Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе"

На правах рукописи

ДЕМИНА Екатерина Петровна

Экспрессия генов транскрипционных факторов ЬХЯа1рИа, ЬХКЬеШ, PPARgamma и транспортера АВСА1 при атеросклерозе

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 ЯН8 2015

005557335

Санкт-Петербург 2014

005557335

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», г. Гатчина.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Шварцман Александр Львович,

заведующий лабораторией молекулярной генетики

человека ФГБУ «Петербургский институт ядерной

физики им. Б. П. Константинова»

НИЦ «Курчатовский институт», г. Гатчина. ■

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Горбунова Виктория Николаевна,

профессор кафедры медицинской генетики ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава РФ, г. Санкт-Петербург,

доктор медицинских наук Баранова Елена Ивановна, профессор кафедры терапии факультетской с курсом эндокринологии, кардиологии и функциональной диагностики с клиникой ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» МЗ РФ, г. Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение:

Защита состоится

«22»

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии» РАН, г. Санкт-Петербург.

0{ 2015 г. в (О .ч

часов на заседании

диссертационного совета Д 212.232.12 на базе . Санкт-Петербургского государственного университета по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «_»

2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.232.12 доктор биологических наук

£

Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Атеросклероз и его осложнения, такие как ишемическая болезнь сердца, ишемический инсульт и др., являются ведущей причиной смертности взрослого населения во многих странах мира. В связи с этим одними из важнейших проблем, стоящих перед медициной, являются выявление групп повышенного риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и создание на этой основе эффективной системы их профилактики и лечения. В свою очередь, решение этих задач невозможно без глубокого понимания причин и механизмов развития атеросклероза.

В настоящее время атеросклероз рассматривают как многофакторное заболевание, представляющее собой сложный многоэтапный патологический процесс. Болезнь развивается на основе тесного взаимодействия как внешних повреждающих, так и генетических факторов.

На молекулярно-клеточном уровне ключевым компонентом в атерогенезе является накопление нагруженных холестерином (ХС) макрофагов, внутриклеточных липидов, внеклеточного матрикса и снижение уровня антиатерогенных липопротеинов высокой плотности (ЛПВП).

Предполагается, что обратный транспорт ХС (ОТХ) из клеток периферических тканей к печени, в котором ЛПВП играют важную роль, является одним из основных механизмов, обусловливающих антиатерогенные свойства ЛПВП. Нагруженные ХС макрофаги (так называемые пенистые клетки) - клеточные маркеры атеросклеротических повреждений. Транспорт ХС из макрофагов интимы может защищать сердечно-сосудистую систему от дальнейшего развития атеросклероза. Таким образом, активация ОТХ может быть эффективной терапевтической стратегией уменьшения риска развития атеросклероза (Опо, 2012).

Одним из ключевых белков ОТХ является АТФ-связывающий кассетный транспортер A1 (АВСА1), который осуществляет перенос ХС на аполипопротеин AI (апо AI). Нарушения функционирования белка АВСА1 или снижение экспрессии гена АВСА1 приводят к ускоренному темпу атерогенеза и раннему развитию атеросклероза {Oram, Heineckel, 2005). Дефицит АВСА1 в макрофагах сопровождается повышенным уровнем ХС в мембране, увеличением его отложения на артериальной стенке и усилением образования липидных пятен (Choi et al, 2009; Francone et al., 2005; Yvan-Charvet et al., 2008).

В понимании механизмов развития атеросклероза важное значение имеет также семейство ядерных рецепторов, которые регулируют липидный гомеостаз и ОТХ, экспрессию генов аполипопротеина Е (апо Е) и генов-

транспортеров АВСА1 и АТФ-связывающего кассетного транспортера G1 (ABCG1) (Bensinger et al, 2008; Oosterveer et al, 2010). К данному семейству относятся печеночные Х-рецепторы (LXR) - LXRa и LXR|3 и рецептор активации пролиферации пероксисом (PPAR) у, которые играют ключевую роль в регуляции энерго- и липидного обмена (Wahli et al., 2012). Было показано, что данные ядерные рецепторы экспрессируются в макрофагах и в пенистых клетках в местах атеросклеротических поражений (Apostoli et al., 2012, Kiss et al, 2013) и их экспрессия может критически воздействовать на функции макрофагов, включая активацию, продукцию цитокинов и их преобразование в пенистые клетки, что, в свою очередь, влияет на развитие атеросклероза.

В ряде исследований в атеросклеротических бляшках был отмечен повышенный уровень экспрессии гена матричной металлопротеиназы (ММР-9) {Chen et al., 2005) и получены данные о том, что аккумуляция ММР-9 макрофагами приводит к фрагментации атеросклеротического кора и формированию осложненной атеромы (Morishige et al., 2003). В этой связи особый интерес уделяется роли экспрессии гена ММР-9 в макрофагах, что может пролить свет на его влияние на патогенез атеросклероза.

На основе анализа литературных данных было сделано предположение, что варианты гена АВСА1 и уровень его экспрессии, а также уровень экспрессии генов ядерных рецепторов LXRa, LXRfi, PPARy и гена ММР-9 в макрофагах могут быть ассоциированы с развитием атеросклероза. Эта гипотеза послужила основой для проведения настоящего исследования.

Цель и задачи исследования — оценка вклада вариантов гена АВСА1, уровня мРНК генов АВСА1, LXRa, LXR/], PPARy и ММР-9 и уровня белка АВСА1 в развитие атеросклероза. В ходе исследования решались следующие задачи: 1) определить частоту вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins < G, (-17)G>C) в группе пациентов с атеросклерозом и контрольной группе; 2) определить уровень мРНК генов АВСА1, LXRa, LXR/], PPARy и ММР-9 в макрофагах, активированных M-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии; 3) провести сравнительный анализ уровня белка АВСА1 в макрофагах, активированных M-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии; 4) провести анализ корреляции между исследованными уровнями мРНК генов АВСА1, LXRa, LXR(], PPARy, ММР-9, уровнем белка АВСА1; 5) провести анализ ассоциации уровня мРНК генов АВСА1, LXRa, LXRfi, PPARy и ММР-9 и уровня белка АВСА1 с содержанием липидов в плазме крови у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии.

Научная новизна исследования. Дана оценка частоты вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins < G, (~17)G > Q у жителей Санкт-Петербурга, и впервые показано, что вариант G319 гена АВСА1 снижает относительный риск развития атеросклероза. Впервые проведен анализ экспрессии генов АВСА1, LXRa, LXRfi, PPARy, ММР-9 и уровня белка АВСА1 в макрофагах, стимулированных M-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечнососудистой патологии. Выявлено повышение уровня мРНК генов АВСА1 и ММР-9 в макрофагах больных атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Впервые показано снижение уровня мРНК LXRf] и PPARy в макрофагах группы пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Впервые установлено понижение содержания белка АВСА1 в макрофагах у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Впервые продемонстрирована корреляция между уровнем мРНК гена ММР-9 и уровнем белка АВСА1 в макрофагах у пациентов с атеросклерозом.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в понимание молекулярно-генетических основ наследственной предрасположенности к атеросклерозу. Типирование варианта 319ins < G гена АВСА1 может быть использовано для оценки прогноза развития атеросклероза. Выявленные изменения в уровне экспрессии генов АВСА1, LXR/3, PPARy и ММР-9 позволяют приблизиться к пониманию роли уровня экспрессии данных генов в патогенезе атеросклероза. Гены, для. которых были обнаружены преобразования, могут рассматриваться в качестве значимых факторов в развитии атеросклероза. Оценка уровня их экспрессии может представлять интерес для формирования групп риска в профилактике атеросклероза.

Основные положения, выносимые на защиту. Вариант G319 гена АВСА1 снижает риск развития атеросклероза у жителей Санкт-Петербурга. Уровень мРНК генов АВСА1 и ММР-9 в макрофагах, активированных M-CSF, повышен у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Уровень мРНК генов LXRfí и PPARy снижен в макрофагах, активированных M-CSF, у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Содержание белка АВСА1 в макрофагах, активированных M-CSF, ниже у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Существует прямая корреляция между уровнем мРНК гена АВСА1 в макрофагах, активированных M-CSF, и уровнем ХС в составе ЛПВП плазмы крови у лиц контрольной группы. Существует обратная корреляция между уровнем мРНК гена ММР-9 и уровнем белка АВСА1 в макрофагах, активированных M-CSF, у пациентов с атеросклерозом.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Основная часть экспериментальной работы, планирование экспериментов, описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно. Осмотр и ангиографическая диагностика атеросклероза у пациентов, забор у них периферической крови, измерения концентрации липидов плазмы крови осуществлялись сотрудниками ПСПбГМУ им акад. И. П. Павлова П. С. Курьяновым, Н. В. Майоровым и В. В. Давыденко, что нашло отражение в совместных публикациях. Культивирование макрофагов, активированных M-CSF, проведено совместно с сотрудником ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт» В. В. Мирошниковой, что также отражено в совместных публикациях.

Апробация работы. Данные, представленные в диссертации, опубликованы в виде четырех статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Материалы работы также были представлены на международных и российских конференциях: Европейской конференции по генетике человека (Барселона, Испания, 2008), Международной конференции «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), III конгрессе FEBS "ABC Proteins" (Инсбрук, Австрия, 2010), 4-й Международной конференции молодых ученых ИМБ «Молекулярная биология: проблемы и перспективы» (Киев, Украина, 2011), Российском национальном конгрессе кардиологов (Санкт-Петербург, 2013), Европейском конгрессе общества атеросклероза (EAS) (Гамбург, Германия, 2010; Милан, Италия, 2012; Мадрид, Испания, 2014).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 195 источников. Работа изложена на 116 страницах, содержит 22 рисунка и фотографии, 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Характеристика обследованных групп

Для оценки вклада вариантов (-17)G> С (SNP ID rs2740483), 319ins< G (SNP ID rsl799777), R219KL (G655Ä) (SNP ID rs2230806) гешАВСА! в развитие атеросклероза была отобрана группа пациентов, которая состояла из 119 человек (79 % мужчин и 21 % женщин) с атеросклерозом, подтвержденным ангиографическим исследованием (средний возраст - 51,41 ±6,21 года).

Первые клинические проявления атеросклероза у пациентов наблюдались в возрасте 47,87 ± 7,05 года. Локализация пораженных атеросклерозом артерий была обнаружена как минимум в одном из трех артериальных бассейнов (церебральном, коронарном или бассейне артерий нижних конечностей).

Контрольная группа состояла из 300 человек (63 % мужчин и 37 % женщин) без ССЗ в анамнезе и соответствовала группе пациентов по полу и возрасту (средний возраст 45,60 ±6,30 года). Возраст контрольной группы соответствовал возрасту начала заболевания у пациентов.

Для оценки вклада уровня мРНК генов АВСА1, LXRa, LXRfi, PPARy, ММР-9 и уровня белка АВСА1 в развитие атеросклероза была отобрана группа пациентов, которая состояла из 15 мужчин с атеросклерозом, подтвержденным ангиографическим исследованием (средний возраст - 53,87 ±6,78 года). Первые клинические проявления атеросклероза у пациентов наблюдались в возрасте 47,73 ± 4,33 года. Пораженные атеросклерозом артерии располагались в коронарном бассейне. У всех больных был выявлен стеноз более 50 % как минимум в одной артерии коронарного бассейна.

Контрольная группа состояла из 19 человек без ССЗ в анамнезе и соответствовала группе пациентов по полу и возрасту (средний возраст -52,05 ± 6,05 года).

Все пациенты, вошедшие в выборки, не принимали ни статинов, ни каких-либо иных гиполипидемических средств. Все представители контрольных групп проходили обследование врача-кардиолога. Данные выборки являются случайными и принадлежат к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц, больных атеросклерозом. -

Методы исследования ,

Для получения макрофагов свежесобранную кровь смешивали в равном соотношении с фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Смесь наслаивали на фиколл-верографин (р = 1,077, БиоЛот, Санкт-Петербург), центрифугировали (1 500 об/мин, 30 мин), мононуклеары промывали в PBS, центрифугировали (1500 об/мин, 15 мин). Затем клетки ресуспендировали в культуральной среде (альфаМЕМ, 10%-'ная' эмбриональная сыворотка, 5 мкг/мл антибиотиков (пенициллин. G, стрептомицин)) и инкубировали в С02- инкубаторе в течение 2 ч. После чего прикрепившиеся к чашкам Петри моноциты культивировали . в присутствии колониестимулирующего; фактора макрофагов M-CSF 15 нг/мл (R&D. Systems, США) в течение 5 суток с ежедневной заменой питательной среды. Далее моноциты и макрофаги были использованы для определения содержания мРНК АВСА1,LXRa, LXRfi, PPARy и ММР-9 и белка АВСА1.

Для выделения тотальной мРНК и проведения реакции обратной транскрипции применяли наборы RNeasy Minikit (Qiagen, Германия) и cDNA synthesis kit (Fermentas, Литва). Уровень мРНК генов АБСА1, LXRa, LXRß, PPARy и ММР-9 определяли методом количественной ПЦР в режиме реального времени' с флуоресцентными зондами TaqMan на приборе CFX96 Touch (BioRad, США). В качестве референсного гена был использован конститутивно экспрессирующийся в клетках ген ß-актина.

Содержание белка АВСА1 в макрофагах оценивали методом вестерн-блоттинга с использованием первичных кроличьих антител к ABC Al (1:1 ООО; ab7360, Abeam, Великобритания). Результаты нормировали относительно окрашивания ß-актина (1 : 10 000; ab8227, Abeam, Великобритания). Клетки лизировали, количество общего белка определяли по методу Бредфорда с использованием реагентов фирмы «Силекс» (Россия) на спектрофотометре SmartSpecTMPlus (Bio-Rad, США). В экспериментах использовали вторичные антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (1 :3 ООО; ab6721, Abeam, Великобритания). Результаты идентифицировали с использованием набора Amersham ECL™ Plus System (Amersham, Великобритания) и фотопленки CEA (Швеция).

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Идентификацию вариантов (~17)G> С, 319ins < G, R219K гена АВСА1 проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом, как описано ранее (Zwarts et al., 2002).

Концентрацию общего ХС и ХС в составе ЛПВП (Х-ЛПВП) в плазме крови измеряли на автоанализаторе А-15 (BioSystems, Испания) с использованием наборов фирмы BioSystems.

Статистический анализ был проведен с использованием программы Statistica 6.0. Для качественных данных определяли частоты встречаемости в %. Проверку соответствия полученного распределения генотипов равновесию Харди - Вайнберга осуществляли при помощи ' непараметрического критериях2- Соответствие полученных данных нормальному распределению проверялось с помощью критериев Шапиро-Уилка или Колмогорова-Смирнова в зависимости от размера выборки. Для сравнения количественных данных использовали метод дисперсионного анализа ANOVA для нескольких групп и непараметрический метод [/-теста Манна - Уитни. Значения р < 0,05 считались статистически значимыми. Для определения относительного риска использовали показатель соотношения шансов (odds ratio, OR), рассчитываемый по формуле

ax.il

оя= —-,

охс

где а - количество пациентов, имеющих более редкую аллель; Ъ - количество пациентов, не имеющих более редкую аллель; с - количество индивидуумов из контрольной группы, имеющих более редкую аллель; с1 - количество индивидуумов из контрольной группы, не имеющих более редкую аллель. Для определения корреляции между количественными характеристиками пользовались корреляционным анализом по Спирмену. Коэффициент корреляции г >0,5 при ¿><0,05 означал положительную и статистически значимую корреляцию между признаками, а отрицательное значение г соответствовало обратной корреляции. В тексте диссертации и в таблицах средние величины приведены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. В случае достоверных различий дополнительно приведены значения медианы (минимум - максимум).

Результаты и обсуждение

Анализ вклада вариантов генаАВСА1 (R219K, 319ins < G, (~17)G > С) в развитие атеросклероза

Частоты вариантов гена АВСА1 (R219K (G655A), 319ins< G, (~17)G> Q в группе больных с атеросклерозом и в контрольной группе представлены в табл. 1. В исследуемых группах распределение генотипов гена АВСА1 находилось в соответствии с распределением Харди - Вайнберга.

В исследовании показано, что в контрольной группе частоты вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, (~17)G>Cj были сопоставимы со значениями, полученными в европейских популяциях (Zwarts et al., 2002; Jensen et al., 2007; Maet al., 2011).

Различий в частотах вариантов R219K и (~17)G> С гена АБСА! между группой пациентов с атеросклерозом и контрольной группой обнаружено не было (табл. 1).

В группе пациентов с атеросклерозом наблюдалось достоверное снижение частоты варианта G319 гена АВСА1 по сравнению с контрольной группой (15,1 % и 25,4 % соответственно, р = 0,03, df = 1). Был установлен пониженный относительный риск развития атеросклероза у носителей варианта G319 гена АВСА1 по сравнению с лицами, у которых отсутствует вставка нуклеотида G в 319-м положении гена АВСА1 (OR = 0,55 (95 % ДИ: 0,86-0,35)).

. Таблица 1

Частоты вариантов гена АВСА1 в группе пациентов с атеросклерозом и в контрольной группе

Частота аллелей п, %

Варианты теяаАВСА1 группа пациентов с атеросклерозом контрольная группа

RR 60 (50,4) 150(50,0)

R219K RK 52 (43,7) 131 (43,7)

КК 7(5,9) 19 (6,3)

f(R аллель) 0,72 0,72

f(K аллель) 0,28 0,28

СС 68 (57,1) 156 (52,0)

(-17)G > С CG 44 (37,0) 131 (43,7)

GG 7(5,9) 13 (4,3)

f(G аллель) 0,76 0,74 ,

/(С аллель) 0,24 0,26

IrtsG319 NN 101 (84,9) 224 (74,6)

NG + GG 18(15,1)* 75 + 1 (25,4)

/(TV аллель) 0,93 0,87

f(G аллель) 0,07 0,13

* р < 0,05, OR (NG + GG vs NN) = 0,55 (95 % ДИ: 0,35-0,86).

Ранее в исследовании Zwarts с соавт. было показано, что носительство аллели G в положении 319 гена АВСА1 ассоциировано со снижением локального и диффузного атеросклероза по сравнению с вариантом, когда аллель G в положении 319 отсутствовала (Zwarts et al., 2002). Однако механизмы, объясняющие функциональный эффект этого варианта на развитие и прогрессирование атеросклероза, остаются в настоящее время неизученными. Поскольку вариант 319insG расположен в 5'-нетранслируемой области гена АВСА1, возможно предположить, что вставка нуклеотида G в 319 положении гена АВСА1 может затрагивать регуляторные элементы, отвечающие за стабильность мРНК гена АБСА 1.

Уровень мРНК генов АБСА1,1ХЯа, ЬХЯ/1, РРА11у и ММР-9 и уровня белка АВСА1 в макрофагах, активированных М-СБР, исследуемых групп

В настоящем исследовании для измерения уровня мРНК АБСА!, ЬХЯа, РРАЯу и ММР-9 был создан банк макрофагов, активированных фактором М-С8Р.

Было показано, что в макрофагах пациентов с атеросклерозом уровень мРНК АВСА1 (медиана 1,60 (мин. 0,83 - макс. 2,73)) повышен по сравнению с макрофагами лиц контрольной группы (медиана 0,66 (мин. 0,15 - макс. 1,66)) (р< 0,001), рис. 1.

2 Í.4

Рис. 1. Относительный уровень мРНК гена АВСА1 в макрофагах у пациентов с атеросклерозом (N- 15) и в контрольной группе {N= 19), * - р < 0,001. Ось абсцисс -исследуемые группы; ось ординат -относительный уровень мРНК (отн. ед.)

Пацкеппл Контроль

Повышение уровня мРНК гена АВСА1 указывает на измененную экспрессию гена АВСА1 и, соответственно, может модифицировать эффективность ОТХ и влиять на темпы атерогенеза. Показано, что нокаут АВСА1 в макрофагах мышей сопровождается усилением атеросклеротических повреждений сосудов. Таким образом, исследование экспрессии гена АВСА1 именно в макрофагах актуально для изучения развития атеросклероза.

Интересно, что в работе Sivapalaratnam с соавт., напротив, было отмечено снижение экспрессии гена АВСА1 в циркулирующих моноцитах у пациентов, страдающих коронарной болезнью сердца и перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте (до 40 лет) {Sivapalaratnam et al., 2012). Этот результат мог быть обусловлен тем, что все пациенты, участвовавшие в исследовании, принимали симвастатин. В то же время известно, что статины, к которым относится и симвастатин, снижают экспрессию генов АВСА1 и ABCG1 в моноцитах у человека {Wong et al., 2008; Genvigir et al., 2010). Важно отметить, что в нашем исследовании пациенты не получали статинов и других гиполиподемических препаратов, что дает возможность адекватной оценки ассоциации уровня мРНК гена АБСА! и развития атеросклероза. Кроме того, показано, что популяции макрофагов в организме человека отличаются

гетерогенностью и эффективностью накопления ХС (Waldo et al., 2008). Следует заметить, что в нашем исследовании для определения уровня мРНК были использованы макрофаги, активированные фактором M-SCF, которые являются наиболее адекватной моделью для изучения патологических процессов при атерогенезе в клетках интимы in vivo (Di Gregoli, Johnston, 2012).

С другой стороны, полученные в настоящем исследовании данные согласуются с результатами, в которых показано повышение уровня экспрессии гена АВСА1 в атероматозных бляшках по сравнению со здоровыми артериями (Albrecht et al., 2004). В исследовании Liu с соавт. было также продемонстрировано увеличение уровня экспрессии гена АВСА1 в артериях с различной степенью выраженности атеросклеротических повреждений по сравнению со здоровыми артериями (Liu et al., 2012). Сравнение пациентов с аневризмой сонной артерии и пациентов с аневризмой брюшной аорты с лицами контрольной группы без признаков атеросклероза показало, что уровень мРНК АВСА1 при атеросклерозе повышен (Soumian et al., 2005), что также согласуется с полученными в настоящем исследовании данными.

Было выявлено снижение относительного содержания белка АВСА1 (медиана 0,14 (мин. 0,07 - макс. 0,54Y* в макрофагах пациентов по сравнению с контрольной группой (медиана 0,44 (мин. 0,14 - макс. 0,97)) (р <0,001), рис. 2.

Пациенты Контроль

ЛВС» ШИ& (

I32Ú tUW

О О

о

О

I !ацисн-| ы Кон ipu.Hi

Рис. 2. А - результаты вестерн-блоттинга для белка АВСА1 в макрофагах, активированных М-СББ; Б - уровень белка АВСА1 в макрофагах у пациентов с атеросклерозом (N=15) и в контрольной группе 19), * - р < 0,001. Ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат -относительный уровень мРНК (отн. ед.)

Известно, что усиление транспорта ХС из периферических клеток посредством ОТХ, основным белком которого и является транспортер АВСА1, предотвращает образование пенистых клеток, обеспечивая атеропротективные свойства данного процесса. Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать о нарушении элиминации ХС из макрофагов у пациентов с атеросклерозом. Подобные результаты отмечены и при изучении трансгенных животных. Так, селективная инактивация АВСА1 в макрофагах как в линии мышей с отсутствием рецептора ЛПНП -/-, так и у апо Е -/- мышей достоверно увеличивала уровень атеросклеротичесхого повреждения сосудов при отсутствии изменений в липидном профиле (Aiello et al., 2002). В то же время при пересадке костного мозга с гиперэкспрессией гена АБСА! было отмечено резкое снижение уровня атеросклеросклеротического повреждения сосудов (Van Eck et al, 2006). Эти данные свидетельствуют о том, что количество белка АВСА1 отражает степень атеросклеротического повреждения сосудов и сниженный уровень белка АВСА1 может служить маркером атерогенеза.

Интересно, что в нашем исследовании в макрофагах пациентов с атеросклерозом было выявлено увеличение уровня экспрессии мРНК АВСА1 и в то же время отмечалось снижение содержание белка АВСА1 по сравнению с макрофагами контрольной группы. Необходимо отметить, что уровень экспрессии мРНК АВСА1 не всегда отражает уровень белка (Gygi et al, 1999). Было показано несоответствие между уровнем мРНК АВСА1 и количеством белка АВСА1 в различных тканях животных, что предполагает наличие посттрансляционной регуляции белка АВСА1 in vivo (Wellington et al, 2002). Исследования in vitro подтверждают, что белок ABCA1 подвержен постгрансляционной регуляции в основном через контроль уровня его деградации.

Следует отметить, что в макрофагах показан быстрый распад белка АВСА1 со временем полужизни менее 1 ч (Oram et al., 2000; Arakawa, Yo/coyama, 2002). В недавнем исследовании было установлено, что деградация АВСА1 может опосредоваться протеосомальным протеолизом и что даже небольшое повышение уровня внутриклеточного ХС ассоциировано со значительным уменьшением убиквитирования АВСА1 (Hsieh et al, 2014). Это, в свою очередь, может отражать постгрансляционные модификации, влияющие на наблюдаемый в настоящей работе повышенный уровень АВСА1 в группе контроля по сравнению с группой пациентов. В литературе есть данные, аналогичные нашим, о том, что на фоне увеличения содержания мРНК АВСА1 содержание белка АВСА1 существенно снижается в атеросклеротических бляшках человека по сравнению с неповрежденными артериями (Albrecht

et al., 2004). В работе Liu с соавт. также был продемонстрирован уменьшенный уровень АВСА1 при увеличенном уровне экспрессии гена АВСА1 в атеросклеротических артериях по сравнению со здоровыми артериями {Liu et al., 2012).

Таким образом, отмеченное снижение содержания белка АВСА1 в макрофагах пациентов может объясняться нарушениями, происходящими на посттрансляционном уровне.

В нашем исследовании установлено повышенное содержания мРНК ММР-9 (медиана 1,63 (мин. - макс. 0,97-2,37)) в макрофагах у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой (медиана 0,85 (мин. 0,61 - макс. 1,66)) (р < 0,001), рис. 3.

Одним из основных патогенетических механизмов ССЗ, в том числе атеросклероза, является нарушение функции эндотелия. Ранее было показано, что важнейшим звеном, регулирующим расщепление коллагена IV типа и обеспечение возможности проникновения моноцитов сквозь эндотелий к месту атеросклеротического поражения сосудов, является активность ММР-9, синтезируемой макрофагами (Mishra et al., 2013). Кроме того, у пациентов со стенозом сонных артерий уровень ММР-9 в плазме крови в 2 раза выше популяционного и ассоциируется с риском развития мозгового инсульта (Eldrup et al., 2006). Изложенные выше данные в настоящее время позволяют рассматривать ММР-9 как весьма перспективный в отношении мониторирования провоспалительный фактор кардиоваскулярного риска.

Рис. 3. Относительный уровень мРНК гена ММР-9 в макрофагах у пациентов с атеросклерозом (ЛГ= 15)

и в контрольной группе (ЛГ= 19), *-р< 0,001. Ось абсцисс -исследуемые группы; ось ординат -относительный уровень мРНК (отн. ед.)

Пациенты Контроль

Таким образом, возрастание экспрессии гена ММР-9 в макрофагах пациентов с атеросклерозом может ассоциироваться с тенденцией к нестабильности атеросклеротической бляшки и прогрессированием атерогенеза.

Полученные в настоящей работе данные также согласуются с результатами, которые показывают повышение уровня мРНК ММР-9 у лиц с аневризмой сонной артерии и в атеросклеротических бляшках по сравнению с артериями лиц контрольной группы (Soumian et al., 2005). Кроме того, в недавней работе Rao с соавт. было отмечено увеличение уровня экспрессии гена ММР-9 в атеросклеротических бляшках у пациентов с выраженными симптомами атеросклероза по сравнению с лицами, у которых наблюдалось асимптомное течение заболевания (Rao et al., 2014).

В настоящем исследовании впервые выявлена отрицательная корреляция (г = -0,79, р < 0,05) между уровнем АВСА1 и уровнем мРНК ММР-9 в группе пациентов с атеросклерозом. Можно предположить, что пути общей белковой деградации, включающие ММР-9 и калпаин, могут быть вовлечены и в деградацию АВСА1, и в уменьшение транспорта липидов. В пользу данной гипотезы свидетельствует ранее установленный факт о том, что протеазы, такие как калпаин, вовлечены в деградацию белка АВСА1 (Wang et al., 2003). В то же время в работах in vitro установлено, что ММР, отвечающие за расщепление белков внеклеточного матрикса, также коррелируют с калпаином (Soumian et al., 2005), что может объяснять показанное в настоящем исследовании снижение уровня АВСА1 и повышение уровня мРНК ММР-9 в группе пациентов с атеросклерозом.

Ранее было показано, что ядерные рецепторы LXRa, LXRp и PPARy имеют антивоспалительную и анти-ММР активность (Soumian, 2005). Эти данные позволяют предположить, что изменение уровня экспрессии вышеуказанных ядерных рецепторов в макрофагах может вносить вклад в дестабилизацию атеросклеротической бляшки. В работе была также проведена оценка уровня экспрессии генов LXRa, LXRJ3 и PPARy.

Результаты исследования продемонстрировали снижение содержания мРНК LXRfi (медиана 0,42 (мин. 0,10 - макс. 0,72)) О <0,001) и мРНК PPARy (медиана 0,30 (мин. 0,13 -макс. 0,81)) (р< 0,001) в макрофагах, активированных колониестимулирующим фактором M-CSF, у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой (медиана 0,67 (мин. 0,43 - макс. 1,04) и медиана 1,36 (мин. 0,61 - макс. 2,09) соответственно), рис. 4.

Пациенты

Контроль

-8-

Контроль

А Б

Рис. 4. Относительный уровень мРНК генов LXR.fi (А) и РРАЯу (Б) в макрофагах у пациентов с атеросклерозом (N=15) и в контрольной группе (N=19), * - р< 0,001. Ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат - относительный уровень мРНК (отн. ед.)

Установлено, что уровень мРНК LXRa в макрофагах в исследуемых группах не отличался (р = 0,06). Для группы пациентов с атеросклерозом и контрольной группы характерны следующие значения медиан: 0,58 (мин. - макс. 0,12-1,30) и 0,82 (мин. - макс. 0,34—1,77) соответственно.

Несмотря на наличие большого количества информации о роли LXR.cc, и РРАЛу как противовоспалительных и антиатерогенных медиаторах, в настоящее время практически нет данных о роли экспрессии данных генов в развитии атеросклероза.

По результатам настоящего исследования было показано статистически значимое снижение содержания РРАЯу мРНК в макрофагах после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что уменьшение уровня мРНК РРАЯу может быть ассоциировано с развитием атеросклероза.

В литературных источниках нашли отражение значительные противоречия относительно роли PPARy в развитии атеросклероза. Наши данные согласуются с результатами, в которых отмечалось снижение уровня РРАНу в атеросклеротических бляшках (Боит1ап а1, 2005) и в макрофагах, коррелировавшее с прогрессией атеросклероза (СИя&пк е/ а/., 2011). С другой стороны, было показано значительное повышение содержания PPARy в макрофагах человека при атеросклерозе (\Amoruso ег а.1., 2009). В исследовании Риса с соавт. было отмечено повышение экспрессии гена РРАЯу как в моноцитах, так и в атеросклеротических бляшках (Риссг еГ а!.,

2011). Однако данное увеличение уровня мРНК гена PPARy проявилось на фоне приема статинов, которое не наблюдалось у лиц, вошедших в наши выборки. В работе Sueyoshi с соавт. (Sueyoshi et al., 2010) также выявлено, что уровень PPARy мРНК в атероматозных бляшках достоверно выше, чем содержание PPARy мРНК в интиме сосуда. Вышеизложенные результаты дают возможность предположить, что экспрессия PPARy может быть связана с формированием атеросклеротических бляшек и PPARy участвует в ранних стадиях развития атеросклероза у человека.

В настоящей работе для определения роли изменения уровня экспрессии LXRa, LXRfi у лиц с атеросклерозом был проведен анализ уровня мРНК LXRa и LXRfi в макрофагах пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой.

LXR играют ключевую роль в патогенезе атеросклероза, регулируя экспрессию важных генов, вовлеченных в липидный гомеостаз и воспалительную реакцию в макрофагах (Bensinger et al., 2008; Oosterveer et al, 2010). Более того установлено, что LXR ингибируют атеросклероз in vitro и in vivo (Calkin et al., 2012). При этом было продемонстрировано, что активация LXR увеличивает ОТХ за счет усиления экспрессии транспортеров АВСА1 и ABCG1 в макрофагах, что отражает механизм LXR-зависимой защиты от атеросклероза (Calkin et al., 2012). В целом наши результаты согласуются с этими данными, указывающими на то, что влияние LXR может не оказывать существенного влияния на уровень АВСА1 и антиатерогенный потенциал LXR может реализоваться путем воздействия на воспалительные процессы (Kappus et al., 2014).

В нашем исследовании установлено сниженное содержания мРНК LXRfi в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой, в то время как в содержании мРНК LXRa разница не показана, что может свидетельствовать о влиянии экспрессии LXRfi в развитии атеросклероза.

В недавней работе Shchelkunova с соавт. было показано увеличение экспрессии гена LXRfi в макрофагах, нагруженных модифицированными ЛПНП, по сравнению с контрольными макрофагами (Shchelkunova et al., 2013). Необходимо отметить, что взаимодействие с модифицированными ЛПНП существенно усиливает воспалительный потенциал макрофагов и дальнейшую аккумуляцию липидов. Также влияние повышенной концентрации эфиров ХС в клетке на уровень экспрессии генов ядерных рецепторов LXR подтверждается в работе Albrehch с соавт. Так, уровень мРНК гена LXRa был повышен в атеросклеротических бляшках сосудов по сравнению со здоровыми артериями

{Albrecht et al, 2004). Таким образом, данные о взаимосвязи уровня экспрессии генов LXR и уровня ХС в клетке могут объяснять снижение содержания мРНК LXRß в макрофагах у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой.

Суммируя полученные результаты, можно предположить, что уровни экспрессии генов LXRß и PPARy в макрофагах могут быть значимыми факторами, ассоциированными с развитием атеросклероза.

При анализе вклада уровня мРНК АВСА1, LXRa, LXRß, PPARy, ММР-9 и уровня белка АВСА1 в макрофагах, активированных M-CSF, на развитие атеросклероза была оценена их корреляция с показателями липидного обмена.

В контрольной группе была обнаружена прямая корреляция уровня мРНК АВСА1 в макрофагах с уровнем Х-ЛПВП (коэффициент корреляции г = 0,74, р < 0,05), которая отсутствовала в группе пациентов. Не обнаружено выраженных корреляций между уровнем Х-ЛПВП и уровнем белка АВСА1 в макрофагах и у лиц контрольной группы, и у пациентов.

Известно, что лица с экстремально низкими уровнем Х-ЛПВП плазмы крови (менее 0,9 ммоль/л у мужчин, менее 1,1 ммоль/л у женщин) характеризуются пониженным уровнем экспрессии гена АВСА1 в макрофагах (Hohen et al., 2013). Действительно, в настоящее время опосредованный транспортером АВСА1 отток ХС рассматривается как один из ключевых моментов образования npe-ß-ЛПВП и, следовательно, концентрации Х-ЛПВП в плазме крови (Oram, 2002). При дефекте транспортера АВСА1 обедненные липидами частицы апо AI не трансформируются в npe-ß-ЛПВП и далее в нативную форму ЛПВП. Было отмечено, что нокаут АВСА1 в тонком кишечнике мышей сопровождался снижением уровня Х-ЛПВП на 30 %, а при одновременном нокауте АБСА] как в тонком кишечнике, так и в печени уровень Х-ЛПВП уменьшился на 90 % (Brunham et al., 2006).

Таким образом, вышеизложенные результаты могут указывать на то, что высокий уровень экспрессии АВСА1 может индуцировать образование частиц ЛПВП (Denis et al., 2003), однако механизм влияния уровня мРНК АВСА1 в макрофагах на уровень Х-ЛПВП в плазме крови остается не до конца изученным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Было показано, что вариант G319 гена АВСА1 снижает относительный риск развития атеросклероза у жителей Санкт-Петербурга. Был определен уровень мРНК генов АВСА1, LXRa, LXRß, PPARy и ММР-9 в макрофагах,

активированных М-СББ, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без ССЗ. Было установлено повышение уровня мРНК АВСА1 и ММР-9 и снижение уровня мРНК ЬХКр и РРАНу в макрофагах больных атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты указывают, что уровень экспрессии данных генов может быть значимым фактором в развитии атеросклероза и может представлять мишень для антиатерогенной терапии. Выявленное в настоящем исследовании достоверное снижение уровня белка АВСА1 в группе пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой может отражать важность посттрансляционных модификаций данного транспортера и свидетельствовать о его повышенном уровне деградации в макрофагах при атеросклерозе.

ВЫВОДЫ

1. Носительство аллели 0319 гена АВСА1 ассоциировано со снижением относительного риска развития атеросклероза: 011 = 0,55; с1/= 1 (95% ДИ: 0,86-0,35) в популяции Санкт-Петербурга.

2. Выявлены изменения уровней мРНК генов АВСА1, ММР-9 и генов транскрипционных факторов ЬХКР и РРАКу в макрофагах, активированных М-СБР. У больных атеросклерозом наблюдалось повышение уровня транскриптов генов АВСА1, ММР-9 и понижение уровня транскриптов генов 1ХЯР и РРАКу по сравнению с контрольной группой.

3. Определение уровня белка АВСА1 в макрофагах, активированных М-СББ, выявило достоверное снижение содержания белка АВСА1 у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой.

4. Показано наличие обратной корреляции между уровнем мРНК гена ММР-9 и уровнем белка АВСА1 в макрофагах, активированных М-СББ, у пациентов с атеросклерозом (г = -0,79, р < 0,05).

5. Была выявлена корреляция между уровнем мРНК гена АВСА1 в макрофагах, активированных М-СББ, и уровнем Х-ЛПВП в плазме крови в контрольной группе (г = 0,74, р < 0,05).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. РодыгинаТ.И. Влияние вариантов генов АВСА1 транспортера и параоксоназы 1 на риск развития и тяжесть течения атеросклероза / Т. И. Родыгина, Е. П. Демина, А: М. Шейдина, В. В. Зверева, П. С. Курьянов, В. Н. Вавилов, А. Л. Шварцман, А. Д. Денисенко, С. Н. Пчелина // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2007. - Т. 4. - № 24. - С. 21-28.

2. Демина Е. П. Экспрессия гена-транспортера АВСА1 в лимфоцитах и макрофагах периферической крови больных атеросклерозом / Е. П. Демина, В. В. Мирошникова, Т. И. Родыгина, П. С. Курьянов, А. Г. Виноградов, А. Д. Денисенко, A. JI. Шварцман // Молекулярная биология. - 2011. - Т. 45. -№2.-С. 289-293.

3. Демина Е. П. мРНК гена АВСА1 и уровень белка АВСА1 в макрофагах, активированных M-CSF, у пациентов с артериальным стенозом / Е. П. Демина, В. В. Мирошникова, Н. В. Майоров, В. В. Давыденко,

A. Л. Шварцман // Цитология. - 2013. - Т. 55. - № 8. - С. 580-585.

4. Демина Е. П. Снижение уровня LXRBfi мРНК и PPARy мРНК в макрофагах, стимулированных колониестимулирующим фактором M-CSF у больных атеросклерозом / Е. П. Демина, В. В. Мирошникова, Н. В. Майоров,

B. В. Давыденко, А. Л. Шварцман // Экологическая генетика. - 2014. - Т. 12. -№ 1.-С. 14-18.

Тезисы:

1. DeminaE., RodyginaT., Zvereva V., Kurianov P., Denisenko A., Sheydina A. ABCA1 Transporter in Atherosclerosis Development // 4th Congress of the Association of Cardiologists and Angiologists of Bosnia and Herzegovina. Mostar, Bosnia and Herzegovina, May, 2007. P. 98.

2. Demina E., Rodygina Т., Kurianov P., Denisenko A., Sheydina A. Expression of АБСА I Transporter in Atherosclerosis // Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics, Dedicated to 120л Anniversary of M. I. Vavilov. Kiev, Ukraine, September 20-22,2007. P. 57.

3. Демина E. П., Родыгина Т. И., Курьянов П. С., Виноградов А. Г., Денисенко А. Д., Шварцман А. Л. Генетические варианты АВСА1 транспортера в развитии атеросклероза // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2008. Т. 7. №6. С. 113-114.

4. Demina Е., Rodygina Т., Sheydina A., Denisenko A., Shvarcman А. Association Between АВСА1 Transporter mRNA Level and Atherosclerosis // European Human Genetics Conference. Barcelona, Spain, May 31 - June 03, 2008. European Journal of Human Genetics. 2008. V. 16. Suppl. 2. P. 294.

5. Демина E. П., Родыгина Т. И., Шварцман A. JI. Влияние уровня экспрессии АВСА1 и генетических вариантов АВСА1 транспортера в развитии атеросклероза // Бюлопя: вэд молекули до бюсфери. Материалы III Международной конференции молодых ученых. Харьков, Украина, 18-21 ноября 2008. С. 85.

6. Демина Е. П., Курьянов П. С., Зверева В. В., Виноградов А. Г., Шваргрчан А. Л. Обратный транспорт холестерина и развитие атеросклероза //

Материалы Съезда генетиков и селекционеров России, посвященного 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина, и V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009. Т. 1. С. 413.

7. DeminaE., Miroshnikova V., Schwarzman A. Role of АБСА 1 Transporter in Humans // ABC2010 - 3rd FEBS Special Meeting on ABC Proteins. Innsbruck, Austria, February 27 - March 5, 2010. P. 76.

8. DeminaE., Miroshnikova V., Denisenko A., Schwarzman A. Role of ABCA1 Transporter in Humans and Relationship to Atherosclerosis // 78th EAS Congress. Hamburg, Germany, June 20-23, 2010. Atherosclerosis Supplements. V. 11. Iss. 2. P. 77.

9. Демина E. П. Роль экспрессии ABCA1 транспортера в клетках крови в развитии атеросклероза // Генетическая и регенеративная медицина: проблемы и перспективы. Киев, Украина, 14-15 октября 2010. С. 17.

10. DeminaE., Miroshikova V., Denisenko A., Schwarzman A. Reverse Cholesterol Transport Key Proteins and Atherosclerosis // The 4th International IMBG Conference for Young Scientists "Molecular Biology: Advances and Perspectives". Institute of Molecular Biology and Genetics. Kiev, Ukraine, September 14-17, 2011. P. 123.

11. DeminaE., Miroshnikova V., Schwarzman A. ABCA1 Gene Expression in Macrophages in Lipid Transport // 80th EAS Congress. Milan, Italy, May 25-28, 2012. P. 616.

12. Демина E. П., Мироитикова В. В., Майоров Н. С., Давыденко В. В., Шварцман А. Л. Экспрессия гена транспортера АБСА1 и уровень белка АВСА1 в макрофагах у пациентов с артериальным стенозом // Материалы Российского национального конгресса кардиологов. Санкт-Петербург, 25-27 сентября 2013. С. 179.

13. DeminaE., Miroshnikova V., MayorovN., Davydenko V., Denisenko A., Schwarzman A. Atherosclerosis is Associated with Reduced Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma and Liver X Receptor Beta Gene Expression // European Human Genetics Conference. Paris, France, June 8-11, 2013. European Journal of Human Genetics. V. 21. Suppl. 2. P. 468.

14. DeminaE., Miroshnikova V., MayorovN., Davydenko V., Schwarzman A. Expression of ABCA1 and MMP-9 in M-CSF Macrophages is Associated with Atherosclerosis Development // 82th EAS Congress. Madrid, Spain, May 31 -June 03,2014. Atherosclerosis. V. 235. Iss. 2. P. el31-el32.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

апо А1 - аполипопротеин А1

апо Е - аполипопротеин Е

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ОТХ - обратный транспорт холестерина

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

Х-ЛПВП - холестерин в составе ЛПВП

ХС - холестерин

АВСА1 - АТФ-связывающий кассетный транспортер А1

АВСО! - АТФ-связывающий кассетный транспортер 01

ЬХЕ1 - печеночный X рецептор

ММР - матричная металлопротеиназа

РРАР. - рецептор активации пролиферации пероксисом

М-СББ - колониестимулирующий фактор макрофагов

ОБ. - отношение шансов

Отпечатано в типографии ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт» 188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 298, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 30.10.2014 г.