Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биологическая оценка штаммов Lactobacillus acidophilus, используемых в производстве пробиотических продуктов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биологическая оценка штаммов Lactobacillus acidophilus, используемых в производстве пробиотических продуктов"

На правах рукописи

ИРКИТОВА АЛЕНА НИКОЛАЕВНА

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискаиие ученой степени кандидата биологических наук

Пермь-2012

005047131

005047131

Работа выполнена на кафедре экологии, биохимии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения ВПО «Алтайский государственный университет» и в лаборатории микробиологии ГНУ СО РАСХН Сибирского НИИ сыроделия, Барнаул.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Соколова Галина Геннадьевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

кафедры микробиологии и вирусологаи ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера Минздравсоцразвития» Кузяев Рафаэль Зиафутдинович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории водной микробиологии ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Соломенный Александр Петрович

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет»

. 00

Защита диссертации состоится «25» мая 2012 г. в /У часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (342) 280 92 11

Автореферат диссертации размещен на официальном сайге Министерства образования и науки РФ (Ьйр://\у\улу.vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и

генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук /^-¿Г? Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность работы. Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе и являются представителями микрофлоры человека и теплокровных животных. Они обладают высокой биологической и функциональной активностью, что определяет их практическое использование в качестве пробиотиков и в производстве пищевых продуктов. Среди бактерий, применяемых как пробиотики, наиболее широко известна своим полезным действием Lactobacillus acidophilus, которая заселяет кишечник новорожденного ребенка и, вступив с ним в устойчивый симбиоз, сопровождает человека на протяжении всей его жизни, оказывая благотворное влияние на его здоровье [Королева, 1975; Каган, 2008]. L. acidophilus является наиболее сильным антагонистом среди других представителей рода Lactobacillus. Антагонистическая активность L. acidophilus к патогенной, условно-патогенной и технически-вредной микрофлоре обусловлена сложной системой конкурентных и аллелопатических взаимоотношений. Изучение этих взаимоотношений, которые характерны как для представителей микробоценозов организма человека, так и микробных популяций в окружающей среде на фоне действия факторов различной природы, является актуальной проблемой экологии микроорганизмов [Тучина, 2008]. Особенно важно, что это свойство, привлекающее к данному виду лактобацилл наибольшее внимание исследователей, четко проявляется не только в опытах in vitro, но и in vivo — непосредственно в естественных системах L. acidophilus/oprammi хозяина.

Штаммы, обладающие антагонистической активностью, различаются по силе и характеру воздействия на ингибируемый микроорганизм, а также по ширине и специфичности спектра ипгибируемых микробов. Антагонистическая активность L. acidophilus - важное, но далеко не единственное свойство этой бактерии. L. acidophilus обладает также высоким уровнем колонизационной способности, желчеустойчивости и антибиотикоустойчивости.

Все это определяет постоянно растущий интерес исследователей к изучению L. acidophilus и выделению штаммов, перспективных для использования в пищевой промышленности. Следует отметить, что входя в состав пробиотических продуктов или лекарственных препаратов, а также при попадании внутрь организма-хозяина, производственные штаммы L. acidophilus оказываются в среде обитания, где на рост и антагонистическую активность ацидофильной палочки влияют разные экологические факторы, поэтому детальное изучение влияния этих факторов на пробиотические микроорганизмы имеет не только большое теоретическое, но и практическое значение. Кроме того, характеристика штаммов L. acidophilus, описанных в патентах не является завершенной, комплексной по оценке биологических и экологических свойств L. acidophilus. Поэтому необходимо описывать и вести мониторинг особешюстей коллекционных штаммов, используемых в промышленности для обеспечения экологической безопасности продуктов питания.

Цель работы: изучить эколого-биологические свойства штаммов L. acidophilus, используемых в производстве пробиотических продуктов.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать морфолого-кулыуральные свойства исследуемых штаммов L. acidophilus.

2. Изучить влияние экологических факторов (выращивание на разных средах, аэробные и анаэробные условия, активная кислотность среды, молочная кислота) на рост и антагонистическую активность штаммов L. acidophilus по отношению к тест-штаммам Escherichia coli в условиях in vitro.

3. Определить желчеустойчивость исследуемых штаммов L. acidophilus.

4. Оценить биосовместимость штаммов L. acidophilus между собой и со штаммами Propionibacterium freudenreichii.

5. Выявить жизнеспособность штаммов L. acidophilus и штаммов P. freudenreichii в различных экологических условиях (выращивание на разных средах, совместное и раздельное культивирование).

6. Разработать пробиотическуто закваску и биотехнологию ацидофильного пробиотического напитка на основе молочной подсырной сыворотки.

Научная новизна работы. Впервые дана комплексная эколого-биологическая характеристика штаммов L. acidophilus из сибирской коллекции микроорганизмов ГНУ СО РАСХН СибНИИ сыроделия. Выявлена зависимость роста и антагонистической активности исследуемых штаммов L. acidophilus от характера субстрата, аэробных и анаэробных условий, активной кислотности среды и наличия молочной кислоты. Для получения количественной оценки антагонистических взаимоотношений L. acidophilus и Е. coli нами модифицированы 2 метода - метод капель и метод культивирования на жидкой среде Кесслера. Проведена оценка биосовместимости штаммов L. acidophilus между собой и с P. freudenreichii. С учетом результатов исследования отобраны штаммы L. acidophilus и P. freudenreichii, перспективные для приготовления пробиотической закваски. Разработана биотехнология и рецептура пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки с применением пробиотической закваски.

Положения, выпосимые на защиту:

1. Антагонистическая активность исследуемых штаммов L. acidophilus по отношению к тест-штаммам Е. coli зависит от аэробных и анаэробных условий, активной кислотности среды, наличия молочной кислоты и не зависит от среды культивирования.

2. Жизнеспособность штамма L. acidophilus СКМ-500 не изменяется при раздельном и совместном культивировании с P. freudenreichii, а при использовании разных сред численность сохраняется на высоком уровне (не менее 10б КОЕ/мл).

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволили выявить, что антагонистическая активность коллекционных штаммов L. acidophilus является индивидуальным,

пггаммоспецифическим признаком, а степепь проявления этого признака зависит от экологических условий.

Результаты исследования могут быть использованы предприятиями молочной промышленности для мониторинга качества бактериальных заквасок и препаратов, обеспечения экологической безопасности продуктов питания, научно-исследовательскими организациями микробиологического профиля для селекции коллекционных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий. Модифицированные нами методы позволяют количественно оценить антагонистическую активность штаммов ацидофильной палочки и могут быть внедрены в практику микробиологических лабораторий и лабораторий по оценке качества пищевой продукции. На основе полученных результатов разработана пробиотическая закваска и утверждена нормативно-техническая документация на производство пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки «Алтайское лето» ТУ 9222-056-00419710-10.

Результаты исследования используются при проведении занятий по Экологии микроорганизмов, Микробиологии, Прикладной биотехнологии, Прикладной экологии со студентами биологического факультета Алтайского

государственного университета.

Апробация работы. Результаты работы апробированы на научных конференциях различного уровня: научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал ученых России» (Барнаул, 2009); XI городской научно-практической конференции «МОЛОДЕЖЬ-БАРНАУЛУ» (Барнаул, 2009); Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); 4-й Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с Международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2011); Всероссийской выставке «РосБиоТех» (Москва, 2010); Слете молодых сыроделов (Барнаул, 2011); Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и

биотехнологии» (Пермь, 2011) и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том

числе 3 из них - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, библиографического списка и приложения. Диссертация иллюстрирована 26 рисунками и 35 таблицами. Основной текст изложен на 144 страницах машинописного текста. Библиографическии список включает 173 наименований работ, в том числе 85 - зарубежных авторов.

Личный вклад автора. Автором определены цель и задачи исследования, спланированы и выполнены лабораторные эксперименты на всех этапах исследования, лично выполнена обработка и обсуждение полученных результатов.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту, к.б.н. Я.Р. Кагану за мудрые советы, терпение и понимание, за помощь в планировании экспериментов. Автор работы признателен своему научному руководителю, д.б.н., проф. Г.Г. Соколовой за ценные замечания и консультационную помощь в написании работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе на основе данных отечественной и зарубежной литературы приведены сведения об экологических, биологических и пробиотических свойствах L. acidophilus. Рассмотрены основные области применения L. acidophilus.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования в настоящей работе были 12 штаммов L. acidophilus из отраслевой коллекции ГНУ СО РАСХН СибНИИ сыроделия, 10 из которых являются промышленными штаммами, используемыми в России для крупнотоннажного производства диетических и лечебно-профилактических (пробиотических) ацидофильных молочных продуктов. В экспериментах по выявлению антагонистической активности и биосовместимости указанных штаммов L. acidophilus в качестве тест-культур использовали 2 штамма Е. coli и 6 промышленных штаммов пропионовокислых бактерий из коллекции СибНИИ сыроделия.

Для выращивания и дальнейшего культивирования микроорганизмов были использованы стандартные микробиологические среды: стерильное обезжиренное молоко, обогащенный агар с гидролизованным молоком, лактатный бульон, бульон из гидролизованного молока, жидкая среда Кесслера.

Изучение антагонистических взаимоотношений проводилось с использованием следующих методов: метода перпендикулярных штрихов [Заборских, 1976; Нетрусов, 2005], метода капель [Заборских, 1976; Глушанова, 2004] в нашей модификации и метода культивирования тест-штаммов кишечной палочки в жидкой селективной питательной среде в присутствии того или иного штамма ацидофильной палочки [Заборских, 1976] в нашей модификации. Определение биосовместимости микроорганизмов устанавливали методом «агаровых блоков» [Нетрусов, 2005]. Определение потребностей в питательных веществах проводили ауксанографическим методом [Герхардт, 1984].

Статистическая обработка полученного материала проведена с использованием шкета прикладных программ Statistica 6.0.

ГЛАВА 3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМЫХ ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

Из 12 штаммов ацидофильной палочки, исследованных в данной работе, 11 штаммов являются продуктом отечественной селекции. Все они обладают высокой кислотообразующей активностью и хорошо растут в молоке, образуя плотный сгусток после 4-8 часов инкубации при 37-40°С (при дозе посевного материала 1%). Все 11 отечественных штаммов L. acidophilus при глубинном посеве в среду «АГМ для палочек» формируют в зависимости от густоты посева мелкие или средней величины (диаметром не более 2 мм) беловатые колонии с неровным контуром в виде комочков ваты или клубочков переплетенных нитей, а при выращивании в жидкой среде БГМ дают равномерное помутнение без образования придонного или пристеночного осадка. Заметных различий между штаммами в характере роста в этих питательных средах не выявлено.

При внесении культуры петлей в пробирку, содержащую 10 см3 стерильного обезжиренного молока, отечественные штаммы образуют сгусток после 10-12 часов инкубирования при оптимальной (37°С) температуре; молочные сгустки — гомогенные, вязкие («сметанообразные»), без отделения сыворотки, вкус сгустка — чистый кисломолочный. Исключение представляет лишь штамм L. acidophilus СКМ-503, образующий невязкий («колющийся») сгусток.

Внешний вид молочных культур всех отечественных штаммов ацидофильной палочки, кроме одного (штамма СКМ-495) оказался однообразным: грамположительные, не имеющие жгутиков, аспорогенные палочки с закругленными концами, располагающиеся поодиночке, парами или в виде коротких цепочек; длииа палочек варьировала от 2 до 20 мкм, толщина составила 0,8 мкм. Отличие внешнего вида штамма СКМ-495 от остальных отечественных штаммов L. acidophilus заключалось в том, что клетки этого штамма содержали метахроматические зерна волютина. Это признак, характерный для двух других видов термофильных лактобацилл - L. delbrueckii ssp. bulgaricus и L. delbrueckii ssp. lactis.

Изучение штамма L. acidophilus CKM-506, выделенного нами из коммерческого сухого моновидового бактериального препарата, показало, что по ряду свойств он значительно отличается от вышеописанных отечественных штаммов ацидофильной палочки. В аннотации к препарату указывалось, что штамм L. acidophilus СКМ-506 обладает незначительным кислотообразованием и слабо растет в молоке. Хотя при внесении в стерильное обезжиренное молоко очень высоких доз концентрированного препарата (2х109 или 2х108 КОЕ/см3) сгусток образуется в течение первых суток, снижение дозы до обычных концентраций (104-10б КОЕ/см3) удлиняет срок образования сгустка до 7 суток. При этом во всех случаях молочные сгустки, образованные штаммом СКМ-506, характеризовались как слабые и пресноватые.

Попытка поддерживать штамм СКМ-506 перевивками в стерильное обезжиренное молоко (по аналогии с отечественными штаммами ацидофильной

палочки) окончилась неудачей: сгусток не образовывался даже после 7 суток инкубации, а в микроскопических препаратах обнаруживались лишь единичные клетки. Сами клетки по морфологии резко отличались от клеток отечественных штаммов L. acidophilus: короткие искривленные палочки, расположенные по одной, изредка по две, или в виде коротких цепочек. Более благоприятной средой для роста штамма СКМ-506 оказался бульон из гидролизованного молока; при выращивании в этой среде штамм давал заметное равномерное помутнение, хотя и существенно позже, чем отечественные штаммы ацидофильной палочки (соответственно после 28 и 18 часов инкубации при 37°С).

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА РОСТ И

ПРОЯВЛЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ПО ОТНОШЕНИЮ К ШТАММАМ ESCHERICHIA COLI

4.1. Характер субстрата

При определении антагонистической активности штаммов L. acidophilus по отношению тест-пггаммам Е. coli модифицированным методом капель на питательной среде «АГМ для палочек» строго учитывается количество штамма-антагониста и штамма тест-культуры. Кроме того, культуры высеваются одновременно и вступают в контакт друг с другом одновременно, т.е. появляется эффект взаимодействия антагониста и тест-культуры. Штаммы L. acidophilus, выделяя в среду антибиотические вещества, ингибировали развитие штаммов Е. coli (табл. 1).

Таблица 1

Ингибирование роста штаммов тест-культуры Е. coli коллекционными

штаммами L. acidophilus при совместном культивировании _ в среде «АГМ для палочек»_

Штамм L. acidophilus Минимальное соотношение клеток антагонист/тест-культура, вызывающее полное подавление роста штаммов тест-культуры

СКМ-829 СКМ-830

СКМ-492 10J 10s

СКМ-495 10* 10s

СКМ-497 10s 10s

СКМ-498 10й 10°

СКМ-499 ю5 10b

СКМ-500 10и ю1

СКМ-501 10' 104

СКМ-502 10' 104

СКМ-503 ю4 10s

СКМ-504 10' Ю"

СКМ-505 103 10'

Следует отметить, что в ко1ггроле оба штамма кишечной палочки росли до 8-го разведения, что подтверждает ингибирование кишечной палочки испытуемыми штаммами L. acidophilus, причем степень этого ингибирования варьирует.

Таким образом, оценка антагонистической активности L. acidophilus к Е. coli при росте на твердой питательной среде выявила, что самым сильным антагонистом является штамм СКМ-500, а самым слабым антагонистом -штамм СКМ-498. Также следует отметить, что тест-штамм СКМ-830 более устойчив к ингибируюгцему действию L. acidophilus по сравнению со штаммом СКМ-829.

Для определения антагонистического эффекта штаммов L. acidophilus в отношении тест-штаммов Е. coli при культивировании на жидкой среде нами была использована жидкая среда Кесслера. Хотя в соответствии с данным методом антагонист и тест-культура засеваются в среду Кесслера одновременно, этот метод вряд ли можно отнести к методам совместного культивирования, так как используемая питательная среда неблагоприятна для роста ацидофильной палочки. На рост штаммов тест-кулыуры Е. coli оказывают влияние продукты метаболизма L. acidophilus, внесенные вместе с посевным материалом.

Анализ антагонистической активности коллекционных штаммов L. acidophilus к штаммам СКМ-829 и СКМ-830 при их культивировании в жидкой среде Кесслера выявил аналогичный порядок расположения штаммов по минимальному соотношению клеток антагонист/тест-культура, как при тестировании штаммов L. acidophilus на антагонистическую активность на твердой питательной среде методом капель (табл. 2).

Таблица 2

Ингибирование роста штаммов тест-культуры Е. coli коллекционными

штаммами L. acidophilus при культивировании в жидкой среде Кесслера

Штамм L. acidophilus Минимальное соотношение клеток антагонист/тест-культура, вызывающее полное подавление роста штаммов тест-культуры

СКМ-829 СКМ-830

СКМ-492 103 ю4

СКМ-495 ю4 10'

СКМ-497 10' 10'

СКМ-498 10ь 10"

СКМ-499 10' 10'

СКМ-500 10и ю1

СКМ-501 10' ю4

СКМ-502 10' ю4

СКМ-503 ю4 10'

СКМ-504 10' ю4

СКМ-505 10' 10'

Таким образом, анализ антагонистической активности исследуемых штаммов L. acidophilus по отношению к штаммам тест-культуры Е. coli при культивировании на твердой и жидкой средах показал, что самым сильным антагонистом оказался штамм СКМ-500, самым слабым антагонистом - штамм СКМ-498, а характер субстрата не оказывает влияния на антагонистическую активность исследованных штаммов L. acidophilus .

4.2. Аэробные и анаэробные условия

Для определения влияния аэробных и анаэробных условий на антагонистическую активность штаммов L. acidophilus по отношению к штаммам Е. coli использовали модифицированный метод капель. Для создания анаэробных условий посевы культивировали в анаэростате.

В аэробных условиях наибольший антагонистический эффект проявил штамм СКМ-500 (МСК<10' по отношению к обоим штаммам кишечной палочки). Самым слабым антагонистом к штамму СКМ-829 оказался штамм СКМ-498 (МСК=10б), а по отношению к штамму СКМ-830 самыми слабыми антагонистами были штаммы СКМ-498, СКМ-503, СКМ-504 (табл.3).

Таблица 3

Ингибирование роста штаммов тест-культуры Е. coli коллекционными

штаммами L. acidophilus при культивировании в аэробных условиях

Штамм L. acidophilus Минимальное соотношение клеток антагонист/тест-культура, вызывающее полное подавление роста штаммов тест-культуры

СКМ-829 СКМ-830

СКМ-492 Ю3 10s

СКМ-495 104 10>

СКМ-497 10s 10s

СКМ-498 10" 10°

СКМ-499 10J 10>

СКМ-500 10и 10и

СКМ-501 W' ю-

СКМ-502 10' 10*

СКМ-503 105 10°

СКМ-504 ю2 10°

СКМ-505 103 ю1

В контроле рост обоих штаммов кишечной палочки наблюдался до 8-го разведения, что значительно выше, чем при совместном выращивании с испытуемыми штаммами ацидофильной палочки.

В анаэробных условиях все исследованные штаммы ацидофильной палочки проявляли значительно более сильный антагонистический эффект, чем в аэробных условиях. Наибольшая антагонистическая активность наблюдалась у штаммов СКМ-492 и СКМ-504; в анаэробных условиях они проявили себя как

самые сильные антагонисты. Наименьшая антагонистическая активность отмечены для штаммов СКМ-505 и СКМ-499 (табл. 4).

Таблица 4

Ингибирование роста штаммов тест-культуры Е .coli коллекционными

штаммами L. acidophilus при культивировании в анаэробных условиях

№ Штамм L. acidophilus Минимальное соотношение клеток антагонисти/тест-культура, вызывающее полное подавление роста тест-культуры

СКМ-829 СКМ-830

1 СКМ-492 10" ю2

2 СКМ-495 10* 103

3 СКМ-497 ю1 ю4

4 СКМ-498 ю1 ю4

5 СКМ-499 104 10°

6 СКМ-500 10' 10J

7 СКМ-501 ю1 103

8 СКМ-502 102 10'

9 СКМ-503 10' 10J

10 СКМ-504 10и ю2

11 СКМ-505 10J 103

Таким образом, в анаэробных условиях штаммы L. acidophilus проявляют больший антагонистический эффект, чем в аэробных условиях, причем наиболее сильными антагонистами по отношению к штаммам тест-культуры Е. coli являются штаммы СКМ-492 и СКМ-504, а самыми слабыми антагонистами — штаммы СКМ-505 и СКМ-499.

4.3. Активная кислотность среды Для определения влияния активной кислотности среды на антагонистическую активность штаммов L. acidophilus к штаммам Е. coli, осуществляли совместное культивирование штаммов-антагонистов и штаммов тест-культуры совместно на жидкой питательной среде БГМ с различными значениями рН (от 5 до 9). Дня получения нужного значения рН, БГМ подкисляли 40% раствором молочной кислоты или подщелачивали 20% NaOH.

Результаты исследования показали, что активная кислотность среды влияет на антагонистическую активность исследуемых штаммов L. acidophilus по отношению к штаммам тест-культуры Е. coli. Отмечено, что чем сильнее рН среды смещена в кислую сторону, тем сильнее шггагонистический эффект, а чем сильнее смещена рН среды в щелочную сторону, тем слабее антагонистический эффект у исследуемых нами штаммов L. acidophilus.

Наибольший антагонистический эффект по отношению к штамму СКМ-829 отмечен при рН=5-6 почти у всех штаммов L. acidophilus, кроме СКМ-503, СКМ-505, СКМ-506, которые проявили низкую антагонистическую активность/ Увеличение рН до 9 вызывает резкое снижение антагонистической активности многих штаммов, за исключением штамма СКМ-492 (табл. 5).

Таблица 5

Ингибирование роста штамма СКМ-829 коллекционными штаммами L. acidophilus при культивировании на БГМ с разными значениями рН

Минимальное соотношение клеток

Штаммы штаммов антагонист/тест-культура, Корреляционное

L. acidophilus вызывающее полное подавление роста штаммов тест-культуры отношение

значения рН

5 б 7 8 9

СКМ-492 10и 10° 10и 10' 10* 0,87

СКМ-495 10° 101 10а 10' 107 0,89

СКМ-497 10° ю1 ю1 101 10й 0,79

СКМ-498 10° ю' ю1 101 10° 0,79

СКМ-499 10° 101 10J 104 10* 0,94

СКМ-500 10° 10J 10J 103 10" 0,96

СКМ-501 10и ю' 101 101 10b 0,77

СКМ-502 10и ю1 10' 10' 10s 0,77

СКМ-503 ю4 ю3 10' I0b 10s 0,77

СКМ-504 10° ю1 ю1 101 106 0,79

СКМ-505 10; 10J 10y 10y 10y 0,69

СКМ-506 10° 10" 10s 10s 10s 0,76

Таблица 6

Ингибирование роста штамма СКМ-830 коллекционными штаммами L. acidophilus при культивировании на БГМ с разными значениями рН

Штаммы L. acidophilus Минимальное соотношение клеток (МСК) штаммов антагонист/тест-культура, вызывающее полное подавление роста штаммов тест-культуры Корреляционное отношение

значения рН

5 6 7 8 9

CKM-492 10J 10° 103 106 107 0,82

CKM-495 10s 108 108 108 10* 0,71

CKM-497 ю1 10J 10j 10; 10' 0,94

CKM-498 10и 10J 104 104 10s 0,94

CKM-499 10J 10^ 104 103 10y 0,94

CKM-500 ю4 10; 10' 10; 10* 0,88

CKM-501 10u 102 101 104 10' 0,91

CKM-502 10° 10' 102 104 103 0,97

CKM-503 104 103 10' 10y 108 0,91

CKM-504 10u 101 10J 104 103 0,99

CKM-505 10* 10* 10* 10* 10* 0,00

CKM-506 10* 10* 10y 10* 10* 0,00

Антагонистический эффект исследованных штаммов ацидофильной палочки к штамму СКМ-830 носил аналогичный характер: самый сильный антагонистический эффект при рН=5 с постепенным ослаблением и слабый антагонизм или полное его отсутствие при рН=9 (табл. 6).

В контроле оба штамма тест-культуры растут до восьмого разведения. Таким образом, активная кислотность среды оказывает сильное влияние на антагонистическую активность штаммов ацидофильной палочки к штаммам кишечной палочки. Самыми устойчивыми при изменении рН среды и сохраняющими антагонизм по отношению к штаммам тест-культуры Е. coli являются штаммы СКМ-501, СКМ-502, СКМ-504, а самыми слабыми антагонистами - штаммы СКМ-505 и СКМ-506.

4.4. Нейтрализация молочной кислоты

Общим свойством молочнокислых бактерий, в том числе L. acidophilus, является продуцирование молочной кислоты (которая сама по себе проявляет определенный бактерицидный эффект) и связанное с этим снижение рН среды до значений, не совместимых с жизнедеятельностью многих групп микроорганизмов. Поэтому для исключения влияния на антагонистический эффект молочной кислоты, проводили её нейтрализацию стерильным 10 %-м раствором NaOH. Все исследованные штаммы L. acidophilus проявляли антагонистический эффект по отношению к штаммам E.coli, но степень антагонистической активности этого эффекта варьирует (табл. 7).

Таблица 7

Антагонистическая активность 24-часовых культур ацидофильных палочек к штаммам кишечных палочек до и после нейтрализации их

раствором NaOH

№ Штаммы L. acidophilus Минимальное соотношение клеток (МСК) штаммов антагонист/тест-штамм, вызывающее полное подавление роста тест-штамма

до нейтрализации после нейп зализ ации

СКМ-829 СКМ-830 СКМ-829 СКМ-830

1 СКМ-492 1 10* 10* 10ц

2 СКМ-495 10j ю4 104 10'

3 СКМ-497 1 10J 10" ю8

4 СКМ-498 1 10' 10" 10'

5 СКМ-499 Ю2 ю4 10* 10'

6 СКМ-500 1 1 101 10J

7 СКМ-501 1 1 10° 10'

8 СКМ-502 ю5 ю4 10° 10'

9 СКМ-503 10J 10' 10J 10°

10 СКМ-504 1 1 1 ю1

11 СКМ-505 1 1 1 1

Большинство штаммов ацидофильной палочки (7 из 11) полностью подавляли штамм СКМ-829 уже при соотношении 1:1 (МСК=1). Среди остальных 4 штаммов наименьшую активность наблюдали у штамма СКМ-495 (МСК=10 ). Тест-пггамм Е. coli СКМ-830 оказался более устойчив к антагонистам, чем штамм СКМ-829: максимальную активность (МСК=1) проявили по отношению к нему только 4 штамма L. acidophilus (СКМ-505, СКМ-500, СКМ-501 и СКМ-504), у остальных штаммов отмечено изменение МСК в сторону до 102-104 (табл.7).

ГЛАВА 5 . СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

5.1. Желчеустойчивость

Устойчивость к желчи - важное свойство пробиотических штаммов лактобацилл, позволяющее прогнозировать возможность их адгезии к эпителиальным клеткам кишечника. Штаммы L. acidophilus существенно различаются по устойчивости к этому фактору. Поэтому все изучаемые нами штаммы мы проверили на чувствительность к воздействию различных концентраций (0, 10, 20, 30 и 40 %) медицинской желчи.

Анализ результатов исследования показал, что высокую чувствительность к желчи проявил только 1 штамм - СКМ-505, у которого рост отсутствовал далее при наименьшей из испытанных концентраций желчи (табл.8).

Таблица 8

Рост штаммов L. acidophilus при различной концентрации желчи

Штаммы L. acidophilus Рост штаммов при различной концентрации желчи

0% 10% 20% 30% 40%

СКМ-492 + + + + +

СКМ-495 + + + + _

СКМ-497 + + + + +

СКМ-498 + + + + _

СКМ-499 + + + + +

СКМ-500 + + + + +

СКМ-501 + + + + +

СКМ-502 + + + + _

СКМ-503 + + + + +

СКМ-504 + + + + +

СКМ-505 + - - - -

Условные обозначения: «+» - рост есть; «-» - признаки роста отсутствуют

Все остальные штаммы L. acidophilus хорошо росли в присутствии от 10 до 30 % концентрации желчи, причем у четырёх штаммов (СКМ-497, СКМ-498, СКМ-500 и СКМ-504) рост в виде помутнения среды обнаружился, уже после 24 часов инкубирования, тогда как у остальных штаммов - лишь через 48 часов.

Наиболее устойчивыми к высокой концентрации желчи (40%) в субстрате оказались штаммы СКМ-492, СКМ-497, СКМ-499, СКМ-500, СКМ-501, СКМ-503 и СКМ-504; рост у штаммов СКМ-495, СКМ-498, СКМ-502 и СКМ-505 при высокой концентрации желчи отсутствовал (табл. 8).

Таким образом, 7 из 11 исследованных штаммов L. acidophilus проявили очень высокую степень желчеустойчивости (до 40%) и являются перспективными для включения их в состав пробиотических продуктов и заквасок.

5.2. Биосовместимость штаммов L. acidophilus между собой

Биосовместимость штаммов L. acidophilus проверяли методом агаровых блоков на твердой питательной среде «АГМ для палочек». Результаты исследования показали, что зоны ингибирования характерны только дня штаммов СКМ-495, СКМ-504 и СКМ-502 и лишь по отношению к одному штамму - СКМ-505. Таким образом, все исследованные штаммы L. acidophilus, кроме штамма СКМ-505, являются биосовместимыми и, следовательно, могут использоваться в приготовлении многоштаммовых заквасочных комбинаций ацидофильной палочки.

5.3. Несовместимость штаммов L. acidophilus и P. freudettreichii

Биосовместимость L. acidophilus и P. freudenreichii также проверяли методом агаровых блоков на твердой питательной среде «АГМ для палочек». Результаты исследования показали, что все изучаемые штаммы L.acidophilus и P. freudenreichii не проявили ингибирующего эффекта по отношению друг к другу при совместном культивировании.

Таким образом, все исследоваштые штаммы L. acidophilus и P. freudenreichii использоваться для приготовления многоштаммовых заквасочных комбинаций ацидофильной палочки и пропионовокислых бактерий.

Так как штамм СКМ-785 из всех исследуемых штаммов пропионовокислых бактерий известен как наиболее активный продуцент витамина Bi2 (Отг, 1984; Воробьева, 1995), то именно он использовался нами для дальнейших исследований. А из изученных штаммов L. acidophilus для дальнейших исследований использовали штамм СКМ-500, так как он проявил себя во всех экспериментах стабильно как сильный антагонист, а также обладает высокой степенью желчеустойчивости и биосовместимости.

5.4. Жизнеспособность L. acidophilus и P. freudenreichii в различных экологических условиях

5.4.1. Выращивание на разных средах

Для изучения жизнеспособности L. acidophilus и P. freudenreichii на разных средах эти культуры выращивали совместно на каждой из сред, после чего

хранили в течении 30 суток в холодильнике (6-8°С). Контролем служили чистые культуры L. acidophilus и P. freudenreichii, выращенные при таких же условиях культивирования. Культивирование проводилось на следующих вариантах сред:

1 - Стерильное обезжиренное молоко.

2 - Стерильное обезжиренное молоко/стерильная подсырная сыворотка в соотношении 1:1.

3 - Стерильная подсырная сыворотка.

Вариант 1. Анализ динамики численности L. acidophilus и P. freudenreichii (рис.1) показал, что в пробе численность ацидофильной палочки выше, чем в контроле, на протяжении всего срока хранения. Это можно объяснить тем, что пропионовокислые бактерии стимулируют рост ацидофильной палочки. Численность P. freudenreichii в пробе также выше по сравнению с контролем на протяжении всего срока хранения, т.к. ацидофильная палочка в процессе своей жизнедеятельности выделяет в среду молочную кислоту. А лактат, в свою очередь, является питательным субстратом для пропионовокислых бактерий.

г 10 20 30 Врем* хранения, сутки

Рис. 1. Динамика численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на обезжиренном молоке

Вариант 2. Анализ динамики численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на молочной сыворотке выявил, что численность пробиотических культур (L. acidophilus и P. freudenreichii) снижается по сравнению с выращиванием на обрате, но сохраняет тот же порядок (10 КОЕ/см3). Численность обеих культур, как и в предыдущем варианте, в опытных образцах выше, чем в контрольных (рис. 2).

* «ОМТЙС-ПЬ 1.№СШОрЫШ$

& контроль kfrevsteivekhl

* проба l.aiiddphiias

® проба Rfieudenrektob

КОЕ/ш\ ІС'

І .......-г-.......—.................ж!............................Щ - ..................................................* контроль Lacidophilus:

2,5 - щк -Щ -г ЩЖу у Гу..]*«контроль fijivudenreichi

/. ;......-......~ЯИ- - ''1ІЕ™тЕІ.........—ИШ щІЩ—-.......ШШ і * проб» LocidoptKius

!,!> ; St Я'ТШш-1- "ШШЖ ,iJP ¡'¡проbzP.frvitdertreicbii

°-s Я Шш ; ■ "в !.....

1 Ю 20 30 бремя хранения, сутки

Рис. 2. Динамика численности /.. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на молочной сыворотке

Вариант 3. Анализ динамики численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на смешанной среде выявил, что численность ацидофильной палочки и пропионовокислых бактерий аналогична той, что регистрировалась при выращивании на обезжиренном молоке или сыворотке по отдельности и составила 107 КОЕ/см3 (рис. 3).

КО£/см', 10;

4,S

1 Ю 20 30 Время хранения, сугяи

Рис. 3. Динамика численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на смешанной среде сыворотка/обрат

• контроль ¿.acidophilus ^ контроль P.freudeiwekh ш проба Laeldophilus Ш проба P.frciidcnreichii

Таким образом, численность L. acidophilus и P. freudenreichii при культивировании и последующем хранении во всех вариантах сред сохраняется на высоком (107 КОЕ/см3).

5.4.2. Совместное и раздельное культивирование

L. acidophilus и P. fi-eudenreichii культивировали совместно и раздельно на обезжиренном молоке, после чего хранили в течении 30 суток в холодильнике (6-8сС). Контролем служили чистые культуры L. acidophilus и P. freudenreichii, культивируемые при таких же условиях.

При раздельном культивировании ацидофильная палочка показывает хорошую выживаемость до 30 суток хранения, ее численность выше в пробе по сравнению с контролем (рис. 4) и составляет 2,1-Ю7 КОЕ/см3 в пробе и 1,1-Ю7 КОЕ/см3 в контроле (рис. 4).

КОЕ/см1, 10*

1 1D 20 30 время хранения, сутки

Рис. 4. Динамика численности L. acidophilus при раздельном культивировании

Контроль Проба

30 время хранения, сутки

КОЕ/см3,10е

Рис. 5. Динамика численности P. freudenreichii при раздельном культивировании

Численность прогшоновокислых бактерий при раздельном культивировании достигла своего максимума на 30 сутки хранения и составила 5,1108 КОЕ/см3 в пробе (рис. 5).

При совместном культивировании численность L. acidophilus составляет 2,710s КОЕ/см3 на 20-е сутки хранения, что сопоставимо с раздельным вариантом культивирования. На первые сутки в контроле численность ацидофильной палочки несколько выше на контроле, но при дальнейшем хранении численность пробиотической культуры в пробе превышает значения по сравнению с контролем (рис. 6).

КОЕ/см5, 10*

2,5

И Контроль

г 5 И Проба

1

0,5 О

1 1D 20 30

время хранения, сутки

Рис. 6. Динамика численности L. acidophilus при совместном культивировании

КОЕ/см', 10"

И Контроль В Проба

время хранения, сутки

Рис. 7. Динамика численности Р. freudenreichii при совместном культивировании

Численность прогшоновокислых бактерий в пробе выше по сравнению с контролем на протяжении всего срока хранения. Максимальная численность пропионовокислых бактерий отмечена на 30-е сутки хранения и составила 4,9-108 КОЕ/см3. По сравнению с раздельным культивированием, численность пропионовокислых бактерий при совместном культивировании сохранилась на том же уровне и составила 108 КОЕ/см (рис. 7).

При храиеиии проб постоянно изменяется титруемая кислотность. Анализ изменения титруемой кислотности в зависимости от продолжительности культивирования выявил, что титруемая кислотность при раздельном и совместном культивировании постепенно нарастает при хранении и достигает максимума при 30 сутках культивирования, что является естественным процессом, так как в среде накапливаются продукты обмена микроорганизмов. Которые смещают рН среды в кислую сторону. Разница титруемой кислотности при совместном и раздельном культивировании составила 5%. Также отмечено, что в опытной пробе титруемая кислотность ниже, чем в контрольных образцах на протяжении всего срока хранения. Это можно объяснить тем, что пропионовокислые бактерии, используя лактат, который выделяет ацидофильная палочка, тем самым понижают кислотность среды.

Таким образом, установлено, что способ культивирования (совместное или раздельное) не влияет на численность L. acidophilus и P. freudenreichii и на титруемую кислотность при хранении.

ГЛАВА 6. БИОТЕХНОЛОГИЯ АЦИДОФИЛЬНОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО НАПИТКА НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОЙ ПОДСЫРНОЙ СЫВОРОТКИ

Данные, полученные в экспериментах по влиянию экологических факторов на антагонистическую активность ацидофильной палочки, а также по выращиванию раздельных и совместных культур ацидофильной палочки и пропионовокислых бактерий в молочных средах, использовали для разработки пробиотической закваски и биотехнологии напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки с использованием пробиотической закваски.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что по морфолого-кулыуральным свойствам исследованные 11 отечественных штаммов L. acidophilus соответствует общепринятому описанию неотипового штамма L. acidophilus АТСС 4356, но отличаются от зарубежного штамма La-5 (СКМ-506).

2. Выявлено, что на рост и антагонистическую активность L. acidophilus по отношению к штаммам тест-культуры Е. coli влияют такие экологические факторы, как аэробные и анаэробные условия, активная кислотность среды и наличие молочной кислоты в культуральной жидкости. В анаэробных условиях антагонистическая активность исследуемых штаммов L. acidophilus повышается по сравнению с аэробными условиями. При смещении активной кислотности среды в щелочную сторону антагонистическая активность исследуемых штаммов L. acidophilus понижается, а при смещении активной кислотности среды в кислую сторону — повышается. Нейтрализация молочной кислоты в культуральной жидкости приводит к уменьшению антагонистической активности штаммов L. acidophilus.

3. Установлено, что характер субстрата не влияет на антагонистическую активность L. acidophilus по отношению к штаммам тест-культуры Е. coli.

4. Определено, что большинство (7 из 11) исследованных штаммов L. acidophilus являются желчеустойчивыми (до 40%).

5. Установлено, что все исследованные штаммы L. acidophilus являются биосовместимыми между собой (за исключением штамма СКМ-505) и все 11 штаммов биосовместимы с исследованными штаммами P. freudenreichii.

6. Показано, что численность L. acidophilus и P. freudenreichii сохраняется на высоком уровне (107 КОЕ/см3) во всех исследоваштых вариантах среды (обезжиренное молоко, сыворотка, обезжиренное молоко/сыворотка).

7. Выявлено, что способ культивирования (совместное или раздельное) не влияет на численность L. acidophilus и P. freudenreichii и на титруемую кислотность при хранении.

8. Разработана пробиотическая закваска и биотехнология приготовления ацидофильного пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ:

1. Иркитова А.Н., Вечернина Н.А. Биотехнология пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки // Известия Алтайского государственного университета. Серия Биологические науки. — №3/1. — 2010. — С.30-32.

2. Иркитова А.Н. Сравнительная оценка штаммов ацидофильной палочки для использования в составе пробиотических продуктов // Вестник уральской медицинской академической науки. №4/1 (38). — 2011. — С.30-31.

3. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Соколова Г.Г. Антагонистическая активность молочных культур Lactobacillus acidophilus по отношению к тест-штаммам Escherichia coli II Известия Алтайского государственного университета. Серия Биологические науки. —№3/1 —2011. —С.19-22.

Публикации в других журналах и сборниках:

4. Каган Я. Р., Сергеева И .Я., Зуева JI.A., Иркитова А.Н. Пробиотические кисломолочные продукты в магазинах города Барнаула // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. - 2008. - Вып. 5. - С. 269-282.

5. Иркитова А.Н. Оптимологический подход к осмыслению биоценоза в валеологической практике // Интеллектуальный потенциал ученых России. -2009. — С.151-153.

6. Каган Я.Р., Сергеева И.Я., Отг Е.Ф., Иркитова А.Н. Пробиотический кисломолочный напиток на основе подсырной молочной сыворотки // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. — 2009. — Вып. 6. - С. 186-190.

7. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Вечернина Н.А. Биотехнология пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки //

Материалы XI городской научно-практической конференции «МОЛОДЕЖЬ-БАРНАУЛУ». - 2009. - С.520-521.

8. Иркитова А.Н., Соколова Г.Г. Биотехнология пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки // Биотехнология начала III тысячелетия. Саранск: ООО «Мордовия - Экспо». - 2010. - С.72-73.

9. Иркитова А.Н., Соколова Г.Г. Переработка отходов молочного производства // Первая Всероссийская молодежная научная конференция, посвященная 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете. - 2010. - С.272-274.

10. Иркитва А.Н. Биотехнология сывороточного напитка // Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности

— 2011. —С.193-196.

11. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. Описание и местообитание // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. - 2011 -Вып.8. — С.207-212.

12. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. Систематика и культивирование // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. - 2011. - Вып.8. - С.213-216.

13. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. 3. Антагонистическая активность // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. - 2011. - Вып.8. - С.216-222.

14. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. Пробиотические свойства и лизогения // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока

- 2011. - Вып.8. - С.222-230.

15. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. Практическое использование // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока -2011 -Вып.8.-С.230-239.

Подписано в печать 20.04.2012 г. Формат 60x90, объем - 1 усл. печ. л. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме Нью Роман Заказ № 196, тираж 150 экз.

Отпечатано в полном соответствии с авторским оригиналом в типографии ООО «Акимирка» 656043, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 96 в Тел.: (3852) 36-77-94

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иркитова, Алена Николаевна, Барнаул

61 12-3/1111

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

Иркитова Алена Николаевна

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

Научный руководитель: д.б.н. проф. Г.Г.Соколова.

Барнаул-2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4 ГЛАВА 1. ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 9

1.1. Характеристика и распространение 9

1.2. Антагонистическая активность 16

1.3. Пробиотические свойства 23

1.4. Практическое применение 31 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42

2.1. Объекты исследования 42

2.2. Питательные среды и условия культивирования 45

2.3. Методы исследования 47 ГЛАВА 3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМЫХ ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 53

3.1. Морфолого-культуральные свойства отечественных

штаммов L. acidophilus 53

3.2. Характеристика штамма L. acidophilus СКМ-506 58 ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА РОСТ И ПРОЯВЛЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ПО ОТНОШЕНИЮ К ШТАММАМ ESCHERICHIA COLI 61

4.1. Характер субстрата 61

4.2. Аэробные и анаэробные условия 68

4.3. Активная кислотность среды 72

4.4. Нейтрализация молочной кислоты 76 ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 81

5.1. Молекулярно-генетическая идентификация штаммов 81

5.2. Желчеустойчивость 85

5.3. Биосовместимость штаммов L. acidophilus между собой 87

2

5.4. Биосовместимость штаммов L. acidophilus и Propionibacterium freude-nreichii 89

5.5. Жизнеспособность L. acidophilus и P. freudenreichii в различных экологических условиях 90

5.5.1. Выращивание на разных средах 90

5.5.2. Совместное и раздельное культивирование 95 ГЛАВА 6. БИОТЕХНОЛОГИЯ АЦИДОФИЛЬНОГО ПРОБИОТИЧЕС-КОГО НАПИТКА НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОЙ (ПОДСЫРНОЙ) СЫВОРОТКИ 102

6.1. Разработка рецептуры экспериментального напитка 102

6.2. Изучение динамики численности заквасочных бактерий в процессе хранения пробиотического сывороточного напитка 108

6.3. Оценка органолептических показателей напитка 113

6.4. Оценка эффективности использования напитка в лечебно-профилактическом питании 116 ВЫВОДЫ 120 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 122 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 140 ПРИЛОЖЕНИЕ 2 142 ПРИЛОЖЕНИЕ 3 144

ВВЕДЕНИЕ

Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе и являются представителями микрофлоры человека и теплокровных животных. Они обладают высокой биологической и функциональной активностью, что определяет их практическое использование в качестве пробиотиков и в производстве пищевых продуктов. Среди бактерий, применяемых как про-биотики, наиболее широко известна своим полезным действием Lactobacillus acidophilus, которая заселяет кишечник новорожденного ребенка и, вступив с ним в устойчивый симбиоз, сопровождает человека на протяжении всей его жизни, оказывая благотворное влияние на его здоровье (Королева, 1975; Каган, 2008). L. acidophilus является наиболее сильным антагонистом среди других представителей рода Lactobacillus. Антагонистическая активность L. acidophilus к патогенной, условно-патогенной и технически-вредной микрофлоре обусловлена сложной системой конкурентных и аллелопатических взаимоотношений. Изучение этих взаимоотношений, которые характерны как для представителей микробоценозов организма человека, так и микробных популяций в окружающей среде на фоне действия факторов различной природы, является актуальной проблемой экологии микроорганизмов (Тучина, 2008). Особенно важно, что антагонистическая активность, привлекающая к данному виду лактобацилл наибольшее внимание исследователей, четко проявляется не только в опытах in vitro, но и in vivo - непосредственно в естественных системах L. acidophilus!организм хозяина.

Штаммы, обладающие антагонистической активностью, различаются по силе и характеру воздействия на ингибируемый микроорганизм, а также по ширине и специфичности спектра ингибируемых микробов. Антагонистическая активность L. acidophilus - важное, но далеко не единственное свойство этой бактерии. L. acidophilus обладает также высоким уровнем колонизационной способности, желчеустойчивости и антибиотикоустойчивости.

Все это определяет постоянно растущий интерес исследователей к изучению L. acidophilus и выделению штаммов, перспективных для использования в пищевой промышленности. Следует отметить, что входя в состав про-биотических продуктов или лекарственных препаратов, а также при попадании внутрь организма-хозяина, производственные штаммы L. acidophilus оказываются в среде обитания, где на рост и антагонистическую активность ацидофильной палочки влияют разные экологические факторы, поэтому детальное изучение влияния этих факторов на пробиотические микроорганизмы имеет не только большое теоретическое, но и практическое значение. Кроме того, характеристика штаммов L. acidophilus, описанных в патентах, не является завершенной, комплексной по оценке биологических и экологических свойств L. acidophilus. Поэтому необходимо описывать и вести мониторинг особенностей коллекционных штаммов, используемых в промышленности, для обеспечения экологической безопасности продуктов питания.

Цель работы: изучить эколого-биологические свойства штаммов L. acidophilus, используемых в производстве пробиотических продуктов.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать морфолого-культуральные свойства исследуемых штаммов L. acidophilus.

2. Изучить влияние экологических факторов (выращивание на разных средах, аэробные и анаэробные условия, активная кислотность среды, наличие молочной кислоты) на рост и антагонистическую активность штаммов L. acidophilus по отношению к тест-штаммам Escherichia coli в условиях in vitro.

3. Определить желчеустойчивость исследуемых штаммов L. acidophilus.

4. Оценить биосовместимость штаммов L. acidophilus между собой и со штаммами Propionibacterium freudenreichii.

5. Выявить жизнеспособность штаммов!,, acidophilus и штаммов P. freudenreichii в различных экологических условиях (выращивание на разных средах, совместное и раздельное культивирование).

6. Разработать пробиотическую закваску и биотехнологию ацидофильного пробиотического напитка на основе молочной подсырной сыворотки.

Научная новизна работы. Впервые дана комплексная эколого-биологическая характеристика штаммов L. acidophilus из сибирской коллекции микроорганизмов ГНУ СО РАСХН СибНИИсыроделия. Выявлена зависимость роста и антагонистической активности исследуемых штаммов L. acidophilus от аэробных и анаэробных условий выращивания, активной кислотности среды. Для получения количественной оценки антагонистических взаимоотношений L. acidophilus и Escherichia coli нами модифицированы 2 метода - метод капель и метод культивирования на жидкой среде Кесслера. Проведена оценка биосовместимости штаммов L. acidophilus между собой и с P. freudenreichii. Разработана пробиотическая закваска с учетом результатов по биосовместимости штаммов. Разработана биотехнология и рецептура пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки с применением пробиотической закваски.

Положения, выносимые на защиту:

1. Антагонистическая активность исследуемых штаммов L. acidophilus по отношению к тест-штаммам Е. coli зависит от аэробных и анаэробных условий, активной кислотности среды, наличия молочной кислоты и не зависит от среды культивирования.

2. Жизнеспособность штамма L. acidophilus СКМ-500 не изменяется при раздельном и совместном культивировании с P. freudenreichii, а при использовании разных сред численность сохраняется на терапевтически значимом уровне (не менее 10ö КОЕ/мл).

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволили выявить, что антагонистическая активность коллекционных штаммов L. acidophilus является индивидуальным, штаммоспецифиче-ским признаком, а степень проявления этого признака зависит от экологических условий.

Результаты исследования могут быть использованы научно-исследовательскими организациями микробиологического профиля и предприятиями молочной промышленности для селекции коллекционных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий, для мониторинга качества заквасок и бактериальных препаратов, обеспечения экологической безопасности продуктов питания. Модифицированные нами методы позволяют количественно оценить антагонистическую активность штаммов ацидофильной палочки и могут быть внедрены в практику микробиологических лабораторий и лабораторий по оценке качества пищевой продукции.

На основе полученных результатов разработана пробиотическая закваска и утверждена нормативно-техническая документация на производство пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки «Алтайское лето» ТУ 9222-056-00419710-10.

Результаты исследования использованы при проведении занятий по Экологии микроорганизмов, Микробиологии, Прикладной биотехнологии, Прикладной экологии со студентами биологического факультета Алтайского государственного университета.

Апробация работы. Результаты работы были апробированы на научных конференциях различного уровня: научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал ученых России» (Барнаул, 2009); XI городской научно-практической конференции «МОЛОДЕЖЬ-БАРНАУЛУ» (Барнаул, 2009); Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); 4-й Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с Международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2011); Всероссийской выставке «РосБиоТех» (Москва, 2010); Слете молодых сыроделов (Барнаул, 2011); Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Совре-

менные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011) и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 из них - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, библиографического списка и приложения. Диссертация иллюстрирована 26 рисунками и 35 таблицами. Основной текст изложен на 144 страницах машинописного текста. Библиографический список включает 173 наименований работ, в том числе 85 - зарубежных авторов.

Личный вклад автора. Автором определены цель и задачи исследования, спланированы и выполнены лабораторные эксперименты на всех этапах исследования, лично выполнена обработка и обсуждение полученных результатов.

Благодарности. Автор выражает сердечную, искреннюю благодарность научному консультанту к.б.н. Я.Р. Катанка мудрые советы, терпение и понимание, за помощь в планировании экспериментов. Автор работы признателен своему научному руководителю д.б.н., проф. Г.Г. Соколовой за ценные замечания и консультационную помощь в написании работы.

ГЛАВА I. ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ LACTOBACILLLUS ACIDOPHILUS

1.1. Характеристика и распространение

Официально начало истории ацидофильной палочки относится к 1900 году, когда Moro Е. описал микроб, выделенный им из фекалий грудного младенца, и дал ему название Bacillus acidophilus (Moro, 1900). Однако эта культура была впоследствии утрачена, а сохранившееся описание недостаточно, чтобы уверенно отнести ее к современному виду Lactobacillus acidophilus. Мы рассматриваем описание вида, предложенное Hansen Р.А., Мос-quot G. в 1970 г. и представленное в 8-ом издании определителя Берги неотиповым штаммом АТСС 4356 (Bogovic-Matijasic, Rogelj, 1998).

Морфология. Палочки с закругленными концами, размером обычно 0,60,9 х 1,5-6 мкм, располагаются поодиночке, парами или в виде коротких цепочек. Неподвижны. Жгутиков не образуют. В отличие от L. bulgaricus и L. lactis не содержат гранул метахроматина. Спор не образуют. Колонии обычно шероховатые (R-форма). Микроскопическое исследование обычно обнаруживает скрученные или пушистые волокнистые выступы с темной волокнистой массой в центре колонии. Глубинные колонии имеют неправильную форму с радиальными или разветвленными выступами. Не имеют характерной окраски.

Физиолого-биохимические свойства. Тип брожения - гомоферментатив-ное с образованием DL-молочной кислоты (в отличие от L. bulgaricus, образующей только D-изомер лактата). Обычно на долю других конечных продуктов ферментации углеводов приходится менее 10 %. Гидролизует эскулин. Ферментирует амигдалин, целлобиозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мальтозу, салицин, сахарозу и трегалозу. Некоторые штаммы ферментируют гликоген (обычно слабо). Некоторые штаммы ферментируют мелибиозу и раффинозу. Факультативный анаэроб. Каталазу не образует. Не

растет при 15°С, может не расти при 22°С; обычно растет при 45 "С и может расти при 48°С; оптимум в пределах 35-3 8°С. Растет при начальных значениях рН от 5,0 до 7,0 с оптимумом в пределах рН 5,5-6,0. Аммиак из аргинина не образует. Активность кислотообразования и продолжительность свертывания молока варьируют; кислотообразование колеблется в пределах 0,3-1,9 % молочной кислоты.

Пептидогликан клеточной стенки относится к типу Ь-лизин-Б-аспартат; тейхоевая кислота обычно отсутствует; у некоторых штаммов выявляются небольшие количества глицерол-тейхоевой кислоты. Клеточные стенки не содержат каких-нибудь различимых гексоз и пентоз. Штаммы проявляют серологическое разнообразие и не дают групповых реакций.

Для роста требуют присутствия ацетата или мевалоновой кислоты, рибофлавина, пантотената кальция, ниацина и фолиевой кислоты. Не нуждаются в добавках тиамина, пиридоксаля и тимидина. Обычно не нуждаются в витамине В12 (цианкобаламине). Мутантные штаммы могут нуждаться в деок-сирибозидах (Квасников, Нестеренко, 1975).

Содержание ГЦ в ДНК, определенное у 6 штаммов по плавучей плотности ДЕК, составило 36,7 ± 0,7 моль% (Buchanan, Gibbons, 1974; Starr et al., 1981).

Исследователи отмечают высокую устойчивость штаммов ацидофильной палочки к щелочной реакции среды (рост при рН=8,3), наличию в среде 0,4 % фенола, желчи (20 %) или поваренной соли (2 %) и связывают эту особенность с ее адаптацией к специфической нише естественного местообитания (Королева, 1975; Банникова и др., 1987).

Ацидофильная палочка способна подавлять рост ряда представителей патогенных, условно-патогенных и технически-вредных микроорганизмов (Королева, 1975; Keogh, 1976; Банникова и др., 1987) за счет неспецифического и специфического антагонизма. Неспецифический антагонизм проявляют не только штаммы L. acidophilus, но и многие другие группы и виды

молочнокислых бактерий, а специфический антагонизм, это скорее штаммо-вое, чем видовое свойство ацидофильной палочки.

Зарубежные исследователи характеризуют штаммы L. acidophilus как относительно слабые кислотообразователи, свертывающие молоко при 0,5 %-ном инокулюме и оптимальной температуре культивирования в лучшем случае не ранее, чем за 24 час. В СССР в 1940-50-х гг. были селекционированы штаммы, идентифицированные как L. acidophilus, с очень высокой скоростью кислотообразования. Эти штаммы, способные свертывать молоко за 9-15 ч, а при 3-5 %-ном инокулюме - за 5-6 ч, отличаются от вышеприведенного описания и по морфологии (размер клеток 1,0-1,5 х 3-40 мкм), у некоторых штаммов наличие в клетках метахроматиновых зерен (колонии R- и S-форм), и по некоторым физиолого-биохимическим признакам (например, по спектру ферментации углеводов) (Квасников, Нестеренко, 1975; Королева, 1975). В коллекции культур СибНИИ сыроделия нетипичные для L. acidophilus свойства проявляет промышленный штамм 630, используемый в производстве детского пробиотического кисломолочного продукта «Биолакт». Этот штамм образует в молоке невязкий сгусток, а его клетки содержат, подобно клеткам L. bulgaricus и L. lactis, метахроматиновые зерна.

О существовании «нетипичных» штаммов L. acidophilus сообщали и зарубежные исследователи. Так, из рубца и сычуга телят и козлят, питавшихся молоком, были выделены штаммы ацидофильной палочки, способные ферментировать крахмал и декстрин, а также устойчивые к ауреомицину (Mann, Oxford, 1955).

У L. acidophilus обнаружено наличие протеолитических и липолитических свойств. Согласно данным JI.A. Банниковой (1987), все 6 исследованных ими штаммов L. acidophilus проявляли протеолитическую активность (оцениваемую по накоплению свободного тирозина) на уровне, сходном с уровнем у штаммов L. bulgaricus, L. helveticus и L.casei, и заметно превосходящем уровень активности, выявленный у лактококков. В свою

очередь египетские исследователи сообщили, что изученные ими штаммы L. acidophilus обладали внутриклеточной эстеразной активностью (El-Soda, Abd-el-Wahab et al., 1986).

Лизогения L. acidophilus. Бактериофаги наносят большой ущерб молочной промышленности; особенно страдает от них сыродельная отрасль, что объясняется использованием щадящих режимов пастеризации молока, контакта полуфабриката с нестерильной внешней средой и широким применением лактококков, наиболее предраспо