Экспериментальный трихинеллез: разработка новых методов моделирования, диагностики, профилактики и лечения

Репина, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальный трихинеллез: разработка новых методов моделирования, диагностики, профилактики и лечения
ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальный трихинеллез: разработка новых методов моделирования, диагностики, профилактики и лечения"

□03457773

На правах рукописи

Репина Елена Александровна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ТРИХИНЕЛЛЕЗ: РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ МОДЕЛИРОВАНИЯ, ДИАГНОСТИКИ, ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

Специальность 03.00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

, г цен я®

Москва-2008

003457773

Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС) и в Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ГУОП Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (ИМПиТМ ММа)

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Коваленко Феликс Павлович Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Бенедиктов Игорь Иванович Доктор биологических наук, профессор Черникова Евгения Анатольевпа

Ведущая организация: Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Севсрцова РАН

Защита диссертации состоится 17 декабря 2008 г. в 11-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.006.011.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС)

Адрес: 117218, Москва, ул. Большая Черемушкинская, д. 28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС

Автореферат разослан «_» 2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

БЕРЕЖКО В.К.

Введение

Актуальность проблемы. Трихинеллёз является одним из наиболее опасных и широко распространённых зооантропогельмшпозов. В настоящее время большинство экспериментальных работ по проблемам трихинеллеза (изучение особенностей патогенеза инвазии, скрининг и доклиническое изучение специфических лечебных и профилактических препаратов) проводится на лабораторной модели инвазии. При поддержании лабораторных штаммов Т. spiralis и воспроизведение экспериментальной модели трихинеллеза используются только личинки паразита (Л.С. Бессонов, 1979); роль же кишечных трихинелл в этом качестве до настоящего времени не изучалась, между тем решение этого вопроса важно для выяснения роли просветы* форм Т. spiralis в передаче возбудителя в природных очагах инвазии, а так же для оптимизации метода поддержания лабораторных штаммов паразита.

Диагностика трихинеллёза у экспериментально зараженных лабораторных животных основана на методах компрессорной трихинсллоскоиии и переваривания в искусственном желудочном соке скелетных мышц и диафрагмы. Однако эти методы, перенесенные в экспериментальные исследования из практической ветеринарии без существенных изменений со времени основополагающих рекомендаций (Reissmann, 1908; Strobel, 1911), сопряжены с обязательным убоем подопытных животных и позволяют выявлять личинки трихинелл лишь на поздней мышечной стадии, что исключает возможность определения па морфологическом уровне качественных и количественных параметров на миграционной и мышечной фазах у каждого зараженного животного в динамике. Такой же информативностью обладает и предложенных ранее метод прижизненной диагностики трихинеллёза у человека, основанный на компрессорной три-хинеллоскопии биоптата из икроножной мышцы (В. А. Калюс, 1952).

Риск возникновения новых вспышек трихинеллёза на территории РФ по-прежнему очень высок и проблема профилактики и лечения трихинеллёза до настоящего времени не утратила своей актуальности, поскольку методы специфической профилактики инвазии еще не разработаны, а поиск новых лекарственных средств против данной инвазии является ключевым. В настоящее время в качестве основных средств для химиотерапии трихинеллёза используют препараты группы карбаматбензимида-золов, но пока еще не разработаны оптимальные лекарственные формы этих препаратов и режимы их применения, приводящие к радикальному терапевтическому эффекту (Chung et al., 2001; McCracen, 1978 и др.). Важным направлением в паразитологии является создание профилактических препаратов, что особенно актуально в отношении антропозоонозных заболеваний. Разработка средств для профилактики трихинеллеза является важной и пока еще не решенной проблемой (Gamble, 1985; Ortega-Pierrcs et al., 1989; Eissa et al., 2003; Dea-Ayuela et al., 2006).

Исходя из этого, проведенные нами исследования были направлены на разработку нового, высокоинформативного метода диагностики трихинеллёза у экспериментально зараженных лабораторных животных, применение этого метода для оценки терапевтической активности оригинальных экспериментальных лекарственных форм препаратов группы карбаматбензимидазолов, для определения протективной активности оригинального препарата на основе новых паразитарных антигенов на лабораторной модели инвазии и при разработке альтернативного метода поддержания лабораторного штамма Т. spiralis.

Цель и задачи исследования. Целью работы явились разработка нового высокоинформативного метода прижизненной диагностики (МПД) экспериментального трихинеллёза и оценка его эффективности при разработке альтернативного метода поддержания лабораторного штамма Т. spiralis, при изучении терапевтической и протективной активности новых средств для лечения и профилактики трихинеллёза

на лабораторной модели инвазии. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить сравнительную пораженность скелетных мышц и диафрагмы инкапсулированными личинками Т. spiralis у экспериментально зараженных лабораторных грызунов при дозе инвазионного материала более 10 личинок на 1г массы тела животного.

2. Выявить адекватность отражения наличия основных качественных и количественных параметров инвазии Т. spiralis (интенсивность и фаза инвазии) при микроскопическом исследовании малых проб из скелетных мышц массой 1-1,5 мг у экспериментально зараженных лабораторных животных.

3. Оценить эффективность МПД в исследованиях по изучению противотрихи-неллезной активности оригинальных лекарственных форм препаратов группы карба-матбензимидазолов (масляных суспензий и водорастворимых продуктов из медамина и альбендазола) при экспериментальном трихинеллёзе белых мышей на мышечной фазе инвазии.

4. Оценить эффективность МПД при оценке протективной активности оригинального препарата на основе новых паразитарных антигенов (НПА) при экспериментальном трихинеллезе белых крыс.

5. Разработать регламент применения МПД в исследованиях по проблемам трихинеллеза на экспериментальной модели инвазии.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

• выявлен феномен манифестации наличия, основных качественных и количественных параметров инвазии Т. spiralis (интенсивность, фаза инвазии, жизнеспособность возбудителя) при микроскопии в тонком слое малых проб скелетных мышц (массой 1-1,5 мг) у лабораторных животных экспериментально зараженными дозами инвазионного материала, используемые обычно при моделировании трихинеллёза (1015 личинок на 1 г массы тела животных);

• выявлены дифференцирующие признаки жизнеспособности инкапсулированных личинок Т. spiralis в мышцах живого хозяина (постоянные развёрнутое положение тела и двигательная активность) и в изолированных мышцах живого или погибшего хозяина (подверженность искусственному декапсулировапию, сворачивание тела в характерную тугую спираль через 1 час после прижизненного взятия пробы или смерти хозяина);

• установлена высокая инвазивность кишечных трихинелл в возрасте 4-8 дней, выделенных от экспериментально зараженных лабораторных грызунов-доноров, для интакгных лабораторных грызунов-реципиентов при оральном заражении последних, что обосновывает концепцию о наличии дополнительного альтернативного пути передачи возбудителя в природных очагах трихинеллеза;

• выявлена высокая эффективность оригинальных экспериментальных лекарственных форм альбендазола и медамина (масляных суспензий и водорастворимых продуктов) при экспериментальном трихинеллёзе на мышечной фазе инвазии;

• охарактеризованы типы деструктивных изменений инкапсулированных личинок трихинелл у животных под влиянием специфической химиотерапии и установлен процесс резорбции инкапсулированных мышечных личинок трихинелл у экспериментально зараженных лабораторных грызунов в отдаленные сроки после радикальной химиотерапии лекарственными формами медамина;

• выявлена высокая протективная активность оригинального препарата на основе НПА при экспериментальном трихинеллёзе белых крыс.

Практическая значимость. Материалы диссертационной работы вошли в методические рекомендации «Метод прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных», одобренные секцией «Инвазии-

онные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 1 марта 2007 г и опубликованные в Российском паразитологическом журнале за 2007., №2, с.125-126.

По результатам исследований новых лекарственных противотрихинеллёзных препаратов подготовлены «Методические рекомендации по применению метода прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных при скршшиге противотрихинеллёзных препаратов», одобренные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 1 марта 2007 г.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

1. Конференции «Теоретические и практические вопросы ветеринарной медицины»,

Киров 16 апреля 2007 г.;

2. Секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины

РАСХН, 1 марта 2007 г., протокол №1;

3. На заседаниях Ученых советов ВИГИС, 2003 - 2006 гг.;

4. На заседании Ученого совета ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского Московской

Медицинской Академии им. И.М. Сеченова, 20 шоня 2007 г.

Личный вклад соискателя.

Представленная диссертационная работа является результатом 4-летних научных исследований автора. Исследования по разработке нового метода прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных проведены совместно с научным руководителем Коваленко Ф. П. Опыты по воспроиз-ведешпо лабораторной модели трихинеллеза (выделение мышечных личинок и кишечных трихинелл, заражение личинками и кишечными трихинеллами лабораторных животных), прижизненное и посмертное исследование скелетных мышц и диафрагмы на наличие и жизнеспособность личинок трихинелл на миграционной, ранней и поздней мышечных фазах инвазии, получение оригинальных лекарственных форм препаратов группы карбаматбензимидазолов, проведение опытов по химиотерапии трихинеллёза у белых мышей на мышечной фазе инвазии, прижизненная оценка эффективности препаратов в процессе лечения и после его окончания, подтверждение эффективности лечения методом компрессорной трихинеллоскопии, получение препарата на основе новых паразитарных антигенов и оценка его протек-тивной активности при экспериментальном трихинеллёзе белых крыс (введение препарата, тестирование его эффективности методами прижизненной диагностики и посмертной трихинеллоскопии), анализ и статистическая обработка полученных данных выполнены аспирантом лично.

Работа выполнена под научным руководством доктора медицинских наук Коваленко Ф.П., который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и анализе полученных результатов. В работе участвовали аспиранты Пивоварова Д.М. и Кухалева И.В., лаборант-исследоватсль Буланова Т.Е.

По результатам исследований опубликованы работы в соавторстве с д.м.п. Коваленко Ф. П., д.б.н. Бережко В.К., Кухалевой И.В., которые не возражают в использовании результатов совместных работ (справки имеются в диссертационном совете).

Основные положения, выпосимые на защиту:

1. Новый метод прижизненной диагностики экспериментального трихинеллёза, обеспечивает контроль за качественными и количественными параметрами инвазии на миграционной и мышечной фазах в динамике у каждого зараженного животного.

2. Кишечные трихинеллы, в возрасте 4-8 дней, выделенные от экспериментально зараженных лабораторных животных-доноров высокоинвазивны для интактпых лабораторных грызунов-реципиентов при оральном заражении.

3. Эффективность оригинальных экспериментальных лекарственных форм аль-бендазола и медамина (масляные суспензии, водорастворимые продукты) при экспе-

римеитальном трихинеллёзе белых мышей на мышечной фазе инвазии достигает 100%.

4. Оригинальный препарат на основе новых паразитарных антигенов обладает высокой протективной активностью при экспериментальном трихинеллезе белых крыс.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК; подана патентная заявка на изобретение.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 117 страницах основного текста и состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, практические рекомендации и выводы. Список использованной литературы включает 223 источника, в том числе 53 отечественных и 170 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 18-ю таблицами и 30-ю рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы представлен анализ данных отечественных и зарубежных авторов по биологии возбудителя, эпизоотологии, диагностике, моделированию, лечению и профилактике трихинеллёза.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследования

В опытах были использованы аутбредные мыши и крысы, золотистые хомяки и хлопковые крысы разного пола и возраста. Штамм Trichinella spiralis был выделен в 1965 г от домашней свиньи в Белоруссии и в дальнейшем пассирован до 2005 г белых крысах в ВИГИС, а затем - на аутбредных мышах и крысах в лаборатории экспериментальной химиотерапии ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского ММА им. И.М. Сеченова. В опытах использованы личинки и просветные формы Т. spiralis.

Для оценки терапевтической активности применяли оригинальные экспериментальные лекарственные формы препаратов группы карбаматбензимидазолов - альбен-дазола и медамина (масляные суспензии и водорастворимые продукты). В опытах по иммунопрофилактике трихинеллеза на лабораторной модели использовали препарат на основе НПА. Состав и способы получения экспериментальных лекарственных форм альбендазола и медамина, препарата на основе НПА являются предметом патентных заявок.

2.1.1. Методы получения инвазионного материала и заражения лабораторных животных.

■ 2.1.1.1. Метод переваривания скелетных мышц в искусственном желудочном соке. Скелетные мышцы и диафрагму зараженных трихинеллёзом животных измельчали ножницами или в мясорубке. Полученный фарш помещали в колбу и инкубировали в искусственном желудочном соке (содержание соляной кислоты - 0,7-1% , пепсина - 0,5 - 3% в зависимости от его активности) при температуре 37-42°С. По окончании переваривания (при перемешивании с помощью мешалки в течение 30-60 мин.; без применения мешалки - 4 часов при 39-42°С или 8-12 часов при 37-38°С), личинки отмывали теплым 0,9% раствором хлористого натрия и оценивали их жизнеспособность под микроскопом. Признаками жизнеспособности личинок являлись двигательная активность при нагревании инкубационной среды и их способность сворачиваться в характерную тугую спираль.

2.1.1.2. Метод выделения кишечных трихинелл. Лабораторных животных заражали декапсулированными личинками Т. spiralis в желудок с помощью шприца и

металлической канюли (внутренним диаметром 1,0 мм) в дозе 10-15 личинок/г массы тела. Для получения кишечных трихинелл зараженных животных содержали на голодной диете в течение 10-12 часов, затем вскрывали, извлекали кишечник, разделяли его на фрагменты длиной 2-3 см, которые разрезали вдоль и промывали теплым (30-35°С) физиологическим раствором для удаления химуса. Затем каждый фрагмент помещали на предметное стекло и соскабливали слизистую. Соскобы помещали в теплый физиологический раствор и перемешивали. Под бинокулярной лупой оценивали жизнеспособность выделенных кишечных трихинелл. Показателем жизнеспособности кишечных трихинелл являлась выраженная двигательная активность и нормальная морфологическая структура.

2.1.1.3. Подсчет количества личинок и кишечных трихинелл при заражении животных. Из равномерно перемешиваемой взвеси трихинелл в физиологическом растворе забирали с помощью шприца 0,5-1 мл и тотчас наносили на предметное стекло 1-2 капели, процедуру повторяли 4-5 раз. Затем подсчитывали количество живых паразитов в каждой капле. Определяли среднее число личинок или кишечных трихинелл в 1 капле, количество капель в 1 мл взвеси и рассчитывали число паразитов в указанной единице объема.

2.1.1.4. Заражение лабораторных животных личинками трихинелл. Животных заражали в желудок суспензией декапсулированных личинок в физиологическом растворе с помощью шприца и металлической кашоли. Количество вводимых личинок варьировало в зависимости от целей экспериментов.

2.1.1.5. Заражение лабораторных животных кишечными трихинеллами. Кишечные трихинеллы от мышей-доноров использовали в качестве инвазионного материала и вводили 3-мя способами: 1) путем введения в желудок изолированных кишечных трихинелл в дозе 150 экз. на мышь; 2) введением в желудок мелких фрагментов тонкой кишки допоров; 3) путем скармливания цельной тонкой кишки доноров. Мышей-реципиентов вскрывали через 30-45 дней после заражения; у животных исследовали скелетные мышцы и диафрагму на наличие и жизнеспособность мышечных личинок трихинелл.

2.1.2. Методы диагностики инвазии у экспериментально зараженных лабораторных животных.

2.1.2.1. Оригинальный метод прижизненной диагностики (МПД) трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных. МПД осуществляли следующим образом. Исследуемое животное фиксировали; на месте предполагаемого разреза выстригали шерсть и проводили местную анестезию (подкожная инъекция 0,1 мл 1%-ного раствора лидокаина). Скальпелем или глазными ножницами рассекали кожу (длина разреза 3-4 мм) и наружную фасцию до обнажения скелетной мышцы. Глазным пинцетом захватывали участок мышцы и отрезали от него глазными ножницами 1-10 фрагментов массой 1-1,5 мг. Точность навески контролировали с помощью аналитических торсиошгых весов типа ВТ. У каждого животного брали пробы из скелетных мышц одной или разных групп (массстср, бедренная, икроножная, корень хвоста, плечевого пояса и др.). После взятия мышечной пробы кожную и мышечную раны обрабатывали антисептическим раствором (5%-ная спиртовая настойка йода). Каждую мышечную пробу помещали между двумя предметными стеклами и подвергали микроскопии при малом увеличении микроскопа. В процессе микроскопии пробу подвергали мануальной компрессии в три последовательных этапа, характеризовавшихся разными интенсивностью и характером компрессии:

1) при слабой и постоянной компрессии, приводившей к умеренному сдавливанию пробы, достигались выявление и визуализация внутренней структуры всех живых, погибших и погибающих инкапсулированных личипок трихинелл (рис.2А, 3); у живых личинок выявлялась двигательная активность в течение 10-15 мин после взятия пробы; к этому сроку тело личинки было развернутым;

2) более интенсивная и импульсивная по характеру компрессия приводила к вытеснению всех живых личинок из их капсул (искусственное декапсулирование) вместе в жидким содержимым капсул в краевую зону за пределы мышечной ткани; у живых декапсулированных личинок двигательная активность повышалась, максимально визуализировалась их внутренняя структура (рис.2Б); искусственное декапсулирование погибших и погибающих личинок не происходило;

3) последующее повышение интенсивности импульсивной компрессии приводило к вытеснению тканевой жидкости из мышечной пробы вместе с новорожденными личинками (длиной 80-100 мкм) и другими некапсулированными личинками разного возраста в краевую зону за пределы мышечных волокон, где определяли их количество, размеры, двигательную активность, визуализировались особенности внутренней структуры (рис. 2Г,Д); некоторые не вытесненные из пробы новорожденные личинки просматривались внутри мышечных волокон (рис 2Е).

Биопсия легко переносилась лабораторными животными. Полное заживление кожной раны происходило через 4-5 дней. МПД трихинеллеза у экспериментально зараженных животных был использован нами для контроля интенсивности и фазы инвазии при скрининге противотрихинеллезных препаратов и при оценке протек-тивной активности НПА.

2.1.2.2. Метод компрессорной трихинеллоскопии (КТ). По ходу мышечных волокон делали срезы длиной 0,3-0,5 и толщиной 0,1 см, помещали их в компрессорий МИС-7, который туго завинчивали и просматривали сначала под бинокулярной лупой МБС-10 (2x8 или 2x14), а затем для уточнения деталей при малом увеличении микроскопа (8 х15).

2.1.3. Методика проведения опытов по экспериментальной химиотерапии и оценке протективной активности препарата на основе НПА.

2.1.3.1. Методика опытов по скринингу и изучению эффективности химиотера-певтических препаратов. Терапевтическую активность препаратов оценивали у экспериментально зараженных белых мышей на мышечной фазе инвазии с помощью метода скрининга в режиме интенсивной терапии.

В опытах были использованы аутбредные мыши-самцы, массой тела 28-34 г, зараженные в желудок инвазионным материалом в дозах 450-700 личинок на 1 животное. Длительность инвазии к началу лечения составляла 38-83 дня. В качестве химиотерапевтических агентов были использованы 2,5 %-ная оральная суспензия аль-бендазола (СА) для ветеринарного использования и следующие оригинальные экспериментальные лекарственные формы, разработаные в лаборатории экспериментальной химиотерапии ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского из нетаблетированных альбепдазола-субстанции, медамина-субстанщш и официнальных таблетированных препаратов альбендазола - немозола и эсказола: водорастворимый продукт из альбен-дазола (ВРА) приготовлен из нетаблетированного альбендазола-субстанции (производства КНР); масляная суспензия медамина (МСМ) и водорастворимый продукт из медамина (ВРМ) приготовлены из нетаблетированного медамина-субстанщш, синтезированного в химической лаборатории отдела разработки и доклинического изучения противопаразитарных препаратов ИМПиТМ им Е.И. Марциновского ММА им И.М. Сеченова; масляные суспензии эсказола (МСЭ) и немозола (МСН) приготовлены из официнальных таблетированных препаратов альбендазола - эсказола (производства SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Германия) и немозола (Ипка Лабо-раториз Лимитед, Индия).

Мышей экспериментальных групп (по 6-12 голов в каждой), меченных индивидуальной меткой, взвешивали на коммерческих весах ВНЦ-2 с точностью до 1 г ежедневно в течение всего курса лечения. Животным вводили в желудок испытуемые препараты с помощью шприца и канюли один раз в день в течение 6-16-дневных курсов в повышенных суточных дозах ДВ (для ускоренного выявления целевого

эффекта и оценки переносимости препарата леченными животными). В процессе лечения при снижении массы тела животных в группе введение препаратов временно прерывали. Контрольные животных, служивших для подтверждения инвазивности личинок трихинелл, использованных для заражения животных, исследовали только с помощью МПД.

Каждое леченное животное исследовали на наличие и количество живых и погибших личинок трихинелл в скелетных мышцах с помощью МПД в течение всего курса лечения, в разные сроки после его окончания и посмертно после вскрытия животных. Определяли характер и степень выраженности деструктивных изменений у погибших личинок трихинелл. Продолжительность курса лечения зависила от показаний МПД: при гибели всех или подавляющего большинства личинок трихинелл в мышечных пробах лечение прекращали. Для проверки эффективности лечения проводили вскрытие леченных животных через 6-8 мес. после окончания лечения и исследовали у них методом КТ диафрагму и скелетные мышцы на наличие и количество живых и погибших личинок трихинелл в отдаленные сроки после окончания лечения. Показателем эффективности препаратов являлось значение интенеэффектив-ностн (ИЭ), которое рассчитывали в процентах по формуле:

ИЭ = (Мо-Мж) / Мо ■ 100, где Мо и Мж - среднее значение общего числа и живых личинок трихинелл в мышечных пробах соответственно.

2.1.3.2. Методика определения протективной активности оригинального препарата на основе НПЛ. На аутбредмых крыс обоего пола, массой тела 110-140 г, проведены два опыта. В первом опыте использованы 18 крыс массой тела 120-140г. Животным экспериментальной группы (7 крыс) вводили внутрибрюшинно НПА 3-кратно с интервалом между введениями в 24 дня. Остальные животные служили контролем. Контрольное заражение животных обеих групп проводили на 17-й день после последней иммунизации путем введения в желудок декалсулированных личинок трихинелл в дозе 2000 личинок на крысу. Прижизненное исследование проб скелетных мышц с помощью МПД проводили в разные сроки после контрольного заражения до момента убоя животных. Посмертное исследование проводили через 75-83 дня после контрольного заражения с помощью КТ образцов диафрагмы и массетера массой 0,4-0,6 г, и определяли количество личинок в исследуемых пробах у животных экспериментальной и контрольной групп.

Во втором опыте были использованы 16 крыс массой тела 110-135 г. Животным экспериментальной группы (8 голов) вводили НПЛ внутрибрюшинно 3-кратно с интервалами между инъекциями в 26 и 28 дней. Остальные крысы служили контролем. Протективную активность НПА оценивали после пяти последовательных заражений животных обеих групп в желудок декапсулированными личинками трихинелл, выделенными от зараженных белых мышей-доноров. Первое контрольное заражение било проведено через 13 дней после последней иммунизации. Интервалы между заражениями составляли 13-65 дней. Дозы инвазионного материала варьировали в пределах 2100-5940 личинок па животное, что соответствовало 7-20 л/г массы тела животных. Прижизненное исследование проб скелетных мышц с помощью МПД проводили в разные сроки после каждого контрольного заражения животных до момента убоя. Посмертные исследования проводили также как в первом опыте. Две ко[прольные крысы пали в течение первого месяца после последнего заражения от гиперинвазии трихинеллами. Вскрытие животных проводили через 52 дня после последнего заражения. Протективную активность (ПА) в обоих опытах рассчитывали в процентах по формуле:

ПА = (Мк-Ми) / Мк • 100, где Мк и Ми - среднее число личинок трихинелл на 1 г мышечной ткани у контрольных и иммунизированных животных соответственно. Полученные количественные данные обрабатывали с помощью метода вариационной статистики.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Сравнение методов прижизненной диагностики (МИД) трихинеллеза и посмертной компрессорной трихннеллоскопии (КТ) у экспериментально зараженных лабораторных животных.

2.2.1.1. Сравнительная эффективность МПД и КТ в отношении качественных параметров инвазии. Опыт 4-летнего применения МПД трихинеллёза у экспериментально зараженных лабораторных животных (исследовано около 4000 проб скелетных мышц у белых мышей и крыс, золотистых хомяков, хлопковых крыс) на миграционной и мышечной фазах инвазии показал высокую информативность этого теста. На основании данных, полученных с помощью МПД, установлены следующие дифференцирующие признаки живых и погибших личинок трихинелл: двигательная активность; способность сворачиваться в характерную тугую спираль в течение 1 часа после взятия мышечной пробы; четкость очерченности контуров капсулы; прозрачность полости капсулы; форма, положение и внутренняя структура тела личинки; подверженность искусственному декапсулированию.

Живые личинки трихинелл характеризовались двигательной активностью внутри капсулы в течение 10-15 минут и сворачиванием тела личинки в характерную тугую спираль через 52-60 минут после взятия пробы при комнатной температуре, четкой очерченностью контура капсулы, прозрачностью полости капсулы, визуализацией морфологической структуры сгихосомных клеток; личинки легко декапсулировались, декапсулированные личинки проявляли повышенную двигательную активность по сравнению с инкапсулированными паразитами (рис.2). Эти признаки жизнеспособности не выявлялись при исследовании мышц с помощью традиционной КТ (рис.1).

Рис. 1 Максимальная визуализация личинок Т. spiralis в 3-х пробах из скелетных мышц экспериментально зараженной белой мыши, исследованных методом традици-онной КТ на мышечной фазе инвазии. Нативные препараты. Длина отрезка измерительной шкалы - 500 мкм.

А, Б, В - три последовательные увеличения.

Рис.2 Микрофотограммы проб скелетных мышц, исследованных методом прижизненной диагностики у экспериментально зараженных трихинеллёзом аутбредных мышей. Нативные препараты. Длина отрезка измерительной шкалы -100 мкм.

А - инкапсулированная личинка Т. spiralis; Б, В - искусственно декап-сулярованные личинки трихинелл; Г' - неинкапсулированные личинки трихинелл разного возраста, вытесненные с тканевой жидкостью за пределы мышечной пробы; Д - новорожденные личинки Т. spiralis, вытес-ненные с тканевой жидкостью за пределы мышечных волокон; Е - новорожденная личинка Т. spiralis внутри мышечного волокна через 7 дней после заражения животного.

У погибающих и погибших личинок двигательная активность была сниженной или отсутствовала; сворачивание тела личинки в тугую спираль не происходило; очертания капсулы были размытыми; полость капсулы мутной или потемневшей и имела зернистую структуру; личинка внутри капсулы слабо визуализировалась, тело личинки было набухшим, имело вид складывающейся плоской ленты из-за снижения тургора; при исскуственном декапсулировании она не вытеснялась из капсулы или фрагментировалась.

Нами охарактеризованы три основных типа деструктивных изменений личинок под влиянием противопаразитарных агентов: I тип - полость капсулы мугная, зернистая, структура тела сглажена, контуры нечеткие, стихоциты деформированы; II тип - контуры капсулы прерывистые или отсутствуют, тело личинки потемневшее, полностью кальцинированно с сохранением конту ров личинки; III тип - фрагментация, частичная или полная резорбция тела петрифицированной личинки.

Рис.3 Деструктивные изменения у инкапсулированных личинок Т. spiralis в прижизненных биоптатах из скелетных мышц белых мышей, леченных экспериментальными лекарственными формами альбендазола, мебендазола и медамина. Нативные препараты. Длина отрезка измерительной шкалы - 500 мкм.

А, Б, В - сглаженность структуры, снижение тургора и набухание тела личинок, потемнение содержимого капсул, размытость очертаний стихоцитных клеток; Г, Д, Е - потемнение и петрификация тела личинок; Ж, 3, И - фрагментация и частичная резорбция петрифицированных личинок.

2.2.1.2. Сравнительная эффективность МПД и КТ по количественным параметрам инвазии. Сравнивали эффективность МПД и метода посмертной КТ при определении интенсивности инвазии в мышцах различных групп у лабораторных животных. В опыте использовали аутбредных мышей-самцов массой тела 25-28 г, зараженных в желудок инвазионным материалом в дозе 600 личинок трихинелл на 1 мышь. Интенсивность инвазии (ИИ) определяли у каждого животного через 42-46 дней после заражения с помощью МПД, а после убоя - методом КТ.

По результатам МПД и КТ в ряду снижения интенсивности инвазии располагались диафрагма, массетер, мышцы икроножной группы (табл.1). При этом различия количественных показателей интенсивности инвазии, определенных по массе-теру и мышцам икроножной группы с помощью МПД и КТ были статистически не существенными (р>0,1). Полученные результаты свидетельствуют о высокой информативности МПД при определении интенсивности инвазии у лабораторных животных, зараженных дозой инвазионного материала 20-25 личинок/г массы тела животных.

Таблица 1

Сравнительные показатели интенсивности инвазии у экспериментально зараженных трихинеллёзом белых мышей по результатам исследований методом прижизненной диагностики (МПД) и посмертной компрессорной трихинеллоскопией

(КТ)*_.____

Группа мышц Интенсивность инвазии (среднее число личинок на 1 г ткани), определенная методами Достоверность различия

МПД КТ 1 Р

Икроножная 570 ± 82 590 ± 191 0,01 >0,1

Массетер 2100 ±646 1810 ±599 0,33 >0,1

Диафрагма - 3190 ±973 - -

*- в опыте использованы аутбредные мыши-самцы массой тела 25-28 г, зараженные в желудок инвазионным материалом в дозе 600 личинок на 1 животное. Интенсивность инвазии определяли у каждой мыши через 42-46 дней после заражения сначала с помощью МПД, а после убоя - методом КТ. При исследовании с помощью МПД из скелетных мышц каждого животного брали по 2-4 пробы массой 11,5 мг каждая, а при КТ масса мышечной пробы составляла 30-120 мг.

2.2.2. Применение МПД у экспериментально зараженных животных при скрининге и оценке эффективности противотрихинеллезных препаратов.

2.2.2.1. Эффективность оригинальной масляной суспензии медамина (МСМ) при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной фазе инвазии. В опыте использовали 9 аутбредных мышей-самцов, зараженных инвазионным материалом в дозе 700 личинок на мышь. Длительность инвазии к началу лечения составляла 48 дней. К этому сроку наличие и интенсивность инвазии были подтверждены с помощью МПД. Параметры экспериментальной химиотерапии приведены на рис.4 и в табл. 3. Результаты полученные с помощью МПД показали, что уже через 3 дня после начала лечения 36% личинок в мышечных пробах были погибшими, а к 8-му дню отмечена гибель всех личинок в пробах. При исследовании излеченных животных с помощью МПД через 2-3 мес после окончания лечения наблюдали деструктивные изменения личинок, отнесенные нами к I типу. Убой, вскрытие леченных животных и определение ИЭ проводили через 6 мес после окончания лечения с помощью КТ. В результате исследования в пробах из диафрагмы, массетера и мышц икроножной группы личинки трихинелл не обнаружены, что свидетельствовало о полной резорбции личинок трихинелл и их капсул.

123456789

Дни печения

н.и....и.ц средняя суточная доза ДВ. мг/кг

—о— среднее содержание живых личинок в пробах скелетных мыщ %

Рис.4. Эффективность оригинальной масляной суспензии медамина (МСМ) при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной фазе инвазии.

2.2.2.2. Оценка терапевтической активности оригинального водорастворимого продукта из медамина (ВРМ). В опыте использовали 6 аутбредных мышей-самцов, зараженных инвазионным материалом в дозе 700 личинок на мышь. Длительность инвазии к началу лечения составляла 48 дней. Наличие и интенсивность инвазии, контроль за качественными и количественными её параметрами в течение курса лечения и после его окончания определяли с помощью МПД. Параметры экспериментальной химиотерапии приведены на рис.5 и в табл. 3.

1 2 3 4 5 6 7 В 9 10 11 12 13 14 15 16

Дни лечения

I"/"'-'.средняя суточная доза ДВ, мг/кг

—|------ среднее содержание живых личинок в пробах скелетных мьмц, %

Рис.5. Эффективность водорастворимого продукта из медамина (ВРМ) при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной фазе инвазии.

По показаниям МПД гибель 92% личинок от всей популяции у леченных животных отмечена через 16 дней после начала лечения. При исследовании леченных животных через 20 дней после начала лечения живых личинок трихинелл в пробах скелетных мышц не обнаружено. Убой животных проводили через 6 месяцев после окончания лечения и исследовали скелетные мышцы и диафрагму с помощью КТ. В результате исследования личинки трихинелл не обнаружены, что свидетельствовало о полной резорбции тел всех личинок и их капсул.

2.2.2.3. Оценка терапевтической активности коммерческой 2,5%-суспензии альбендазола (СА). В опыте использовали 12 аутбредных мышей-самцов, зараженных дозой инвазионного материала - 700 личинок на мышь. Контроль за параметрами инвазии в течение курса лечения и после его окончания проводили с помощью МПД. Длительность инвазии к началу лечения составляла 38 дней. Режим и результаты химиотерапии приведены на рис.6 и в табл. 3. По данным, полученным с помощью МПД, СА вызвал гибель лишь 80 % личинок трихинелл через 20 дней после начала лечения. Исследование вскрытых животных с помощью КТ через 8 мес после окончания лечения выявило 23,6% живых личинок, остальные личинки были погибшими; выявленные у них деструктивные изменения относились преимущественно к III типу.

2.2.2.4. Оценка терапевтической активности водорастворимого продукта из альбендазола (ВРА). В опыте использовали 6 аутбредных мышей-самцов, зараженных инвазионным материалом в дозе 450 личинок на мышь. Длительность инвазии к началу лечения составляла 47 дней. Исходную интенсивность инвазии, её параметры в течение курса лечения и после его окончания определяли с помощью МПД.

1400 -о-о—о—о—о—т 100

90 80 70 60 50 40

400 -¡- _ _п||||1111 30

20 10

о |1|И|-;> ■:»!■ ».«¡ч НИ ■ Ж | Ю И -1-,-,-,-,-0

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21

Дни лечения

средняя суточная доза ДВ. мг/кг —о— среднее содержание живых личинок в пробах скелетных МЫЦХ1, %

1200 1000 800 600

Рис.6. Эффективность 2,5%-ной суспензии альбендазола при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной стадии инвазии.

Результаты исследования, полученные с помощью МПД, показали (рис. 7 и табл.3), что ВРА обладает выраженной ларвицидной активностью в отношении инкапсулированных Т. spiralis. Гибель всех личинок в прижизненных пробах из скелетных мышц была отмечена через 7 дней после начала лечения.

т 100 1

90 |

т 80 |

70 *

60 I

50 |

40 I

30 |

20 |

10 |

О "

1 2 3 4 5 6 7

Дни лечения

средняя суточная доза ДВ. мг/кг

среднее содержание живых личинок в пробах скелетных мышц, Ч

зос

!';3

50 --

Рис.7. Оценка эффективности водорастворимого продукта из альбендазола при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной фазе инвазии.

Деструктивные изменения у погибших личинок относились к III типу. Высокая эффективность ВРА была подтверждена показателями посмертной КТ через 6 мес после окончания лечения.

2.2.2.5. Оценка сравнительной эффективности оригинальных масляных суспензий эсказола (МСЭ) и немозола (МСН) при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной фазе инвазии.

Белых мышей, средней массой тела 25-28 г, заражали в желудок, дозой инвазионного материала 700 личинок T.spiralis на 1 мышь. Длительность инвазии к началу лечения составляла 83 дня. В экспериментальных и контрольной группах было по 8 животных. МСЭ и МСН с содержанием ДВ 40 мг/мл вводили леченным животным в

желудок в течение 6-ти дней в средней суточной дозе 0,3 г/кг (табл. 2, 3). Эффективность препаратов в процессе всего курса лечения оценивали с помощью МПД и при вскрытии животных через 30 дней после окончания лечения с помощью КТ. В ходе эксперимента у животных, леченных МСН, пало 4 (50,0%) мыши через 3-9 дней после начала лечения. У леченных МСЭ мышей и в контрольной группе падежа не было. При вскрытии у всех леченных животных в скелетных мышцах и диафрагме выявлены только погибшие личинки Т. spiralis, тогда как у мышей контрольной группы все личинки были живыми, средняя интенсивность инвазии диафрагмы, массетера и мышц икроножной группы составляла в среднем 3190, 1810 и 590 личинок/г ткани соответственно.

Полученные результаты показали 100%-ную эффективность МСЭ и МСН при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной фазе инвазии после 6-дневном курса лечения. Однако МСН оказался гораздо более токсичным для животных, чем МСЭ в одинаковых условиях эксперимента, что свидетельствует о перспективности МСЭ в качестве противотрихинеллбзного средства.

Среди испытанных препаратов наиболее эффективными были оригинальные лдекарственные формы альбендазола (ВРА, МСН, МСЭ) под влиянием которых в средних суммарных дозах ДВ 1,63-1,95 г/кг гибель всей популяции инкапсулированных личинок трихинелл у всех леченных животных отмечена через 6-7 дней после начала лечения, однако выраженная токсичность МСН исключает возможность применения этого препарата для лечения трихинеллеза Высокая эффективность ВРА и МСЭ позволяет рекомендовать их в качестве перспективных противотрихинеллезных средств. Менее эффективными оказались лекарственные формы медамина (МСМ и ВРМ), вызвавшие радикальный терапевтический эффект у всех леченных животных в средних суммарных дозах ДВ 2,09-4,43 г/кг в более поздние сроки после начала лечения (через 8-20 дней). Однако в отдаленные сроки после окончания лечения этими препаратами (6 мес) у всех леченных животных наблюдали полную резорбцию всех погибших личинок трихинелл и их капсул. Это впервые выявленное свойство МСМ и ВРМ может быть использовано при создании новых лекарственных композиций, высокоэффективных при ларвальном трихинеллезе, способных вызывать не только гибель всей популяции личинок, но и полную резорбцию погибшего паразита.

Высокая информативность, малая трудоемкость и быстрое осуществления МПД обеспечивают ускорение и снижение затратности экспериментальных исследований с его использованием. МПД позволяет проводить скоротечные эксперименты по скринингу новых лечебных противотрихинеллезных препаратов длительностью до 1 недели на малом количестве животных в экспериментальных группах. Применение МПД в исследованиях по скринингу новых противотрихинеллезных препаратов на мышечной фазе экспериментальной инвазии (фаза стабилизации количества прижившихся личинок трихинелл) дает возможность заменить традиционную КТ (не дающую информацию о танатогенезе личинок) новой методикой, позволяющей проводить прижизненный мониторинг особенностей губительного действия исследуемых препаратов на инкапсулированные личинки (скорость, характер, степень выраженности, синхронность) на протяжении всего курса лечения до момента гибели всей популяции личинок у всех леченных животных. Перспективным представляется быстрое и точное прижизненное тестирование на этой модели биодоступности новых экспериментальных лекарственных форм препаратов группы карбаматбензимидазолов, пригодных для химиотерапии других тканевых гельминтозов.

Таблица 2

Сравнительная оценка терапевтической активности оригинальных лекарственных форм, полученных из офици-нальных препаратов альбсндазола - Немозола* (МС11) и Эсказола* (МСЭ) при экспериментальном трихинеллёзе белых мышей на мышечной фазе инвазии**.

Дни лечения Параметры экспериментальной химиотерапии, обеспечивающие гибель всех мышечных личинок трихинелл у животных, леченных масляными суспензиями

МСЭ мен

средняя, маосатела ЖИПСГП1ЫХ,Г средняя доза Д В, г/кг падеж, % средняя массатела животных, г средняя доза ДВ, г/кг падеж, %

суточная суммарная суточная суммарная

1 32,4 0,25 0,25 0 30,6 0,26 0,26 0

2 33,8 0,40 0,65 0 31 0,39 0,65 0

3 33,3 0,48 1,13 0 30,4 0,39 1,04 0

4 29,5 - 1,13 0 26,6 - 1,04 12,5

5 29,5 0,27 1,40 0 26,6 0,30 1,34 12,5

6 31 0,39 1,79 0 27,6 0,29 1,63 25

7 31 - 0 26,5 - 37,5

8 30,9 - 0 26,8 - 50

9 32,3 - 0 26,25 - 50

* - официнальные препараты альбендазола - Немозол (производства Ипка Лабораторнз Лнмитед, Индия) и Эсказол (произ-водства SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Германия)

** - доза инвазионного материала - 700 личинок трихинелл на мышь; длительность инвазии к началу лечения - 83 дня

Сравнительная эффективность лекарственных форм препаратов группы карбаматбензимидазолов при экспериментальном трихинеллезе белых мышеи на мышечной фазе инвазии при использовании методов прижизненной диагностики (МПД) и посмертной компрессорной трихинеллоскопни (КТ)

Препарат Параметры химиотерапии Показатели эффективности лечения, полученные с помощью методов диагностики

МПД КТ

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Оригинальная масляная суспензия медамина (МСМ) 0,30 2,09 7 3 4 8 1* 6 100

Оригинальный водорастворимый продукт из медамина (ВРМ) 0,28 4,43 16 6 13 20 1* 6 100

2,5%-суспензия альбендазола (производства фирмы ШУЕБА®, Испания) (СА) 0,64 10,18 16 8 14 - III 8 86

Оригинальный водорастворимый продукт из альбендазола (ВРА) 0,28 1,95 7 4 6 7 III 6 100

Оригинальная масляная суспензия эсказола (МСЭ) 0,30 1,78 6 - - 6 III 8 100

Оригинальная масляная суспензия немозола (МСН) 0,28 1,63 6 - - 6 III 8 100

1 - расчетная средняя суточная доза ДВ за курс лечения, г/кг;

2 - средняя суммарная доза ДВ за курс лечения, г/кг;

3 - продолжительность курса лечения, дни;

4 - срок появления деструктивных изменений у мышечных

личинок трихинелл после начала лечения, дни;

5 - срок гибели 50% личинок трихинелл в пробах скелетных мышц

после начала лечения, дни;

6 - срок гибели всей популяции личинок трихинелл в пробах

скелетных мышц после начала лечения, дни;

7 - преобладающий тип деструктивных изменений личинок

трихинелл;

8 - срок вскрытия животных после начала лечения, мес.;

9 - интенсэффективность препарата, %;

* - полная резорбция личинок и их капсул в отдаленные сроки после окончания лечения

2.2.3. Протективная активность препарата на основе нового паразитарного антигена (НПА) при экспериментальном трихинеллезе белых крыс.

При исследовании с помощью МПД скелетных мышц в двух опытах у всех иммунизированных животных личинки трихинелл не были обнаружены, тогда как у всех контрольных животных прослежена в динамике гиперинвазия Т. spiralis на всех стадиях развития паразита. Новорожденные личинки трихинелл были выявлены у всех контрольных животных через 6-8 дней после контрольных заражений.

В первом опыте при вскрытии животных и исследовании их мышц с помощью КТ через 75-83 дня после контрольного заражения было установлено (табл. 4), что у иммунизированных крыс интенсивность инвазии составляла: в диафрагме - 4,97 личинок на 1 г ткани (л/г), в массетере - 0,94 л/г, тогда как у контрольных животных интенсивность инвазии была равна: в диафрагме - 4293,8 л/г, а в массетере - 2581,6 л/г. ПА составляла: по диафрагме - 99,88%, по массетеру - 99,96%. Экстенсэффекгивность (ЭЭ) (число животных свободных от личинок трихинелл в процентах) была равна: по.диафрагме - 14,3%, по массетеру - 42,9%.

Во втором опыте две контрольные крысы пали в течение первого месяца после последнего заражения от гиперинвазии трихинеллами. При вскрытии животных обеих групп и исследовании их мышц с помощью КТ с 52-го дня после последнего заражения установлено (табл. 4), что у иммунизированных крыс число личинок составляло: в диафрагме - 2,74 л/г, в массетере - 3,84 л/г, в мышцах икроножной группы - 3,07 л/г, тогда как у контрольных животных интенсивность инвазии была равна: в диафрагме - 5098,6 л/г, в массетере - 4679,3 л/г, в мышцах икроножной группы - 2719,2 л/г. ПА составила: по диафрагме - 99,95%, по массетеру - 99,92%, по мышцам икроножной группы - 99,89%; ЭЭ была равна: по диафрагме -75,0%, по массетеру и мышцам икроножной группы - 50,0%.

Результаты наших исследований показали, что с применением МПД тестирование целевого эффекта экспериментальных противотрихинеллезных вакцин стало возможным уже с 7-го дня после контрольного заражения иммунизированных животных. Полученные данные, свидетельствующие о высокой протективной активности НПА при экспериментальном трихинеллезе белых крыс, открывают перспективу разработки новых эффективных противотрихинеллезных вакцин.

2.2.4. Результаты опытов по искусственной трансплантации кишечных трихинелл.

В природных очагах возбудитель инвазии Т. spiralis передается в биологической системе хищник-жертва, в которой хищник, как правило, поедает всё тело жертвы вместе с кишечником. Роль кишечных трихинелл в передаче инвазии до настоящего времени не выяснена. Мы изучали инвазивность кишечных трихинелл в возрасте в 4, 6 и 8 дней от экспериментально зараженных белых мышей-доноров для взрослых интактных лабораторных грызунов-реципиентов того же вида, массой тела 25-30г. Донорами кишечных трихинелл служили мыши, зараженные в желудок инвазионным материалом в дозе 500 личинок на животное. Кишечные трихинеллы от мышей-доноров, использовали в качестве инвазионного материала 3-мя способами: 1) путем введения в желудок мышам-реципиентам изолированных кишечных трихинелл; 2) введением в желудок мышам-реципиентам мелких фрагментов тонкого отдела кишечника доноров с помощью шприца и канюли; 3) путем скармливания мышам-реципиентам цельной тонкой кишки мышей-доноров. У мышей-реципиентов, зараженных первым способом, с помощью МПД выявлена инвазия Т. spiralis с 8-го дня после заражения. У всех мышей-реципиентов, зараженных 3-мя способами и вскрытых через 30-45 дней после заражения, исследовали с помощью КТ скелетные мышцы и диафрагму на наличие и жизнеспособность мышечных личинок трихинелл.

Протективная активность (ПА) препарата на основе новых паразитарных антигенов (НПА) при экспериментальном трихинеллезе белых крыс

Группы животных Интенсивность инвазии, число личинок трихинелл в 1 г ткани

Опыт 1* Опыт 2**

диафрагмы массетера диафрагмы массетера мышц икроножной группы

конрольная 4293,8±913,2 2581,6±526,6 5098,5 8±987,5 4679,35± 1039,6 2719,2±907,3

экспериментальная 4,97±3,48 0,94±0,39 3,7±2,9 4,0±3,2 3,3±3,2

Достоверность различия t 4,7 4,9 5,16 4,50 2,99

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

ПА, % 99,88 99,96 99,93 99,91 99,88

Число (%) иммунизированных животных, которых не выявлены личинки трихинелл 1 (14,3) 3 (42,8) б (75,0) 6 (75,0) 4 (50,0)

« - В первом опыте использованы 18 крыс обоего пола массой тела 120-140г. Животным экспериментальной группы (7 крыс) вводили внутрибрюшинно НПА 3-кратно с интервалом между введениями в 24 дня. Остальные животные служили контролем. Контрольное заражение животных обеих групп проводили на 17-й день после последней иммунизации путем введения в желудок декапсулированных личинок трихинелл, выделенных методом пептического переваривания из мышечной ткани экспериментально зараженных белых мышей-доноров. Доза инвазионного материала составляла 2000 личинок на крысу.

** - Во втором опыте были использованы 16 крыс обоего пола массой тела 110-135 г. Животным экспериментальной группы (8 голов) вводили НПА внутрибрюшинно 3-кратно с интервалами между инъекциями в 26 и 28 дней. Остальные крысы служили контролем. Протекгивную активность НПА оценивали после пяти последовательных заражений животных обеих групп в желудок декапсулированными личинками трихинелл, в дозах инвазионного материала 2100-5940 личинок на животное. Первое контрольное заражение было проведено через 13 дней после последней иммунизации. Интервалы между последующими заражениями составляли 13-65 дней.

У всех мышей первой группы, получивших в желудок изолированные кишечные трихинеллы, в скелетных мышцах и диафрагме выявлено множество мышечных личинок трихинелл. У животных второй и третьей групп, которым вводили в желудок фрагменты или скармлив&чи цельную тонкую кишку, восприимчивость к заражению составила 72,2% и 76,2% соответственно (табл. 5), что, по-видимому, обусловлено травмированием многих кишечных трихинелл экспериментатором или грызунами. Полученные данные впервые показали высокую патогенностъ изолированных кишечных трихинелл для интактных лабораторных животных, что дает возможность их использования в качестве альтернативного инвазионного материала для поддержания возбудителя инвазии в лабораторных условиях и серийного воспроизведения экспериментальной модели трихинеллеза. В свете этих данных доказана возможность передачи возбудителя инвазии в природных очагах трихинеллеза не только на стадии инвазионных мышечных личинок трихинелл, как это было принято считать ранее, но и на кишечной стадии развития паразита.

Таблица 5

Восприимчивость интактных белых мышей к оральному заражению кишечными трихинеллами от экспериментально зараженных белых мышей-доноров*

Способ заражения животных-реципиентов Возраст донорских кишечных трихинелл, дни Число животных

в опыте из них заразилось

абс. %

Введение в желудок изолированных кишечных трихинелл (150 особей на 1 мышь) 4 16 16 100

Введение в желудок мелких фрагментов тонкой кишки 8 18 13 72,2

Скармливание цельной тонкой кишки инвази-рованных мышей-доноров** 6 21 16 76,2

*- мыши-доноры вскрыты через 4-8 дней после заражения в желудок 500 личинками трихинелл. ** - мыши- реципиенты содержались на голодной диете в течение 1 суток до заражения.

Таким образом, метод прижизненной диагностики трихинеллеза позволяет на морфологическом уровне осуществлять контроль в динамике за основными качественными и количественными параметрами инвазии на миграционной и мышечной фазах у каждого экспериментально зараженного животного как при естественном течении заболевания, так и под влиянием лечебных и профилактических средств.

ВЫВОДЫ

1. Новый метод прижизненной диагностики экспериментального трихинеллеза, основанный на микроскопии в тонком слое малых проб скелетных мышц массой 1-1,5 мг обеспечивает диагностику на миграционной и мышечной фазах инвазии и позволяет на морфологическом уровне осуществлять контроль за индивидуальными качественными и количественными параметрами инвазии в динамике у каждого зараженного животного. Применение нового метода обеспечивает повышение информативности, ускорение и снижение затратности экспериментальных исследований по проблемам трихинеллеза как фундаментального и прикладного характера.

2. На основе впервые выявленного феномена успешной искусственной трансплантации (пассивного «переселения») кишечных трихинелл из кишечника зараженных трихинеллезом лабораторных грызунов-доноров в кишечник интактных животных-реципиентов через желудок последних доказана высокая патогеиность кишечных трихинелл при их

использовании в качестве альтернативного инвазионного материала для поддержания возбудителя инвазии в лабораторных условиях.

3. ЮО-% эффективность оригинальных экспериментальных лекарственных форм препаратов группы карбаматбензимидазолов (альбендазола и медамина) при трихинеллезе белых мышей на мышечной стадии инвазии получена после лечения животных в режиме интенсивной терапии под контролем нового метода прижизненной диагностики трихинеллеза в течение курса лечения и после его окончания.

4. Установлен процесс резорбции инкапсулированных личинок трихинелл и их капсул а скелетных мышцах и диафрагме у зараженных трихинеллёзом белых мышей в отдаленные сроки (через 6 мес) после экспериментальной химиотерапии оригинальными лекарственными формами медамина.

5. Выявлена высокая протективная активность (99,9%) оригинального препарата на основе новых паразитарных антигенов при экспериментальном трихинеллезе белых крыс. Эффективность препарата оценена в условиях жесткого контроля (до 5-ти контрольных заражений в дозе инвазионного материала при контрольных заражениях до 5,9 тыс личинок трихинелл на 1 животное).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы диссертационной работы вошли в методические рекомендации «Мегод прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных», одобренные секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, 1 марта 2007г.

По результатам исследований лекарственных противотрихинеллезных препаратов представлены «Методические рекомендации по применению метода прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных животных лабораторных животных при скрининге противотрихинеллезных препаратов», одобренные секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, 1 марта 2007г.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Репина Е.А., Коваленко Ф.П., Кухалева И.В. Новый метод прижизненной диагностики экспериментального трихинеллеза// Материалы Всероссийской научной конференции "Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты профилактики инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний", СПб, 17-18 апреля 2008 г. // Вестник Российской Военно-медицинской академии. Приложение. - 2008. - 2(22). - Ч. I. - С. 190-191.

2. Коваленко Ф.П., Репина Е.А., Бережко В.К. Протективная активность препарата на основе новых паразитарных антигенов при экспериментальном трихинеллезе белых крыс// Материалы Всероссийской научной конференции "Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты профилактики инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний", СПб, 17-18 апреля 2008 г. // Вестник Российской Военно-медицинской академии. Приложение. -2008.-2(22).-4.1.-С. 139-140.

3. Репина Е.А., Коваленко Ф.П. Метод прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных// Российский паразитоло-гический журнал, №2 .-2007.-С.125-126

4. Репина Е.А., Коваленко Ф.П., Кухалева И.В. Новый метод прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных.// Тезисы V Конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки

и прогресс клинической медицины» 19-22 мая 2008 г.// Вестник РАМН. Приложение. -2008.-С.360.

5. Репина Е.А., Коваленко Ф.П., Кухалева И.В. Сравнительная эффективность эсказола и немозола при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной стадии инвазии.//Тезисы V Конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 19-22 мая 2008 г. // Вестник РАМН Приложение.-2008.-С.361.

6. Репина Е.А., Коваленко Ф.П., Кухалева И.В. Экспериментальное обоснование нового пути передачи инвазии в природных очагах трихинеллёза.//Тезисы V Конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 19-22 мая 2008 г. // Вестник РАМН. Приложение - 2008. -С.361-362.

7. Коваленко Ф.П., Репина Е.А., Кухалева И.В. Способ диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных. Патентная заявка на изобретение № 057599 / 2008144172. Приоритет - 10.11.2008 г.

Подписано в печать 14.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1194 Тираж: 150 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wvvw.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Репина, Елена Александровна

ВВЕДЕНИЕ

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I Сведения о биологии возбудителя, диагностике, лечении и 10 профилактике трихинеллеза

1.1 Систематическое положение Т.spiralis

1.2 Географическое распространение трихинеллеза

1.3 Морфология и развитие паразита

1.4 Диагностика трихинеллеза

1.5 Химиотерапия трихинеллеза

1.6 Профилактика трихинеллеза

1.7 Моделирование трихинеллеза

II СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Материалы и методы

1.1 Методы получения инвазионного материала и заражения лабораторных животных.

1.1.1 Метод переваривания скелетных мышц в искусственном же- 40 лудочном соке.

1.1.2. Метод выделения кишечных трихинелл.

1.1.3. Подсчет количества личинок и кишечных трихинелл при за- 41 ражении животных.

1.1.4. Заражение лабораторных животных личинками трихинелл.

1.1.5. Заражение лабораторных животных кишечными трихинел- 41 лами.

1.2. Методы диагностики инвазии у экспериментально заражен- 42 ных лабораторных животных.

1.2.1. Оригинальный метод прижизненной диагностики (МПД) 42 трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных.

1.2.2. Метод компрессорной трихинеллоскопии (КТ).

1.3. Методика проведения опытов по экспериментальной химио- 45 терапии и оценке протективной активности препарата на основе НПА.

1.3.1. Методика опытов по скринингу и изучению эффективности хи- 45 миотерапевтических препаратов.

1.3.2. Методика и схемы опытов по определению протективной ак- 46 тивности оригинального препарата на основе нового паразитарного антигена (НПА).

1.4. Постановка и учет опытов.

1.4.1. Постановка и учет опыта по сравнению метода прижизненной 48 диагностики (МПД) и посмертной комрпессорной трихинеллоскопии (КТ).

1.4.2. Схемы опытов по оценке терапевтической активности оригинальных экспериментальных лекарственных форм препаратов группы карбаматбензимидазолов.

1.4.2.1. Схема опыта по оценке терапевтической активности ориги- 49 нальной масляной суспензии медамина (МСМ).

1.4.2.2. Схема опыта по оценке терапевтической активности ориги- 50 нального водного раствора медамина (ВРМ).

1.4.2.4. Схема опыта по оценке терапевтической активности оригинальной коммерческой 2,5%-суспензии альбендазола (СА).

1.4.2.4. Оценка терапевтической активности оригинального водного 50 раствора альбендазола(ВРА).

1.4.2.5. Сравнительная эффективность оригинальных масляных сус- 51 пензий эсказола (МСЭ) и немозола (МСН) при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной стадии инвазии.

1.4.3. Постановка и учет опыта по оральному заражению кишечны- 51 ми трихинеллами интактных лабораторных животных.

2 Результаты исследований и их обсуждение.

2.1. Сравнение методов прижизненной диагностики (МПД) три- 52 хинеллеза и посмертной компрессорной трихинеллоскопии

КТ) у экспериментально зараженных лабораторных животных.

2.1.1. Сравнительная эффективность МПД и КТ в отношении каче- 52 ственных параметров инвазии

2.1.2 Сравнительная эффективность МПД и КТ по количественным 60 параметрам инвазии

2.2. Применение МПД у экспериментально зараженных животных 63 при скрининге и оценке эффективности противотрихинеллезных препаратов

2.2.1. Эффективность оригинальной масляной суспензии медамина 63 (МСМ) при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной фазе инвазии.

2.2.2. Оценка терапевтической активности оригинального водорас- 65 творимого продукта из медамина (ВРМ).

2.2.3 Оценка терапевтической активности коммерческой 2,5%- 67 суспензии альбендазола (СА).

2.2.4 Оценка терапевтической активности водорастворимого про- 69 дукта из альбендазола (ВРА).

2.2.5 Оценка сравнительной эффективности оригинальных масля- 70 ных суспензий эсказола (МСЭ) и немозола (МСН) при экспериментальном трихинеллезе белых мышей на мышечной фазе инвазии.

2.3. Протективная активность препарата на основе нового парази- 73 тарного антигена (НПА) при экспериментальном трихинеллезе белых крыс.

2.4. Искусственная трансплантация просветных форм трихинелл.

3. Обсуждение результатов исследований.

4 ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментальный трихинеллез: разработка новых методов моделирования, диагностики, профилактики и лечения"

Актуальность проблемы. Трихинеллез является одним из наиболее опасных зоонозов. В 1991 г. на территории Российской Федерации у людей зарегистрировано 173 случая, в 1992 - 673, в 1993 - 626, в 1994-1945, а в 1995 г. -1091 случай трихинеллеза. Из 884 случаев, выяв-ленных в 1993 г. у животных при послеубойной ветсанэкспертизе, 94,5% приходилось на Краснодарский и Красноярские края, Северную Осетию, Карелию, Московскую, Мурманскую, Калининградскую и Ленинградскую области. Анализ вспышек трихинеллеза в ряде регионов Урала, Сибири, а также Северо-Восточного региона Нечерноземной зоны РФ свидетельствуют о том, что наибольшее значение имеют факторы прямой передачи через туши употребляемых в пищу диких животных и скармливание тушек пушных зверей домашним животным.

В настоящее время большинство экспериментальных работ по проблемам трихинеллеза (особенности патогенеза инвазии, скрининг и доклиническое изучение специфических противотрихинеллезных лечебных и профилактических препаратов) проводиться на лабораторной модели инвазии.

Диагностика трихинеллёза у экспериментально зараженных лабораторных животных основана на методах компрессорной трихинеллоскопии и переваривания в искусственном желудочном соке скелетных мышц и диафрагмы. Однако эти методы, перенесенные в экспериментальные исследования из практической ветеринарии без существенных изменений со времени основополагающих рекомендаций (Reissmann, 1908; Strobel, 1911), сопряжены с обязательным убоем подопытных животных и позволяют выявлять личинки трихинелл лишь на поздней мышечной стадии, что исключает возможность определения на морфологическом уровне качественных и количественных параметров на миграционной и мышечной фазах у каждого зараженного животного в динамике. Такой же информативностью обладает и предложенных ранее метод прижизненной диагностики трихинеллёза у человека, основанный на компрессорной трихинеллоскопии биоптата из икроножной мышцы (В. А. Калюс, 1952).

Риск возникновения новых вспышек трихинеллёза на территории РФ по-прежнему очень высок и проблема профилактики и лечения трихинеллёза до настоящего времени не утратила своей актуальности, поскольку методы специфической профилактики инвазии еще не разработаны и поиск новых лекарственных средств против данной инвазии является ключевым. В настоящее время в качестве основных средств химиотерапии трихинеллёза используют препараты группы карбаматбензимидазолов, но пока еще не разработаны оптимальные лекарственные формы этих препаратов и режимы их применения, приводящие к радикальному терапевтическому эффекту (Chung et al., 2001; McCracen, 1978 и др.). Важным направлением в паразитологии является создание профилактических препаратов, что особенно актуально в отношении антропозоонозных заболеваний. Разработка средств профилактики трихинеллеза является важной и пока еще не решенной проблемой (Gamble, 1985; Ortega-Pierres et al., 1989; Eissa et al., 2003; Dea-Ayuela et al., 2006).

Цель и задачи исследования.

Цель работы: разработка нового метода прижизненной диагностики экспериментального трихинеллеза у лабораторных животных и оценка его пригодности в изучении вопросов патогенеза инвазии, при скрининге и изучении эффективности лечебных и профилактических противотрихинеллезных средств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• сравнить пораженность скелетных мышц и диафрагмы инкапсулированными личинками Т. spiralis у экспериментально зараженных лабораторных грызунов при интенсивной инвазии;

• выявить возможность отражения важнейших параметров трихинеллеза (наличия, интенсивности и фазы инвазии) при микроскопическом исследовании нативных малых проб скелетных мышц (массой 1-1,5 мг) у экспериментально зараженных лабораторных грызунов;

• отработать оптимальные параметры метода прижизненной диагностики (МПД) трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных грызунов на миграционной и мышечной фазах инвазии;

• оценить пригодность МПД и отработать параметры его применения при скрининге противотрихинеллезных препаратов на мышечной фазе инвазии;

• оценить пригодность МПД в исследованиях по изучению эффективности оригинальных лекарственных форм медамина и альбендазола (масляных суспензий и водорастворимых продуктов из препаратов) у экспериментально зараженных лабораторных грызунов на мышечной фазе инвазии;

• оценить пригодность МПД при изучении протективной активности оригинального препарата на основе новых паразитарных антигенов (НПА).

• разработать регламент применения МПД трихинеллеза в экспериментальных исследованиях;

Научная новизна.

В результате исследований впервые:

• выявлен феномен манифестации основных параметров инвазии Т. spiralis (наличия, интенсивности и фазы инвазии) в малых прижизненных пробах скелетных мышц (массой 1-1,5мг) у экспериментально зараженных лабораторных животных;

• доказана возможность искусственной трансплантации (пассивного «переселения») кишечных трихинелл от экспериментально зараженных лабораторных животных-доноров в кишечник интактных животных-реципиентов через желудок последних и последующего развития типичной инвазии у реципиентов;

• выявлена высокая эффективность оригинальных экспериментальнных лекарственных форм альбендазола и медамина (масляных суспензий и водорастворимых продуктов из препаратов) на мышечной стадии трихинеллеза у лабораторных животных;

• установлен процесс резорбции инкапсулированных мышечных личинок трихинелл после радикальной химиотерапии экспериментальной инвазии оригинальными лекарственными формами препаратов группы альбендазола и медамина;

• выявлена высокая протективная активность оригинального препарата на основе (НПА) при экспериментальном трихинеллезе белых крыс;

Практическая значимость.

Новый, высокоинформативный, удобный и быстро выполнимый метод обеспечивает прижизненную диагностику трихинеллеза на миграционной и мышечной фазах инвазии, позволяет осуществлять контроль за качественными и количественными показателями инвазии в динамике у каждого зараженного в норме и под влиянием антигельминтных препаратов. Его применение обеспечивает снижение затратности, повышение информативности и ускорение экспериментальных исследований.

Экспериментально установленный феномен успешной искусственной трансплантации кишечных трихинелл обосновывает оригинальную концепцию передачи возбудителя трихинеллеза в природных очагах как на личиночной, так и на половозрелой фазах развития паразита.

Высокая противотрихинеллезная активность оригинальных экспериментальных лекарственных форм альбендазола и медамина открывает перспективу широкого применения этих средств в ветеринарии и медицине.

Высокая протективная активность оригинального препарата на основе НПА при экспериментальном трихинеллезе расширяет возможности разработки новых высокоэффективных противотрихинеллезных профилактических средств.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

1. Конференции «Теоретические и практические вопросы ветеринарной медицины», Киров 16 апреля 2007 г.;

2. Секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 1 марта 2007 г., протокол №1;

3. На заседаниях Ученых советов ВИГИС, 2003 — 2006 гг.;

4. На заседании Ученого совета ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова, 20 июня 2007 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Кишечные трихинеллы, в возрасте 4-8 дней, выделенные от экспериментально зараженных лабораторных животных-доноров высокоинвазивны для интактных лабораторных грызунов-реципиентов при оральном заражении.

3. Эффективность оригинальных экспериментальных лекарственных форм альбендазола и медамина (масляные суспензии, водорастворимые продукты) при экспериментальном трихинеллёзе белых мышей на мышечной фазе инвазии достигает 100%.

4. Оригинальный препарат на основе новых паразитарных антигенов обладает высокой протективной активностью при экспериментальном трихинеллёзе белых крыс. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК; подана патентная заявка на изобретение № 057599 / 2008144172. Приоритет - 10.11. 2008 г. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах основного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, включающих в себя материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, практические рекомендации, выводы. Список использованной литературы включает 223 источника, в том числе 53 отечественных и 170 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 30 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Репина, Елена Александровна

4 ВЫВОДЫ

2. На основе впервые выявленного феномена успешной искусственной трансплантации (пассивного «переселения») кишечных трихинелл из кишечника зараженных трихинеллезом лабораторных грызунов-доноров в кишечник интактных животных-реципиентов через желудок последних доказана высокая патогенность кишечных трихинелл при их использовании в качестве альтернативного инвазионного материала для поддержания возбудителя инвазии в лабораторных условиях.

4. Установлен процесс резорбции инкапсулированных личинок трихинелл и их капсул в скелетных мышцах и диафрагме у зараженных трихинеллёзом белых мышей в отдаленные сроки (через 6 мес) после экспериментальной химиотерапии оригинальными лекарственными формами медамина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Материалы диссертационной работы вошли в методические рекомендации «Метод прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных», одобренные секцией «Инвазиионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 1 марта 2007 г и опубликованные в Российском паразитологическом журнале за 2007., №2, с. 125-126. подробно методика изложена в разделе «Материалы и методы».

По результатам исследований новых лекарственных противотрихинел-лёзных препаратов подготовлены «Методические рекомендации по применению метода прижизненной диагностики трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных при скрининге противотрихинеллёзных препаратов», одобренные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 1 марта 2007 г.

Скрининг и доклиническое изучение специфических препаратов профилактического и лечебного действия проводят на экспериментальной модели трихинеллеза на разной стадиях инвазии.

Предлагаемый новый метод прижизненной диагностики (МПД) трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных обеспечивает контроль в динамике как за качественными и количественными параметрами инвазии, так и за эффективностью новых противотрихинеллезных препаратов на всех стадиях инвазии.

Действие препаратов на кишечную половозрелую стадию:

1. Животных опытной и контрольной групп исследуют на наличие личинок трихинелл в мышцах, (для исключения спонтанной инвазии, если животные содержались в виварии с зараженными трихинеллезом животными).

2. Животные обеих групп заражают в желудок (через пищеводный зонд) личинками Т. spiralis, выделенными с помощью пептического переваривания мышц инвазированных животных-доноров, минимальная доза заражения 10 личинок на грамм массы тела животного;

3. Сроки дачи препарата: с 3-4-го дня по 10-14-й день с момента заражения;

4. Исследуют на наличие мигрирующих личинок начиная с 6-го дня после заражения.

5. На протяжении всего опыта животные исследуются с помощью МПД;

6. Через 30-40 дней после заражения проводится контрольный убой леченых и контрольных групп животных, скелетные мышцы и диафрагма исследуются методом компрессорной трихинеллоскопии на наличие и количество инкапсулированных личинок или проводиться подсчет количества личинок после пептического переваривания определенных навесок мышечной ткани.

Отсутствие мигрирующих, неинкапсулированных и инкапсулированных личинок в пробах у животных опытной группы при наличии их у контрольных животных свидетельствует об эффективности препарата. Действие препаратов на кишечную и мигрирующую стадии:

1. Животных опытной и контрольной групп исследуют на наличие личинок трихинелл в мышцах (для исключения исходной спонтанной инвазии).

2. Животные опытной и контрольной групп заражают в желудок (через пищеводный зонд) личинками Т. spiralis, выделенными в ходе пептического переваривания зараженного мяса, минимальная доза 10 личинок на грамм массы тела животного

3. Животных исследуют на наличие мигрирующих личинок, начиная с 6-го дня после заражения;

4. Сроки дачи препарата: с 8-9-го по 15-16-й день с момента заражения;

5. На протяжении всего опыта животные исследуются с помощью МПД;

6. Через 30-40 дней после заражения проводится контрольный убой леченных и контрольных групп животных, скелетные мышцы и диафрагма исследуются компрессорным методом на наличие и количество инкапсулированных личинок или проводится подсчет количества личинок после пептического переваривания всех тушек животных.

Наличие мигрирующих личинок в пробах опытной и контрольной групп характеризует протекание кишечной и мигрирующей стадии развития паразита к моменту начала лечения. Отсутствие мигрирующих личинок у животных леченой группы и обнаружение их в контроле характеризует эффективность препарата.

Посмертные исследования проводят по следующим направлениям: каждое павшее животное исследуют на наличие и количество кишечных трихинелл в тонком отделе кишечника, скелетные мышцы и диафрагму на наличие и количество мышечных личинок трихинелл в навеске мышечной ткани - полученные данные обрабатывают статистически, определяя интенсэффектив-ность.

Действие препаратов на мышечную стадию.

1. Животных опытной и контрольной групп подвергают биопсии и путем подсчета личинок в каждой пробе определяют наличие и интенсивность инвазии, полученные исходные показатели являются ориентировочными;

2. Лечение инвазии на мышечной стадии начинают с 30-45-го дня после заражения;

3. Продолжительность дачи препарата могут варьировать в зависимости от скорости и эффективности препарата, контролируемого с помощью МПД;

4. На протяжении всего опыта животные исследуются с помощью МПД для выявления деструктивных изменений у личинок под влиянием препарата.

Жизнеспособность личинки характеризуется двигательной активностью внутри капсулы в течение 10-15 минут, сворачивание тела личинки в характерную тугую спираль происходит через 52-60 минут после взятия боипро-бы,четкой очерченностью капсулы и прозрачностью полости капсулы, визуализацией морфологической структуры кутикулы и стихосомных клеток. Де-капсулированные личинки проявляют повышенную двигательную активность по сравнению с инкапсулированными и имеют четко визуализирующуюся морфологическую структуру.

У нежизнеспособные личинок (погибающих или погибших) двигательная активность снижена или отсутствует, очертания капсулы размыты, полость мутная или потемневшая, приобретает зернистую структуру, личинка внутри капсулы плохо визуализируется, тело личинки набухшее, при декапсулиро-вании не вытесняется из капсулы, либо фрагментируется, декапсулированная личинка неподвижна, деструктивные изменения ярко выражены.

Отсутствие живых личинок в пробах у леченных животных свидетельствует о радикальном терапевтическом эффекте. Для подтверждения которого проводиться контрольный убой леченных и контрольных животных и исследуют методом компрессорной трихинеллоскопии диафрагму, икроножную группу мышц, массетер, или перевариванием в искусственном желудочном соке навесок мышечной ткани, для обнаружения мышечных личинок трихинелл.

При наличии живых и погибших личинок у леченных животных определяют интенсэффективность.

ИЭ = (кол-во личинок на грамм в опыте / кол-во личинок на грамм в контр.гр.)*100%

В отдельных случаях у излеченных животных продолжают взятие проб для определения наличия и выраженности резорбции и петрификации погибших личинок в течение 3-5 месяцев после окончания лечения.

Алгоритм скрининга противотрихинеллезных препаратов на половозрелой кишечной стадии экспериментального трихинеллеза у лаборатоных животных. п/п Манипуляция Сроки исследования с момента исследования, сут Комментарии

1 животных опытной и контрольной групп исследуют на наличие личинок трихинелл в мышцах -1 для исключения исходной инвазии, при содержании животных в одном виварии

2 животные обеих групп заражают в желудок (через пищеводный зонд) личинками Т. spiralis, минимальная доза заражения 10 личинок на грамм массы тела животного 0 данная доза заражения является оптимальной при моделировании трихинел-лезной инвазии, меньшие дозы инвазионного материала дают слабую инвазию, что затруднит диагностику с помощью МПД

3 сроки дачи препарата: 3,4-10,14 на 3-4-й день от момента заражения трихинеллы достигают половой зрелости, но отрождения личинок еще не происходит

4 исследуют на наличие мигрирующих личинок 6-9 на 6-е сутки после заражения в пробах мышц обнаруживаются мигрирующие личинки

5 на протяжении всего опыта животные исследуются с помощью МПД 10-40 что позволяет судить о стадии протекания и интенсивности инвазии

6 через 30-40 дней после заражения проводиться контрольный убой леченных и контрольных групп животных 30-40 тушки исследуют компрес-сорно и методом пептиче-ского переваривания, вычисляют интенсэффектив-ность

Алгоритм скрининга противотрихинеллезных препаратов на мышечной стадии экспериментального трихинеллеза у лабораторных животных. п/п манипуляция Сроки исследования с момента исследования, сут комментарии

1 животных опытной и контрольной групп исследуют на наличие личинок трихинелл в мышцах -1 животных опытной и контрольной групп исследуют на наличие личинок трихинелл в мышцах

2 животные обеих групп заражают в желудок (через пищеводный зонд) личинками Т. spiralis, минимальная доза заражения 10 личинок на грамм массы тела животного 0 данная доза заражения является оптимальной при моделировании трихинеллез-ной инвазии, меньшие дозы инвазионного материала дадут слабую инвазию, что затруднит диагностику с помощью МПД

3 лечение инвазии на мышечной стадии начинают с 30-45-го дня после заражения; 30-45 Большая часть личинок будет инкаспсулированна,

4 на протяжении всего опыта животные исследуются с помощью МПД 30-го дня и до окончания эксперимента Это позволит зафиксировать происходящие изменения и зафиксировать начало гибели личинок под действием препарата

5 продолжительность дачи препарата могут варьировать Длительность курса лечения будет зависеть от терапевтической эффективности препарата

6 Контрольный убой животных леченной и контрольной групп Сроки убоя зависят от данных МПД, отсутствие живых личинок в опыте и наличие их в контроле

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Репина, Елена Александровна, Москва

1. Бекеш О.-Я.Л., Рачковская И.В. Аллергическая реакция при экспериментальном трихинеллезе тучных клеток брызжеки крыс //Матер, науч. ис-след. членов Всес. об-ва гельминтол.- М.- 1972,- Вып.24.- С. 15-18.

2. Белозеров С.Н. Эффективность реакции непрямой иммунофлуорес-ценции при экспериментальном трихинеллезе свиней //Бюл. ВИГИС.- М.-1973.- Вып. 10.- С.11-15.

3. Белозеров С.Н. Применение непрямой реакции иммунофлуоресценции для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней //Матер, докл. 2-й Всес. конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных.- Вильнюс.-1976.- С.175-178.

4. Белозеров С.Н. Иммунологическая диагностика гельминтозов //Автореф. дис. док. вет. наук.- М.- 1990.- 44с.

5. Белозеров С.Н., Бессонов А.С. Применение реакции иммунофлуоресценции для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней в производственных условиях //Бюл. ВИГИС.- М.- 1974,- Вып.12.- С. 175-179.

6. Белозеров С.Н., Гуданавичус Т.И. Реакция энзимом меченных антител для диагностики трихинеллеза //Ветеринария.- 1982.- №11.- С.41-44.

7. Белозеров С.Н., Жданова О.Б. Прижизненная диагностика трихинеллеза песцов с помощью иммуноферментной реакции //Ветеринария.- 2000.-№2.- С.34-36.

8. Белозеров С.Н., Шеховцов Н.В. Реакция иммунофлуоресценции для диагностики трихинеллеза //Ветеринария.- 1978.- №2.- С.61-64.

9. Бережко В.К. Видоспецифические антигены гельминтов и иммуно-ферментная реакция в диагностике гельминтозов //Тр. ВИГИС.- 1988.-Т.29.- С.8-22.

10. Бережко В.К., Белозеров С.Н., Шеховцов Н.В., НаписановаЛ.А., Успенский А.В. Диагностическая эффективность имму но ферментной реакции при трихинеллезе свиней //Матер. 5-й Всес. конф. по пробл. человека и животных, Новочеркасск.- 1988.- С.21-22.

11. Бессонов А.С. К вопросу об аллергической диагностике трихинеллеза свиней //Тр. ВИГИС.- 1962.- Т.9.- С. 196-209.

12. Бессонов А.С. Изучение реакции латекс-агглютинации для диагностики трихинеллеза свиней //Вопросы очаговости болезни.- Алма-Ата.-1966,- С.23-25.

13. Бессонов А.С. Сравнительная диагностическая эффективность внут-рикожной аллергической реакции, биопсии, трихинеллоскопии ножек диафрагмы при трихинеллезе свиней //Тематический сборник работ по гель-минтол. с/х животных.- М.- 1967.- №13.- С.165-174.

14. Бессонов А.С. Эпизоотология и диагностика трихинеллеза свиней //Животноводство и ветеринария.- М:Колос.- 1968.- С.325-337.

15. Бессонов А.С. Эпизоотология (эпидемиология), диагностика и профилактика трихинеллеза (монографический анализ и собственные исследования) //Автореф. дис. док. вет. наук.- М.- 1970.

16. Бессонов А.С. Диагностика трихинеллеза//Вильнюс:Минтис.- 1975.-380с.

17. Бессонов А.С. Иммунитет и иммунодиагностика трихинеллеза //Трихинеллез,-М.:Колос.- 1976.- С.162-237.

18. Бессонов А.С., Успенский А.В. Прижизненная диагностика трихинеллеза песцов в звероводческом хозяйстве //Бюл. ВИГИС.- 1971.- Вып.75.-С.5-9.

19. Бессонов А.С., Успенский А.В. Методика постановки и учета реакции кольцепреципитации в капилляре для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов //Бюл. ВИГИС.- 1977.- Вып. 19.- С.9.

20. Бессонов А.С. Трихинеллез. Итоги науки и техники. — Зоопаразито-логия. - 1979.-Т.6.-С. 130-207.

21. Гаркави Б.Л. Реакция кольцепреципитации при трихинеллезе свиней (РКП) //Ветеринария.- 1971.- №7.- С.69-70.

22. Ефремов Е.Е., Ермолин Г.А. Иммуноферментный метод обнаружения антител кантигенам декапсулированных личинок трихинелл //В кн.:Морфофункциональные закономерности неспецифических защитных реакций организма.- М.- 1980.- С. 112-116.

23. Жданова О.Б. Диагностическая эффективность ИФА при трихинеллезе песцов //Матер, докл. 7-й Науч. конф. по трихинеллезу человека и жмвотных.- М.- 1996.- С.27-28.

24. Жданова О.Б. Иммунологическая диагностика трихинеллеза песцов //Дис. канд. вет. наук.- Киров.- 1997.- 154с.

25. Калюс В.А. Трихинеллез (трихиноз) человека //Автореф. дис. док. мед. наук.- М.- 1947.- 41с.

26. Костецкий А.Ф., Васерин Ю.И. Сравнительная характеристика чувствительности и специфичности РНГА с культуральным и коммерческим трихинеллезными антигенами //Матер. 5-й Всес. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных,- М.- 1988.- С.90-91

27. Лейкина Е.С. Сероэпидемиологические исследования пригельминто-зах//Мед. паразитол. и паразитар. болезни,- 1989.- №2.- С.3-8.

28. Лейкина Е.С., Мартыненко В.Б., Зорихина В.И. и др. Формула коррекции показателей сероэпидемиологического обследования населения наэхинококкозы//Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1984.- №1.- С. 17-19.96

29. Лейкина Е.С., Полякова О.И. Упрощенный метод иммунодиагностики гельминтов. I Реакция агглютинации при диагностике экспериментального аскаридоза и трихинеллеза животных //Мед. паразитол и паразитар. болезни.- 1956.- Вып.25(2).- С. 131-136.

30. Лукашенко Н.П. Прижизненная диагностика трихинеллеза свиней методами аллергической (внутрикожной) и серологических реакций //Дисс. на соиск. уч. ст. канд. вет. наук М.- 1956,- 21с.

31. Лукашенко Н.П. Изучение прижизненной диагностики трихинеллеза свиней методами аллергических и серологических реакций //Ветеринария.-1957.-№2.- С.31-32.

32. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития //М.:Наука.- 1991.- 288С.

33. Озерецковская Н.Н. Иммунологические и иммунопатологические реакции в клинике и патогенезе трихинеллеза //Тр. 1 Моск. мед. ин-та.- 1967.-Т.48.- С.179-194.

34. Пашук В.П. Экспериментальные данные к применению иммунологических реакций в диагностике трихинеллеза //Здравоохранение Белоруссии,- 1956.- Вып.З.- С.42-45.

35. Пашук В.П. Опыт серологической дтагностики трихинеллеза у свиней/Матер. ВОГ.- 1965.- 4.4.- С. 191-195.

36. Пашук В.П. Трихинелльные антигены и серодиагностика трихинеллеза //Вет. наука пр-ву.- 1984.- Вып.22,- С. 199-206.

37. Пашук В.П. Реакция непрямой иммунофлуоресценции и непрямой гемагглютинации в диагностике трихинеллеза человека и вопросы перси-стенции трихинелл //Матер. 4-й Всес. конф. по пробл. человека и животных.- Ереван.- 1985.- С.107-110.

38. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигенами трихинелл //Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1986.- №3.- С.51-56.

39. Полетаева О.Г., Нгуен Суан Тхао, Красовская Н.Н. Оценка эффективности серологических реакций при трихинеллезе //Матер, докл. науч. конф. Гельминтозы меры борьбы и профилактика.- М.- 1994.- С.121-123.

40. Полетаева О.Г., Угликова М., Хюбнер И., Красовская Н.Н. Эффективность двух тест-систем иммуноферментного анализа в диагностике трихинеллеза человека //Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1990.- №4.-С.43-45.

41. Сакалаускайте Ю.А. Иммунный ответ хозяина на паразитирование трихинелл и его изменение под воздействием мебендазола. Сообщение 1//Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1978.- №5.- С.24-29.

42. Сапунов О.Я. Эффективность реакции кольцепреципитации (РКП) при диагностике трихинеллеза свиней //Бюл. ВИГИС.- 1986.- Вып.43.- С.83.

43. Степанов А.В. Динамика преципитинов в сыворотке крови и лейкоцитарная формула у лабораторных животных при экспериментальном трихинеллезе //Сб науч. тр. Моск. вет. акад.- 1975.- Т.79(2).- С.13-14.

44. Субботин Н.Ф. Эффективность иммунологических реакций в диагностике трихинеллеза //Ветеринирия,- №2.- С.66-68.

45. Тараканов В.И. Методика приготовления искусственной питательной среды для культивирования трихинелл //Матер. 2-й Всес. конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных, Вильнюс.- 1976.- С.209.

46. Тараканов В.И. Методические приемы и принципы культивирования гельминтов в искусственных питательных средах //Тр. ВИГИС.- 1985.-№28.- С. 109-116.

47. Твердохлебова Т.И., Васерин Ю.И., Нагорный С.А., Попов М.А. Разработка технологии получения диагностикума трихинеллезного антигенного эритроцитарного сухого для РНГА //Метер. докл. науч. конф.- М.- 2001.-С.268-270.

48. Успенский А.В. Изучение реакции латексагглютинации для прижизненной диагностики трихинеллеза животных //Бюл. ВИГИС.- М.- 1971.-Вып.5.- С.127-130.

49. Успенский А.В. Сравнительная диагностическая эффективность агг-лютинационных реакций при трихинеллезе //Автореф. дис. канд. вет. наук.-М.- 1972.- 27с.

50. Успенский А.В., Назарова Н.С., Нечиненный А.Д., Певнева В.Д. Реакция кольцепреципитации в капилляре (РКПК) для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов //Бюл. ВИГИС.- М.- 1975.- Вып. 16,- С.80-81.

51. Шеховцов Н.В., Бережко В,К., Написанова JI.A. Сравнительная эффективность РНИФ и ИФР в диагностике трихинеллеза свиней //Ветеринария.- 1989.- №12.- С.39-41.

52. Arriaga C., Yepez-Mulia L., Morilla A., Ortega-Pierres G. Detection of circulating Trichinella spiralis muscle larva antigens in serum samples of experimentally and naturally infected swine //Vet. Parasitol.- 1995.- V.58(4).- P.319-326.

53. Armas-Serra C., Gimenez-Pardo C., Bernadina W.E., Rodriguez-Caabeiro F. Antibody response to a protease secreted by Trichinella spiralis muscle larvae //Parasitol. Res.- 1995.- V.81(6).- P.540-542.

54. Avrameas S., Guilbert B. Dosade enzymo-immunoglogique de proteines a l'aide d'immunosorbants d'antigenes marques aux enzymes //S.R. Acad, Sci., Ser.D.- 1971,- V.273.- P.2705-2715.

55. Berntzen A.K. Efects of environment on the growth and development of Trichinella spiralis in vitro //Proceedings of the 3-d Inter. Conf. on Trichinellosis. New York.- 1974.- P.25-30.

56. Bloomfield N., Snook G.W. Use of slide-latex test for detecting trichinosis in hogs //Cornell Veterinarian.- 1962.- V.52(4).- P.569-581.

57. Boctor F.N., Farid Z. El-Scherif N. Using whole bacteria, LPS, and soluble antigens to detect IgG, IgM, IgA in human brucellosis by dot-ELISA with nitrocellulose as a solid phase //Clin. Chemistry.- 1987.- V.33.- P. 1570-1571.

58. Bozicevich J. The bentonite flocculation test for trichinosis and its evaluation with the compliment fixation test on sera obtained from infected animals //Wiad. Parasitol.- I960.- V6(4).- P.345.

59. Catherine S. McVay, Peter Bracken, Lucille F. Gagliardo, Judith Apple-ton. Antibodies to tyvelose exhibit multiple modes of interference with the epithelial niche of Trichinella spiralis //Infection and immunity, Apr.200, P1912-1918.

60. Choy W.E., Lin P.L., Ng M.H. A comparison of immunological methods for the detection of Trichinella spiralis antigen //J. Immunol. Meth.- 1988.-V.113(1).- P.17-24.

61. Choy W.E., Lin P.L. A rapid method for detecting Trichinella spiralis larvae in pork using a monoclonal AT-latex conjugate //Vet. Parasitol.- 1989.-V.32(4).- P.301-310.

62. Chroust К. Sensibility of indirect fluorescent method with living Trichi-nella spiralis larvae //Wiad. Parasitol.- 1970.- V.16(l).- P.12-15.

63. Chroust K., Dubansky V. Fluorescent-antibody studies on muscle larvae Trichinella spiralis (Owen, 183 5), II the indirect fluorescent-antibody method //Acta Univ. Agric. Fac. Vet.- 1967.- V.36(2).- P.299-306.

64. Chroust K., Mittermayer T. Indirect fluorescent antibody test in diagnosis of trichinellosis in man //Acta Vet. Brno.- 1983.- V.52(3-4).- P.l77-181.

65. Chung MS, Joo KH, Quan FS, Kwon HS, Cho SW/ Efficacy of flubenda-zol and albendozole against Trichinella spiralis in mice. Parasite, 2001 Jun, 8 (2 Suppl) S 195-8.

66. Daryl O.M., Benjamin L. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of platelet antibodies using detergent-solubilized platelets immobilized on nitrocellulose discs //J. Immunol. Meth.- 1987,- V.I05.- P.63-70.

67. Derer M.M., Miescher S., Johansson H. Application of the dot immuno-binding assay to allergy diagnosis //J. Allergy Clin. Immunol.- 1984.- V.74.-P.85-92.

68. Diaconu S., Militaru D., Vior E., Sarca M. Kinetics Trichinella antibodies defected by ELISA, the ELITRICH kit, in experimentally infected pigs //Studies and Researches in Vet.Ved.- 1995.- V.3.- P.77-79.

69. Draelants E., Hofkens E., Harding E., Brandt J., Geerts S. Development of a dot-enzyme immunoassay for the detection of circulating antigen in cattle infected with Taenia saginata cysticerci //Res. Vet. Sci.- 1995.- V. 58(1).- P.99-100.

70. Durham R.J., Isenstein R.S., Despommier D.D., Robinson B.J., Mattingly J.A. The use of an ELISA for detection of antibody to Trichinella spiralis in porcine serum of blood //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol.- 1987.- P276.

71. Durham R.J., Isenstein R.S., Despommier D.D., Mattingly J.A. Development of an ELISA for detection of antibody to Trichinella spiralis in porcine serum //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol.- 1986.- P.277.

72. Dzebenski Т.Н., Bitkowska E., Plonlca W. Detection of a circulating parasitic antigen in acute infections with Trichinella spiralis: diagnostic significance of finding //Zentralblatt for Bakteriologie.- 1994.- V.281(4).- P.519-525.

73. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quatitative assay of immunoglobulin G by means of enzymelabelled antigen and antibody-coated tubes //Biochim., Biophys. Acta.- 1971.- V.271.- P.427-435.

74. Faubert O.M., Viens P., Magluilo P. Superiority of the ELISA technique over parasitological methods for detection of trichinellosis in slaughtered pigs in Canada//Can. I. Cong. Med.- 1985.- V.49(l).- P.75-78.

75. Franci C., Ingles J. et al. Further studies on the ELISA-spot technique. Its applications to particulate antigens and potential improvement in sensitivity //J. Immunol. Meth.- 1986.- V.88.- P.225-232.

76. Fiydas S.I., Alexakis A.E., van Knapen F. Prevalence of IgG antibodies to Trichinella spiralis in dogs in Macedonia, northern Greece /Net. Parasitol.-1995.-V.59(l).-P.81-85.

77. Furuya K., Nero S. et al. Adsorption of influenza viruses to nitrocellulose membrane filters by filtration and their quantitative densitomatric determination //J. Virol. Meth.- 1984.- V.- P.191-199.

78. Gamble H.R., Anderson W.R., Graham C.E., Murrell K.D. Diagnosis of swine trichinosis by enzyme-linked immunosorbent (ELISA) using an excretory-secretory antigen //Vet. Parasitol.- 1983.- V.13(4).- P.349-361.

79. Gamble H.R., Graham C.E. Comparison of monoclonal antibody-based competetiv and indirect enzyme-linked immunosorbent assays for the diagnosis of swine trichinosis //Vet. Immunol. Immunopathol.- 1984.- V.6(3-4).- P.379-389.

80. Gamble H.R., Murrell K.D. Conservatin of diagnostic antigen epitopes among biologically diverse isolates of Trichinella spiralis //J. Parasitol.- 1986.1. V.72(6).- P.921-925.

81. Gamble H.R., Rapic. D., Marinculic. A., Murrell K.D. Evaluation on excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis //Vet. Pa-rasitol.- 1988.- V.30(2).- P.131-137.

82. Gancarz Z. Metody immunologiczne w diagnostyce wlosnicy u ludzi i zvierzat //Med. dosw. i microbiol.- 1968.- V.20(2).- P.213-218.

83. Giannini S.H. Induction and detection of leishmanial infections in Rattus norvegicus //Trans. Roy. Trop. Med. Hyg.- 1985.- V.79.- P.458-461.

84. Gore R.W., Sadun E.H. A soluble antigen fluorescent antibody (SAFA) test for the immunodiagnosis of trichinellosis in man and experimental animals //II Int. Conf. of Trichinellosis. Wroclaw.- 1969.-P.153-154.

85. Haralambidis S.T., Fridas S.J., Himonas C.A. Latex agglutination test for detecting Trichinella spiralis infections in pigs using muscle extract //Vet. Parasi-tol.- 1989.- V.34(3).- P.191-201.

86. Hardman E., Jarvis H.M. Nitrocellulose-based assays for the detection of glucolipids and other antigens: mechanism of binding to nitrocellulose //J. Immunol. Meth.- 1985.- V.33.- P.l 13-123.

87. Hassan M.M., Seleem M.A., Eterwa S.E. Humoral and cellular immune responses in experimental trichinosis //J. Egypt. Soc. Parasitol.- 1994.- V.24(2).-P.363-370.

88. Hawkes R., Niday E., Gordan J.A. A dot immunobinding assay for monoclonal and other antibodies. //Analyt. Biochem.- 1982.- V.l 19.- P. 142-147.

89. Ibhu В., Lesia В., Sumana B. Detection of IgE binding to same airborne pollen and fungal allergens using dot immunoassay //J. E. Mitchell Sci. Soc.-1988.- V.103.- P.77-79.

90. Isenstein R.S. Testing of swine for trichinellosis in the US //4-th Int. Conf. on Trichinellosis Abstr. of Papers.- 1976.- V.82

91. Isenstein R.S., Marks H.M., Webert D.W., Judkins J.C., Parker C.M., Despommier D.D. Development of an enzyme immunoassay for surveillance of trichinellosis in swine //6-th Int. Conf. on Trichinellosis. Trichinellosis Proceedings.- 1985.- P.240-245.

92. Isenstein R.S., Webert D.W., Leightg J.C., Zimmermann W.J., Singh P., Oliver D.G., Jang L. Development of an industrial immunoassay for trichinellosis //7-th Int. Conf. on Trichinellosis Prog, and Abstr.- 1988.- №.62.

93. Ivanoska D., Sofrinic L., Movsesijan M., Cuperlovic K., Murrell K.D., Gamble H.R. Detection of Trichinella spiralis antigens //Period. Biol.- 1986.-V.88(l).- P.243-245.

94. Ivo dos Santos J., Galvao-Castro B. et al. Dot enzyme immunoassay. A simple, cheap and stable test for antibody to human immunodeficiency virus (HIV) //J. Immunol. Meth.- 1987.- V.99.- P. 191-194.

95. Jacob H.P., Eckert J., Jemmi Т., Gottstein B. Trichinellosis in slaughtered and wild animals in Switzerland using a digestion method and a serologic method (ES-ELISA). //Schweiz Arch. Tierheilkd.- 1994.- V.136(9).- P.298-308.

96. Jiang H.J., Yang L.X., Pang S.H., Sun Т., Xie S.P., Meng J.M., Wen G.Z., Wang G.Z. Dot-ELISA in the diagnosis of neurocysticercosis // Chung Kuo Chi Sheng Chung Hsueh Yu Chi Sheng Chug Ping Tsa Chin.- 1990.- V.8(3).-P.207-209.

97. Jol-Van der Zijde C.M., Labadie J. et al. Dot immunobinding assay as an accurate and versatile technique for the quantification of human IgG subclasses //J. Immunol. Meth.- 1988.- V.108.- P. 195-203.

98. Kagan I.G. Standardization and quality control of immunodiagnostic methods //Behring Inst. Mitt.- 1982.- V.71.- P.10-22.

99. Kagan I.G. Serodiagnosis of trichinosis //Immunol. Parasit. Infect.-1976.- P.143-151.

100. Kampelmacher E.H., Streefkerk E.W. Experiments with a latex-slide test for the serodiagnosis of trichinosis //Wiad. Parazytol.- 1965.- V.ll(4).- P.317-326.

101. Kimball S.R., Rannels S.L. et al. Quantitation of proteins by dot immunobinding assay. A comparison of visualization methods using eukariotic initiation factor 2 and a monospecific antibody. //J. Immunol. Meth.- 1988.- V.106.-P.217-223.

102. Knapen van F., Franchimont J.H., Ruitenberg E.J., Andre P., Baldelli В., Gibson Т.Е., Henriksen S.A. et al. Comparison of three methods for detection of prolonged experimental Trichinellosis in pigs //Vet. Parasitol.- 1984a.- V.16(l-2).- P. 167-171.

103. Knapen F. Van., Ruitenberg E.J., Vermeulen C.J. Results obtaind with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in conventionally held experimentally and naturally Trichinella spiralis infected slaughter pigs //4-th Int. Conf. on

104. Trichinellosis. Abstr. of Papers.- 19766.- P.78.105

105. Korinkova К., Kovarcik H., Pavlicova Z., Koldela B. Detection of Trichinella infections in experimentally inoculated goat kids by ELISA //Helminthologia.- 2003.- V.40(3).- P. 179.

106. Kozar Z., Kozar M. Indirect fluorescent antibody test in diagnosis on tri-chinellosis //Wiad. Parazytol.- 1970.- V.16(l).- P.7-13.

107. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature.- 1970.- V.227.- P.680-685.

108. Layne E. Spectrophotometric and turbidometric methods for measuring proteins //Methods Enzymol.- 1957.- V.3.- P.447-454.

109. Lazarovits G., Zutra D., Bar-Joseph M. Enzyme-linked immunosorbent assay on nitrocellulose membranes (dot-ELISA) in the serodiagnosis of plant pathogenic bacteria//Canad. J. Microbiol.- 1987.- V.33.- P.98-103.

110. Leek M.L. van der, Dame J.B., Littel R.C. Minimizing ELISA background in the diagnosis of swine trichinellosis //J. Parasitol.- 1982.- V.78(5).-P.822-829.

111. Lefroit-Joliy M., Neven T. Description and comparison of three in vitro methods for the detection of guined pig MHC antigen. //J. Immunol. Meth.-1986.- V.89.- P.141-148.

112. Leighty F.C. Regulatory action to control Trichinella spiralis //Food. Tehnol.- 1983,- V.37(3).-P.95-97.

113. Lin T.M., Halbert S.P. Rapid dot enzyme immunoassay for the detection of antibodies to cytomegalovirus //J. Clin. Microbiol.- 1986.- V.24.- P.7-11.

114. Liu Y.S., Du W.P., Wu Z.X. Dot-immunogold-silver staining in the diagnosis of cysticercosis //Int. J. Parasitol.- 1996.- V.26(l).- P.127-129.

115. Londner M.V., Revel A. et al. Dot-ELISA a potential immunoassay of Plasmodium falciparum antibodies //Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.- 1988.-V.82.- P.686-688.

116. Lupasco G., Hacig A., Solomon P. at al. Etude sur la dynamique des an-ticorps dans la trichinellose experimentale pas methode de Г immunofluorescence

117. Arch. roum. pathol. exp. et microbiol.- 1968.- V.27(3).- P.611-618.106

118. Magat W.J., Jeska E.L. A serodiagnostic antigen for trichinellosis //Acta parasitol polon.- 1976.- V.24(l 1-19).- P. 191-198.

119. Mazzola V. New trichinosis test first step to fradication //Agricult. Res.- 1984.- V.32(10).-P.10.

120. McVie A., Ersfeld K., Rogan M.T, Craig P.S. Expression and immunological characterisation of Echinococcus granulosus recombinant antigen В for IgG4 subclass detection in human cystic echinococcosis //Acta Trop.- 1997-V.67(l-2).- P.19-35.

121. Mearus G., Richmond S.J., Storey C.C. Sensitive immune dot blot test for diagnosis of Chlamidia trachomatis infection //J. Clin. Microbiol.- 1988.-V.26.- P.1810-1813.

122. Melcher L.R. An antigenic analysis of Trichinella spiralis //J. Infect. Dis.- 1943.- V.73(l).- P.31-39.

123. Molinaro G.A., Eby W.C., Reimer C.A. A monoclonal antibody may show cross reactivities in Ouchterlony assay but not in other assays //J. Immunol. Meth.- 1987.- V.96.-P.219-222.

124. Morlow S.J., Handa A.K. Immuno spot-blot using a membrane which covalently binds protein //J. Immunol. Meth.- 1987.- V.101.- P.133-139.

125. Murrell K.D., Vannier W.E., Ahmed A. Antigenic heterogenity of excretions and secretions //Exp. Parasitol.- 1984.- V.36.- P.316-330.

126. Navarrete J., Reina D., Habela M., Serrano F. Standardization of the ELISA test for the serodiagnosis of Trichinella in pigs //Progr. and Abstr. of the 5-th Europ Multicolloq. of Parasitol.- 1988.- F. 10-13.

127. Navarrete J., Serrano F., Habela M., Reina D. Cross-reaction between Trichinella antigens and other parasites of pigs in endemic area of Trichinellosis //Progr. and Abstr. of the 5-th Europ Multicolloq. of Parasitol.- 1988.- F. 10-12.

128. Navarrete J., Serrano F., Reina D., Albarran-Gomez E., Habela M., Nieto C.G. Standardization of the enzyme-linked immunosorbent assay in the detection of swine trichinellosis //7-th Int. Conf. on Trichinellosis Progr. and Abstr.- 1988.-№68.

129. Nockler K., Voigt W.P., Protz D., Miko A., Ziedler K., Diagnosis of trichinellosis in living pigs using indirect ELISA. //Berl. Munch. Tierarztl Wo-chenschhr.- 1995.- V.108(5).- P.167-174.

130. Nodet P., Grange J., Fevre M. Dot-blot assays and their use as direct an-tigenbinding method to screen monoclonal antibodies to 1,4-B and 1,3-B glucan sunthases //Analyt. Biochem.- 1988.- V.174.- P.662-666.

131. Norman L., Sadun E.H., Redding R.W., Cooperider O.E. Flocculation test in sera from hogs experimentally and naturally infected with Trichinella spiralis //J. Parasitol.- 1955.- V.41(2).- P. 162-166.

132. Pappas M.G. Recent applications of dot-ELISA immunoparasitology //Vet. Parasitology.- 1988.- V.29.- P.105-129.

133. Pappas M.G., Ballou W.R., Gray M.R., Takafuji E.T, Miller R.N., Hockmeyer W.T. Rapid diagnosis of leptospirosis using the IgM specific dot-ELISA: comparison with the microscopic agglutination test //Am. J. Trop. Med. Hyg.- 1985.- V.34.- P.346-354.

134. Pappas M.G., Hajkowski R., Hockmeyer W.T. Dot enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA): a micro method for the rapid diagnosis of visceral leishmaniasis //J. Immunol. Meth.- 1983.- V.64.- P.205-214.

135. Parkhouse R.M.E., Ortega-Pierres G. Stage-specific antigens of Trichi-nella spiralis //Parasitology.- 1988.- V.88(4).- P.623-630.

136. Patel J.D., Joseph J.M., Falkler W.A. Direct detection of Chlamidia trachomatis in clinical speciamens by a dot immunobinding technique using monoclonal antibody //J. Immunol. Meth.- 1988,- V.108.- P.279-287.

137. Phillip M., Parkhouse R.M.E., Ogilvie B.M. Molecular basis for stage specificity of the primary antibody responses to the surface of T. spiralis //5-th Int. Conf. on Trichinellosis. Trichinellosis Proc. Readbooks.- 1980.- P.59-63.

138. Prichard D.I. Antigen production by encysted muscle larvae of Trichinel-la spiralis //J. Helminthol.- 1985.- V.59(l).- P.71-77.

139. Prosad S., Thraves P. et al. A dot-blot method for screening polyclonal and monoclonal antisera to poly (ADP-ribose). //J.Immunol. Meth.- 1989,-V.l 16.- P.79-85.

140. Rapic D. Immunoenzimski test (ELISA) u dijagnostici eksperimentalne i prirodne trichineloze svinja //Acta Parasitol. Jugosl.- 1980.- V.l 1(1-2).- P.49-57.

141. Rapic D., Dzakula N., Matic-Piantanida D. Evaluation of different antigens in seroepizootiological survey of trichinellosis by enzyme-linked immunosorbent assay //Vet. Parasitol.- 1986.- V.21(4).- P.285-289.

142. Rapic D., Dzakula N., Zukovic M. A study of the cross reaction between trichinellosis and metastrongylosis in pigs trichinellosis by enzyme-linked immo-nosorbent assay (ELISA) //Vet. arhiv.- 1981.- V.51(5).- P.223-227.

143. Rapic D., Stojilkovic D., Marinkulic A. Influence of cultivation time of Trichinella spiralis muscle larvae on antigenic properties of excretory/secretory products. //6-th Int. Congr. of Parasitol. Progr. and Abstr. Handbook.- 1986,-№536,1L.

144. Reina D., Munoz-Ojegda M.C., Serrano F., Molina J.M., Navarrete I. Experimental trichinellosis in goats //Vet.Parazitol.- 1996.- V.62(1-2).- P. 125132.

145. Reissmann E. Kann die Trichinenschau ohne sanitaren Nachteil be scharankt und verbilligt werden //Fleisch-u Milchhyg.- 1908.- V.19(l).- P. 1-9.

146. Richard O. McCracen. Efficacy of mebendazole and albendozole against Trichinella spiralis in mice. J. Parasitol., 64 (2), 1978, P 214-219

147. Rivera Marrero C.A., Santiago N., Hillyer G.V. Evaluation of immuno-diagnostic antigens in the excretory-secretory products of Fasciola hepatica //J.Parasitol.- 1998.- V.74(4).- P.646-652.

148. Rogan M.T., Craig P.S., Zeyhle E., Roming Т., Lubano G.M., Deshan L. Evaluation of rapid dot-ELISA us a field test for the diagnosis of cystic hydatid disease. //Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.- 1991,- V.85 (6).- P.773-777.

149. Romia S.A., Youssef M.E., Handoussa A.E., Rizk H.M., Sallam S.M. Dot-ELISA as a diagnostic test in hydatid disease. //J. Egypt. Soc. Parasitol.-1992.- V.22(3).- P.603-610.

150. Roop R.M., Preston-Moore D. et al. Rapid identification of smooth Brucella species with a monoclonal antibody. //J. Clin. Microbiol.- 1987.- V.25.-P.2090-2093.

151. Rozeik C., Schulz-Harder B. The competitive antigen spot test (CAST). A rapid and simple means of quantitatively screening antisera. //J. Immunol. Meth.- 1986.- V.91.- P.91-97.

152. Ruinterberg E.J., Buys J. Trichinella spiralis infections in pigs. Comparison of homologous passive cutaneous anaphylactic (PCA) reactions with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). //Vet.Parazitol.- 1979.- V.5(l).-P.73-78

153. Ruitenberg E.J., Kampelmacher E.H., Berkvens J. Recherche sur la tehni-que indirecte des anticorps fluorescents comme methode diagnostique pour la Trichinese //Office international des epizooties.- 1968.- V.70(l).- P.736-749.

154. Ruitenberg E.J., Van Knapen F. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as a diagnostic method for T.spiralis in pigs //Vet. Paraziol.- 1973.-V.3(4).-P.317-326.

155. Ruitenberg E.J., van Knapen F., Vermeulen C.J. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in Trichinella spiralis infections in pigs //Proc. of the 4th Int.Conf on Trichinellosis (1976).- Poznan.- 1978,- P.487-489.

156. Ruitenberg E.J., Streerenberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J. Serodiagnosis of Trichinella spiralis infections in pigs by enzyme-linked immunosorbent assay //Bull. WldHLTH.- 1974.- V.51(l).- P108-109.

157. Rutenberg E.J., Steerenberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J. Reliability of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis of Trichinella spiralis infections in conventionally raised pigs //J. Immunol Method.- 1976.-V.10(l).- P.67-83.

158. Sakamoto T. Development and behavior of adult and larval Trichinella spiralis cultured in vitro //Mem.Fac.Agr. Kagoshima Univ.- 1979.- V. 15(24).-P.107-114.

159. Scholtens R.G., Kagan I.G., Quist K.D., Norman L.G. An evaluation of test for the diagnosis of trichinosis in swine and associated quantitative epidemiologic observations //Amer. J. Epidemiol.- 1966.- V.83(3).- P.489-500.

160. Seawight G.L., Bartlett M.L, Sanders W.M. Automated enzyme immunoassay for detecting Trichinella spiralis antibody in swine //Abstr. 79-th Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol.- 1979.- P.314.

161. Smith H.J. Evalution of the ELISA for the serological diagnosis of trichinosis in Canadian swine //Can. J. Vet. Res.- 1987.- V.51(2).- P. 194-197.

162. Smith H.J. Comparison of pepsin-digestion and enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of trichinosis in swine //Can.J.Vet. Res.- 1988.-V.52(l).- P.63-66.

163. Smith H.J., Snowdon K.E. Detection of Trichinella spiralis nativa antibodies in porcine sera by ELISA using T.spiralis spiralis excretory-secretory antigen //Can. J. Vet. Res.- 1987,- V.51(3).- P.413-414.

164. Smith H.J., Snowdon K.E. Experimental Trichinella infections in ponies //Can. J. Vet. Res.- 1987.- V.51(3).- P.415-416.

165. Smith H.J., Snowdan K.E., Bishop L.J. Prevalence of trichinosis in Canadian swine determined serologically by enzyme-linked immunosorbent assay //Can. J. Vet. Res.-1988.- V.52(3).- P.392-393.

166. Stay M., Wahl R., Beierwaltes W.H. Dot-based ELISA and RIA: two rapid assay that screen hybridoma supernatants against whole live cells //J.Immunol. Meth.- 1984,- V.73.- P.75-81.

167. Steinmetz H.T., Pfreundschuh M.G. Production of monoclonal antibodies againts glucose oxidase, alcaline phosphatase and peroxidase. //J. Immunol. Meth.- 1987.-V.101.-P.251-259.

168. Strobel H. Die Serodiagnostik der Trichinosis //Munch, med. Wo-chennschr.- 1911.- V.58.-P.672.

169. Su X.Z., Prestwood A.K. A dot-ELISA mimicry western blot test for the detection of swine trichinellosis //J. Parasitol.- 1991.- V.77 (1).- P.76-82.

170. Sulzer A.J., Chisholm E.S. Comparison of the IFAA and other test for Trichinella spiralis antibodies //Publ. Health. Rep.- 1966.- V.81(8).- P.729-734.

171. Taylor S.M., Kilpatrick D., Kenny J. The influense of age and husbandry of pigs on evaluatin of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Trichinella spiralis infection//Zbe. Veterinarmed.- 1978.- V.25(4).- P.482-489.

172. Tellez-Giron E., Ramas M.C., Alvarez P., Dufour L.,Montante M. Detection and characterization of antigens from Taenia solium cysticercus in cerebrospinal fluid//Acta Leiden.-1989.- V.57(2).- P.101-105.

173. Thomas E.H., Bozicevich J., Hoy em H.M. Flocculation reactions in rabbits experimentally infected with Trihinella spiralis //J. Infect. Diseuses.- 1953.-V.92(l).- P.89-96.

174. Tondon A., Murthy P.K. et al. Dot-ELISA for diagnosis of limphatic fila-riasis //Indian J. Med.- 1988,- V.87.- P.429-433.

175. Tong W.D., Guo S.J., Sun L.G. Studies on the rapid diagnosis of the cys-ticercosis, trichinosis and toxoplasmosis using trace blod dot-ELISA //Int. Conf. On Parasitic Zoonoses, Sept. 20-24.- 1994.- P. 138.

176. Towbin H., Gordon L. Immunoblotting and dot immunobinding-current status and outlook//J. Immunol. Meth.- 984.- V.72.- P.313-340.

177. Uhlikova M., Hubner J. Comparison of the ELISA reaction with four other methods for the detection of Trichinella spiralis infection //6-ht Int. Helm. Symp.- High Tatras.- Prog. And Abstr.- 1991.- P. 133.

178. Vertosich F.T., Kelly R.H. Antibodies to native and denatured DNA. Quantitation using on immuno slot-blot technique // J.Immunol. Meth.- 1987.-V.102.- P.15-21.

179. Vior E., Popesku., Vior C., Fromunda V., Oproiu V., Tetu M. Aplicarea testilui imunoenzimatic (ELISA) in trichineloza experimentala //Rev. crest, anim.- 1980.- V.30(10).-P18-22.

180. Vishawapoka U., Hemachudha T. et al. Detection of rabies antigen in canine parotid glands by dot-blot technique //Lancet.- 1988.- V.I.- P.881.

181. Vullo V., Contini C. et al. Evalyation of dot immunobinding assay (DIB) for the detection of antibodies against Brucella melitensis //J. Immunol. Immuno-pharmacol.- 1987.- V.7.- P. 147-150.

182. Whelen A.C., George J.E, Osburn R.L., Wikel S.K. Dot-ELISA for examine serologic responses of Bos taurus and Bos indicus to ixodid tick infestation //Fed. Proc.- 1984,- V.43.- P. 1628.

183. Wilozynski M., MikulskiZ., Gancarz Z. Immunobiologic methods in the diagnosis of trichinellosis in pigs and laboratory animals //2-d Int. Conf. on Trichinellosis. Abstr of Papers.- 1969.- P. 169-170.115

184. Yan X.X., Xu X.F., Ma Y.X. Changes in T lymphocytes and their subpo-pulations and IgG in peripheral blood from mice infected with Trichinella spiralis //Chung Kuo Chi Sheng Chung Hsueh Yu Chi Sheng Chug Ping Tsa Chin.1992.-V.10(l).-P.62-65.

185. Yang S.M. A preliminary study on the use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Trichinella spiralis infections in dogs //Vet. Parasitol.- 1989.- V.31(2).- P. 165-171.

186. Yao C., Prestwood A.K., McGraw R.A. Trichinella spiralis (Tl) and Trichinella (T5): a comparison using animal infectivity and molecular biology techniques //J. Parasitol.- 1997.- V.83(l).- P.88-95.

187. Yepez-Muila L., Ortega-Pierres M.G. Current aspects of trichinosis diagnosis. //Rev. Latinoam. Microbiol.- 1994.- V.36(2).- P.127-138.

188. Zalis M., Jaffe C.L. Routine dot-blot assay of multiple serum samples using a simple apparatus //J. Immunol. Meth.- 1987.- V.101.- P.261-264.

189. Zapart W., Slusarski W. Attempts to employ hom-made latex particles in the serodiagnosis of trichinellosis in experimental animals //Acta parazitol po-lon.- 1972,-V.10.-P.29.

190. Zhang Y.W., Lee D.L., Smith J.E. Biochemical haracterisation of Trichi-nellaspiralis and Trichinella pseudospiralis stihocyti antigens //Appl. Parasitol.1993.- V.34(4).- P.291-294.

191. Zhu X.Q., Dou L.Q., Shi X.H., Shi L., Niu B.H. Analisis of excretory-secretory and soluble antigens of Trichinella spiralis muscle larvae by electrophoresis //Acta Vet. at Zootech. Sin.- 1995.- V.26(2).- P. 168-173.

192. Zimmerman G.L., Nelson M.J., Clark C.R.B. Diagnosis of ovine fasci-oliasis by a dot enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid microdiagnostic technique//Am. J. Vet.Res.- 1985.- V.46.- P.1513-1515.

Информация о работе

Репина, Елена Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.19

Диссертация

Экспериментальный трихинеллез: разработка новых методов моделирования, диагностики, профилактики и лечения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы