Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние мутаций по генам мембранных рецепторов цитокининов на экспрессию генов хлоропластных белков Arabidopsis thaliana

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние мутаций по генам мембранных рецепторов цитокининов на экспрессию генов хлоропластных белков Arabidopsis thaliana"

На правах рукописи

ДАНИЛОВА Мария Николаевна

Влияние мутаций по генам мембранных рецепторов цитокининов на экспрессию генов хлоропластных белков АгаЫйоряк ЧшИапа

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 МАЙ 2015

005569076 Москва -2015

005569076

Работа выполнена в лаборатории экспрессии генома растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Кузнецов Виктор Васильевич

кандидат биологических наук

Кудрякова Наталия Васильевна

Официальные оппоненты: Кудоярова Гюзель Радо.месовна,

доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии УНЦ РАН, заведующая лабораторией физиологии растений

Бибикова Татьяна Николаевна,

кандидат биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное Образовательное учреждение высшего

профессионального образования Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет,

старший научный сотрудник кафедры физиологии растений

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет"

Защита состоится «30» июня 2015 г. в 11:00 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, г. Москва, Ботаническая ул., 35. Факс:(499)977-80-18; e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук www.ippras.ru

Автореферат разослан «28» апреля 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Азаркович Марина Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитокинины (ЦК) - растительные гормоны, оказывающие полифункциональное регуляторное влияние на рост и развитие растений на протяжении всего жизненного цикла (Кулаева, 1973; Романов, 2009; Hwang et al., 2012). Благодаря достижениям последних 15 лет стало понятно, что рецепция ЦК у A. thaliana осуществляется тремя мембранными гистидинкиназами (АНК2, АНКЗ и AHK4/CRE1), которые при участии белков двухкомпонентной сигнальной системы регулируют экспрессию ЦК-зависимых генов (Kieber and Schalier, 2014).

Особый интерес к цитокининам обусловлен их участием в регуляции биогенеза хлоропластов. Они стимулируют дифференцировку хлоропластов, их фотосинтетическую активность, транскрипцию ряда хлоропластных генов (Кулаева, 1973; Kusnetsov et al., 1994; Zubo et al., 2008). Несмотря на значительный прогресс в понимании механизма сигналинга цитокининов, до сих пор не было проведено систематических исследований, позволяющих установить биологическую роль индивидуальных рецепторов в ЦК-зависимом контроле экспрессии хлоропластных генов в растении в ходе его развития. В литературе также отсутствуют сведения, характеризующие участие рецепторов ЦК в регуляции экспрессии ядерных генов, отвечающих за транскрипцию пластидного генома (пластома).

Несмотря на перекрывание функций в контроле ряда биологических процессов, рецепторы ЦК имеют неодинаковый характер экспрессии в растении (Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004), различаются по лигандной специфичности (Lomin et al., 2011; Stolz et al., 2011) и характеризуются различным физиологическим значением in planta (Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004; Riefler et al., 2006). Это позволяет предполагать существование функциональной специфичности индивидуальных рецепторов ЦК в регуляции экспрессии генов хлоропластных белков.

Использование нокаут-мутантов по рецепторам ЦК растений A. thaliana, имеющих измененный цитокининовый статус, представляет хорошую экспериментальную модель для выяснения возможной роли отдельных рецепторов в регуляции экспрессии хлоропластных генов и ядерных генов, отвечающих за транскрипцию пластома (РНК-полимеразы и сигма-факторы). Так как в ходе онтогенеза растения функции индивидуальных рецепторов могут изменяться, в настоящей работе анализировали участие рецепторов ЦК в регуляции экспрессии хлоропластных генов на разных стадиях онтогенеза растения A. thaliana.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение влияния мутаций по генам мембранных рецепторов цитокининов на экспрессию генов хлоропластных белков в ходе онтогенеза Arabidopsis thaliana. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить влияние нокаут-мутаций по генам рецепторов ЦК на накопление хлорофилла, а также определить корреляцию между содержанием хлорофилла и экспрессией маркерного гена старения SAG12 на разных стадиях онтогенеза A. thaliana;

2. Выявить роль рецепторов цитокинина в регуляции содержания транскриптов хлоропластных генов в листьях разного возраста у мутантов ahkA. thaliana;

3. Изучить действие экзогенного цитокинина на уровень транскриптов хлоропластных генов в листьях на разных стадиях развития мутантов ahk A. thai ¡ana-,

4. Выяснить участие рецепторных гистидинкиназ в цитокинин-зависимой регуляции интенсивности транскрипции хлоропластных генов у мутантов ahk A. thaliana',

5. Исследовать влияние мутаций по генам рецепторов ЦК на цитокинин-зависимую регуляцию экспрессии ядерных генов, отвечающих за транскрипционную систему хлоропластов в ходе онтогенеза A. thaliana.

Научная новизна. На инсерционных нокаут-мутантах A. thaliana по генам рецепторов цитокинина впервые продемонстрировано участие индивидуальных рецепторов ЦК в регуляции экспрессии хлоропластных генов в ходе онтогенеза растения. Получены данные о первостепенной роли рецепторов АНКЗ совместно с АНК2 в накоплении транскриптов ряда важнейших генов пластидного кодирования, а также в поддержании их транскрипционной активности. Впервые показано, что при старении, завершающей стадии онтогенетического цикла растения, важное значение в контроле физиологического состояния листьев имеет рецептор АНК2. Обнаружено участие рецепторов ЦК в цитокинин-зависимой активации генов хлоропластных РНК-полимераз ядерного кодирования: RpoTp и RpoTmp и дифференциальной регуляции содержания транскриптов хлоропластных транс-факторов семейства Sig ядерного кодирования. Это дает основания предполагать, что реализация сигнала ЦК в пластидах на разных стадиях развития растений частично обусловлена гормон-зависимым изменением экспрессии ядерных генов аппарата транскрипции пластома.

Практическая значимость. Полученные в диссертационной работе результаты вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов цитокинин-зависимой регуляции экспрессии пластидных генов и дополняют существующие представления о биогенезе фотосинтетического аппарата растений. Эти данные открывают возможность избирательного воздействия на геном хлоропластов и геном ядра с целью управления фотосинтетической функцией растений и повышения их продуктивности.

Экспериментальные данные, изложенные в работе, могут быть применены в учреждениях сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, а также использованы для подготовки курсов лекций по физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений в ВУЗах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Показана зависимость уровня хлоропластных транскриптов от функционирования индивидуальных рецепторов ЦК в ходе онтогенеза растения A. thaliana: на стадии проростка и в листьях молодых растений наибольшее значение в контроле уровня хлоропластных транскриптов имеют рецепторы АНКЗ и АНК2. Отсутствие рецептора АНК2 способствовало замедленному старению розеточных листьев А. thaliana.

2. Интенсивность транскрипции большинства изученных хлоропластных генов в листьях 3-недельных растений A.thaliana определялась функциональной активностью рецептора АНКЗ, тогда как АНК2 и АНК4 играли вспомогательную роль.

3. Установлена возрастная зависимость дифференциальной регуляции содержания транскриптов хлоропластных генов у растений дикого типа и мутантов ahk при обработке экзогенным цитокинином.

4. Участие ЦК в регуляции экспрессии ядерных генов хлоропластных РНК-полимераз (RpoTp и RpoTmp) и генов сигма-факторов, может быть одним из возможных путей контроля цитокинином экспрессии пластидного генома.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на III Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 2010); семинаре молодых ученых в Институте физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН (Москва, 2012); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011» (Москва, 2011); Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011); VII Съезде Общества физиологов растений «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); IV Всероссийском симпозиуме «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность» (Москва, 2012); на 18-ом Международном конгрессе биологии растений (Фрайбург, Германия); Международной научной конференции и школе молодых ученых «Физиология растений — теоретическая основа инновационных arpo- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из которых 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 157 страницах машинописного текста и содержат 12 таблиц и 37 рисунков. Список цитируемой литературы включает 275 наименований, в т.ч. 250 иностранных.

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследований. В качестве объекта исследований использовали растения Arabidopsis thaliana (экотипа CoIumbia-0) дикого типа и созданные на его основе одинарные и двойные инсерционные нокаут-мутанты по генам рецепторов цитокининов (ahk мутанты), экспрессирующие два или один из трех рецепторов цитокинина соответственно. Семена инсерционных нокаут-мутантов были получены из коллекции ABRC (Ohio State University, USA).

Выращивание растений A. thaliana и условия проведения опытов. В экспериментах по исследованию влияния мутаций ahk на уровень транскриптов хлоропластных генов в онтогенезе использовали растения дикого типа и мутантов ahk на трех стадиях развития: 7-дневные проростки, 3 - и 7 - недельные растения. Выращивание 7-дневных проростков А. thaliana в стерильных условиях. Семена растений стерилизовали раствором гипохлорита натрия в течение 5 мин и трижды промывали стерильной водой. Семена проращивали на жидкой питательной среде МС/2 (Murashige and Skoog, 1962) в климатической камере при режиме 16 ч день/8 ч ночь, интенсивности освещения 50 мкмоль м"2 с"' и температуре 20-23° С. Возраст растений определяли с момента прорастания семян. Для синхронизации всходов

чашки Петри с семенами выдерживали в течение 2 дней при +4° С в темноте и затем переносили в климатическую камеру.

Выращивание растений A. thaliana в почве. Для экспериментов с молодыми и стареющими растениями проростки выращивали в почве, смешанной с перлитом, до 3 - и 7 - недельного возраста в климатической камере при вышеописанных условиях.

Обработка растений цитокининами. Для анализа эффекта ЦК на уровень транскриптов хлоропластных и ядерных генов на ранней стадии развития 7-дневные проростки A. thaliana переносили на среду выращивания (МС/2) с добавлением экзогенного транс-зеатина (17.) в концентрации 5 мкМ и инкубировали в течение 15 минут и 3 часов. С целью исследования влияния экзогенного ЦК на уровень транскриптов генов хлоропластного и ядерного кодирования на стадии взрослых (3-недельных) и стареющих (7-недельных) растений, листья опрыскивали раствором цитокинина той же концентрации (íZ, 5 мкМ) и через 3 часа отбирали 5-й и 6-й настоящие листья с пяти разных растений с целью последующей экстракции РНК.

Выделение РНК. Суммарную РНК выделяли из растительной ткани с помощью реагента TRIzol согласно рекомендации производителя (Invitrogen, США). Содержание РНК определяли на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, США).

Количественный анализ экспрессии генов методом обратной транскрипции с последующей полнмеразной цепной реакцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР РВ).

Обратная транскрипция. Выделенную РНК предварительно очищали от возможной примеси геномной ДНК, используя ДНКазу I свободную от РНКаз (Fermentas, Литва) в соответствии с рекомендациями производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя, используя обратную транскриптазу RevertAid M-MuLV (Fermentas, Литва). Синтез кДНК проводили в присутствии 01igo(dT)12.is праймеров (ДНК-синтез, Россия) для последующего определения уровня транскриптов генов ядерного кодирования. Для анализа уровня транскриптов генов хлоропластного кодирования синтезировали суммарную кДНК с использованием 01igo(dT)12.i8 и случайных праймеров (randomö) (ДНК-синтез, Россия).

ПЦР в режиме реального времени. Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени осуществляли с помощью амплификатора с оптическим модулем ABI 7500 Fast (Applied Biosystems, США). Реакцию проводили в объеме 25 мкл, содержащем 5х готовую реакционную смесь qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген», Россия), по 0,5 мкМ каждого праймера и 5 мкл кДНК (100 нг для анализа ядерных генов, 50 нг для анализа хлоропластных генов) в следующем режиме: начальная денатурация в течение 5 мин при 94°С; амплификационный цикл (40 повторов): денатурация в течение 15 с при 94°С; отжиг праймеров в течение 15 с при 58°С, элонгация в течение 25 с при 72° С; достраивание цепей ДНК в течение 3 мин при 72° С. По окончании амплификации для подтверждения наличия ПЦР-продукта и специфичности отжига праймеров проводили процедуру плавления.

Для определения исходного количественного содержания транскриптов использовали калибровочные кривые, построенные как для целевого, так и для референсного генов с помощью специализированного программного обеспечения Applied Biosystems SDS v2.0.6 (Applied Biosystems, США). Оценку уровня

транскриптов целевых генов проводили относительно референсного гена UBQI0. Праймеры для последовательностей целевых генов подбирали с использованием пакета программ Vector NTI 9 и синтезировали в НПФ «Литех» (Россия).

Выделение хлоропластов и проведение run-on транскрипции.

Анализ интенсивности транскрипции хлоропластных генов проводили на розеточных листьях 3-недельных растений дикого типа и ahk мутантов. Выделение хлоропластов и проведение run-on транскрипции осуществляли по методу, описанному ранее (Зубо и Кузнецов, 2008). 32Р - меченая РНК, синтезированная в ходе реакции транскрипции, была экстрагирована из реакционной смеси и использована для гибридизации с фрагментами ДНК, нанесенными на нейлоновую мембрану. После гибридизации нейлоновую мембрану экспонировали в кассете с радиочувствительным экраном, после чего экран сканировали на приборе фосфоимиджер Typhoon Trio (GE Healthcare, США). Обработку данных проводили с помощью программ Quantity One и Excel. Двукратные различия в интенсивности транскрипции в эксперименте рассматривались как достоверно значимые.

Определение содержания фотосинтетических пигментов проводили по методу Lichtenthaler (Lichtenthaler, 1987).

Статистическая обработка данных. Все эксперименты проводили в трех аналитических и трех биологических повторностях. На рисунках и таблицах приведены среднеарифметические значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние мутации ahk на уровень транскриптов хлоропластных генов в ходе

онтогенеза A. thaliana

Для того чтобы лучше понять роль индивидуальных рецепторов ЦК в регуляции экспрессии хлоропластных генов, анализировали содержание транскриптов генов хлоропластного кодирования у нокаут-мутантов ahk и растений дикого типа A. thaliana на трех возрастных стадиях (7-дневные проростки, 3- и 7-недельные растения) при помощи количественного ПЦР после обратной транскрипции.

Для анализа были выбраны 12 хлоропластных генов, кодирующих субъединицы белковых комплексов, необходимых для осуществления процесса фотосинтеза {psaA, psaB, psbA, psbD, atpB, rbcL и petD) и гены «домашнего хозяйства», кодирующие белки или молекулы РНК, участвующие в поддержании функционального состояния хлоропластов (rpoB, rrnló, trnE, rps¡4, rplló), например, процессов транскрипции и трансляции. Выбранные гены принадлежат к разным оперонам, транскрибируются разными РНК-полимеразами, а кодируемые ими белки входят в состав различных функциональных комплексов. Результаты по исследованию экспрессии генов rpl¡6 и petD приведены в диссертационной работе.

1.1. Влияние мутаций по генам рецепторов ЦК на уровень транскриптов хлоропластных генов в 7-дневных проростках A.thaliana

С целью выяснения роли рецепторов ЦК в регуляции уровня транскриптов хлоропластных генов на ранней стадии развития растений Arabidopsis использовали 7-дневные проростки дикого типа, а также одинарные и двойные мутанты по рецепторам ЦК.

Количественный ПЦР-анализ показал, что на стадии проростка рецепторы ЦК оказывают дифференциальное влияние на экспрессию пластидных генов. Однако одинарные мутанты незначительно отличались по уровню транскриптов от дикого типа, за исключением мутантов аИкЗ и аИк4, которые отличались повышенным уровнем транскриптов ¡гпЕ и ШрВ, а также гроВ, ¡гпЕ и гЬсЬ, соответственно.

Одновременная инактивация двух генов рецепторов АНК2 и АНКЗ у мутанта аИк2аЬкЗ, обладающего единственным геном рецептора АНК4, привела к 2-кратному снижению содержания мРНК большинства фотосинтетических генов (рзаА, р^оВ, рвЬА, рхЬО, МрВ и гЬсЬ) (рис. 1) и уменьшению содержания суммарного хлорофилла по сравнению с диким типом (данные не представлены).

ШгроВ Оггп16 ПГгпЕ Ягрз14 ПрзаА ПрзаВ □ ряЬА □ рзЪО \3atpB игЪсЬ

ДТ аИк2 аИкЗ аИк4 аИк2 аИкЗ аИк2 аИк4 аЬкЗ аИк4

Рис. 1. Влияние мутаций аИк на уровень транскриптов хлоропластных генов в 7-дневных проростках А. ШаНапа

Двойной мутант аИк2аИк4, содержащий функционально активный белок-рецептор АНКЗ, характеризовался отсутствием изменений в уровне транскриптов большинства хлоропластных генов (рис. 1) и сходным с диким типом содержанием суммарного хлорофилла (данные не приводятся).

Полученные результаты свидетельствуют о функциональном перекрывании рецепторов ЦК в регуляции экспрессии генов «домашнего хозяйства» гроВ, ггп16 и /гпЕ на стадии проростка АгаЫс1орз15. Кроме того, они демонстрируют зависимость экспрессии генов фотосинтетических белков от рецепторов АНКЗ и АНК2 на ранней стадии развития растения.

1.2. Влияние мутаций по генам рецепторов ЦК на уровень транскриптов хлоропластных генов в розеточных листьях 3-недельных растений А. ¡ИаИапа

Для того чтобы исследовать роль рецепторов ЦК в регуляции экспрессии хлоропластных генов в листьях молодых растений, содержащих фотосинтетически-активные хлоропласты, использовали 3-недельные растения аИк мутантов и дикого типа АгаЫс1ор$'и. Количественный ПЦР-анализ уровня хлоропластных транскриптов в 5-м и 6-м листьях 3-недельных растений не выявил значительного влияния одинарных мутаций на содержание целевых хлоропластных РНК. Тем не менее, выключение индивидуальных рецепторов АНК2 и АНК4 (аИк2 и акк4 мутанты) приводило к

повышению содержания транскриптов ряда генов пластидного кодирования, в том числе гроВ, ггп16, МрВ и гЬск (рис. 2).

При этом функционально-активный рецептор АНК2 был необходим для нормального уровня экспрессии генов ряМ и ртбД кодирующих белки 01 и 02 реакционного центра ФСП, поскольку его инактивация приводила к достоверному снижению содержания транскриптов этих генов (рис. 2).

От аИк2 аИкЗ аИк4 аЬк2 аИкЗ аИк2 аИк4 аИкЗ аЬк4

Рис. 2. Влияние мутаций аИк на уровень транскриптов хлоропластных генов в листьях 3-недельных растений А. ¡ИаИапа.

В листьях 3-недельных растений двойного мутанта аИк2аИкЗ, содержащего рецептор АНК4, экспрессия которого преобладает в корнях (МаЪбпеп й а1., 2000; Ь-^исЫ е1 а1„ 2004), происходило снижение уровня транскриптов генов ФСП (рзЬА и ряЬЭ) (рис.2). Аналогичная тенденция к снижению уровня транскриптов гена ряЬА, кодирующего белок 01 реакционного центра ФСП. была выявлена в листьях 4 -недельных растениях мутанта аИк2аИкЗ А. ?ИаИапа (СогНеуеп е1 а1., 2014).

Двойной мутант аИк2 аИк4, с единственным рецептором АНКЗ характеризовался нормальным (гр$14, рзЬА) или достоверно повышенным (гроВ. ггп16, рзаА, ряаВ, рзЬО, ШрВ, гЬсЬ и ¡гпЕ) накоплением большинства исследованных транскриптов (рис. 2). Следовательно, рецептор АНКЗ, экспрессирующийся главным образом в розеточных листьях (Higuchi е1 а1., 2004). самостоятельно способен обеспечить поддержание нормального уровня транскриптов исследованных хлоропластных генов в листьях 3-недельных растений, содержащих зрелые активно фотосинтезирующие хлоропласты.

Снижение содержания транскриптов некоторых фотосинтетических генов в отсутствие рецепторов АНКЗ и АНК2 в листьях, вероятно обусловлено ослаблением трансдукции сигнала эндогенного ЦК в пластиды. На основе полученных результатов можно заключить, что рецептору АНКЗ принадлежит первостепенная, а рецептору АНК2 вспомогательная роль в контроле экспрессии пластидных генов в розеточных листьях 3-недельных растений Л. /ИаИапа.

1.3. Влияние мутаций по генам рецепторов ЦК на уровень транскриптов хлоропластных генов в розеточных листьях 7-недельных растений А. ИгаНапа

Для того чтобы выяснить участие рецепторных гистидинкиназ в контроле экспрессии хлоропластных генов в процессе старения листьев, анализировали уровень транскриптов в 5 и 6 листьях стареющих 7-недельных растений.

Стареющие листья 7-недельных мутантных линий аИк2, аИк2аИкЗ и акк2аИк4 характеризовались достоверно более высоким уровнем транскриптов большинства хлоропластных генов по сравнению с диким типом. Наиболее значимым повышением содержания транскриптов отличался одинарный мутант аИк2, который обнаружил более чем 2-кратное повышение экспрессии 7 генов (гроВ, гряЫ, рзаА, рваВ, рзЬО, а!рВ и гЬсЬ) (рис. 3).

аЬкЗ

аЬк4 аИк2 аИкЗ аЬк2 аИк4 а/1кЗ аИк4

ДТ аНк2

Рис. 3. Влияние мутаций аИк на уровень транскриптов хлоропластных генов в листьях 7-недельных растений А. ЛаНапа

Одинарный мутант аИкЗ, несмотря на достоверное повышение экспрессии гена в сравнении с Со1-0 (рис. 4). не отличался по содержанию транскриптов хлоропластных генов (гт!6, и-пЕ, рзЬА и р^ЬЛ), а также содержал повышенный уровень транскриптов генов гроВ, р$аА, ряаВ, МрВ (рис. 3). Содержание большинства хлоропластных мРНК в старых листьях мутанта аИкЗаИк4, имеющего высокий уровень транскриптов гена старения 5'ag^2 (рис. 4). незначительно отличалось от растений дикого типа (рис. 3).

Повышенный уровень транскриптов большинства хлоропластных генов у мутантов по гену АНК2, возможно, обусловлен задержкой старения этих линий, что подтверждается подавленной у этих линий экспрессией гена маркера старения Sagl2 (рис. 4) и сниженной скоростью разрушения хлорофилла (рис. 5).

ДТ аИк2 аИкЗ аИк4 аИк2 аИк2 аНкЗ аИкЗ аИк4 аИк4

Рис. 4. Экспрессия гена Sagl2 в листьях 7-недельных растений аИк мутантов и дикого типа А. ЛаИапа.

ДТ аИк2 аИкЗ аЬк4 аИк2 аИк2 аИкЗ иНкЗаНк4аИк4

Рис. 5. Содержание хлорофилла в листьях 3 и 7-недельных растений аИк мутантов и дикого типа А. ЛаИапа.

Таким образом, подавленная экспрессия гена маркера старения (Scigl2), повышенный уровень хлорофилла, а также повышенное содержание транскриптов хлоропластных генов в листьях 7-недельных мутантов cihk2, ahk2ahk3, ahk2ahk4 по сравнению с диким типом демонстрируют негативную роль белка-рецептора АНК2 в задержке старения розеточных листьев Arabidopsis. Однако механизм старения листьев с участием рецептора АНК2 остается мало исследованным.

1.4. Роль рецепторов цитокинина в регуляции интенсивности транскрипции

хлоропластных генов

Уровень хлоропластных транскриптов в любой момент времени зависит от соотношения интенсивности их синтеза и деградации. С целью изучения регуляторной роли рецепторов ЦК в контроле интенсивности транскрипции генов пластома у ahk мутантов A. thaliana использовали метод run-on транскрипции. Сравнение интенсивности транскрипции хлоропластных генов в листьях 3-недельных растений одинарных ahk мутантов не выявило существенных изменений по сравнению с диким типом. Отсутствие влияния одинарных ahk мутаций на транскрипцию хлоропластных генов, возможно, объясняется функциональной избыточностью рецепторов ЦК, позволяющей двум активным рецепторам компенсировать недостающий. Двойные мутанты ahk2ahk3 и ahk3ahk4 отличались снижением транскрипции фотосинтетических генов psaA, psaB, psbA. psbD, rbcL и atpB по сравнению с диким типом, тогда как ген «домашнего хозяйства» ггп/6 имел нормальную (ahk3ahk4) или повышенную (ahk2ahk3) транскрипционную активность (данные не представлены). При этом двойной мутант ahk2ahk4 с единственным функционально-активным рецептором АНКЗ не отличался по интенсивности транскрипции изученных генов от дикого типа. Следовательно, рецептор АНКЗ играет первостепенную роль в регуляции экспрессии хлоропластных генов на уровне транскрипции. Полученные данные по интенсивности транскрипции ряда хлоропластных генов в листьях 3-недельных растений ahk мутантов коррелируют с данными по уровню мРНК хлоропластных

генов, полученными нами с помощью ОТ ПЦР PB (п. 1.2). Следовательно, накопление транскриптов ряда пластидных генов в значительной мере определяется интенсивностью их транскрипции.

2. Влияние экзогенного цитокинина на уровень транскриптов хлоропластных генов у мутантов ahk A. thaliana в ходе онтогенеза

Одним из наиболее ярких проявлений физиологической активности цитокининов является их способность активировать биогенез хлоропластов. что согласуется с активацией ЦК экспрессии пластидных генов как на уровне содержания транскриптов (Sever and Lescure, 1984; Brenner et al., 2005), так и на уровне интенсивности транскрипции (Zubo et al., 2008).

С целью изучения участия рецепторов ЦК in planta в цитокинин-зависимой регуляции уровня транскриптов хлоропластных генов одинарные и двойные ahk мутанты A. thaliana обрабатывали экзогенным цитокинином (tZ, 5 мкМ) на трех возрастных стадиях: 7-дневные проростки, 3- и 7-недельные растения.

2.1. Регуляция экзогенным цитокинином экспрессии хлоропластных генов в 7-дневных проростках мутантов ahk A.thaliana

Для выяснения роли рецепторов ЦК в регуляции экзогенным цитокинином уровня транскриптов хлоропластных генов на ранней стадии развития, 7-дневные проростки Arabidopsis в течение 3 часов инкубировали на среде выращивания (МС/2) с добавлением транс-зеатина (tZ, 5 мкМ). Предварительный анализ ЦК-опосредованного накопления матриц гена первичного ответа на ЦК - ARR5 у дикого типа показал значительную активацию (-22 раза), на фоне значимо сниженной экспрессии у всех ahk мутантов, особенно у растений с выключенными генами рецепторов АНК2 и АНКЗ.

Обработка 7-дневных проростков дикого типа тронозеатином (5 мкМ) приводила к существенному (от 2 до 5 раз) повышению уровня транскриптов как генов фотосинтеза (psaA, psaB, psbD, atpB и rbcL), так и генов «домашнего хозяйства» (rrnlô, trnE и rpsl4) на фоне снижения уровня мРНК гена psbA (рис. 6). Содержание транскриптов гена гроВ, кодирующего /?-субъединицу PEP (РНК-полимераза пластидного кодирования), на стадии проростка не регулировалось ЦК (рис. 6).

Двойной мутант ahk2ahk3 (активный рецептор АНК4) характеризовался отсутствием активации цитокинином экспрессии генов обеих фотосистем (psaA, psaB и psbD), а также гена rbcL в сравнении с диким типом (рис. 6). При этом у него происходило накопление транскриптов генов «домашнего хозяйства» (rrnlô, rpsl4 и trnE) и atpB, однако, менее выраженное в сравнении с диким типом (рис. 6). Это может свидетельствовать о способности рецептора АНК4 избирательно регулировать экспрессию генов пластома разных функциональных групп.

аЬк2 аИкЗ аИк4 аИк2 аЬкЗ аНк2 аЪк4 аИкЗ аИк4

Рис. 6. Влияние транс-зеатина (5 мкМ, 3 часа) на уровень транскриптов хлоропластных генов в 7-дневных проростках дикого типа и аИк мутантов А. ¡ИаИапа. На рисунке представлено отношение уровня транскриптов растений, обработанных транс-зеатином, к уровню транскриптов контрольных растений соответствующего генотипа.

Проростки двойных мутантов аИк2аИк4 и аИкЗаИк4, экспрессирующие один рецептор ЦК - АНКЗ и АНК2 соответственно, обнаружили более выраженную реакцию на ЦК в сравнении с мутантом аИк2аИкЗ и были способны после обработки гормоном активировать накопление транскриптов как генов фотосистем I и II, так и генов «домашнего хозяйства» (рис. 6).

Таким образом, результаты исследования показывают, что на стадии проростка, несмотря на частичное перекрывание функций мембранных рецепторов в регуляции экспрессии пластидных генов, рецепторам АНКЗ и АНК2 принадлежит первостепенная роль в реализации эффекта экзогенного цитокинина в хлоропластах на уровне регуляции содержания транскриптов.

2.2. Регуляция экзогенным цитокинином экспрессии хлоропластных генов в листьях 3-недельных мутантов аИк растения АлИаИапа

Для того чтобы выявить регуляторную роль рецепторов в ЦК-зависимом изменении содержания транскриптов хлоропластных генов в розеточных листьях молодых 3-недельных растений АгаЫс^оря/я растения опрыскивали транс-зеатином (5 мкМ) и через 3 часа определяли уровень транскриптов пластидных генов методом ОТ ПЦР РВ. На данной стадии развития ЦК-опосредованный уровень мРНК гена АЯЯ5 в молодых розеточных листьях мутантов аИкЗ, аЬк2аИкЗ и аккЗаИк4 был значительно снижен по сравнению с диким типом, который, в свою очередь, характеризовался умеренным ответом (~2,5 раза).

По сравнению с 7-дневными проростками экспрессия пластидных генов в молодых листьях под действием экзогенного ЦК (И, 5мкМ) через 3 часа изменялась незначительно (от 1,5 до 2 раз).

Результаты анализа влияния экзогенного цитокинина на уровень транскриптов хлоропластных генов у одинарных мутантов показывают, что на этом этапе биогенеза

хлоропластов функции мембранных рецепторов в контроле ЦК-зависимой экспрессии большинства исследованных пластидных генов перекрываются. Однако у мутанта аИк2 под влиянием транс-зеатина наблюдался повышенный по сравнению с ДТ уровень транскриптов генов ФСП - ряЬА и ряЬО (рис. 7). Мутант аИкЗ в ответ на ЦК накапливал меньше транскриптов генов ГгпЕ, гр$!4, рзаВ и рзЬА по сравнению с диким типом (рис. 7).

Двойной мутант аИк2 аИкЗ практически не отвечал на обработку экзогенным цитокинином в 3-недельных растениях (исключение ггп16 и /гпЕ) в отличие от мутантов аИк2 аЬк4 и аИкЗаИк4, которые, напротив, накапливали существенное количество транскриптов ряда исследуемых генов - гроВ, ггп16, МрВ и гЬсЬ (рис. 7).

ДТ аИк2 аккЗ аИк4 аИк2 аИкЗ аИк2 аИк4 аИкЗ аИк4

Рис. 7. Влияние /пронс-зеатина (5 мкМ, 3 часа) на уровень транскриптов хлоропластных генов в листьях 3-недельных растений дикого типа и мутантов акк А. ¡ИаИапа. На рисунке представлено отношение уровня транскриптов растений, обработанных транс-зеатином, к уровню транскриптов контрольных растений соответствующего генотипа.

Следовательно, функционально активные рецепторы АНКЗ и АНК2 способны самостоятельно обеспечивать активацию накопления транскриптов части хлоропластных генов «домашнего хозяйства» и фотосинтеза при участии экзогенного ЦК. Однако индивидуальные рецепторы ЦК у всех двойных мутантов не могли обеспечить накопление транскриптов генов ФС1 (рзаА ирзаВ) и ФСН (рзЬА ирзЬП) на данной стадии развития растений.

Таким образом, в ответ на обработку экзогенным цитокинином листьев 3-недельных растений происходила дифференциальная регуляция экспрессии генов в хлоропластах при участии рецепторов ЦК. Однако, несмотря на перекрывание функций всех рецепторов, наиболее активное участие в этом процессе принимает рецептор АНКЗ. что согласуется с его доминирующей ролью в восприятии ЦК сигнала в листьях растений (ШеЯег й а1„ 2006; Романов, 2009).

2.3. Регуляция экзогенным цитокинином экспрессии хлоропластных генов в листьях 7-недельных мутантов акк растения АЛкаИапа

Для того, чтобы выяснить участие рецепторов ЦК в цитокинин-зависимой регуляции уровня хлоропластных транскриптов в стареющих листьях. 7-недельные растения АгаЫс1орз1$ опрыскивали транс-зеатином (5 мкМ) и через 3 часа определяли уровень транскриптов пластидных генов методом ОТ ПЦР РВ. Анализ ЦК-индуцированного накопления транскриптов гена ЛЕЯ5 показал значительный активирующий эффект гормона в стареющих листьях дикого типа (-25 раз), в отличие от мутантов аИкЗ, аИк2аИкЗ и аИкЗаИк4, у которых достоверный стимулирующий эффект гормона отсутствовал.

Стареющие листья 7-недельных растений дикого типа, характеризующиеся наличием всех трех функционально-активных белков-рецепторов, под влиянием экзогенного цитокинина накапливали наибольшее, по сравнению с аИк мутантами, количество транскриптов всех исследованных хлоропластных генов. При этом степень активации варьировала в интервале от 1,7 до 5 (рис. 8).

аМ2 аШ аИк2 аЬк4 аккЗ аИк4

ДТ аЪк2 аНкЗ аИк4

Рис. 8. Влияние транс-зеатина (5 мкМ, 3 часа) на уровень транскриптов хлоропластных генов в листьях 7-недельных растений дикого типа и мутантов аИк А. ¡ИаИапа. На рисунке представлено отношение уровня транскриптов растений, обработанных /яранс-зеатином, к уровню транскриптов контрольных растений соответствующего генотипа.

В листьях дикого типа максимальный активирующий эффект цитокинина (свыше трех раз) был характерен для транскриптов генов гроВ, ггп16, ряаА, а1рВ и гЬсЬ, минимальный - для ¡гпЕ (-1.7). Одинарные мутации аИк2 и аИкЗ снижали активирующий эффект ЦК на уровень хлоропластных транскриптов в листьях 7-недельных растений. При этом ЦК-опосредованное изменение уровня транскриптов в стареющих листьях у мутанта аИк4 с функционально-активными рецепторами АНКЗ и АНК2 было сходным с диким типом (рис. 8).

Двойные мутанты аИк2аИкЗ, аИк2аИк4 и аИкЗаИк4, содержащие единственные функционально-активные рецепторы АНК4, АНКЗ. АНК2 соответственно, характеризовались сниженной способностью к активации накопления мРНК генов ФС1 (рхаА и р$аВ) и ФСП (р$ЬА и ряЬО), а также гроВ и аГрВ в ответ на ЦК. Из этого

может следовать, что функциональной активности одного, любого из рецепторов ЦК, недостаточно для активной экспрессии пластидных генов. Вместе с тем, у мутантов ahk2ahk3 и ahk3ahk4 сохранялась способность к активации гена rbcL, а у ahk3ahk4 и ahk2ahk4 гена гт16 (рис. 8).

Таким образом, дифференциальная активация накопления транскриптов в хлоропластах при участии цитокинина позволяет сделать вывод об индивидуальной реакции различных пластидных генов на действие гормона. При этом особенности ответа различных мутантов позволяют заключить, что наряду с перекрыванием функций для рецепторов ЦК характерна определенная специфичность в проведении сигнала ЦК в хлоропласты стареющих листьев.

3. Влияние рецепторов цитокинина на экспрессию ядерных генов аппарата

транскрипции пластома

Одним из возможных путей реализации цитокининового сигнала в хлоропластах при участии рецепторов ЦК может быть его влияние на экспрессию ядерных генов, кодирующих компоненты аппарата транскрипции хлоропластного генома. Транскрипция пластома у высших растений осуществляется двумя типами РНК-полимераз - NEP и РЕР (от англ. Nuclear и Plastid Encoded Polymerase соответственно). РЕР для узнавания и связывания промоторных областей нуждается в одном из шести транс-факторов сигма (ст-факторов, семейства Sig). Учитывая, что в предыдущих экспериментах была выявлена дифференциальная регуляторная роль рецепторов ЦК в контроле транскрипции пластома и накоплении транскриптов в хлоропластах в ходе онтогенеза, на следующем этапе анализировали роль рецепторов в ЦК-зависимой экспрессии ядерных генов, продукты которых участвуют в транскрипции хлоропластных генов. Для анализа были выбраны два гена РНК-полимераз из семейства RpoT - RpoTp и RpoTmp, функционирующие только в пластидах или одновременно в пластидах и митохондриях соответственно. В ходе онтогенеза растений дикого типа и мутантов ahk А. thaliana также исследовали ЦК — индуцированную экспрессию генов сигма-факторов.

3.1. Регуляция цитокинином экспрессии генов ЯроТр и ЯроТтр у мутантов аИк АЛкаНапа в ходе онтогенеза

и контроль

Т 0 3 часа

ДТ сМ2 аИкЗ аИк4 аШ аИк2 аИкЗ аИкЗ аЬк4 аИк4

шконтроль

т 13/2, 3 часа

14_[ I и

пгп 1 1 Тт

тшшшшт

■ пик III;

ДТ аИк2 аИкЗ аИк4 аИк2 аИк2 аНкЗ аИкЗ аИк4 аНк4

■ контроль

□/7, 3 «

А

.о. О

РГГГГГГ

ДТ

аИк2 аИкЗ аИк4 аИк2 аИк2 аИкЗ аИкЗ аИк4 аИк4 Рис. 9. - Влияние транс-зегпнна (5 мкМ, 3 часа) на уровень транскриптов гена ЯроТр в проростках (А), листьях 3-недельных (Б) и 7 - недельных (В) растений дикого типа и мутантов аИк А. ЖаНапа.

До настоящего времени не было изучено влияние цитокинина на экспрессию генов семейства ЯроТ в ходе онтогенеза, а также не известно участие отдельных рецепторов ЦК в регуляции уровня матриц этих генов. В связи с этим мы исследовали действие экзогенного ЦК на экспрессию генов ЯроТр и ЯроТтр на разных стадиях онтогенеза дикого типа и мутантных растений (аМ) А. ЛаНапа.

Количественный ПЦР-анализ

выявил значительный активирующий эффект экзогенного цитокинина на экспрессию гена ЯроТр в проростках и стареющих листьях дикого типа, имеющего три активных рецептора ЦК (рис. 9). Исследование ЦК-зависимого уровня мРНК гена ЯроТр у аИк мутантов позволило выявить первостепенную регуляторную роль рецептора АНКЗ и вспомогательную рецептора АНК2 на всех изученных возрастных стадиях растения АлИаИапа (рис. 9).

Изучение ЦК-зависимой

экспрессии гена ЯроТтр позволило сделать аналогичное заключение, хотя эффект ЦК на экспрессию этого гена был несколько ниже, чем на ЯроТр (данные не приводятся).

Таким образом, реализация сигнала ЦК в пластидах на разных стадиях развития растений, частично может быть опосредована гормон-зависимым

изменением экспрессии пластидных РНК-полимераз ядерного кодирования.

3.2. Роль рецепторов ЦК в регуляции экспрессии генов сигма-факторов в ходе

онтогенеза A. thaliana

Участие рецепторов ЦК в регуляции уровня транскриптов и интенсивности транскрипции хлоропластных генов, транскрибируемых PEP, у мутантов ahk может заключаться в способности индивидуальных рецепторов ЦК регулировать экспрессию генов сигма-факторов (Sigl-Sig6).

Анализ влияния цитокинина (tZ, 3 часа) на содержание транскриптов всех шести сигма-факторов на стадии 3-недельных растений дикого типа и ahk мутантов A. thaliana показал повышение экспрессии всех генов, за исключением Sig5, однако уровень их активации, как правило, не превышал двукратный.

Для двух генов Sig5 и Sig6 изучали изменение ЦК-зависимой экспрессии на стадии проростка и в стареющих листьях. Первый из них SV'gJ - индуцибельный ген, активируемый светом и стрессовыми факторами. Экспрессия Sig6 особенно важна на начальных стадиях биогенеза хлоропластов, где он регулирует транскрипцию целого ряда пластидных генов, включая atpB, atpE, rbcL, psbA, psbD и все рибосомные РНК (Ishizaki et al., 2005).

Анализ экспрессии гена Sig5 у 7-дневных проростков продемонстрировал значимое подавление экспрессии этого гена под действием ЦК (рис. 1 OA). Однако на стадии 7 недель экзогенный гормон практически не оказывал влияния на содержание транскриптов Sig5 (рис. 1 ОБ).

ahk3 ahk4 ahk4 ahki ahk4 ahk4

Рис. 10. Влияние транс-зеатина (5мкМ, 3 часа) на уровень транскриптов гена в 7 - дневных проростках (А) и листьях 7-недельных растений (Б) дикого типа и аМ мутантов А. ¡1гаИапа

Экспрессия гена Sig6 значительно индуцировалась экзогенным гормоном в 7-дневных проростках (до 6 раз у мутанта оМ2) (рис. 11А). При этом двойной мутант аЬк2аИкЗ отличался от дикого типа значимым снижением исходного уровня мРНК гена S¡g6 (рис. ПА), а мутант аИк2аЬк4, содержащий функционально-активный рецептор АНКЗ, напротив, имел достоверно повышенный исходный уровень мРНК гена $¡§6 (рис. 11 А).

А 9

И контроль

В ¡2, 3 часа

I ■ ■ ■ га ■

дт

аИк2 аИкЗ аИк4 аИк2 аИк2 аИкЗ аИкЗ аИк4 аИк4

аИк2 аИкЗ аИк4 аИк2 аИк2 аЬкЗ аИкЗ аЪк4 аИк4

Рис. 11. Влияние транс-зеатина (5мкМ, 3 часа) на уровень транскриптов гена в 7 - дневных проростках (А) и листьях 7-недельных растений (Б) дикого типа и аИк мутантов А. /каИапа

Повышенный исходный уровень транскриптов гена 8^6 наблюдался также у мутантов с инактивированным геном аИк2 на стадии 7 недель (рис. 11Б). Однако рост ЦК-индуцированного накопления матриц у этих мутантов, а также мутанта аИкЗ, оказался в значительной мере снижен по сравнению с диким типом и мутантом акк4, которые обнаружили на этой стадии онтогенеза более чем 7-кратную активацию экспрессии гена Sig6 (рис. 11Б).

Таким образом, полученные в работе результаты свидетельствуют о многообразном влиянии цитокининов при участии мембранных рецепторов ЦК на экспрессию генов сигма-факторов ядерного кодирования на протяжении различных этапов онтогенеза растения АлкаЧапа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе с использованием одинарных и двойных инсерционных нокаут-мутантов растения А. ЛаНапа с инактивированными генами рецепторов цитокининов показана зависимость уровня транскриптов хлоропластных генов от функционирования рецепторов ЦК в ходе онтогенеза. На стадии проростка и молодых активно фотосинтезирующих растений первостепенное значение в контроле уровня хлоропластных транскриптов принадлежало рецепторам АНКЗ и АНК2. В процессе старения листьев ключевая роль в цитокинин-опосредованном контроле уровня хлоропластных транскриптов переходит к рецептору АНК2.

Показано, что чувствительность растений к действию экзогенного цитокинина. о которой судили по индуцибельной экспрессии гена первичного ответа на цитокинин АЯЯ5, изменялась в ходе онтогенеза растений.

Наибольший активирующий эффект цитокинина на содержание транскриптов в хлоропластах наблюдался в проростках и стареющих листьях. В ходе онтогенеза растения содержание транскриптов функционально различных хлоропластных генов в разной степени активировалось или подавлялось экзогенным цитокинином, что

свидетельствует об индивидуальной реакции различных пластидных генов на действие гормона.

Инактивация рецепторов ЦК вызывала изменения в содержании транскриптов хлоропластных генов в ответ на действие экзогенного гормона. Особенности ответа различных мутантов на разных стадиях онтогенеза позволяют заключить, что наряду с перекрыванием функций для рецепторов ЦК характерна определенная специфичность в проведении сигнала ЦК в хлоропласты. При этом сниженное накопление транскриптов в хлоропластах двойных ahk мутантов при действии гормона свидетельствует о ведущей роли рецептора АНКЗ в позитивной цитокинин-зависимой регуляции содержания транскриптов хлоропластных генов.

Показано участие рецепторов ЦК в регуляции интенсивности транскрипции генов пластома. Стабильную транскрипционную активность хлоропластных генов в листьях 3-недельных растений A.thaliana обеспечивает присутствие рецептора АНКЗ, тогда как АНК2 и АНК4 выполняют вспомогательную функцию.

В работе впервые показана первостепенная роль рецептора АНКЗ в активации экзогенным цитокинином экспрессии генов РНК-полимераз ядерного кодирования (ЯроТр и RpoTmp) на всех изученных стадиях онтогенеза растения A.thaliana.

Впервые показано участие рецепторов ЦК в дифференциальной регуляции уровня транскриптов компонентов аппарата транскрипции пластома - хлоропластных транс-факторов (семейства Sig) ядерного кодирования - Sig5 и Sig6 в ходе онтогенеза растения A. thaliana.

На основе полученных результатов и данных литературы (López -Juez and Руке, 2005 и Hwang et al., 2012) можно предложить следующую модель регуляции рецепторами цитокининов экспрессии генов хлоропластных белков ядерного и пластидного кодирования (рис. 12). Мембранные гистидиновые протеинкиназы (АНК2, АНКЗ, AHK4/CRE1) воспринимают цитокининовый сигнал и передают его через фосфатный каскад при участии белков АНР в ядро на ЦК-специфичные трансфакторы ARR типа В, которые в свою очередь активируют транскрипцию ЦК-регулируемых генов в ядре. Белки CRF, активируемые ЦК при участии АНР, накапливаются в ядре и активируют транскрипцию ЦК-зависимых ядерных генов. При участии этой сигнальной системы происходит дифференциальная регуляция содержания транскриптов ядерных генов РНК-полимераз (ЯроТр и RpoTmp) и мРНК транс-факторов семейства Sig, продукты которых в свою очередь регулируют экспрессию хлоропластных генов.

Цитокинины о

^ \

CRE1/AHK4 АНК2 АНКЗ

V

4 ^

CRE1/AHK4 Ai АНК2 ¿I АНКЗ

^AHPl-5 • СЯПС

Ядро

i—Трамосиоцив

цк-pefywpyw«" генов

^ y\\\\\\\\\\

Цитоплазма

Хлоропласт

' Г",voB ЛАЛА-V

I

РЕР-здвчсимы» te«oe

Рис. 12. Предполагаемая схема регуляции рецепторами цитокининов экспрессии генов хлоропластных белков ядерного и хлоропластного кодирования. CRE1/AHK4, АНК2, АНКЗ - мембранные рецепторы цитокинина, гистидиновые протеинкиназы; АНР - белки переносчики фосфата с киназ на регуляторы ответа; CRF

- транс-факторы ответа на цитокинин; ARR-A и ARR-B белки регуляторы ответа; NEP

- РНК-полимераза ядерного кодирования; PEP - РНК-полимераза пластидного кодирования; Sig - транс-факторы PEP. (Модифицировано по López -Juez and Руке, 2005 и Hwang et al., 2012).

ВЫВОДЫ

1. Использование одинарных и двойных мутантов A. thaliana с инактивированными генами мембранных рецепторов ЦК впервые позволило установить, что уровень транскриптов преимущественно фотосинтетических хлоропластных генов, зависит от активности рецепторов АНКЗ и АНК2 на протяжении всего онтогенеза растения, в то время как роль рецептора АНК4 в этом процессе второстепенна.

2. Экзогенный цитокинин вызывает дифференциальную регуляцию содержания транскриптов хлоропластных генов в листьях дикого типа и мутантов ahk в зависимости от возраста растений A. thaliana. Наибольший активирующий эффект цитокинина на содержание матриц в хлоропластах наблюдали на стадии проростка и в стареющих листьях.

3. Интенсивность транскрипции большинства изученных хлоропластных генов в молодых розеточных листьях A. thaliana определялась функциональной активностью рецептора АНКЗ, тогда как АНК2 и АНК4 играли меньшую роль.

4. Выявлено участие рецепторов ЦК в цитокинин-зависимой активации генов хлоропластных РНК полимераз ядерного кодирования - RpoTp и RpoTmp. Показана дифференциальная регуляция содержания транскриптов ядерных генов хлоропластных транс-факторов семейства Sig. Регуляция ЦК экспрессии ядерных генов, кодирующих важнейшие компоненты транскрипционной системы хлоропластов, представляется одним из возможных путей участия ЦК в регуляции биогенеза хлоропластов.

5. Показана негативная роль белка-рецептора АНК2 в задержке старения розеточных листьев A. thaliana.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК МОИ РФ

1. Данилова М.Н., Кудрякова Н.В., Р. Оельмюллер., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. (2012) Участие мембранных рецепторов цитокинина в регуляции транскрипции хлоропластных генов. Вестник РУДН, Серия: агрономия и животноводство, 4, 23-33.

2. Данилова М.Н., Кудрякова Н.В., Зубкова Н.К., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. (2012) Цитокинин вызывает дифференциальную регуляцию экспрессии конструкций Рднк-GUS в трансгенных растениях Arabidopsis thaliana. Физиология растений, 59(1), 323-331.

3. Kudryakova N.V., Efimova M.V., Danilova M.N., Zubkova N.K., Khripach V.A., Kusnetsov V.V., Kulaeva O.N. (2013) Exogenous brassinosteroids activate cytokinin signalling pathway gene expression in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Growth Regul, 70, 61-69.

4. Данилова M.H., Кудрякова H.B., Воронин П. Ю., Оельмюллер Р., Кузнецов В. В., Кулаева О. Н. (2014) Мембранные рецепторы цитокинина и их регуляторная роль в реакции растений Arabidopsis thaliana на фотоокислительный стресс в условиях водного дефицита. Физиология растений, 61(4), 466-475.

Публикации в сборниках и материалах конференций

1. Данилова М.Н. Кудрякова Н.В. Кузнецов В.В. Кулаева О.Н. (2010) Генно-модифицированные растения Arabidopsis thaliana как инструмент исследования цитокинин-регулируемой экспрессии генов гистидиновых киназ. III Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва), с.38.

2. Данилова М.Н., Кудрякова Н.В., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. (2011) Выяснение влияния инактивации генов рецепторов цитокинина на транскрипцию хлоропластного генома A. thaliana. VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений-фундаментсшьная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международная научная школа Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции (Нижний Новгород), с. 205

3. Данилова М.Н. Влияние мутации по генам рецепторов цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов A. thaliana. «Ломоносов-2011». Тезисы

докладов: XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых (Москва), с. 222.

4. Данилова М.Н., Кудрякова Н.В. (2011) Выяснение роли мембранных рецепторов цитокинина в регуляции транскрипции хлоропластных генов. «Биология наука XXI века». Сборник тезисов: 15 Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пушино), с. 423.

5. Данилова М.Н., Кудрякова Н.В., Кузнецов В.В., Воронин П.Ю. Кулаева О.II. (2012) Влияние мутаций по генам мембранных рецепторов цитокинина на темновой выход флуоресценции ФС1 И ФСП у растений А. thaüana. IV Всероссийский симпозиум «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность» и Годичное собрание ОФР (Москва), с. 35.

6. Danilova M.N., Kudryakova N.V., Oelmüller R„ Kusnetsov V.V., Kulaeva O.N. (2012) Elucidation of the role for cytokinin receptors in transcription of chloroplast genes in Arabidopsis thaliana. «18th Plant Biology Congress» (Freiburg, Germany), p. 764.

7. Данилова M.H., Кудрякова H.B., Дорошенко A.C., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. (2014) Рецептору цитокинина АНКЗ принадлежит ведущая роль в контроле экспрессии пластидных генов А. thaüana. Международная научная конференция и школа молодых ученых «Физиология растений - теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологии» и Годичное собрание ОФР (Калининград), с. 52-54.

Подписано в печать 27.04.2015 г. Заказ № 10745 Тираж: 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru