Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия генов кальций-зависимых протеинкиназ в процессе соматического эмбриогенеза женьшеня Panax ginseng C.A. Meyer
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генов кальций-зависимых протеинкиназ в процессе соматического эмбриогенеза женьшеня Panax ginseng C.A. Meyer"
На правах рукописи
ТУРЛЕНКО АННА ВЛАДИМИРОВНА
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ КАЛЬЦИИ-ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ В ПРОЦЕССЕ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА ЖЕНЬШЕНЯ Panax ginseng С.A. MEYER
Специальность: 03.01.06 - биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
9 ИЮН 2011
Владивосток, 2011
4849043
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Учреждения Российской академии наук Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения РАН
Научный руководитель:
кандидат биологических наук, Киселев Константин Вадимович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, доцент
Брыков Владимир Алексеевич
доктор биологических наук, ст.н.с.
Максимов Игорь Владимирович
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва
Защита состоится «29» июня 2011г. в «10» часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.003.04 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159.
Факс:(4232)310-193
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.
Автореферат разослан «23» мая 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
Музарок Т. И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Женьшень настоящий Panax ginseng С.А. Meyer на сегодняшний день является одним из наиболее известных и ценных лекарственных растений, вследствие чего его природные запасы подвергаются чрезмерной эксплуатации. Современный ареал женьшеня значительно сократился, природные популяции сохранились, вероятнее всего, только на территории российского Приморья. Вид занесен в Красную книгу Приморского края со статусом "на грани исчезновения". Решить проблему с источником сырья может помочь биотехнологический способ получения растений женьшеня, в основе которого лежит процесс образования соматических эмбрионов.
Соматический эмбриогенез у растений зависит от большого числа внешних и внутренних факторов. Например, на данный момент известно более сотни генов, экспрессия которых влияет на соматический эмбриогенез (Karami et al., 2009). Стало понятно, что данное множество факторов, приводящее в итоге к формированию соматических эмбрионов, должно регулироваться единым механизмом. Поэтому изучение регуляции соматического эмбриогенеза редких и исчезающих видов важно для биотехнологии.
Известно, что в сложной сети передачи информации ионы кальция служат универсальным посредником, поскольку ни один вторичный посредник не участвует в столь большом количестве процессов в клетке, как свободный Са2+ цитозоля. Главными сенсорами кальция в клетках растений являются кальций-зависимые протеинкиназы (CDPK), которые принадлежат к эукариотическим протеинкиназам, катализирующим обратимый перенос фосфата с АТФ на боковые цепи аминокислотных остатков в составе белка. Реакции фосфорилирования/дефосфорилирования оказывают значительное воздействие на активность белков и их взаимодействие с другими белками. Предполагается, что у растений большая часть киназной активности, которая стимулируется кальцием, связана именно с CDPK.
Ранее было показано, что кальциевая сигнальная система вовлечена в регуляцию соматического эмбриогенеза (Anil, Rao, 2000), но оставалось непонятным, как эта система может регулировать сразу так много процессов. Полногеномное секвенирование двух таксономически далеких видов растений Oryza sativa (однодольные) и Arabidopsis thaliana (двудольные) показало, что они содержат 27 и 34 генов CDPK, соответственно (Cheng et al., 2002; Asano et al., 2005). По-видимому, это может свидетельствовать о выполнении разными CDPK различных функций. Постоянно пополняемый список белков-мишеней CDPK включает мембранные транспортные белки (Н+-АТРазу плазмалеммы, калиевые и анионные каналы замыкающих клеток устьиц, аквапорины и др.), факторы транскрипции, ферменты (сахарозофосфатсинтаза, нитратредуктаза, фенилаланин-аммиаклиаза), белки цитоскелета и другие мишени. Таким образом, CDPK вовлечены в передачу Са2+-сигнала, связанного с поддержанием мембранного потенциала, регуляцией углеводного и азотного
обменов, движениями устьиц, ответом на стрессовые воздействия, формированием архитектуры клетки, эмбриогенезом и т.д.
Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение экспрессии кальций-зависимых протеинкиназ в процессе соматического эмбриогенеза в интактных растениях и клеточных линиях женьшеня настоящего Р. ginseng.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Подтвердить с помощью анализа экспрессии генов-маркеров эмбриогенеза: генов гомеобокс-содержащих транскрипционных факторов WUSCHEL (WUS), что в го/С-трансгенной линии 2сЗ Р. ginseng при длительном культивировании образуются соматические эмбрионы.
2. Исследовать влияние ингибиторов кальциевых каналов, протеинкиназ и ионофора А23187 на развитие соматических эмбрионов в клеточных линиях женьшеня.
3. Получить нуклеотидные последовательности частей генов CDPK Р. ginseng и изучить экспрессию этих генов в разных клеточных линиях женьшеня. Создать базу наиболее часто встречаемых генов CDPK и изучить экспрессию генов CDPK на разных стадиях развития соматических эмбрионов в клеточной линии 2сЗ женьшеня.
4. Получить полные последовательности комплементарной ДНК (кДНК) генов CDPK женьшеня; сделать детальный анализ экспрессии каждого гена CDPK; определить возможные функции белковых продуктов наиболее важных генов CDPK.
Научная новизна. Впервые изучена экспрессия генов CDPK в клеточных линиях женьшеня с разным уровнем морфо-анатомического развития. Показано, что при развитии соматических эмбрионов в го/С-трансгенной клеточной линии женьшеня появляются транскрипты CDPK с инсерциями и делециями в последовательности Ser/Thr-киназного домена. Впервые получена полная последовательность белок кодирующей части кДНК первого гена CDPK женьшеня PgCDPKla и изучена его детальная экспрессия. Показано, что существует положительная корреляция между экспрессией PgCDPKla и приростом биомассы клеток Р. ginseng. Возможно, PgCDPKla является позитивным регулятором клеточного роста женьшеня.
Практическая значимость работы. Получена информация о нуклеотидных последовательностях киназного домена основных представителей генов CDPK женьшеня, которую можно в дальнейшем использовать в молекулярных и физиологических исследованиях, т.к. CDPK являются основными сенсорами цитоплазматического кальция, а кальций вовлечен в регуляцию практически всех процессов, протекающих в клетке. Информация о полной последовательности генов CDPK может быть основой для проведения экспериментов по сверхэкспрессии генов CDPK и получению клеточных линий или растений с повышенными характеристиками устойчивости к стрессам или содержанию гинзенозидов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Звенигород, 2008); XI Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток,
2009); 4-й Международной конференции польского сообщества экспериментальной растительной биологии (Краков, 2009); VIII Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2009); XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток,
2010); IX Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых международных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах печатного текста, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 7 таблиц. Список литературы насчитывает 204 наименования. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (06-04-48149-а), ДВО РАН, гранта по Программе «Научная школа России» (04-А-06-047), гранта Министерства науки и Образования РФ (АОЗ-2.12-524).
Благодарности. Автор искренне благодарит своего научного руководителя К.6.Н. Киселева К.В. за всестороннюю поддержку и помощь в освоении экспериментальных методов и ценные консультации на всех этапах работы; академика РАН Журавлева Ю.Н. за всестороннюю помощь и поддержку; Грищенко О.В. и Чернодед Г.К. за помощь в работе с культурами клеток растений; к.б.н. Горпенченко Т.Ю. за консультации в области морфологии и анатомии клеточных культур; к.б.н. Музарок Т.И. за помощь в поддержании коллекции растений женьшеня; к.б.н. Атопкина Д.М. за помощь в проведении молекулярно-генетических исследований; к.б.н. Козыренко М.М. за помощь и советы при написании диссертации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растенш и клеточные линии женьшеня P. ginseng.
В работе использованы листья и корни 2- и 3-летних растений из коллекционного питомника с искусственным затенением, собранные в июле-сентябре 1993-2009 гг. в природных популяциях Приморского края, и дикорастущие растения, собранные в неохраняемой Сихотэ-Алинской популяции.
Клеточные линии P. ginseng из коллекции лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН: каллусная культура женьшеня 1с полученная в 1988 г. из стебля растения P. ginseng (Булгаков и др., 1991); трансгенная клеточная линия GV, не содержащая ген го/С; /-о/С-трансгенные линии 2cR2, 2с2 и эмбриональная линия 2сЗ, полученные в 1993-2004 гг. (Gorpenchenko et al.,
2006). Клеточные линии выращивали на твердой среде W4cpa (Bulgakov et al.,
1998). Эмбриональная линия 2сЗ представляет собой гетерогенный каллус, образованный из нескольких клеточных агрегатов, обладающих разной степенью дифференциации. Каллус был механически разделен на 3 группы клеток: 1) 2c3-DD - рыхлый недифференцированный каллус, который представлен мелкими меристематическими клетками; 2) 2c3-ES -соматические эмбрионы на ранних стадиях развития: глобулярная, сердцевидная и торпедовидная стадии; 3) 2c3-LS - соматический эмбриогенез на поздних стадиях развития. Обычно соматический эмбриогенез в линии 2сЗ не достигает поздних стадий в условиях культивирования на среде W4cpa, при перенесении на инициирующую среду (Chang, Hsing, 1980) и в присутствии белого света нам удалось получить поздние стадии эмбриогенеза.
Обработка ингибиторами и ионофором А23187. Ингибиторы и ионофор получены из ICN Biomedicals. Ингибиторы кальциевых каналов добавляли в питательные среды до автоклавирования и измерения pH среды, а ионофор и ингибиторы протеинкиназ добавляли после автоклавирования.
Обратно-транскрипционная ПЦР (ОТ-ПЦР) и секвенирование ДНК. Тотальную РНК экстрагировали из клеточных линий на 30-35 день культивирования при помощи метода с использованием LiCl (Bekesiova et al.,
1999). кДНК получали, используя 1-3 мкг тотальной РНК (предварительно обработав ДНКазой), с помощью набора для обратной транскрипции (Силекс, Россия). Реакцию проводили при 37°С в течении 1-2 часов. На основе известных аминокислотных последовательностей CDPK растений (номера доступа в GenBank D21805, AF363784, AF072908, D21806, AJ344154, AJ344155, АВ042550, D84408) подобраны вырожденные праймеры 5 '-GTKCA YYT WGTKATGGAR и 5 '-TTCKGCCC АА AADGG WGG к консервативным участкам серин-треонин киназного домена. На основе известных аминокислотных последовательностей WUS растений (AJ012310, AJ538329, AF481951) к гомеобоксу были подобраны вырожденные праймеры: 5'-AARGAACTYTACTACAACAATG и 5'-CTCTTCTTCTGTCTYTCACGRGC. Температура отжига праймеров 53 °С к генам CDPK и WUS позволяет получать сигнал в области 390 и 150 п.н., соответственно, без дополнительных сигналов.
Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР генов PgActinl, rolC, WUS и CDPK проводили с использованием набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer Biosystems, Forster City, CA) по методике производителя. Секвенирование осуществляли на секвенаторе ABI 3130 Genetic Analyser (Perkin-Elmer Biosystems) на базе БПИ ДВО РАН. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с известными последовательностями этих генов в программе NCBI BLAST. Выравнивание участков WUS и CDPK проводили в программе BioEdit 7.0.8http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html. Секвенированные
фрагменты генов Actinl, WUS и CDPK депонированы в GeneBank, номера доступа даны в скобках: PgActinl (AY907207), PgWUSI-1 (EU293843), PgWUSI-2 (EU293844), PgWUSI-3 (EU293845), PgWUSI-7 (EU939528),
PgWUSII-6 (EU939529), PgWUSII-3-6 (EU939530), PgWUSII-5 (EU939527), PgWUSII-8 (EU939531), PgCDPKla (DQ421785), PgCDPKlb (EF546429), PgCDPKlc (EF621917), PgCDPKla (DQ422856), PgCDPK2b (EF541125), PgCDPK2c (EF600555), PgCDPK3a (DQ422857), PgCDPK3b (DQ981494), PgCDPK4a (EU043518), PgCDPKld (EU378948), PgCDPK2d (EU073200), PgCDPK3L (EU672431).
Анализ экспрессии генов WUS и CDPK на основе ОТ-ПЦР. Для получения данных по суммарной экспрессии генов CDPK и WUS ПЦР-продукты после ОТ-ПЦР нормализовали с ПЦР-продуктами гена актина P. ginseng по ранее описанной методике (Kiselev et al., 2006). Для сравнения экспрессии генов Actinl, WUS и CDPK в разных линиях использовали технологию микрочипов с DNA 1000 LabChip®kit на Agilent 2100 Bioanalyzer (Германия), как описано ранее (Киселев и др., 2008). Далее ампликоны CDPK и WUS были выделены из геля при помощи набора Glass Milk (Силекс, Россия), клонированы в вектор pTZ57R/T согласно протоколу фирмы-производителя (Fermentas, Литва) и секвенированы, как описано ранее (Kiselev et al., 2006). Экспрессию отдельных генов семейств WUS и CDPK оценивали количественно, основываясь на данных о частоте встречаемости отдельных клонов каждого транскрипта в исследуемых пробах, полученных с помощью секвенирования, и данных о суммарной экспрессии генов (Kiselev, Dubrovina, 2010).
Условия проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Для генов rolC и CDPK ПЦР-РВ была выполнена согласно методике, описанной Гиулиетти с соавторами (Giulietti et al., 2001). Геноспецифичные пары праймеров и TaqMan пробы представлены ранее (Kiselev et al., 2010). кДНК амплифицировали с помощью Real-time PCR Kit (Синтол, Россия), используя iCycler амплификатор с оптическим блоком ¡Q5 для ПЦР-РВ (Bio-Rad Laboratories, США). Данные анализировали при помощи программного обеспечения Optical system software v.2.0. Праймеры и зонды синтезировали по рекомендациям фирмы Синтол. Обработку результатов проводили при помощи программного обеспечения Optical system software v.2.0, как описано ранее (Dubrovina et al., 2010). ПЦР-РВ проводили с использованием набора реактивов фирмы Синтол (Россия).
Статистический анализ полученных результатов. Результаты были обработаны при помощи программы Statistica 9.0. Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка измерений. Значимость полученных данных оценивалась по спаренному критерию Стьюдента. Уровень значимости в 0.05 был выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Морфология клеток и экспрессия гена rolC в клеточных линиях женьшеня. Ранее было показано, что ген rolC экспрессируется в полученных линиях женьшеня на разном уровне (Gorpenchenko et al., 2006). Сильная экспрессия гена выявлена в корнях, средняя - в эмбрионах линии 2сЗ. Слабая экспрессия гена rolC не приводила к значительным морфо-анатомическим изменениям,
тогда как сильная экспрессия гена rolC, в 8-9 раз большая, чем в линиях женьшеня с низким уровнем экспрессии rolC (2с2), вызывала ризогенный эффект. Из клеток корней получена линия 2cR2, в которой тоже наблюдается высокий уровень экспрессии rolC. В этой линии мало дифференцированных структур, но сохраняется способность формировать корни. В линии 2с2, обладающей низкой экспрессией rolC, клетки характеризуются хорошим ростом и гомогенной консистенцией без каких-либо проявлений эмбриогенеза. На основании проведенного анализа мы полагаем, что только средний уровень экспрессии rolC приводит к наблюдаемым эффектам: образование проэмбриональных структур, соматических эмбрионов и почек.
Анализ экспрессии генетического маркера эмбриогенеза растений WUS в клеточных линиях женьшеня. Соматические эмбрионы в /-о/С-трансгенной линии 2сЗ за период работы с 2007 по 2010 г.г. имели вид, описанный ранее (Gorpenchenko et al., 2006). В течение развития соматические зародыши проходили стадии глобулы и сердечка, иногда достигали стадии торпеды. Индукция соматических эмбрионов геном rolC в линиях женьшеня является доказанным фактом. Было не ясно, активирует ли ген rolC известные эмбриогенные механизмы. Эмбриогенез в линии 2сЗ был схож с эффектами сверхэкспрессии гомеобокс содержащего гена WUS (Zuo et al., 2002). На сегодняшний день WUS считается одним из генетических маркеров эмбриогенеза растений (Klimaszewska et al., 2011), поэтому решено было оценить экспрессию гена WUS женьшеня в контрольной линии GV и эмбриональной 2сЗ с помощью вырожденных праймеров.
Многочисленные попытки клонировать ПЦР-продукт с контрольной линии GV не увенчались успехом: последовательностей, гомологичных генам WUS, секвенировать не удалось. ПЦР-продукты с линии 2сЗ были успешно клонированы. Анализ аминокислотных последовательностей показал высокую гомологию с известными WUS растений (77-85% идентичности). Анализ колоний, полученных с ОТ-ПЦР-продуктов, показал, что в 2сЗ линии экспрессируются 3 гена WUS. Больше всего экспрессировался PgWUSI (67% всех клонированных ПЦР-продуктов), в меньшей степени PgWUSII (28%) и PgWUSIII (5%). Дальнейший анализ экспрессии генов WUS в линии 2сЗ и клеточных агрегатах 2c3-DD, 2c3-ES, 2c3-LS показал, что количество секвенированных генов WUS увеличилось до 9. Были описаны гены WUS, которые по нуклеотидной последовательности наиболее близки к PgWUSI и PgWUSII. Все полученные части гомеобоксного домена по аминокислотной последовательности были наиболее близки к известным WUS растений. Затем, мы проанализировали экспрессию rolC в разных агрегатах линии 2сЗ, содержащих соматические эмбрионы на разных стадиях развития с помощью ПЦР-РВ. Оказалось, экспрессия этого гена в разных клеточных агрегатах различна. Уровень экспрессии rolC в клеточных агрегатах 2c3-DD был в 1.5 раза ниже уровня экспрессии этого гена в линии 2сЗ. Уровень экспрессии гена rolC в 2c3-ES и 2c3-LS был в 1.1-1.3 раза выше, чем в линии 2сЗ (рис. 1А). Ранее было показано, что экспрессия генов под 35S промотором может регулироваться различными путями у разных видов растений и в разных
тканях (Вег^еу, С1ша, 1990). Разница в экспрессии го1С может быть обоснована разницей ткани и клеток в агрегатах линии 2сЗ. Экспрессия генов \V11S в линии СУ отсутствовала, а в 2сЗ и ее разных клеточных агрегатах экспрессия была на уровне от 0.05 до 0.21 отн. ед. (рис. 1Б). Суммарная экспрессия генов PgWUS в значительной степени коррелировала с суммарной экспрессией гена го1С. Далее определяли качественный состав ПЦР-продуктов генов 1¥иБ и на основе данных по суммарной экспрессии и качественному составу проб высчитывали экспрессию каждого гена 1УиБ женьшеня.
Рис. 1. Экспрессия го1С (А) и \VLJS (Б) в линиях СУ, 2сЗ и клеточных агрегатах 2сЗ-ЭО, 2сЗ-Е8 и 2сЗ-Ь8. Данные получены в трех независимых экспериментах, выведено среднее значение с учетом погрешности. *Р < 0.05, **Р < 0.01.
Экспрессия ЖиБ в 2сЗ-ОП. В недифференцированном рыхлом каллусе 2сЗ-ЭО экспрессия представителей I подсемейства генов ШиБ была намного больше, чем экспрессия PgWUSII. Единственным геном, чья экспрессия была близка к 0.05 отн. ед. был ген PgWUSI-7 (рис. 2А).
Экспрессия ЖиБ в 2сЗ-ЕБ. В клеточных агрегатах 2сЗ-Е8, содержащих соматические эмбрионы на начальных стадиях развития (рис. 2Б) отмечались достоверные изменения в экспрессии подсемейств PgWUSII по сравнению с клеточными агрегатами 2сЗ-ЭБ. В 2сЗ-Е8 достоверно возрастала экспрессия PgWUSП-8 до 0.06 отн. ед. и появлялась экспрессия двух новых генов -PgWUSII-6 и PgWUSII-5. Экспрессия остальных генов изменялась незначительно.
Экспрессия Жия в 2сЗ-ЬБ. В клеточных агрегатах 2сЗ-ЬВ, содержащих соматические эмбрионы на поздних стадиях развития (рис. 2В), экспрессия генов 1УиБ значительно отличалась от экспрессии в ранее описанных клеточных агрегатах. В 2сЗ-Ь8 достоверно повышена экспрессия PgWUSI-3, PgWUSII-7, PgWUSП-5 и Р%1¥иБП-3-6, и достоверно снижена экспрессия (рис. 2В).
2c3-LS
В
Рис. 2. Экспрессия генов WUS в клеточных линиях женьшеня 2сЗ-DD (A), 2c3-ES (Б) и 2c3-LS (В).
А.
и
Влияние ингибиторов кальциевых каналов, ингибиторов протеинкиназ и ионофораА23187 на эмбриогенез в клеточной линии 2сЗ. Ранее было показано (Anil, Rao, 2000), что частота эмбриогенеза в культуре клеток чефраса Santalum album связана с концентрацией цитоплазматического Са2+. Эмбриогенезу сопутствует повышенная концентрация [Са2*]^. Кроме того, функционирование гена rolC связано с кальциевой сигнальной системой (Bulgakov et al., 2003). Учитывая вышесказанное, нами были проведены эксперименты по определению влияния [Са21]^ на соматический эмбриогенез женьшеня. Использовали общий ингибитор каналообразующих Са2+-ионофоров LaCl3, ингибитор внешних Са2+-каналов - верапамил, ингибитор внутриклеточных Са2+-каналов - нифлюмовую кислоту. Все ингибиторы снижали частоту эмбриогенеза в линии 2сЗ (рис. 3), соматические эмбрионы перерождались в рыхлые каллусные клетки. Наиболее достоверное подавление эмбриогенеза достигнуто при использовании нифлюмовой кислоты и верапамила (15 и 28%, соответственно).
Рис. 3. Эмбриогенез в клеточной линии 2сЗ на средах с добавлением ингибиторов кальциевых каналов, ингибиторов протеинкиназ и ионофора А23187. 2сЗ -эмбриогенез в норме; La - эмбриогенез при добавлении LaCI3 (0.5 мМ); NA -нифлюмовой кислоты (50 мкМ); VER - верапамила (0.25 мМ); Н7 общего ингибитора протеинкиназ (30 мкМ); W7 -ингибитора CDPK (15мкМ); CI-1 - ионофора А23187 (1 мкМ); CI-10 - ионофора А23187 (10 мкМ). *Р < 0.05; **Р < 0.01.
Основными сенсорами кальция в клетке служат CDPK, поэтому важно было изучить влияние общего ингибитора протеинкиназ (Н7) и более специфического ингибитора CDPK (W7) на эмбриогенез в клеточной линии женьшеня 2сЗ. Показано, что Н7 и W7 на 30-40% подавляли эмбриогенез в культуре (рис. 3). Важным этапом стало изучение влияния увеличения концентрации [Са2^^ с помощью ионофора А23187 на эмбриогенез в линии 2сЗ (рис. 3). Функционируя, как правило, в условиях низких концентраций ионов этот ионофор действует как ионообменный "челнок": на каждый внесенный двухвалентный катион он переносит два иона водорода из клетки. Следовательно, он не деполяризует мембрану, поэтому ионофор А23187 широко используется в клеточной биологии для повышения концентрации свободного кальция в цитозоле. Нами показано, что добавление ионофора А23187 достоверно увеличивает количество соматических эмбрионов в линии 2сЗ в 1.2-1.7 раза (рис. 3).
Экспрессия CDPK в клеточных линиях GV и 2сЗ женьшеня. В кальциевой сигнальной системе растений важную роль играют гены CDPK (Ludwig et al., 2004). Впервые анализ экспрессии генов CDPK в клеточных линиях женьшеня был проведен в 2007 г. (Киселев и др., 2008), но уровень выполненных работ был недостаточен, поэтому мы повторили анализ с привлечением большего количества клонов. Методом ПЦР с использованием вырожденных праймеров для генов CDPK для кДНК линий GV и 2сЗ были получены ампликоны ожидаемого размера. Эти ампликоны клонировали и секвенировали фрагменты нескольких CDPK, кодирующих часть киназного домена. Все части киназного домена по выведенной аминокислотной последовательности наиболее близки к известным CDPK растений. Аминокислотные последовательности CDPK женьшеня при выравнивании в программе BioEdit разделились на четыре подсемейства, как описано ранее у Р. ginseng (Киселев и др., 2008) и у CDPK A. thaliana (Cheng et al., 2002), им присвоили название PgCDPKl, PgCDPK2, PgCDPK3, PgCDPK4. Каждое подсемейство представлено несколькими генами, всего выделено 12 генов CDPK. Принцип разделения на гены был следующим: по нуклеотидным последовательностям фрагментов генов CDPK женьшеня, ограниченных вырожденными праймерами, определили аминокислотные последовательности. Основанием для выделения нового гена было отличие в аминокислотной последовательности секвенированного участка больше, чем на один аминокислотный остаток. Нуклеотидные последовательности, установленные по результатам трех независимых секвенирований, депонированы в GeneBank. Важно отметить, что в эмбриогенной линии женьшеня 2сЗ найдены CDPK, в серин-треонин киназном домене которых отсутствовал ряд субкаталитических доменов, а рамка считывания при этом сохранялась. Аминокислотные последовательности этих CDPK полностью идентичны ранее описанным генам и отличались только отсутствием нескольких аминокислотных остатков. Их объединили в группу PgCDPKl as или PgCDPK2ds (s - short).
Аминокислотная последовательность части киназного домена, определенная по результатам секвенирования PgCDPKla, среди известных
СБРК наиболее близка к ШСОРК1 (87% идентичности), PgCDPK2a - к АК:РК10 (84%), PgCDPKЗa - к (ЪСРК7 (94%), PgCDPK4a - к А1СОРК17 (94%). Интенсивность суммарной экспрессии генов СОРК, полученных на кДНК эмбриогенной линии 2сЗ, всегда была значительно ниже, чем у СУ (рис. 4). Этот эффект подтвержден результатами анализа кДНК из нескольких пассажей. Более 300 клонов СОРК векторной контрольной линии 6У и эмбриогенной линии 2сЗ было отсеквенироно и определена экспрессия каждого гена СОРК.
Рис. 4. Суммарная экспрессия генов СВР К. женьшеня в векторной линии вУ и эмбриогенной линии 2сЗ. *Р < 0.05.
В норме в каллусной линии СУ сильнее всего экспрессировались Р'¿СОРК 1а, PgCDPKlb и PgCDPKЗa. Экспрессия гена гоЮ и появление соматических эмбрионов приводило к достоверному снижению уровня экспрессии именно активно экспрессирующихся в контроле СОРК. PgCDPKla, PgCDPKlb и РёСОРКЗа (рис. 5). В линии 2сЗ женьшеня экспрессия этих генов была наименьшей из всех проанализированных проб кДНК и уступала уровню экспрессии генов PgCDPK2b и PgCDPK2d (рис. 5). Таким образом, нами было отмечено достоверное изменение экспрессии 10 транскриптов СОРК. Для подтверждения полученных результатов проведен следующий анализ.
R 0.2
rh r*i_ELÉL
N 0.2
lu lb le ld lu le 2a 2b 2c 2d 3(1. 2dL 3a 3b 4.
lb le ld las le 2a 2b 2c 2d 2ds 2dL За 3b 4a
Рис. 5. Экспрессия генов CDPK в контрольной клеточной линии GV, rolC-трансгенных 2с2, 2cR2 и эмбриогенной линии 2сЗ. *Р < 0.05, **Р < 0.01.
Анализ экспрессии генов СОРК женьшеня с помощью ПЦР-РВ. На основе известных нуклеотидных последовательностей генов СОРК провели ПЦР-РВ для подтверждения результатов экспрессии СОРК, полученных с помощью вырожденных праймеров. Оказалось, что оба метода выявляют сходную тенденцию: экспрессия генов PgCDPKla, PgCDPKlb, PgCDPKЗa уменьшается, а генов PgCDPK2b, PgCDPK2d увеличивается. Отмечены лишь небольшие отличия в степени увеличения или уменьшения уровня экспрессии анализируемых генов, но это можно отнести к ошибкам измерений и к тому,
что сигналы получены на разной кДНК. Таким образом, с помощью ПЦР-РВ было доказано, что экспрессия нескольких транскриптов СВРК действительно изменяется. Но, экспрессия каких генов СВРК имеет более важное значение для развития соматических эмбрионов в линии 2сЗ женьшеня? Для ответа на этот вопрос были проведены эксперименты по изучению экспрессии СВРК на разных стадиях развития соматических эмбрионов.
Экспрессия генов СВРК в клеточных агрегатах линии 2сЗ с разной степенью развития соматических эмбрионов: 2сЗ-ВВ, 2сЗ-Е8, 2сЗ-Ь8. Экспрессию генов СВРК определяли с использованием анализа частоты встречаемости клонированных ПЦР-продуктов и ПЦР-РВ. Фрагменты ожидаемой длины были получены с использованием вырожденных праймеров для кДНК клеточного штамма 1с, линий ОУ, 2сЗ и клеточных агрегатов 2сЗ-ОЭ, 2сЗ-Е8 и 2сЗ-ЬВ. Тотальная экспрессия генов СВРК в эмбриогенной линии 2сЗ и в различных клеточных агрегатах была в 1.8-2.0 раза ниже, чем в контрольном штамме клеток 1с и линии ОУ (рис. 6).
Рис. 6. Экспрессия генов СЭРК в клеточном штамме 1с, линиях 1с, вУ, 2сЗ и клеточных агрегатах 2сЗ-ОВ, 2сЗ-Е8, 2сЗ-Ь8. *Р < 0.05.
Экспрессия генов PgCDPKla, PgCDPKld и PgCDPKЗa в клетках рыхлого недифференцированного каллуса 2сЗ-00 значительно ниже, чем в контрольной линии ОУ (рис. 5А; рис. 7А). Однако экспрессия PgCDPKIc, PgCDPK2c и PgCDPKЗb достоверно возрастала (рис. 5А; рис. 7А).
В сравнении с каллусными клетками 2сЗ-ПО в клеточных агрегатах 2сЗ-Е8 выявлено несколько изменений в экспрессии внутри подсемейства PgCDPK2 (рис. 7Б). Так, уровень экспрессии PgCDPK2d возрос семикратно, в то время как уровень экспрессии PgCDPK2c - снижался. При анализе кДНК из клеточных агрегатов 2сЗ-Е8 обнаружен короткий химерный транскрипт СВРК. PgCBPK2ds(2d-ЗЬ) (рис. 7Б). Транскрипт PgCBPK2ds(2d-Зb) отличался от PgCBPK2d отсутствием 102 нуклеотидов, включая VI каталитический субдомен (рис. 8). Ранее (Киселев и др., 2008) были описаны подобные короткие транскрипты в го/С-трансгенных линиях женьшеня, однако в полученных транскриптах PgCBPK2dsl и PgCBPK2ds2 отсутствовали 132 и 15 нуклеотидов, соответственно (рис. 8). Транскрипт PgCBPK2dsl был обнаружен ранее в кДНК линии 2сЗ, транскрипт PgCBPK2ds2 в кДНК линии 2сЯ2 (Киселев и др., 2008). Первая часть короткого химерного транскрипта PgCBPK2ds(2d-Зb) идентична таковой транскрипта PgCBPK2d, в то время как вторая его часть такая же, как у
транскрипта PgCDPK3b. Таким образом, PgCDPK2ds(2d-3b) - это химерный короткий транскрипт.
а 0.4
2C3-DD
Ib le Id le 1ая 2а 2b 2с 2d 2ds 2dL За 3b
2c3-ES
la Ib le Id le las 2a 2b 2c 2d 2d» 2dl, 3a 3b 4a
2c3-LS
В Рис. 7. Экспрессия отдельных генов СИРК в клеточных агрегатах эмбриогенной клеточной линии 2сЗ: гсЗ-ЭЭ (А), 2сЗ-Е8 (Б) и 2сЗ-Ь8 (В). *Р < 0.05, **Р <0.01 в сравнении с
Ib le Id le 1ая 2а 2Ь Zc 2d 2dj 2dl, За 3b
P«C6Ff¡b PaCDPKi* PgCDPKla P^COPnias pgcnpxl* PgcoPSld
P?CüPK-í-áí <2d-3bí
РЭСйРЮЬ
PflCüPKU
P9CPK.it.
PflC&PKj*
pqr.tWb
P^CDPKSd
faCDPX2ds2
PíCOPSÍdsJ
P9CDPK44 PflCW
¡Vital)
LCACaiFCRIIA^H-^gRA^ATICRCílS'M^/HVCMFWSvMMROLKPENR-
LCAJ^tFCRlIAKCHV^gKAAA^CRSr^^WHfMíTWRriLHPEh»: LCECS3E LP Cfc IVAK04Y3É RAA---------------------j........
splkaiocc«.
LCS<^krCRXVA«<WySfRAAAAVARTVAEVVRMC)eS5VamOFKPr»if LC £CSE Í.FCP X KAAAAVART V*EW8 S----—4-—......
-U.S«06 «HJÍATOPQlKXffIGtGX\Wl)n4»A^VAFEXrt..R8SYfi^Eirav«;AüVXÍ.YIl.L$GV -i-LSSKNC - - - -i.....4......OKV^OXVGSAvWAÍ 5VLS&YG& XOIVvSAGVlt YILÍ.5GE
-lYSCfiMS ------
•I.U.STAE
-LlYTiSOCPSl^I&FCLií^fKPt^T&vV^PYWW
-IFMWKg Sn^X&r^irfKPGE'KrSEIveS'Pv^Ar-rvVK^'WCIDXV^ACVIt.VlLtC'rv'
VIH
IX
----------------------------------------------------- - ------------------- ...viieKPsSlV^VM^íVtKWrWSEXOVWSAeWl.FIttCCV
-----------SEIVÍSPVy»<^PE>l.SRNy<»»f:IDVVS>.GylvrXl.LC«4'
U.LNXOE
• .......- SM.WtW»«"' -----------------ь----------------- -------- ■
¿V tul ¿ A^fc VT. ».ЦК rijFfc vi> i w» l UVMI. VJ t Ijv
--«IVGSAYVXAPCvA.^Pf-v^evtlX'HSItSíMi.VXv.V.cev
Рис. 8. Выровненные аминокислотные последовательности части киназного домена генов CDPK, выделенных из контрольной линии GV и ro/C-трансгенных линиях Р. ginseng. Примечание: (-) - отсутствие аминокислотных остатков, (*) -консервативные аминокислотные остатки.
Экспрессия CDPK в 2c3-LS сильно отличается от таковых в других клеточных агрегатах линии 2сЗ. Все CDPK транскрипты, описанные выше, экспрессировались гораздо слабее, за исключением транскрипта PgCDPKla (рис. 7В). Доминирующим транскриптом на этой стадии развития соматического эмбриогенеза является PgCDPK2dL (рис. 7В). Нуклеотидная последовательность данного транскрипта близка к PgCDPK2d, с той лишь разницей, что внутри VIII каталитического субдомена располагается достаточно длинная вставка из 53 нуклеотидов (рис. 9). Эта инсерция приводит к сдвигу рамки считывания и образует несколько преждевременных стоп-ко донов (рис. 9).
ПЦР-РВ CDPK на разных стадиях морфологической дифференциации. ПЦР-РВ использовался нами для подтверждения результатов, полученных с помощью вырожденных праймеров. Нами было показано, что оба метода имеют схожие результаты, хотя значения экспрессии CDPK варьировали, что может быть объяснено ошибкой измерения или тем фактом, что ПЦР-сигнал
был получен при использовании разных проб кДНК. В общем, экспрессия подсемейства PgCDPKl в линии 2сЗ по сравнению с контролем СУ уменьшалась. Экспрессия Р§СОРК2а и PgCDPK2b увеличивалась в 3 раза на ранних и поздних стадиях соматического эмбриогенеза в сравнении с контролем. Экспрессия PgCDPK2d значительно возрастала в на ранних и поздних стадиях эмбриогенеза в сравнении с контролем. Экспрессия PgCDPK2dL сильно возрастала в 2сЗ-Ь8 в сравнении с вУ.
е<юш<а i Реейсм 1
egcnadi PqCPKld Ш j
1С К й с StF&illHAfcGHYSERAATAVART VA Е И V R Н С Н
1 с * с- с I L yt'RIVAKGHYS S &AAAAVART VAXVVRHCH
,У," ... I „. ... (., Vll„s | m
Т> С О V I К К t> L К » В V Í ( Ь Т А Л К К JHS Г 1 К | А t l I l l | ' V 1 I1
t> S С V I KSD*K¿«»fMLfAííKKt»Sl>LKlA IDfCLiSVfy
exiJi tsi FBCPKM ZZ1
ШЯМИ^ШШШ и I В ^^^^^^ ь ь Т S ^^ Г I А Т f К 5> С S К F 3 % I V CS S Y IK с н i ? i о с r i У .й... Л ..........Р г......._ ..........
VXltlllCGV
Рис. 9. Выровненные аминокислотные и нуклеотидных последовательностей части киназного домена транскриптов PgCDPK2d и PgCDPK2dL, выделенных из клеточных линий P. ginseng. Примечание: пунктиром обозначена инсерция 53 п.н. Стрелками указаны стопкодоны, прямоугольниками отмечены VI—IX каталитические субдомены.
Структура и экспрессия гена PgCDPKla в корнях, листьях и клеточных линиях женьшеня. Наши первые попытки изучения экспрессии генов CDPK женьшеня с использованием вырожденных праймеров, описанные выше, показали, что в линиях женьшеня экспрессируется от 15 до 20 различных транскриптов CDPK. Далее была секвенирована полная последовательность к ДНК первого гена CDPK P. ginseng - PgCDPKla. С помощью метода ПЦР-РВ проанализирована экспрессия PgCDPKla в листьях, корнях и клеточных линиях женьшеня с разным уровнем синтеза гинзенозидов и разным уровнем экспрессии патоген-связанных генов и устойчивости к солевому стрессу. Используя 5', 3' RACE амплификацию мы получили полную кДНК PgCDPKla (GeneBank GU137295). Показана высокая гомология (80% идентичности) между PgCDPKla, LeCDPKl и NtCDPKl на белковом уровне. Данные киназы (PgCDPKla, LeCDPKl и NtCDPKl) имеют сходные структуры: амино-концевая часть содержит каталитический серин-треониновый киназный домен, карбоксильный домен содержит кальмодулин-подобный домен с четырьмя предполагаемыми Са2+ -связывающими доменами. Между киназным и кальмодулин подобным доменом располагается связыващий домен. Каталитические субдомены (I—IX), связывающий домен и кальмодулин подобный домен PgCDPKla обнаруживают 90-95% гомологии с соответствующими доменами гена CDPK1 табака (NtCDPKl), что доказывает высокую консервативность данных доменов между генами таких разных семейств как Araliacea и Nicotiana. Гены
PgCDPKla и NtCDPKl имеют гомологичные участки (45% гомологии) в пролин-глицин-богатых последовательностях. В отличие от этих двух киназ, LeCDPKl не содержит пролин-глицин-богатых последовательностей. Филогенетические отношения киназ с несколькими представителями кальций-зависимых протеинкиназ, ответственных за защитные механизмы (Levy et al., 2004) представлены на рис. 10. PgCDPKla, NtCDPKl, LeCDPKl являются представителями отдельного кластера филогенетического древа (рис. 10).
Рис. 10. Филогенетическое дерево основных представителей кальций-зависимых протеинкиназ, полученное методом объединения ближайших соседей. PgCDPKla, NtCDPKl, LeCDPKl составляют отдельный кластер на филогенетическом древе.
Экспрессия PgCDPKla в клетках Р. ginseng. Экспрессию PgCDPKla проанализировали в листьях и корнях двухлетнего дикорастущего женьшеня и женьшеня из коллекционного питомника. Активно растущие листья собраны в июле 2009 г.; листья, завершающие рост - в сентябре этого же года. Корни растений из питомника были разделены на две группы - медленно растущие основные корни и быстрорастущие молодые тонкие корни. Наивысший уровень экспрессии PgCDPKla был отмечен в активно растущих молодых листьях и корнях (рис.11). Экспрессия PgCDPKla в листьях дикорастущих растений была в 1.3-1.9 раза ниже, чем экспрессия в листьях интродуцированных растений (рис. 11). Уровень экспрессии данного гена в клеточных линиях Р. ginseng GV, 2с2 и GB был проанализирован, и свойства этих линий описаны нами подробно в статье (Kiselev et al., 2010). Самая низкая экспрессия PgCDPKla определена в эмбриогенной линии 2сЗ, что в 4 раза ниже в сравнении с экспрессией в GV (рис. 12Б). Линия GV была использована для анализа экспрессии PgCDPKla при разных условиях культивации клеток: различные концентрации ауксина и NaCl.
А !
s 0.8 \ Й 0-6 \
X
Ü о.б
_____
_
Рис. 11. Экспрессия PgCDPKla в листьях и корнях Р. ginseng. J-L-ON - РНК выделена из активно растущих листьев интродуцированных растений; J-L-W - РНК выделена из листьев дикорастущих растений; S-L-ON - РНК выделена из завершающих рост листьев интродуцированных растений; S-L-W - РНК выделена из листьев дикорастущих растений; J-Rb-ON - РНК выделена из медленно растущих
основных корней интродуцированных растений; - РНК выделена из активно
растущих молодых тонких корней интродуцированных растений.
Й
ñ h
3 i
i
° 0.8
5 0.6
3
£ 0.4 ;
8 0.2
I
fí o •
GV 2c2 2c3 GB CII 2cR2
GB CII 2cR2
í 3
I
I 2
и 0
íi
H
J±L
GV 0.01 CV 0 1 GV0.J CV 0.4 GV a
3 1
к
0.8
£ 0.6 g
a 0.4
I °'2
I o
QJLfl
jíl
N.n. NeClb NeCU
GV Zb GV Ih GV4h GV4h GV 24h GV 24h GV 3Sd CV 35d
Рис. 12. Прирост сырой биомассы (А, В) и экспрессия гена PgCDPKla (Б, Г) в клеточных линиях йУ, 2с2, 2с112, СП, 2сЗ и вВ. вУ 0.01 - линия вУ, растущая на среде с концентрацией 4-СРА 0.01 мг/л; йУ 0.1 - вУ на среде 0.1 мг/л 4-СРА; ¿¡V 0.4 -вУ на среде с 0.4 мг/л 4-СРА; ОУО.4 + №С1а - йУ на среде с 0.4 мг/л 4-СРА и 60 мМ ЫаС1; йУ0.4 + ШС1Ь - йУ на среде с 0.4 мг/л 4-СРА и 100 мМ №С1; СУ0.4 + КаС1 -БУ на среде с 0.4 мг/л 4-СРА и 200 мМ ЫаС1; йУ 1 - на среде с 1 мг/л 4-СРА; *Р < 0.05, **Р < 0.01.
Показано, что прирост биомассы и уровень экспрессии PgCDPKl а в линии GV положительно коррелирует с концентрацией ауксина в питательной среде. Наивысший уровень экспрессии данного гена в линии GV зафиксирован при содержании ауксина 4-СРА в среде в концентрации 1 мг/л, в то время как уровень экспрессии гена значительно снижался при понижении концентрации этого гормона (рис. 12Г). Интересно, что экспрессия гена PgCDPKla значительно снижалась в условиях солевого стресса в линии GV (рис. 12Г).
ОБСУЖДЕНИЕ
CDPK играют важную роль в процессе соматического эмбриогенеза в го/С-трансгенной линии 2сЗ Р. ginseng. Предполагаемый механизм эмбриогенеза в линии 2сЗ. Кальциевая сигнальная система играет одну из ключевых ролей в регуляции большинства физиологических процессов в клетках растений (Lecourieux et al., 2006), в том числе эмбриогенеза (AniJ, Rao, 2000). Результаты наших опытов с ингибиторами кальциевых каналов показывают, что подавление притока кальция в цитоплазму блокирует соматический эмбриогенез в эмбриогенной линии 2сЗ. Более того, добавление ионофора А23187 достоверно увеличивает количество соматических эмбрионов в линии 2сЗ. Эти результаты свидетельствуют о том, что активация процессов эмбриогенеза геном rolC в линии 2сЗ связана с поступлением
кальция в клетку. Возможно, rolC, изменяя работу кальциевой сигнальной системы, прямо или опосредованно влияет на чувствительность клеток к кальцию. Одним из результатов такого влияния может быть модификация основных сенсоров кальция в клетках растений - CDPK. Интерес к генам CDPK усиливали результаты опытов с ингибиторами киназ и данные индийских ученых (Anil, Rao, 2000), обнаруживших у сандалового дерева S. album белок swCDPK, активность которого повышена в эмбриогенной линии 2сЗ и прямо коррелирует с [Са2+]цих.
Первые результаты анализа экспрессии CDPK с использованием вырожденных праймеров поставили под сомнение данные индийских ученых (Anil, Rao, 2000), т.к. суммарная экспрессия CDPK в эмбриогенной линии 2сЗ уменьшалась в 2 раза. Более детальный анализ показал, что в линии 2сЗ на фоне уменьшения экспрессии генов PgCDPKla, PgCDPKlb, PgCDPK3a и увеличения экспрессии PgCDPKlb появляются новые CDPK, которых нет в контроле: PgCDPKlas, PgCDPK2d, PgCDPK2ds. Возможно, новые транскрипты CDPK, экспрессия которых возросла в эмбриогенной линии 2сЗ, являются аналогами swCDPK сандалового дерева, нуклеотидная последовательность которой до сих пор не опубликована, что не позволяет проанализировать сходство между swCDPK и генами CDPK женьшеня.
Несмотря на усилия многих исследователей, еще нет полного понимания механизма действия CDPK, не известны субстраты, функции и регуляция экспрессии генов CDPK. Первые шаги, сделанные нами, показывают, что в клетках женьшеня экспрессируется несколько транскриптов CDPK. Возможно, есть CDPK, которые еще не выявлены, но на основе имеющихся аминокислотных последовательностей определены четыре филогенетические ветви. У арабидопсиса и риса также обнаружены четыре подсемейства CDPK, это говорит о том, что нами найдены все основные подсемейства CDPK женьшеня. У большинства CDPK женьшеня секвенирован фрагмент, кодирующий часть серин-треонин киназного домена, но известно (Cheng et al., 2002), что на основе только этого домена можно успешно отнести CDPK к существующим подсемействам, и различия в серин-треонин киназном домене должны, вероятно, сказываться на функциях CDPK. Возможно, и в нашем случае есть CDPK с разными функциями. Подсемейство PgCDPKl (особенно PgCDPKla, PgCDPKlb) и PgCDPKl (PgCDPKla) активно экспрессируются в контрольной каллусной быстрорастущей линии GV. Гены из группы PgCDPKla по кодируемой аминокислотной последовательности близки к VCPK1 винограда Vitis labrusca * V. vinifera, которая способствует приросту биомассы в культуре клеток (Yu et al., 2007). Сходный результат получен и в наших опытах: в трансгенных линиях женьшеня снижение прироста биомассы клеток коррелировало с уменьшением экспрессии PgCDPKla. Аминокислотные последовательности, кодируемые PgCDPKla и PgCDPKlb, наиболее близки к NtCDPKl, который активно экспрессируется в быстро делящихся тканях и клеточных культурах растений. NtCDPKl взаимодействует с 26S протеасомой и катализирует процессы деградации многих ферментов и регуляторных белков, способствуя переходу клеток к
делению (Lee et al., 2003). Возможно, в норме в контрольной линии GV деградации подвергается ряд белковых факторов, инициирующих процессы морфогенеза, поэтому соматические эмбрионы из этой линии получить не удалось. Согласно этому сценарию, экспрессия rolC привела к уменьшению экспрессии PgCDPKla и PgCDPKlb, что понизило активность 26S протеасом и увеличило концентрацию белковых факторов, запускающих соматический эмбриогенез. В эмбриогенной линии 2сЗ активно экспрессируется подсемейство PgCDPK2 (PgCDPK2b, PgCDPK2d), наиболее близкое к AtCPK30. AtCPK30 - это кальциевый сенсор, вовлеченный в проведение гормональных сигналов и участвующий в образовании корней растений. Повышенная экспрессия гена AtCPK30 коррелировала с процессами морфогенеза в культурах клеток и органов растений (Yuan et al., 2007).
Сравнение экспрессии CDPK в клеточных агрегатах линии 2сЗ с разной степенью развития соматических эмбрионов (2c3-DD, 2c3-ES и 2c3-LS) показали наиболее интересные результаты. Клетки в 2c3-DD и 2c3-ES имели сходную картину экспрессии CDPK, однако обнаружена разница в экспрессии, которая заключалась в высокой экспрессии PgCDPK2d и PgCDPK2ds(2d-3b) на ранних стадиях соматического эмбриогенеза. Транскрипты PgCDPK2d и PgCDPK2ds(2d-3b) являются доминирующими в 2сЗ-ЕБ. Напротив, на поздних стадиях развития соматических эмбрионов ген PgCDPK2dL уже является доминирующим среди других CDPK. PgCDPK2dL близок по нуклеотидному составу к PgCDPK2d, следовательно, изменения в экспрессии генов внутри подсемейства PgCDPK2d наиболее значимы в процессе инициации и развития соматического эмбриогенеза женьшеня. Таким образом, при развитии соматических эмбрионов в линии 2сЗ появляются новые CDPK, наблюдается активация экспрессии некоторых CDPK. Известно несколько примеров, где в качестве белков-мишеней для CDPK могут выступать факторы транскрипции (Ludwig et al., 2004), значит, WUS являются белками, с которыми могут взаимодействовать новые CDPK. Известно, что WUS участвуют в инициации развития соматических эмбрионов растений (Klimaszewska et al., 2011), поэтому можно предположить, что соматических эмбрионы появляются в линии 2сЗ вследствие экспрессии новых белков CDPK которые активируют WUS и тем самым запускают процесс эмбриогенеза.
Наличие коротких (.PgCDPK2ds(2d-3b)) и длинных транскриптов (PgCDPK2dL) CDPK в кДНК из различных клеточных агрегатов линии 2сЗ на разных стадиях соматического эмбриогенеза является любопытным явлением. В обзоре Нишияма (Nishiyama et al., 1999) говорит о том, что существует лишь один известный случай альтернативного сплайсинга CDPK, при котором участок, кодирующий руки связывания с кальцием, подвергался видоизменениям. Имеются данные о том, что модификациям альтернативного сплайсинга также подвержены гены МАРК риса (Xiong, Yang, 2003). Короткие транскрипты МАРК получались при вырезании III—VI субдоменов каталитического серин-треонин киназного домена, что приводило к снижению киназной активности белкового продукта. Таким образом,
существует несколько примеров подобных структурных изменений в киназах растений, сходных с возможными посттранскрипционными модификациями, наблюдаемыми в PgCDPK2dL. Однако известны и другие работы, в которых описываются изменения, напоминающие именно модификации PgCDPK2dL. В работе (Wei et al., 2007) описали три варианта специфичной для семенников мыши серин-треонин киназы, образованных благодаря процессу альтернативного сплайсинга. Эти изоформы содержали инсерцию из 10 аминокислотных остатков в IV области. Белковые продукты после сплайсинга не обладали киназной активностью. Появление стопкодонов в длинном транскрипте CDPK может приводить к тому, что будут синтезироваться короткие белковые продукты CDPK, лишенные киназной активности. Либо транскрипт PgCDPK2dL может служить мишенью для нонсенс-опосредованного разрушения мРНК (Baker, Parker, 2004), что приводит к деградации мРНК. Таким образом, для установления функций подобных транскриптов должны быть проведены дополнительные исследования.
На основе наших данных можно предположить, что соматический эмбриогенез растений опосредован Са2+-сигнальной системой. Под действием гена rolC происходит дисбаланс в кальциевой сигнальной системы. Далее происходит, возможно, активация определенных белков, что, в свою очередь, приводит к увеличению экспрессии генов WUS, что мы наблюдали в эмбриональной клеточной линии 2сЗ. Активные формы белков WUS приводят к постоянному эмбриогенному стимулу в 2сЗ. Инициация эмбриогенеза у растений обусловлена, в какой-то мере, увеличением или уменьшением экспрессии определенных генов CDPK. У женьшеня это PgCDPKla, PgCDPKlb, PgCDPK2b, PgCDPK2d и PgCDPK3a. Возможно, определенную роль в инициации эмбриогенеза в клеточной линии 2сЗ играет появление коротких и длинных мРНК CDPK, значение которых еще предстоит понять. Доказательство этого предполагаемого механизма образования соматических эмбрионов в линии 2сЗ является нашей дальнейшей работой.
PgCDPKla - позитивный регулятор клеточного роста женьшеня. Нами получена полная последовательность к ДНК гена PgCDPKla женьшеня и проанализирована его экспрессия в различных условиях культивирования клеток, в том числе и в клетках растения P. ginseng. Выявлена позитивная корреляция между приростом сырой биомассы в клетках женьшеня и экспрессией гена PgCDPKla. Также обнаружена неявная негативная корреляция между экспрессией патоген-связанных генов и содержанием гинзенозидов с экспрессией PgCDPKla, потому что экспрессия этого гена понижена в линии 2cR2 с более высоким содержанием гинзенозидов и экспрессией патоген-связанных генов (Bulgakov et al., 1998; Kiselev et al., 2006). Возможно, PgCDPKla вовлечен в ростовые процессы женьшеня и является позитивным регулятором клеточного роста. Недавние исследования (Lee et al., 2003), связанные с вирус-индуцируемым замолканием гена NtCDPKl табака, показали, что существует корреляция между степенью ингибирования экспрессии NtCDPKl и степенью индукции генов, ответственных за механизмы защиты данного растения. Чем сильнее степень
ингибирования гена NtCDPKl, тем выше экспрессия генов, ответственных за механизмы защиты (Lee et al., 2003). Так и в нашем случае уровень содержания мРНК гена PgCDPKla уменьшался при увеличении экспрессии защитных генов, таких как PAL и бета-1,3-глюканазы в линиях CII и 2cR2 (Kiselev et al., 2006; Persiyanova et al., 2008).
Несмотря на то, что гены CDPK вовлечены в механизмы защиты растений от биотического и абиотического стресса, они признаны как индуцибельные гены (Ludwig et al., 2004), но имеется несколько примеров, когда ингибирование экспрессии CDPK ассоциировано с активацией защитных реакций в растении. Учитывая высокую гомологию генов NtCDPKl, PgCDPKla и LeCDPKl, можно предположить существование высококонсервативной группы CDPK, которые выполняют сходные функции в растении. Их функционирование может служить связующим звеном между клеточным ростом и защитным контролем в клетке.
ВЫВОДЫ
1. Добавление ингибиторов кальциевых каналов и ингибиторов протеинкиназ в питательные среды достоверно уменьшало в 1.3-6.7 раза количество соматических эмбрионов в эмбриогенной клеточной линии женьшеня 2сЗ, напротив добавление ионофора А23187 достоверно увеличивало количество соматических эмбрионов в 1.2-1.7 раза. Это указывает на то, что кальциевая сигнальная система участвует в регуляции соматического эмбриогенеза растений.
2. В каллусной контрольной линии женьшеня GV полностью отсутствовала экспрессия генов WUS, в то время как в эмбриогенной линии 2сЗ присутствовали транскрипты 8-ми различных генов WUS, что подтверждает эмбриогенную природу клеточных агрегатов линии 2сЗ.
3. В го!С-трансгенной линии 2сЗ изменена экспрессия генов CDPK по сравнению с контрольной линией GV: достоверно увеличена экспрессия PgCDPKlc, PgCDPK2b, PgCDPK2d и PgCDPK3b\ достоверно уменьшена экспрессия PgCDPKla, PgCDPKlb, PgCDPK3a и PgCDPK4a; появлялись транскрипты, в киназном домене которых выпадает несколько аминокислот (PgCDPK2ds).
4. По мере развития соматических эмбрионов в клеточной линии женьшеня 2сЗ значительным изменениям в экспрессии подвергалось подсемейство PgCDPK2d {PgCDPK2d, PgCDPK2ds и PgCDPK2dL): на ранних стадиях соматического эмбриогенеза достоверно активировалась экспрессия PgCDPK2d и появлялись транскрипты, в киназном домене которых выпадают несколько аминокислот (PgCDPK2ds)\ поздние стадии характеризовались появлением экспрессии доминирующего транскрипта PgCDPK2dL, в последовательности киназного домена которого встречаются стоп-кодоны.
5. Впервые получена полная последовательность белок кодирующей части кДНК CDPK женьшеня Р. ginseng - PgCDPKla. Обнаружена положительная корреляция между приростом сырой биомассы клеток Р. ginseng и экспрессией PgCDPKla и отрицательная корреляция между
уровнем экспрессии патоген-связанных генов и содержанием гинзенозидов с уровнем экспрессии PgCDPKla. Таким образом PgCDPKla, возможно, является позитивным регулятором роста клеток женьшеня.
Список работ по теме диссертации:
Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах из списка ВАК:
1. Kiselev K.V., Turlenko A.V., Zhuravlev Y.N. 2009. CDPK gene expression in somatic embryos of Panax ginseng expressing rolC II Plant Cell Tissue and Organ Culture. V. 99. P. 141-149.
2. Kiselev K.V., Turlenko A.V., Zhuravlev Y.N. 2009. PgWUS expression during somatic embryo development in a Panax ginseng 2c3 cell culture expressing the rolC oncogene // Plant Growth Regulation. V. 59. P. 237-243.
3. Kiselev K.V., Turlenko A.V., Zhuravlev Y.N. 2010. Structure and expression profiling of a novel calcium-dependent protein kinase gene PgCDPKla in roots, leaves, and cell cultures of Panax ginseng II Plant Cell Tissue and Organ Culture. V. 103. P. 197-204.
Работы, опубликованные в материалах региональной, всероссийских и международных научных конференций:
4. Киселев К.В., Турленко А.В. 2008. Механизм соматического эмбриогенеза в культурах клеток женьшеня, экспрессирующих онкоген rolC И В сборнике тезисов IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология", Звенигород, Россия, С. 176-177.
5. Турленко А.В., Киселев К.В. 2008. Экспрессия генов CDPK на разных стадиях развития соматических эмбрионов в культуре клеток женьшеня Panax ginseng, экспрессирующей агробактериальный ген rolC // Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии. Владивосток. С. 8-10.
6. Турленко А.В., Киселев К.В. 2009. Экспрессия генов WUS на разных стадиях развития соматических эмбрионов в культуре клеток женьшеня Panax ginseng, экспрессирующей агробактериальный ген rolC // XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. С. 89.
7. Turlenko A.V., Kiselev K.V. 2009. Changes of CDPK genes expression during embryogenesis in Panax ginseng ro/C-expressing cell culture 2c3 // Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. V. 51. P. 24.
8. Турленко A.B., Киселев К.В. 2010. Структура и экспрессия кальций зависимой протеинкиназы PgCDPKla в корнях, листьях и клеточных культурах женьшеня Panax ginseng II XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. С. 72.
ТУРЛЕНКО АННА ВЛАДИМИРОВНА
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ В ПРОЦЕССЕ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА ЖЕНЬШЕНЯ Panax ginseng С. A. MEYER
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Подписано в печать 20.05.2011. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №325 Отпечатано в типографии РПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского 690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Турленко, Анна Владимировна
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
I. Женьшень, как важный биотехнологический объект.
1.1. Систематическое положение и биологическая характеристика.
1.2. Состав биологически активных веществ женьшеня.
1.3. Лекарственные свойства женьшеня.
II. Общие аспекты эмбриогенеза в культуре клеток растений.
1.3. Размножение и развитие высших растений.
1.4. Соматический эмбриогенез растений в культуре клеток.
1.5. Применение в биотехнологии соматического эмбриогенеза растений.
1.6. Получение соматических эмбрионов женьшеня в культуре клеток.
III. Молекулярные аспекты.регуляции соматического эмбриогенеза и клеточной дифференциации растений.
1.7. Генетические маркеры соматического эмбриогенеза растений.
1.8. Семейство транскрипционных факторов WOX/WUS.
IV. Кальциевая сигнальная система и процесс эмбриогенеза.
1.9. Общая роль кальциевой сигнальной системы в клетке.
1.10. Участие кальциевой сигнальной системы в регуляции морфогенеза и эмбриогенеза растений. Кальций-зависимые протеинкиназы.
1.11. Направление исследований в изучении эмбриогенеза растений.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Растительный материал и клеточные культуры.
2.2. Обработка ингибиторами и ионофором А23187.
2.3. Выделение нуклеиновых кислот.
2.4. Условия проведения ОТ-ПЦР.
2.5. Секвенирование ДНК.
2.6. Анализ экспрессии генов WUS и CDPK на основе ОТ-ПЦР.
2.7. Условия проведения ПЦР-РВ.
2.8. Статистический анализ полученных результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Морфология клеток и экспрессия гена rolC в культурах женьшеня, используемых в работе.
3.2. Анализ экспрессии генетического маркера эмбриогенеза растений WUS в культурах клеток женьшеня.
3.3. Влияние ингибиторов кальциевых каналов, ингибиторов протеинкиназ и ионофора А23187 на эмбриогенез в культуре клеток женьшеня 2сЗ.
3.4.1. Экспрессия CDPKв культурах клеток GV и 2сЗ женьшеня.
3.4.2. Экспрессия CDPKв клеточных агрегатах культуры 2сЗ с разной степенью развития соматических эмбрионов.
3.4.3. Структура и экспрессия гена PgCDPKla в корнях, листьях и клеточных культурах женьшеня.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. CDPK играют важную роль в процессе соматического эмбриогенеза в го/С-трансгенной культуре 2сЗ Р. ginseng.
4.2. Возможные гены CDPK ответственные за инициацию соматического эмбриогенеза в 2сЗ культуре женьшеня.
4.3. Гипотетические функции «коротких» и «длинных» транскриптов CDPK женьшеня.
4.4. PgCDPKla - позитивный регулятор клеточного роста женьшеня.
4.5. Предполагаемый механизм эмбриогенеза в культуре клеток 2сЗ.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия генов кальций-зависимых протеинкиназ в процессе соматического эмбриогенеза женьшеня Panax ginseng C.A. Meyer"
Женьшень настоящий Panax ginseng С.А. Meyer на сегодняшний день является одним из наиболее известных и ценных лекарственных растений. Возросший интерес к препаратам на основе женьшеня ставит под вопрос возможность существования данного реликтового растения в дикой природе и, кроме того, создает проблему получения источника сырья. Помочь решить ее может биотехнологический способ получения женьшеня, в основе которого лежит процесс образования соматических эмбрионов. Поэтому изучение регуляции соматического эмбриогенеза редких и исчезающих видов важно для биотехнологии.
Соматический эмбриогенез у растений зависит от большого числа внешних и внутренних факторов. Например, на данный момент известно более сотни генов, экспрессия которых влияет на соматический эмбриогенез (Karami et al., 2009). Стало понятно, что все данное множество факторов, приводящее в итоге к формированию соматических эмбрионов, должно t регулироваться единым механизмом. Представленная работа - это попытка найти такой регуляторный механизм.
Известно, что в сложной сети передачи информации ионов кальция служит универсальным посредником, поскольку ни один второй посредник не реагирует на столь большое число стимулов, как свободный Са цитозоля. Главными сенсорами кальция в клетках растений являются кальций-зависимые протеинкиназы (CDPK), которые принадлежат к эукариотическим протеинкиназам, катализирующим обратимый перенос фосфата с АТР на боковые цепи аминокислотных остатков в составе белка. Реакции фосфорилирования/дефосфорилирования оказывают значительное воздействие на активность белков и их взаимодействие с другими белками. Предполагается, что у растений большая часть киназной активности, которая стимулируется кальцием, связана именно с CDPK.
Ранее было показано, что кальцивая сигнальная система вовлечена в регуляцию соматического эмбриогенеза (Anil, Rao, 2000), но оставалось непонятным, как эта система может регулировать сразу столько много процессов. Полногеномное секвенирование двух таксономически далеких видов растений Oryza sativa (однодольные) и Arabidopsis thaliana (двудольные) показало, что они содержат 27 и 34 генов CDPK, соответственно (Cheng et al., 2002; Asano et al., 2005). По-видимому, это может свидетельствовать о выполнении разными CDPK различных функций. Постоянно пополняемый список белков-мишеней CDPK включает мембранные транспортные белки (ЬГ-АТРазу плазмалеммы, калиевые и анионные каналы замыкающих клеток устьиц, аквапорины и др.), факторы транскрипции, ферменты (сахарозофосфатсинтаза, нитратредуктаза, фенилаланин-аммиаклиаза), белки цитоскелета и другие мишени. Таким образом, CDPK включены в передачу Са2+ -сигнала, связанного с поддержанием мембранного потенциала, регуляцией углеводного и азотного обмена, движениями устьиц, ответом на стрессовые воздействия, формированием архитектуры клетки, эмбриогенезом и т.д.
Цель и задачи исследования
Главная цель представленной работы состояла в изучении участия кальциевой сигнальной системы в появлении соматических эмбрионов растений. В качестве модельной системы для изучения соматического эмбриогенеза мы использовали эмбриогенную культуру клеток женьшеня1 2сЗ, другие ro/C-трансгенные культуры клеток женьшеня из коллекции лаборатории биотехногии БПИ ДВО РАН и интактные растения Р. ginseng.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить внешнюю структуру соматических эмбрионов в rolC-трансгенной культуре клеток 2сЗ Р. ginseng при длительном культивировании. Подтвердить то, что наблюдаемые структуры являются соматическими эмбрионами с помощью анализа экспрессии генов-маркеров эмбриогенеза: генов гомеобокс-содержащих транскрипционных факторов WUSCHEL ( WUS).
2. Исследовать влияние ингибиторов кальциевых каналов, протеинкиназ и ионофора А23187 на развитие соматических эмбрионов в культурах клеток женьшеня.
3. Получить нуклеотидные последовательности частей генов CDPK женьшеня Р. ginseng и изучить экспрессию этих генов в разных культурах Р. ginseng. Создать базу наиболее часто встречаемых генов CDPK и подготовить основу для более точного изучения экспрессии описанных генов. Изучить экспрессию генов CDPK на разных стадиях развития соматических эмбрионов в культуре клеток 2сЗ женьшеня.
4. Получить полные последовательности комплементарной ДНК (кДНК) генов CDPK женьшеня, сделать более детальный анализ экспрессии каждого гена CDPK. Выявить гипотетические функции белковых продуктов наиболее важных генов CDPK.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Соматические эмбрионы в культуре клеток женьшеня 2сЗ проходили стадии глобулы, сердечка и иногда достигали* стадии торпедо. У соматических эмбрионов отмечено достоверное повышение экспрессии генов WUS — генов-маркеров эмбриогенеза растений.
2. Воздействие ингибиторов кальциевых каналов и кальций-зависимых протеинкиназ приводит к достоверному снижению количества соматических эмбрионов в rol С-трансгенной культуре женьшеня 2сЗ. Напротив, добавление ионофора А23187 достоверно увеличивает количество соматических эмбрионов, это говорит об участии кальциевой сигнальной системы в регуляции соматического эмбриогенеза растений.
3. В эмбриогенной культуре клеток женьшеня 2сЗ по сравнению с каллусной культурой GV достоверно повышена экспрессия 4 генов CDPK СPgCDPKlc, PgCDPK2b, PgCDPK2d, PgCDPK3b); достоверно снижена экспрессия 4 генов СИРК (РёСВРК1а, РёСВРК1Ъ, РёСОРКЗа, РёСОРК4а) Кроме того, появляются транскрипты СИРК с необычными модификациями последовательности Зег/ТИг-киназного домена {РёСОРК1а$, РёСОРК2с1з).
4. На ранних стадиях развития соматических эмбрионов женьшеня по сравнению с недифференцированными каллусными клетками культуры 2сЗ достоверно повышена экспрессия 2 генов СИРК (Р§СНРК2с1, PgCDPK2ds) тогда как экспрессия PgCDPK2c достоверно понижена. На поздних стадиях развития соматических эмбрионов по сравнению с недифференцированными каллусными клетками культуры 2сЗ достовено повышена экспрессия генов 3 генов СВРК СИРК1е, Р^СИРК2с1,, PgCDPK2dL), тогда как экспрессия 4 генов СВРК достоверно понижена (РёСЭРК1Ъ, PgCDPKlc, PgCDPK2c, PgCDPKЗb).
5. PgCDPKla активно экспрессируется в молодых, активно растущих культурах и тканях женьшеня, на основании чего можно отнести белковый продукт гена PgCDPKla к положительному регулятору роста клеток женьшеня.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость
Накоплена информация о нуклеотидных последовательностях киназного домена основных представителей генов СИРК женьшеня, что можно дальше использовать в молекулярной биологии и физиологии женьшеня, потому что СБРК являются основными сенсорами цитоплазматического кальция, а кальций вовлечен в регуляцию практически всех процессов, протекающих в клетке. Впервые изучена в культурах клеток с разным уровнем морфо-анатомического развития экспрессия генов СИРК. Впервые показано, что при развитии соматических эмбрионов в го/С-трансгенной культуре клеток женьшеня появляются транскрипты СИРК с инсерциями и делениями в последовательности 8ег/ТЪг-киназного домена.
Также впервые получена полная последовательность белок кодирующей части кДНК первого гена СЭРК женьшеня PgCDPKla, изучена его детальная экспрессия. Показано, что существует положительная корреляция между экспрессией PgCDPKla и приростом биомассы клеток P. ginseng. Возможно, PgCDPKla является позитивным, регулятором клеточного роста женьшеня. Информация о полной последовательности генов СВР К, может быть основой для проведения экспериментов по сверхэкспрессии генов CDPK, что в итоге может привести к получению культур клеток или растений с повышенными характеристиками устойчивости к стрессам или содержанию гинзенозидов.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Звенигород, 2008); XI Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным- проблемам химии и биологии (Владивосток, 2009); 4-й Международной конференции польского сообщества экспериментальной растительной биологии (Польша, 2009); VIII Региональной конференции студентов, аспирантов вузов- и научных организаций' Дальнего* Востока России (Владивосток, 2009); XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2010); IX Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том- числе 3 статьи, опубликованные в рецензируемых международных журналах.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах печатного текста, иллюстрирована 19 рисунками- и содержит 7 таблиц. Список литературы насчитывает 204 наименования. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (06-04-48149-а), ДВО РАН (06-04-48149-а), гранта по Программе
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Турленко, Анна Владимировна
ВЫВОДЫ
1. Добавление ингибиторов кальциевых каналов и протеинкиназ в питательные среды достоверно уменьшает в 1.3-6.7 раза количество соматических эмбрионов в культуре клеток женьшеня 2сЗ, напротив добавление ионофора А23187 достоверно увеличивает количество соматических эмбрионов в 1.2-1.7 раза. Это указывает на то, что кальциевая сигнальная система участвует в регуляции соматического эмбриогенеза растений.
2. В каллусной контрольной культуре женьшеня ОУ полностью отсутствует экспрессия генов ¡¥1/5, в то время как в эмбриогенной культуре клеток 2сЗ присутствуют транскрипты 8-ми различных генов ШУБ, что подтверждает эмбриогенную природу наблюдаемых клеточных агрегатов в культуре клеток 2сЗ.
3. В го/С-трансформированой культуре 2сЗ изменена экспрессия генов СИРК по сравнению с контрольной культурой ОУ: достоверно активирована экспрессия Р%СВРК1с, PgCDPK2b, PgCDPK2d и PgCDPKЗb и достоверно ингибирована экспрессия PgCDPKla, PgCDPKlb, PgCDPKЗa и PgCDPK4a; появляются транскрипты в киназном домене которых выпадает несколько аминокислот (PgCDPK2ds).
4. По мере развития соматических эмбрионов в культуре клеток женьшеня 2сЗ значительным изменениям в экспрессии подвергается подсемейство PgCDPK2d (РёСОР1Ш, PgCDPK2ds и PgCDPK2dL): на ранних стадиях соматического эмбриогенеза достоверно активируется экспрессия PgCDPK2d и появляются транскрипты, в киназном домене которых выпадают несколько аминокислот (PgCDPK2ds); поздние стадии характеризуются появлением экспрессии доминирующего транскрипта
PgCDPK2dL, в последовательности киназного домена которого встречаются стоп-кодоны.
5. Впервые получена полная последовательность белок кодирующей части кДНК CDPK женьшеня Р. ginseng - PgCDPKla. Обнаружена положительная корреляция между приростом сырой биомассы клеток Р. ginseng и экспрессией PgCDPKla, и отрицательная корреляция между уровнем экспрессии патоген-связанных генов и содержанием гинзенозидов с уровнем экспрессии PgCDPKla. Таким образом, возможно, PgCDPKla является позитивным регулятором роста клеток женьшеня.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Турленко, Анна Владимировна, Владивосток
1. Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В., Мейчик Н.Р., Носов A.M., Полесская О.Г., Харитоношвили Е.В., Чуб В.В. Физиология растений. М.: Издательский центр "Академия", 2005. 640 с.
2. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Бабкина Э.Н., Уварова Н.И., Маханьков В.В. (1991) Содержание даммарановых гликозидов в различных каллусных линиях Panax ginseng С.А. Меу // Раст. Рес. 27:94-100.
3. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. Тимирязевские чтения XXXV. М.: Издательство «Наука», 1975. 51с.
4. Бутенко Р.Г., Грушвицкий И.В., Слепян Л.И. (1968) Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре тканей женьшеня и других представителей рода Panax L. // Ботанический журнал. 53:906-911.
5. Ванюшин Б.Ф. (2005) Энзиматическое метилирование ДНК -эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки // Биохимия. 70:598-611.
6. Гетманова Е.С., Журавлев Ю.Н., Музарок Т.И. (1992) Вегетативное размножение дикорастущего женьшеня в культуре in vitro // Тез. докл. 2 Съезда Всесоюз. о-ва физиологов растений. С. 51.
7. Грушвицкий И.В. Женьшень. Вопросы биологии. JL, 1961. 344 с.
8. Гутникова З.И., Воробьева П.П., Бункина И.А. Женьшень и его возделывание. Владивосток: ДВФ СО АН СССР, 1963. 124 с.
9. Журавлев Ю.Н., Гетманова Е.С., Музарок Т.И., Булгаков В.П. Способ микроразмножения женьшеня / Авторское свид. N 1824114. А01Н 4/00. Приор, от 26.06.1990 г. Опубл. 30.06.93, Бюлл. № 24.
10. Журавлев Ю.Н., Коляда A.C. Araliaceae: женьшень и другие. Владивосток: Дальнаука, 1996. 280 с.
11. Ивановская Е.В. Цитоэмбриологическое исследованиедифференцировки клеток растений. М.: изд-во Московского ун-та, 1983. 140 с.
12. Левина P.E. Репродуктивная биология семенных растений. М.: Наука, 1981.96 с.
13. Магешвари П. Эмбриология покрытосеменных. М.: изд-во иностранной литературы, 1954. 440 с.
14. Малышев A.A. Женьшень. М.: Агропромиздат, 1991. 144 с. Ноглер Г.А. (1990) Гаметофитный апомиксис // Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии. Т. 2. / Под ред. к.б.н. И.П. Ермакова. М.: Агропромиздат, С. 39-91.
15. Орлова И.Г. Основные пути воспроизводства культурных и дикорастущих растений. Ставрополь: Изд-во СГУ, 2002. 143 с.
16. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 1988. 303 с.
17. Полевой В.В. Физиология растений. М.: Высшая школа. 1989. 464 с. Рейвн П., Эверт Р., Айкхорн С. Современная ботаника. Т. 2. М.: Мир. 1990. 344 с.
18. Солнцева М.П. (1991) Что же такое апомиксис у цветковых растений? // Ботанический журнал. 76:801-808.
19. Тарчевский H.A. Сигнальные системы клеток растений / Отв. ред А.Н. Гречкин М.: Наука, 2002. 293 с.
20. Эсау К. Анатомия семенных растений. М.: Мир, 1980. Т. 2. 218 с. Яковлев Г.П., Челомбитько В.А. Ботаника. М.: Высшая школа, 1990. 359 с.
21. Ammirato P.V. (1983) Embryogenesis // Handbook of Plant Cell Culture. 1:82-123
22. Anil V.S., Rao K.S. (2000) Calcium-mediated signaling during sandalwood somatic embryogenesis. Role of exogenous calcium as second messenger // Plant Physiol. 123:1301-1311.
23. Ariel F.D., Manavella P.A., Dezar C.A., Chan R.L. (2007) The true story of the HD-Zip family // Trends Plant Sci. 12:419-426.
24. Asaka I., Li I., Hirotani M., Asada Y., Yoshikawa T., Furuya T. (1994) Mass production of ginseng {Panax ginseng) embryoids on media containing high concentrations of sugar // Planta Med. 60:146-148.
25. Baker K.E., Parker R. (2004) Nonsense-mediated mRNA decay:terminating erroneous gene expression// Curr. Opin. Cell Biol. 16:293-299.
26. Barton M.K., Poethig R.S. (1993) Formation of the shoot apical meristem in Arabidopsis thaliana'. an amalysis in the wild type and shoot meristemless mutant //Development. 119:823-831.
27. Benfey P:N., Chua N.H. (1990) The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial-regulation of transcription in plants // Science. 250:959-966.
28. Bicknell R.A., Koltunow A.M. (2004) Understanding apomixis: recent advances and remaining conundrums // Plant Cell. 16:228-245.
29. Billker O, Dechamps S., Tewari R., Wenig G., Franks-Fayard B., Brinkmann V. (2004) Calcium and calcium-dependent protein kinase regulate gamete formation and mosquito transmission in a malaria parasite // Cell. 117:503-514.
30. Bhat S.R., Srinivasan S. (2002) Molecular and genetic analyses of transgenic plants: considerations and approaches //Plant Sci. 163:673-681.
31. Bhojwani S.S., Mullins K., Cohen D. (1987) Micropropagation of Feijoa sellowiana Berg // Acta Horticult. 212:69-76.
32. Blumenthal M. (2003) The ABC Clinical Guide to Herbs. American Botanical Council. Thieme, New York, ISBN 1-58890-157-2
33. Bonfill M., Cusido R.M., Palason J., Pinol M.T., Morales C. (2002) Influence of auxins on organogenesis and ginsenoside production in Panax ginseng calluses // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 68:73-78.
34. Botella J.R., Arteca J.M., Somodevilla M., Arteca R.N. (1996) Calcium dependent protein kinase gene expression in response to physical and chemical stimuli in mungbean ( Vigna radiata) II Plant Mol. Biol. 30:1129-1137.
35. Breuninger H., Rikirsch E., Hermann M., Ueda M., Laux T. (2008) Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo //Dev. Cell. 14:867-876.
36. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.V., Tchernoded" G.K., Zhuravlev Y.N. (1998) The impact of plant rolC oncogene' on ginsenoside production by ginseng hairy root cultures // Phytochemistry. 49:1929-1934.
37. Bush D.S. (1995) Calcium regulation in plant cells and its role in signaling // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 46:95-122.
38. Caliskan M:, Turet M., Cuming A.C. (2004) Formation of wheat {Triticum aestivum L.) embryogenic callus involves peroxide-generating germin-like oxalate oxidase // Planta. 219:132-140.
39. Chang W.C., Hsing Y. (1980) In vitro flowering of embryoids derived from mature root callus of ginseng {Panax ginseng) // Nature. 284:341-342.
40. Clark S.E., Jacobsen S. E., Levin J.Z., Meyerowitz E.M. (1996) The CLAVATA and SHOOT MERISTEMLESS loci competitively regulate meristem' activity in Arabidopsis II Development. 122:1567-1575.
41. Cheng S.H., Willmann M.R., Chen H.C., Sheen J. (2002) Calcium signaling through protein kinases. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family 11 Plant Physiol. 129:469-485.
42. Choi Y.E., Soh W.Y. (1996) The role of excision on somatic embryogenesis from mature ginseng zygotic embryos // Phytomorphology. 46:151-159.
43. Choi Y.E., Yang D.C., Choi K.T. (1998) Induction of somatic embryos by macrosalt stress from mature zygotic embryos of Panax ginseng H Plant Cell Tiss. Organ Cult. 52:177-181.
44. Choi Y.E., Yang D.C., Yoon E.S., Choi K.T. (1999) High-efficiency plant production via direct somatic single embryogenesis from preplasmolysed cotyledons of Panax ginseng and possible dormancy of somatic embryos // Plant Cell Rep. 18:493-499.
45. Choi Y.E., Jeong J.H:, In J.K., Yang D.C. (2003) Production of herbicide-resistant transgenic Panax ginseng through the induction of-the phosphinothricin acetyl transferase gene and successful soil transfer // Plant Cell Rep. 21:563-568.
46. Chong S.K., Oberholzer V.G. (1988) Ginseng is there a use in clinical medicine? // Postgrad Med. J. 64:841-846.
47. Clapham D.E. (1995) Calcium-signaling // Cell. 80:259-268
48. Deyhle F., Sarkar A.IC., Tucker E.J., Laux T. (2007) WUSCHEL regulates cell differentiation during anther development // Dev. Biol. 302:154-159.
49. Dharmasiri N., Dharmasiri S., Weijers D., Lechner E., Yamada M., Hobbie L., Ehrismann J.S., Jiirgens G., Estelle M. (2005) Plant development is regulated by a family of auxin receptor F-box proteins // Dev. Cell 9:109-119.
50. Dieguez M.J., M. Belloto, Afsar K., Mittgelsten-Scheid O., Paszkowski J. (1997) Methylation of cytosines in non-conventional methylation acceptor sites can contribute to gene expression // Mol. Gen. Genet. 253:581-588.
51. Dudits D., Gyorgyey J:, Bogre L., Bako L. (1995) Molecular biology of somatic embryogenesis. In vitro embryogenesis in plants // Curr. Plant Sci. Biotech. Agricult. 20:267-309.
52. Edwards R., Dixon D.P., Walbot V. (2000) Plant glutathione S-transferases: enzymes with multiple functions in sickness and in health // Trends Plant Sci. 5:193-198.
53. Eshed Y., Baum S.F., Bowman J.L. (4999) Distinct mechanisms promote polarity establishment in carpels of Arabidopsis II Cell. 99:199-209.
54. Feher A., Pasternak T.P., Dudits D. (2003) Transition of somatic plant cells to an embryogenic state // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 74:201-228.
55. Frank M., Rupp H.M., Prinsen E., Motyka V., Van Onckelen H., Schmulling T. (2000) Hormone autotrophic growth and differentiation identifies mutant lines of Arabidopsis with altered cytokinin and' auxin content or signaling // Plant Physiol. 122:721-730.
56. Fujimura T., Komamine A. (1975) Effects of various growth regulators on the embryogenesis in a carrot suspension culture // Plant Sci. Lett. 5:359-364.
57. Fukuda H., Masaki I., Munetaka S., Komami A (1994) Mechanisms of the proliferation and differentiation of plant cells in cell culture systems // Int. J. Dev. Bio. 38:287-299.
58. Galland R., Randoux B., Vasseur J., Hilbert J.L. (2001) A glutathione S-transferase cDNA identified by mRNA differential display is upgrated during somatic embryogenesis in Cichorium H Biochem. Biophys. Acta. 1522:212.
59. Gapper C., Dolan L. (2006) Control of plant development by reactive oxygen species // Plant Physiol. 141:341-345.
60. Gargantini P.R., Gonzalez-Rizzo S., Chinchilla D., Raices M., Giammaria V., Ulloa R.M., Frugier F., Crespi M.D. (2006) A CDPK isoform participates in the regulation of nodule number in Medicago truncatula II Plant J. 48:843-856.
61. Gazzarrini S., Tsuchiya Y., Lumba S., Okamoto M., McCourt P. (2004) The transcription factor FUSCA3 controls developmental timing in Arabidopsis through the hormones gibberellin and abscisic acid // Dev. Cell. 7:373.
62. Gehring W.J., Muller M., Affolter M., Percival-Smith A., Billeter M., Qian Y.Q., Otting G., Wuthrich K. (1990) The structure of the homeodomain and its functional implications // Trends Genet. 6:323-329.
63. Gehring W.J. (1993) Exploring the homeobox // Gene. 135:215-221.
64. Gehring W.J., Qian Y.Q., Billeter M., Furukubo-Tokunaga K., Schier A.F., Resendez-Perez D., Affolter M., Otting G., Wuthrich K. (1994) Homeodomain-DNA recognition // Cell. 78:211-223.
65. Gehring M., Henikoff S. (2007) DNA methylation dynamics in plant genomes // Biochemistry Biophys. Acta. 1769:276.
66. Gelhaye E., Rouhier N., Jacquot J.P. (2004) The thioredoxin h system of higher plants // Plant Physiol. Biochem. 42:265-271.
67. Giulietti A., Overbergh L., Valckx D., Decallonne B., Bouillon R., Mathieu C. (2001) An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression II Methods. 25:386-401.
68. Gross-Hardt R., Lenhard M., Laux T. (2002) WUSCHEL signaling functions in interregional communication during Arabidopsis ovule development // Genes Dev. 16:1129-1138.
69. Guilfoyle, T.J. (1999) Auxin-regulated genes and promoters. In Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, P.J.J. Hooykaas, M. Hall, and K.L. Libbenga, eds (Leiden, the Netherlands: Elsevier), pp. 423-459.
70. Haecker A., Gross-Hardt R., Geiges B., Sarkar A., Breuninger H., Herrmann M., Laux T (2004) Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana // Development 131:657-668.
71. Harada J.J. (2001) Role of Arabidopsis LEAFY COTYLEDON genes in seed development // J. Plant Physiol. 158:405-409.
72. Harper J.F., Breton G., Harmon A. (2004). Decoding Ca2+ signals through plant protein kinases //Ann. Rev. Plant Biol. 55:263-288.
73. Harper J.F., Harmon A. (2005). Plants, symbiosis and parasites: A calcium signalling connection // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:555-566.
74. Hasegawa H. (2004) Proof of the mysterious efficacy of ginseng: basic and clinical trials: metabolic activation of ginsenoside: deglycosylation by intestinal bacteria and esterification with fatty acid // J. Pharmacol.Sci. 95:153-157.
75. Hetherington A.M., Brownlee C. (2004) The generation of Ca(2+) signals in plants // Ann. Rev. Plant Biol. 55:401-427.
76. Hoffman D. (2003) Medical Herbalism: The Science and Practice of Herbal Medicine // Healing Arts Press. 570.
77. Kakutani T., Jeddeloh J.A., Flowers S.K., Munakata K., Richards E.J. (1996) Developmental abnormalities and epimutations associated with DNA hypomethylation mutations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:12406-12411.
78. Karami O., Deljou A., Karimi Kordestani G. (2008) Secondary somatic embryogenesis of carnation (Dianthus caryophyllus L.) // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 92:273-280.
79. Karami O., Aghavaisi B., Pour A.M. (2009) Molecular aspects of somatic-to-embryogenic transition in plants // J. Chem. Biol. 2:177-190.
80. Kevers C., Gaspar T., Dommes J. (2002) The beneficial role of different auxin and polyamines at successive stages of somatic embryo formation and development of Panax ginseng in vitro II Plant Cell Tiss. Organ Cult. 70:181-188.
81. Kim H.J., Ryu H., Hong S.H., Woo H.R., Lim P.O., Lee I.C., Sheen J., Nam H.G., Hwang I. (2006) Cytokinin-mediated control of leaf longevity by AHK3 through phosphorylation of ARR2 in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:814-819.
82. Kiselev K.V., Kusaykin M.I., Dubrovina A.S., Bezverbny D.A., Zvyagintseva T.N., Bulgakov V.P. (2006) The rolC gene induces expression of a pathogenesis-related beta-l,3-glucanase in transformed ginseng cells // Phytochemistry. 67:2225-2231.
83. Kiselev K.V., Turlenko A.V., Zhuravlev Y.N. (2009) PgWUS expression during somatic embryo development in a Panax ginseng 2c3 cell culture expressing the rolC oncogene // Plant Growth Regul. 59:237-243.
84. Kiselev K.V., Turlenko A.V., Zhuravlev Y.N. (2009) CDPK gene expression in somatic embryos of Panax ginseng expressing rolC II Plant Cell Tiss. Organ Cult. 99:141-149.
85. Kiselev K.V., Turlenko A.V., Zhuravlev Y.N. (2010) Structure and expression profiling of a novel calcium-dependent protein kinase gene PgCDPKla in roots, leaves, and cell cultures of Panax ginseng II Plant Cell Tiss. Organ Cult. 103:197-204.
86. Klug M., Rehli M. (2006) Functional analysis of promoter CpG-methylation using a CpG-free luciferase reporter vector // Epigenetics. 1:127-130.
87. Mahonen A.P., Higuchi M., Tormakangas K., Miyawaki K., Pischke M.S., Sussman M.R., Helariutta Y., Kakimoto T. (2006) Cytokinins regulate a bidirectional phosphorelay network in Arabidopsis // Curr. Biol. 16:1116.
88. Malik M.R., Wang F., Dirpaul J.M., Zhou N., Polowick P.L., Ferrie A.M.R., Krochko J.E. (2007) Transcript profiling and identification of molecular markers for early microspor embryogenesis in Brassica napusn II Plant Physiol. 144:134154.
89. Mayer K.F.X., Schoof H., Haecker A., Lenhard M., Jurgens G., Laux T. (1998). Role of WUSCHEL in regulating stem'cell fate in the Arabidopsis shoot meristem.// Cell. 95:805-815.
90. Mathur A., Mathur A.K. (2001) Gangwar A. In vitro plantlet regeneration in Panax sikkimensis I I Planta Med. 65:181 -183.
91. Michniewicz M., Brewer P.B., Friml J. (2007) Polar auxin transport and asymmetric auxin distribution // The Arabidopsis Book / Rockville, MD: American Society of Plant Biologists.
92. Monshausen G.B., Bibikova T.N., Messerli M.A., Shi C., Gilroy S. (2007) Oscillations in extracellular pH and reactive oxygen species modulate tip growth of Arabidopsis root hairs // Proc Natl Acad Sci USA. 104:20996-21001.
93. Monteiro M., Kevers C., Dommes J., Gaspar T.H. (2002) A specific role for spermidine in the initiation phase of somatic embryogenesis in Panax ginseng CA Meyer II Plant Cell Tiss. Organ Cult. 68:225-232.
94. Morrish F., Vasil I. (1989) DNA methylation and embryogenic competence in leaves and callus of Napiergrass (Pennisetum purpureum Schum.) // Plant Physiol. 90:37-40.
95. Nagata T., Ishida S., Hasezawa S., Takahashi Y. (1994) Genes involved in the dedifferentiation of plant cells // Int. J*. Dev. Biology. 38:321-327.
96. Nagy E., Maquat L.E. (1998) A rule for termination-codon position within intron-containing genes: when nonsense affects RNA abundance // Trends Biochem. Sci. 23:198-9.
97. Nakano T., Suzuki K., Fujimura T., Shinshi H. (2006) Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice. // Plant Physiol. 140:411
98. Namasivayam P. (2007) Acquisition of embryogenic competence during somatic embryogenesis // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 90:1-8.
99. Nardmann J., Reisewitz P., Werr W. (2009). Discrete shoot and root stem cell-promoting WUS/WOX5 functions are and evolutionary innovation of angiosperms //Mol. Biol. Evol. 26:1745-1755.
100. Nolan K.E., Irwanto R.R., Rose R.J. (2003) Auxin up-regulates MtSERKl expression in both Medicago truncatula root-forming and embryogenic cultures // Plant Physiol. 133:218-230.
101. Odnevall A., Bjork L. (1989) Differentiated tissue cultures of Panax ginseng and their response to various carbon sources // Biochem. Physiol. Pflanzen. 185:403-413.
102. Ogas J., Cheng J.C., Sung Z.R., Somerville C. (1997) Cellular differentiation regulated by gibberellin in the Arabidopsis thaliana pickle mutant // Science. 277:91-94.
103. Ogas J., Kaufmann S., Henderson J., Somerville C. (1999) PICKLE is a CHD3 chromatin-remodeling factor that regulates the transition from embryonic tovegetative development in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:1383913844.
104. OhmiyaX A., Tanaka Y., Kadowaki K., Hay ash i T. (1998) Cloning of genes encoding of auxin-binding proteins (ABP19/20) from, peach: significant peptide sequence similarity with germin-like proteins // Plant Cell Physiol. 39:492-499;
105. Overvoorde P.G., Grimes H.D. (1994) The role of calcium and calmodulin in carrot somatic embryogenesis // Plant Cell Physiol. 35:135-144.
106. Palovaara J., Hakman I. (2008) Conifer WOX-related homeodomain transcription factors, developmental consideration and expression dynamic of WOX2 during Picea abies somatic embryogenesis // Plant Mol. Biol. 66:533-549;
107. Pareek A.,. Kothari S.L. (2003) Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf cultures of ornamental species of Dianthus // Sci. Horticult. 98:449-459.
108. Park SH, Choi J, Kang JI, Choi SY, Hwang SB, Kim JP, Ahn BY. (2006) Attenuated expression of interferon-induced protein kinase PKR in a simian cell devoid of type I interferons.//Mol. Cells. 21:21-28.
109. Park S., 1 iarada J.J. (2008) Arabidopsis embryogenesis // Methods Mol. Biol. 427:3-16.
110. Peret B., De Rybel B., Casimiro I., Benkova E., Swarup R., Laplaze L., Beeckman T., Bennett M.J. (2009) Arabidopsis lateral root development: an emerging story // Trends Plant Sci. 14:399-408;
111. Pestenacz A., Erdei L. (1996) Calcium-dependent protein kinase in maize and sorghum induced by polyethylene glycol // Physiol. Plant. 97:360-364.
112. Poovaiah B.W., Reddy A.S.N. (1987) Calcium messenger systems in plants // CRC Crit. Rev. Plant Sci. 6:47-103.
113. Rai R. (2007) Genetics and plant breeding. Introduction to Plant Biotechnology // National Research Centre on Plant Biotechnology.
114. Richardt S., Lang D., Reski R., Frank W. and Rensing S. A. (2007) PlanTAPDB, a phylogeny-based resource of plant transcription-associated proteins //Plant Physiol. 143:1452-1466.
115. Rider S.D., Hemm M.R., Hostetler H.A., Li H.C., Chappie C., Ogas J. (2004) Metabolic profiling of the Arabidopsis pkl mutant reveals selective derepression of embryonic traits // Planta. 219:489-499.
116. Rose R.J., Nolan K.E., Bicego L. (1999) The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicago truncatula\ implications for regenerability via somatic embryogenesis // J. Plant Physiol. 155:788-791.
117. Rout G.R., Samantaray S., Das P. (2000) In vitro somatic embryogenesis from callus cultures of Cephaelis ipecacuanha A. Richard // Sci. Hortic. 86:71-79.
118. Rudd J.J., Franklin-Tong V.E. (2001) Unravelling response-specificity in Ca2+ signalling pathways in plant cells // New Phytol. 151:7-33.
119. Ryschka S., Ryschka U., Schulze J. (1991) Anatomical studies on the development of somatic embryoids in wheat and barley explants // Biochem. Physiol. Pflanzen. 187:31-41.
120. Sarkar A.K., Luijten M., Miyashima S., Lenhard M., Hashimoto T., Nakajima K., Scheres B., Heidstra R., Laux T. (2007) Conserved factors regulate signalling in Arabidopsis thaliana shoot and root stem cell organizers // Nature. 446:811-814.
121. Sanders D., Brownlee C., Harper J.F. (1999) Communication with calcium // Plant Cell. 11:691-706.
122. Sanders D., Pelloux J., Brownlee C., Harper J.F. (2002) Calcium at the crossroads of signaling // Plant Cell. Suppl.:401-417.
123. Santos M.D., Romano E., Yotoko K.S.C., Tinoco M.L.P., Dias B.B.A., Aragao F.J.L. (2005) Characterisation of the cacao somatic embryogenesis receptor-like kinase (SERK) gene expressed during somatic embryogenesis // Plant Sei. 168:723-729.
124. Schmidt E.D.L., Guzzo F., Toonen M.A. J., de Vries S.C. (1997) A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos // Development. 124:2049-2062.
125. Schiott M., Romanowsky S. M., Baskgaard L., Keyed Jakobsen M., Palmgren M. G., Harper J. F. (2004) A plasma membrane Ca" pump is required for normal pollen tube growth and fertilization // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 101:9502-9507.
126. Schoof H., Lenhard M., Mayer K.F.X., Jürgens G., Laux T. (2000) The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems is maintained by a regulatory loop between the CLAVATA and WUSCHEL genes // Cell. 100:635-644.
127. Seely D., Dugoua J.J., Perri D., Mills E., Koren G. (2008) Safety and efficacy of Panax ginseng during pregnancy and lactation. Can. J. Clin. Pharmacol. 15:8794.
128. Shamrov I.I. (1998) Ovule classification in flowering plants new approaches and concepts // Bot. Jb. 120:377-407.
129. Shimizu R., Ji J., Kelsey E., Ohtsu K., Schnäble P.S., Scanion M.J. (2009) Tissue specificity and evolution of meristematic WOX3 function // Plant Physiol. 149:841-850.
130. Shoyama Y., Zhu X.X., Nakai R., Shiraishi S., Kohda H. (1997) Micropropagation of Panax notoginseng by somatic embryogenesis and RAPD analysis of regenerated plantlets // Plant Cell Rep. 16:450-453.
131. Shu W., Yoshimatsu K., Yamaguchi H., Shimomura K. (1999) Somatic embryogenesis and ginsenoside production of Panax ginseng in phytohormon-free medium// Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku. 117:140-147.
132. Skinner D.J., Hill T.A., Gasser C.S. (2004) Regulation of Ovule Development // Plant Cell. 16:32-45.
133. Slater A., Scott N.W., Fowler M.R. (2003) Plant Biotechnology: The Genetic Manipulation of Plants Oxford University Press. 346p.
134. Spena A., Schmulling T., Koncz C., Schell J.S. (1987) Independent and synergistic activity of rolA, B and C loci in stimulating abnormal growth in plants //EMBO J. 6:3891-3899.
135. Stone S.L., Kwong L.W., Yee K.M., Pelletier J., Lepiniec L., Fischer R.L., Goldberg R.B., Harada J.J. (2001) LEAFY COTYLEDON 2 encodes a B3 domain transcription factor that induces embryo development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:11806-11811.
136. Taylor M.G., Vasil I.K. (1996) The ultrastructure of somatic embryo development in pearl millet (Pennisetum-glaucum; Poaceae) // Am. J. Bot. 83:2844.
137. Takeshima H.5 Yamashita S., Shimazu T., Niwa T., Ushijima T. (2009) The presence of RNA polymerase II, active or stalled, predicts epigenetic fate of promoter CpG islands // Genome Res. 19:1974-1982.
138. Tamura T., Cui X., Sakaguchi N. and Akashi M. (2008) Ginsenoside Rd prevents and rescues rat intestinal epithelial cells from irradiation-induced apoptosis // Food Chem. Toxicol. 46:3080-3089.
139. Tang W. (2000) High-frequency plant regeneration via somatic embryogenesis and organogenesis and in vitro flowering of regenerated plantlets in Panax ginseng I I Plant Cell Rep. 19:727-732.
140. Teng W.L., Nicholson L. (1997) Pulse treatments of penicillin-G and streptomycin minimise internal infections and have post-treatment effects on the morphogenesis of ginseng root culture // Plant Cell Rep. 16:531-535.
141. Thakare K.G., Chore C.N., Deotale R.D., Kambale P.S., Lende S.R. (2006) Influence of nutrients and hormones on biochemical and yield and yield contributing parameters of soybean // J. Soils Crops. 16:210-216.
142. Thomas C., Meyer D., Himber C., Steinmetz A. (2004) Spatial expression of a sunflower SERK gene during induction of somatic embryogenesis and shoot organogenesis // Plant Physiol. Biochem. 42:35-42
143. Tirajoh A., Kyung T.S., Punja Z.K. (1998) Somatic embryogenesis and plantlet regeneration in American ginseng {Panax quinquefolium L.) // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 34:203-211
144. Trewavas A.J. (1997) Plant cyclic AMP comes in from the cold // Nature. 390:657-658.
145. Vasil V., Vasil I. (1981) Somatic embryogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Pennisetum americanum, and P. americanum x P. purpureum hybrid // Am. J. Bot. 68:864-872.
146. Vergne P., Dumas C. (2000) Genes normally expressed in the endosperm at early stages of microspore embryogenesis in maize. // Plant Mol. Biol. 44:559-574.
147. Vongs A., Kakutani T., Martienssen R.A., Richards E.J. (1993) Arabidopsis thaliana DNA methylation-mutants // Science. 260:1926-1928.
148. Wei Y.H., Fu G.L., Hu H.R., Lin G., Yang J.C., Guo J.H., Zhu Q.Q., Yu L. (2007) Isolation and characterization of mouse testis specific ser/thr kinase 5 possessing four alternatively spliced variants // J. Biochem. Mol. Biol. 40:749-756.
149. Weiss R. Herbal Medicine. Gothenburg, Sweden: Beaconsfield Publishers LTD; 1988:176-177.
150. West M.A., Harada J.J. (1993) Embryogenesis in higher plants: an overview //Plant Cell. 5:1361-1369.
151. White P.J., Broadley M.R. (2003) Calcium in plants // Ann. Bot-London. 92:487-511.
152. Willemsen V., Scheres B. (2004) Mechanisms of pattern formation in plant embryogenesis. // Ann. Rev. Genetic. 38:587.
153. Wilson J.W., Wilson P.M.W. (1991) Effects of auxin concentration on the dimensions and patterns of tracheary elements differentiating in pith explants. // Ann. Bot. 68:463-467.
154. World Health Organization (1999) Radix Ginseng. WHO Monographs on Selected Medicinal Plants 1:168-182.
155. Wu X., Li F., Zhang C., Liu C., Zhang X. (2009) Differential gene expression of cotton cultivar CCRI24 during somatic embryogenesis // J. Plant Physiol. 166:1275-83.
156. Xiao W., Custard K.D., Brown R.C., Lemmon B.E., Harada J.J., Goldberg R.B:, Fischer R.L. (2006) Regulation of seed size by hypomethylation of maternal and paternal genomes // Plant Physiol. 142:1160-1168.
157. Xiong L.Z., Yang Y.N. (2003) Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic acid-inducible mitogen-activated protein kinase // Plant Cell. 15:745-759.
158. Xu Y.Y., Wang X.M., Li J., Li J.H., Wu J.S., Walker J.C., Xu Z.H., Chong K. (2005) Activation of the WUS gene induces ectopic initiation of floral meristems on mature stem surface in Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. 57:773-784.
159. Yamamoto N., Kobayashi H., TogashiT., Mori Y., Kikuchi K., Kuriyama K., Tokuji Y. (2005) Formation of embryogenic cell clumps from carrot epidermal cells is suppressed by 5-azacytidine, a DNA methylation inhibitor // J. Plant Physiol. 162:47-54.
160. Yun T.K. (1999) Update from Asia Asian studies on cancer chemoprevention // Cancer Prev. Novel Nutr. Pharmac. Developments Book Series Ann. New York Academy Sci. 889:157-192.
161. Yun T.K. (2001) Brief introduction of Panax ginseng CA Meyer // J. Korean Med. Sci. 16:3-5.
162. Zimmerman J.L. (1993) Somatic embryogenesis: a model for early development in higher plants // Plant Cell. 5:1411-1423.
163. Zhu C., Perry S.E. (2005) Control of expression and autoregulation of AGL15, a member of the MADS-box family // Plant J. 41:583-594.
164. Zeng F., Zhang X., Zhu L., Tu L., Guo X., Nie Y. (2006) Regulation of plant morphogenesis in vitro: role of ethylene and polyamines // Plant Mol. Biol. 60:167.
165. Zuo J., Niu Q.W., Frugis G., Chua N.H. (2002) The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis II Plant J. 30:349-359.
-
Турленко, Анна Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Владивосток, 2011
-
ВАК 03.01.06
- Влияние гена rolC aгробактерий на процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза в клеточной культуре Panax ginseng C.A. Mey
- Молекулярные маркеры для технологии сохранения природных популяций женьшеня
- Действие синтетических ауксинов на рост, цитоморфологию и синтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток двух видов рода Panax
- Синтез тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var.repens при разных условиях выращивания
- Влияние гена rolC агробактерий на процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза в клеточной культуре Panax ginseng C.A. Mey
