействием. XXX не изменялась и составила как и в контроле 16 часов.

ГМК-Na 0. IX вызывала регкое снижение митотического ин--декса к первой фиксации и в последующем полную остановку.деления. Довольно интересная картина складывается в составе интер-

Таблица б

Состав клеточной популяции в корневой меристеме проростков Allium ristulosum, обработанных фиторегуляторами.

Препарат — ■■ -".' -......i Время после Процент клеток в фаг зах цикла

концент- контакта с 1

рация препаратом G1 1 s G2 М

(час)

Контроль 0 41.8 | 21.6 29.3 7.2

18 41.9 | 24.4 26. б 7.1

36 43.5 1 .24.8 24.6 7.1

ООО . 0 42.3 1 23-6 27.3 6.8

IX 18 42.4 1 12.8 39.8 5.0

33 ' 38. 4 | 22.0 34.1 Б. 1

ГЫК-Na о 42.7 | 27.1 29.0 . 1.2

0.1Х 18 26. 4 I 16. б 68.1 0

36 20.4 I 6.9 73.2 0

ГНК-Ma 0 ' 46.0 I 13.3 35.2 2.2

0.001Х 18 42.3 1 . 14.8 38.8 2.3

36 49.6 | 16.8 27. В 6.1

2-ЯЗЖ 0 ■."■; 43.4 Г 16.0 34.6 6.3

12 ' 18 : 67.1 1 10,1 29.8 2.9

36 67.3 I 11.1 - 28.5 3.1

Брассино : о 34.7 1 29.6 28.8 7.5

лид-214 18 36.9 I ' 27.6 28. Б 7.4

0.0001Х 36 41.7 1 23.1 28.1 7.6

Картолин 0 50.2 | 20.0 27.7 2.1

0.1Х 18 ,' 63.8 1 19.9 19.8 6.2

36 58.1 | 18.2 17.0 7.2

Картолин 0 43.7- I 18.5 31. 8 6.3

0.011 18 43. 9 Г 20.0 28.5 6.0

36 I . .. . 1 44.7 | 26.7 л,..'....... 20.3 Г. 7.1

фазных клеток (рис. 4в).В связи с тем, что полностью заблокировано продвижение клеток в 62/М происходит значительное накопление клеток в (32 - фазе, что, соответственно, ведет к падению процента клеток в И - фазе. Клетки, вступившие в. синтез завершают репликацию ДНК и тем самым увеличивают процент клеток в Э2 - фазе. Блок на рубеже 61/Э ведет к сильному истощению пула клеток в 5 - фазе и к третьей фиксации он падает до 5.9%. Продолжительность цикла не удалось' определить из-за полного отсутствия деления клеток.

ГМК-Иа 0.001% полностью не останавливала деление едеток, хотя значение МГ было довольно низким - 2.2%. Продолжительность цикла возрасла более, чем в 2 раза и составила 37 часов Препарат вызывал образование блоков 01/3 и 62/М .

ЕЕ. Иванов (1974) показал, что ГМК действует на рост и размножение клеток подобно облучению. Действительно в наших экспериментах при высоких дозах ГМК картина распределения кле-_ ток по фазам цикла сходна с таковой при у-облучёнии, наблюдаемой И.Н. Гудковым (1981) в популяции клеток корневой меристемы гороха. Если в норме без облучения клетки, прекратившие деление останавливаются почти всегда в 61 фазе, т.е. завершив очередной митоа, то при облучении они преимущественно накапливаются в 02 фазе, что ми и наблюдаем в наших экспериментах .с высокой дозой ГЫК: накопление клеток в 61 й 62 (особенно в (32). и сильное истощение,пула клеток в Б-фазе. То небольшое число клеток, которое к моменту воздействия препарата успели пройти через середину синтеза ДНК завершает репликацию и ' вступает в. 02-фазу. .

18-ти часовая экспозиция проростков лука в 1% растворе 2-ХЭФК привела, к снижению М1 до 6,3% и увеличению числа клеток в 132 фазе , что говорит о задержке выхода клеток в мигоа. К второй фиксации четко видно образование блоков на рубеже 61/3 и Э2/М-фаз. Митотический индекс падает до 2,9%. Происходит накопление клеток в 61-фазе, так как клетки не вступают в стадию синтеза. К третьей фиксации митотический индекс остается довольно низким - 3,1% и не иаменяется картина распределения ин-терфазньи ядер. Сохраняются блоки 61 /Б и (52/М (рис. 46).

Известно, что физиологическое действие 2-ХЭФК, как ретарданта связано с продуктом его метаболизма в' организме расте-

- еб -

Рис. А. Распределение клеток по фазам клеточного цикла: а - контроль; 6-1X 2-ХЭФК; в - О,IX ГИК-Иа.

Частота вотрвчаемооти 50

61 Б <32

40' 30 20 Ю О

01 Б

а э й

М1

Jir.il

"а

18 ч.

Интегральная оптическая плотность

Частота встречаемости

>ео|

40| • ! 30

20

10

61 Б 62

зб ч.

61 Б 02

54 ч.,

Ю Б СЕ

1

ш

шшк

УШк

18 Ч.

Частота вотречаемоотн 50

40 30 20 10

И. З В2'

Интегральная оптическая плотность 36 ^ . 54 ч.

Ш Б (32

¿11

11к

48 ч.

Интегральная оптическая плотность 36 ч. 64 ч.

ний, а именно этиленом. Исследователями, изучавшими влияние этилена, на скорость деления и длительность митотического цикла установлено, что этилен в зависимости от концнтрации может останавливать рост корня и практически полностью подавлять митоз (Apelbaum, Bun«, 1972). В наших опытах действие 2-ЯЭФК было более мягкое и пролонгированное по сравнению с этиленом. По-видимому, это связано с динамикой поступления и разложения 2-ХЭФЕ в растениях. Период полурааложения препарата в организме растений равен 2-4 дням, а полный распад происходит через 32 дня (Сиушева, Блиновский,1990).

Мэханизм действия брассинолида не на столько изучен, как других групп фитогормонов, и почти не изучен на клеточном уровне. Нами было установлено,-что брассинолид-214 не изменял продолжительность клеточного цикла, но увеличивал процент клеток в S-фазе, что свидетельствует о стимуляции препаратом вступления большего числа клеток в' синтез. Подтверждением этого предположения могут служить данные по влиянию брассинолида-:^ на метаболизм нуклеиновых кислот, где было показано, что Зрассинолид-: увеличивает активность ДНК и РНК-полимераз и способствует накоплению белка, РНК и ДНК (Kalinlsh et al., 1986).

Картолин в концентрации О,IX резко снижал Ш (2,IX) к моменту первой фиксации. Но уже через 18 часов после снятия действия вещества наблюдается увеличение UI до 6,21, а к третьей фиксации Ml достигает уровня контроля. В составе популяции интерфазных ядер четко определяется блок G1/S. Картолин увеличивал продолжительность цикла до 26 часов. Картолин в 10 раз меньшей концентрации (0,01Х) лишь незначительно снижал Щ, Препарат увеличивал продолжительность цикла на 2 часа

Обобщая данные полученные нами, следует *сказать, что брассинолид-214 стимулировал вступление клеток в синтеа и не влиял на продолжительность клеточного цикла; для картолина получена четко выраженная зависимость эффекта от дозы препарата; - ретарданты увеличивали длительность'клеточного цикла , угнетали митотическую активность клеток , вызывали, образование блоков на рубеже G1/S и G2/M и накопление клеток в G1 и G2 фазах. ■.•''•-'..'

3. г. Влияние брасс ином да на щгтофиатлогические показатели у ячменя в условиях солевого стресса.

С целью испытания регуляторов роста как антистрессовых средств нами было изучено действие брассинолида на процессы клеточного деления и характер структурных нарушений хромосом в условиях солевого стресса

Опыты были проведены на проростках семян ярового ячменя Носовский 9. ^

Добавка 10 X эпибрассинолида-ББ на фоне хлошдного засоления активировала деление клеток - митотический индекс резко возрастал. При 0.3Ы ИаС1 не было зарегистрировано стимулирующего действия препарата на процесс клеточного деления (Табл. 6).

Таблица б

Влияние эпибрассинолида-ББ на митотическую активность . клеток корневой меристемы ячменя в условиях хлоридного

засоления.

Вариант опыта Всего проана- 1------ 1 |Из них 1

лизированных Iделящихся М1 + ш td

клеток

Контроль " 1797 | 162 9.01+0. 67 —

Эпибрассинолид (Эб) ; 1346 ' | 124 9. 21+0.78 -0.19

0,1 У ИаС1 1448 . | 92 6.35+0. 64 2.86*

0.2 Ы ЫаС1 . 1768 | 66 3. 73+0. 45 6. 53*

0,3 Ы ЫаС1 1288. I" 1« 3. 26+0. 49 6. 90*

0,1 М N801 + Эб \ 1Б77 . V 1 Р131 а 31+0. 69 0. 72

0,2 М МаС1 + Эб 1286 | 100 8. 47+0. 78 0. 52

0,3 Ы ИаС! +. Эб 1366 | '46 3.37+0.49 6. 80* 1

' . * - Р < 0,06

Ионы соли выаывали задержку клеток в метафаае-анафаае. Эпиб-рассинолида изменял картину распределения клеток по фазам митоза и делал ее сравнимой с контрольной. Эпибрассинолида-55 существенно снижал уровень йарушений возникающих в клетках при хлоридном засолении (Табл.7).-

Таблица 7

Влияние эпибрассинолида 66 на уровень мутирования хромосом клеток корневой меристемы ячменя в условиях солевого стресса

Препарат г...............----- IВсего проанализированных | клеток 1 1 Количество | клеток с | нарушениями! X + т 1 1 1(1

Контроль I 836 22 | 2.63+0.55

№ С1 0.2М Г 804 50 | 6.21+0.85 3.54*

Ыа С1+0.2М эпибрассино-лид 65 1 890 32 | 1 3. 59+0.62 1.16 ...........

* - Р < 0,05

Анализ спектра хромосомных нарушений в варианте с хлорид-ным засолением выявил увеличение всех типов аберраций в среднем в 3,5-4 раза Эпибрассинолид-55 снижал образование двойных и одиночных мостов.

Активация клеточных делений'и. рнижение числа структурных нарушений брассинолидом является проявлением на клеточном уровне способности препарата снимать последствия солевого стресса

4. Последействие регуляторов роста (полевые апыш).

Поскольку регуляторы роста активно влияет на ядерные структуры, необходимо установить, в какой мере сохраняются изменения в последующих- поколениях, какова способность к воста-новлению на разных уровнях биологической организации, как изменится геиотипическая структура сорта при регулярном ежегодном применении фиторегуляторов.

Пэсевы ячменя сорта Нэсовский-9 были обработаны 0,52 2-ХЭ4К в стадии выхода в трубку и 0,161 картолином в фазу цве- '. тения. В течение трех последующих поколений вели наблюдения за уровнем мутирования соматических клеток и морфофизиологически-

ми параметрами растений. Парадельно с этими опытами по слежению проводили ежегодные обработки фиторегуляторами в течение трех лет.

4,1. Учет структурных нарушений в Ынюав.

При анализе нарушений в клетках корневой мористомо проростков, выращенных из семян растений ячменя, обработанных в 1986 году 2-ХЭвК и картолином, установлено наличие кластоген-ных эффектов (Табл. 8)'. В 1987 й 1988 годах при*пересеве семян, полученных от обработанных в 1986 году растений, не зарегистрировано сохранения повышенного уровня мутирования клеток корневой меристемы проростков семян второго и третьего поколения. Вероятность длительного сохранения кластогенного эффекта препаратов до первого семенного поколения была проверена в повторных полевых экспериментах, проведенных в 1990 и 1991 годах. При этом было установлено, что повышение уровня мутирования клеток сохраняется только в первом семенном поколении.

Итак, в результате трехлетних полевых экспериментов было показано сохранение кластогенного эффекта для 2-Х&£К и карто-дина в первом семенном поколении. Шка мы не можем дать достаточно полного объяснения природе этого явления. Можно предполагать, что в момент обработки под действием вещества образуются нарушения в ядерных структурах архиспориальных клетск, которые сохраняются в многоклеточном зародыше и реализуются при проращивании семян. Длительное сохранение повышенного уровня мутирования клеток в варианте с ""картолином возможно связано с тем, что препарат вызывает генные мутации. Клетки с нелетальными генными мутациями могут сохраняться довольно долго, влияя на уровень мутирования. В то время как крупные обменные нарушения хромосом чаще всею губительны для клеток. Через два-три деления такие клетки элиминируют.

Щ>и трехлетней обработке отмеченс) снижение уровня мутирования клеток до спонтанного при действии картолина и 2-ХЭФК. При ежегодном воздействии, препарат становится постоянно действующим фактором, поэтому реакция организма на них постепенно стабилизируется. Па-видимому, под влиянием этого внешнего фактора из популяции элиминируются ослабленные растения с пониженной жизнеспособностью. Выживающие, более устойчивые растения формируют популяции последующих поколений. О другой сторо-

-зоны возможно происходит генетическая адаптация популяции в от-

Таблица 8

Влияние регуляторов роста на уровень мутирования соматических клеток трех поколений ярового ячменя Носовский-9.

1 Препарат | 1Шфры Обшее ("•...... -г........ -Т— |Анафааы с нару- | td

опта число | тениями 1

анафаз -1

| всего X Í Ы | i

1986 . 1

Контроль | 0 1045 1 . 23. 2,2+0,31 |

0,52 2-ХЭФК | 1 ■ 1093 | 68 6,1+0,29 Г 8,86*

0,152 картолин| 1 1509 1 те 4,9+0,25 | б,14*

1987 -

Контроль | 00 1825 | 25 2,4+0,23 | ' ■ - -

0,5* 2-ХЭФК | 10 1500 I 60 2,6+0,26 1 0,64

0.6Х 2-ХЭ5К | 11 1600 1 35 4,3+0,25 | ' 6,13*

0,152 картолин) 10 127Б 1 60 2,9+0,27 | 1,67

0,151 картолин| 11 1100 1 44 4,0+0,30 | ' 5,33*

Í 988

Контроль | ООО 1250 | 28 2,2+0,28 |

0,5% 2-X3ÍK | 100 1390 | 35 2,5+0,26 | 0,71

0,5% 2-ХЭЙС | 111 1617 Г 30 2,0+0,25 | 0,45

0,162 картолин! 100 1290 | 67 2,4+0,27 Г 0,62

0,152 картолин! 111 1255 I 33 2,6±0,28 ! 1,05

1990

Контроль | 0 2783 | 76 2,7+0,31 |

0,52 2-ХЭФК | 1 2202 ! 108 4,9+0,46 | 3,38*

0,162 картолин! 1 2334 1 136 5,8+0,49 J ; 5,35*

1991

Контроль ( 00 2220 | 64 2,4+0,33 | Y-

Ъ. 52 2- ХЭФК | 10 1656 . | 36 2,2+0,62 ! 0,30

0,152 картолин! ю 1494. I 48 3,2+0,46 | ' ,.,., . . i , 1,39

* - Р < 0,05.

** - 10 и 100 вариант "слежения",

11 и 111 вариант ежегодных обработок. '

ввт на воздействие внешнего агента- возрастает зашита ДНК ферментативными системами клеток, что обеспечивает возвращение уровня мутаби^ности к оптимальному значению (Дубинин, 1986).

>4. г. Анаша измгненш? количественных признаков.

Обработка посевов ячменя 1% 2-ХЭФК и 0,16% картолином вызывала изменения покайатлей количественных признаков (табл.9).

Таблица 9

Влияние фиторегуляторов на биометрические показатели трех поколений ярового ячменя сорта Носовский 9.

1—........1 | препарат | Шифры 1........ |Высота I ■. ■ |Длина Число 1 Масса 10001

опыта |растений, | колоса, зерен а колосе, зерен, |

i 1 ! см. | "см. шт. гр. I

1986

|Контроль | 0 I 70,31 | 8,32 20,80 38,34 |

|0,5Х 2-ХМК | 1 Г 66,82* I 7,76* 16,63* 35,27* |

|о,15Х картолин| 1 | 65,48* | 7,53* 16,29* 36,60 |

| НСР | | 2,63 1 1.1 1987 . 1,74 1,80 |

(Контроль | L 00 | 83,04 1 7,70 19,93 60,01 |

|0,5Х 2-ХЭФК | 10 | 81,10 1 7,61 20,11 49,52 |

|0,5Х 2-ХЭФК | 11 | 72,61* | 6,32* 15,31* 40,01* |

|0,1БХ картолин| 10 | 83,43 1 "Ш 19,73 49,63 !

Ю.15Х картолин| И. Г 86,01 1 ( А10 20,00 49,01 |

I íffiP ' | ' - ' 1 2,41 1 OÍ, 43 198^ 1,10 1,77 |

| Контроль, | ООО | 70,31 | 7,70 20,82 38,31 |

|0,5% 2-ХЭФК ^ 100 | 68,82 1 7,71 19,63 39,04 |

10,5Х 2-ХЭФК | 111 | 56,41* | 7,02* 16,81* 27,53* |

(О,15% картолин| 100 | 70,33 1 7,73 21,02 37,71 |

|0,15Х картолин| 111 | 68,81 1 7,54 20,41 39,32 |

i . НЗР ; | i ', ' i 1 2,3 1 ,'■ , 1 0,4 i 0,9 1,2 | , i

• * - статистически достоверная разница между контролем и опытом

Особенно это было выражено в варианте с 2-ХЭ4К. Препарат достоверно снижал зысоту растений, длину колоса, число зерен в колосе и массу 1000 верен.

При пересеве в 1987 и 1988 годах семян, полученных от обработанных в 1986 году растений, не наблюдали видимых отклонений. Было обнаружено лишь небольшое снижение высоты растений и длины колоса в вариантах с 2-ХЭФК.

Выраженное угнетающе воздействие на ростовые процессы. и формирование зерновок оказывали ежегодные обработки регуляторами роста, особенно в варианте с 2-X3SK. Препарат вызывая статистически достоверное по сравнению с контролем снижение высоты растений, длины колоса, а также уменьшал число зерен в колосе и массу 1000 зерен.

& Влияние аюстрессавис ^оорегуляторов на синтез белка.

Электрофоретический анализ спектров белков эндосперма ячменя и изоферментоЕ был использован как непрямой тест та генные мутации. Миоголокусный контроль позволил задействовать каждую хромосому кариотипа (рис.Б) и сократить обьем выборки.

Посевы ячменя Нэсовский-9 и Зазерский-85 были обработаны картолином (БОмг/га), брассинолидом (БОмг/га) и спирокарбоном (бОг/га) (10). Предварительно был получен генетически однородный материал от одного колоса, проверенного на гомозигот-ность (по гордеинам). Достаточное количество семенного материала для полевых испытаний выращэно в ряде поколений. ' Эксперимент проводился в течении 3-х лет по описанной ранее схеме; пересев материала, обработанного в первый год (1989) и ежегодная обработка в течение трех лег (1989, 1990, 1991гг. ).

Разделение гордеинов было проведено с использованием методики SDS-ПААГ. Экстракцйю гордеиновой фракции семян ячменя осуществляли по методу P. Shewry ( 1982) с некоторой модификацией. Электрофореа белков-ферментов ставили в 7% ПААГ по В. J. Devis (1964). Для извлечения белков-ферментов использовали 6-ти дневные проростки семян ячменя. Выявление исследуемых ферментов осуществляли по методу Е. В. Левитес (1986). Гели , анализировали как визуально, так и с помощью сканирования на лазерном денситометре "Ультраскан". На каждый вариант опыта было проанализировано 120 зерен. •

Рис. 5 . Расположение в хромосомах ячменя докусов, кодирующих •изучаемые белки.

ерд-2

ет>с1-1

ШЬ-2

аср2

+Ез12 |0,23 ^Ези 10.48 +&з14

□

— Ногб 77,6 —

Ног2 — 77,4

НоП — 64,8

Ног4 и-л 63,6 —

НогЗ - 8,1

□

ЬШ-КЮ аорЗ(1Л

I

II

III

IV

VI

VII

grpd-l.gpd-.2- глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа; кМЬ-Ии, ШЬ-2 -малат^-дегидрогеназа; аэр2 - кислая фосфатаза; Еви, Ез12, ЕвИ-- зстераза; Ног1 - гордеин С; Ног2, Ног4 - гордеин В; НогЗ -гордеин Д; Ногб - гамма-гордеин.

У ячменя наиболее изученными в генетическом отношении являются спирторастворимые бёлки эндосперма - гордеины. Они кодируются локусами Ног. 2, Ног 1 и Нрг 3. Все локусы наследуются сцепленно и расположены на коротком плече 5-й хромосомы.

Анализ спектров гордеиновой' фракции позволил выявить до 11 белковых компонентов у Носовского-9 и 7 компонентов у За-зерского-85. На сорте Зазерский-85 не зарегистрировано изменений в гордеиновой фракции по трем, исследуемым препаратам. На йосовском-9 выявлены единичные изменения в гордеиновой фракции., Так в год обработки зпибрассинолид-55 вызывал усиление компонента в зоне С (рис. 6), картодин -появление нового компонента в той же зоне , спирокарбон - усиление компонента в зоне а

Рис. 6. Электрофореграммо гордеинов.

з

1. Носовский-9 - контроль.

2. Носовский-9 - усиление компонента в воне "С"

под действием эпибрассинолида-65.

3. Зааерский-85 - контроль.

Рис. 7. Электрофореграмма Малатдегидрогеназы.

Mdh 1

МсШ 2

\

1 2 3 4

1. Носовский1^ - контроль.............- — —

2. Носовский-9 - появление компонента в локусе ШЬ-2

под действием эпибрассинолида-65.

3. Зааерский-85 - контроль.

4. Зааерский-85 - усиление компонента в локусе ШП-1

под действием картолина .

- 36 -

Наиболее отзывчивой к воздействию исследуемых препаратов была малатдегидрогеназа В год обработки эпибраосинолидом-Б5 на Носовском-9 выявлен новый компонент в яоне бастроподвижных белков в докусе Мс1Ь 2 (рис. 7). Спирокарбон индуцировал усиление синтеза одного из компонентов в зоне высокомолекулярных белков локуса ШЬ. 1. Количество изменений на вариант составило 2,IX. Картолин на Носовском-9 не влиял на спектр изофермента, но на Зазерском-85 препарат вызывал усиление компонента в ло-кусе ШЬ 1 (рис. 7). Количество изменений составило 0,3 X.

При пересеве в 1990 и 1991 годах семян, полученных от растений обработанных в 1989 году регуляторами роста, не обнаружено сохранение биохимических изменений.

Ежегодные двухлетние обработки эпибрассинолидом-55 выявили на сорте Нзсовский-9 усиление компонента в локусе ШЬ 2 (1,7%). На сорте Зазерский-85 при трехлетних ежегодных обработках картолином зарегистрировано увеличение синтеза компонента локуса №111 1 (0,8%).

Нами показано, что антистрессовые препараты влияют на белковые системы, вызывая усиление или ослабление отдельных компонентов в спектрах иэоферментов и белков эндосперма и появление новых компонентов. Проявление эффекта препарата зависело от генотипа сорта. Щ>н сравнительном анализе двух сортов ярового ячменя по спектрам белков эндосперма и иэоферментов сорт Носовский-9 был более отаывчив к воздействию препаратов. Изменения в спектрах белков эндосперма,иэоферментов нссит характер модификаций, так как уже во втором поколении не было зарегистрировано сохранение биохимических изменений.

' : ' ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе разработанной тест-системы по оценке генетических последствий применения экзогенных регуляторов роста растений научены закономерности их воздействия на геном растений в зависимости от их химической природы, концентрации, пов-торности обработок, стадии клеточного цикла, генотипа и физиологического состояния клетки.

Скрининг 14 фиторегулягоров на мутагенную активность показал наличие кластогенного эффекта у 5 веществ. В полевых экспериментах показано, -что увеличенный выход хромосомных на-

- Э6 -

рутений, индуцируемых регуляторами роста, сохраняется в первом семенном поколении. Однако во втором поколении не отмечено повышенного уровня мутирования клеток, по-видимому, в результате соматического и гаметического отборов| в вегетирующем растении происходит элиминации аберрантных клеток.

Установлено, что регуляторы роста активно влияют на белковые системы. На генетически однородном материале показано, что изменения в спектрах проявляются только в год обработки. Сохранение эффекта не было зарегистрировано у следующего поколения. Изменения, вызываемые регуляторами роста, носили кодификационный характер и не затрагивали генетические' структуры локусов, кодирующих изучаемые белки.

При ежегодных обработках регуляторами роста посевов ячменя, т.е. на фоне постоянного воздействия регуляторов роста , вероятно, происходит отбор форм нечувствительных к кластоген-ному действию препаратов. Но такая устойчивость генома к повреждающему действию ксенобиотиков сопровождается потерей хо-аяйственноценных признаков сортов.

Показано, что препараты XXX и брассинолид не обладают мутагенным действием и могут применятся как в интенсивных технологиях, так и в семеноводческих хозяйствах. Картодин и 2-ХЭФК проявили кластогенный эффект в биотесте и на трех сортах ярового ячменя. При применении этих регуляторов роста необходимо учитывать генотип сорта и технологические концентрации^ особенно для картолина, так как этот препарат в зависимости от концентрации может оказывать стимулирующее или' ингибирующэе действие на геном растений. Не рекомендуется проводить ежегодные обработки посевов ярового ячменя 2-ХЭОК ., так как это приводит к снижению показателей урожайности.

Приведенная картина взаимодействия генома растений и регуляторов роста подводит к пониманию тех последствий, которые могут иметь место при применении препаратов с мутагенным действием. Проведение систематических исследований по оценке генетического риска применения регуляторов роста позволит недопустим попадание в биосферу веществ, обладающих мутагенной активностью. • •

- 37 -ВЫВОДЫ

1. Разработана комплексная тест-система, основанная на регистрации морфофизиологических, биохимических и цитогенети-ческих изменений у растений, вызываемых экзогенными регуляторами роста. Выявлены основные закономерности воздействия синтетических регуляторов роста на геном растений и установлены параметры, характеризуете их зависимость от химической нриро-ды и концентрации веществ, повторностей обработок, стадии клеточного цикла, физиологического состояния клеток и генотипа сорта Установлена корреляция цитогенетического эффекта в соматических и генеративных клетках..

2. В биотесте показана кдастогенная активность у б регуляторов роста в зависимости от концентрации препаратов и определена пороговая доза их кластогенного действия. В порядке убывания кластогенной активности регуляторы роста распределились в такой последовательности: ГМК-Na - картолин - гйдрел -2-ХЭФК - 3983К. Ш характеру кластогенного действия препараты йа группы этилёнпродуцентов и картолин следует отнести к мутагенам незадержанного типа действия, ГМК-Na - к мутагенам задержанного типа.

3. Продолжительность кластогенного последействия зависит от характера структурных повреждений хромосом и степени воздействия препаратов на кинетику клеточного цикла и колеблется от 18-ти до Зб-ти часов. •

4. Картолин вызывает генные мутации типа сдвига рамки считывания и замены пар оснований в условиях отсутствия и наличия метаболической активации в тесте Эймса, ГМК-Na вызывает генные мутации в условиях метаболической активации. 2-хэфк, XXX, декстрел и гидрел не вызывают гфных мутаций. На индикаторных штаммах E. coli не установлено ДНК-повреждапцэго эффекта . у картолина' '

6. Экзогенные регуляторы роста активно влияют на кинетику клеточного цикла Ретардант 2-ХЭЯЙ и ГМК-Na задерживают деление клеток на рубежах G1/S и GZ/U-.фэз, увеличивая длительность клеточного цикла и угнетая митотическую активность клеток. Брассинолид стимулирует вступление клеток в стадию синтеза, но не влияет, на продолжительность клеточного цикла Картолин в

концентрации 0,1% угнетает митотическую активность клеток и увеличивает продолжительность клеточного цикла,.

6. Изучено антистрессовое действие брассююлида на геном растений в условиях хлоридного засоления. Показана способность брассинолида снимать последствие солевого стресса. Препарат активирует клеточное деление и снижает число структурных нарушений хромосом.

7. Проявление онтогенетического действия регуляторов роста зависит от генотипа растений. Различия в устойчивости и чувствительности сортов к мутагенному воздействию применяемых в растениеводстве средств химизации должны учитываться при разработке технологий возделывания сельскохозяйственных культур.

8. Регуляторы роста растений способны вызывать усиление или ослабление отдельных компонентов и появление новых компонентов в спектрах изоферментов и белков эндосперма ячменя. Наиболее чувствительными к воздействию регуляторов роста были гордеиновая фракция и малатдегидрогеназа Изменения в спектрах белков эндосперма и иаоферментов в год обработки носят характер модификаций.

9. Кластогенный эффект наблюдается в первом семенном поколении ячменя, полученном от растений, обработанных регуляторами роста В результате элиминации в вегетирующем растении нежизнеспособных клеток с нарушениями в геноме кластогенный эффект во втором семенном поколени не сохраняется.

10. При многолетнем воздействии регуляторов роста, способных вызывать хромосомные аберрации и другие нарушения' в геноме растений, возможны изменения в генотипической структуре сорта В результате снижается чувствительность растений к кластогенному действию экзогенных регуляторов роста, сопровождаются ухудшением хозяйственно-ценных показателей сорта

- 39 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДНССШАЦИИ.

1. В. С. Шевелуха, Л. Я Хруеталева, И. К. Блиновский, 10. U. Го-ловнина и др. Генетический контроль за применением регуляторов роста растений. / "Вестник с.-х. науки", 1989, N. 2, С. 42-50.

2. ЕС. Шевелуха, Л. И. Хруеталева, И. К. Блиновский, П. М. Головкина и др. Оценка генетического риска применения регуляторов роста. / Сборник "Регуляторы роста в растениеводстве" М. , 1989, С. 137-134.

3. В. С. Шевелуха, И. К. Блиновский, Л. И. Хруеталева, la M. Го-ловнина и др. "Методические рекомендации по комплексной оценке генетического риска применения фиторегуляторов в растениеводстве" М. , MOXA, 1992, 28с.

4. B.C. Шевелуха, Л. И.Хруеталева, И.К. Блиновский, Ю. М. Головнина Оценка мутагенной активности ряда фиторегуляторов. / Тезисы докладов на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" Ереван 1987, С. 117.

5. Л. И. Хруеталева, И. К. Блиновский, IQ Ы. Головнина и др. Скрининг на мутагенную активность новых фиторегуляторов. / Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Объем и методы гено-токсической оценки" Ленинград, 1989, С. 32.

6. Л. И. Хруеталева, Г. Е Андреева, П. М. Головнина, А. И. Зло-бин и др. Генетический контроль аа применением картолина и кампозана на зерновых культурах. / Тезисы докладов Всесоюзного координационного совещания "Генетические последствия загрязнения окружающей среды" Москва-Самарканд, 1990, С. 185.

7. Л. И. Хруеталева, Злобин А. И., '¡Андреева Г. R Действие картолина на компонентный состав запасных белков ячменя./ Тезисы докладов Всесоюзного координационного совещания " Генетические - последствия загрязнения окруизхвдэй среды" Ыэсква-Самар-

•канд, 1990¡ С. 186. '

8. Khrustaleva L. I. , Andreeva й N., Golovnina G. M. Adaptation of- Hordeüm vulgaris (variety Nosovskiy-9) to growth regulators in a three year trial. / Proceedings of the 5-th International Youth Symposium "Plant metabolism regulation", Varna, Bulgaria, 1990, P. 180-183.

9. JL И. Хруеталева. г. R Андреева, a U Головнина, А. И. Злобин . Цитогенетические исследования в соматических и

генеративных клетках ячменя, обработанного зпибрасинолидоы-55 в полевых условиях. / Теаисы докладов совещания "Брассиноотерои-ды", Минск, 1991, С. 31-32.

10. JL И. Хрусталева, Г.Н.Андреева, IdЫ. Головкина, A. ItЗло-бин . Генетические последствия применения химических средств в сельском хозяйстве. / Тезисы докладов н-п конференции "Природоохранные аспекты землепользования и с/х производства в свободных экономических зонах" Ленинград, 1991, С. 47.,

11. L. I. Khrustaleva, ÜN. Andreeva, G. M. Golovnina, A. I. Zlobia / The problem of preservation of germoplasm in the conditions of antropogenlc pollution". V. Abst. 4: Exchange and convertation of Plant Genetiо Resources between America and Europe. Etnobotan ica-92" Cordoba, 1992. P. 42.

12. JL И. Хрусталева, Ю. M, Головнина . К вопросу сохранения растительного генофонда Цитогенетические эффекты ретардантов и генеративных клетках ярового ячменя. / .Доклады РАОХН, 1994, N.6, (в печати).

13. Л. И. Хрусталева, Ю. U. Головнина Влияние брассинолида на цитологические и физиологические показатели у ячменя (Hordeum vulgare L.)' в условиях солевого стресса/ С.-х.биология 1984, N. 5

14. Шевелуха ЕС.,' Блиновский И. К. , Хрусталева Л. И. 4ито-регуляторы: за и против. / йаука в СССР., 1989, N4, С.23-24.

15. Артамонова Г. М. , Герасимова С. И., Хрусталева Л. И. и др. "Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии" М.: Изд-во ТСХА, 1991, 94 с.

16. Хрусталева Л. И. , Погорилая Е. В. Влияние фиторегулято-ров на состав клеточной популяции в корневой меристеме Allium fistulosum L. / онтогенез. 1994, N Б