Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка комплексного пробиотического препарата на основе лактобактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка комплексного пробиотического препарата на основе лактобактерий"

На правахрукописи

ФАДЕЕВА Ирина Валентиновна

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2004

Работа выполнена в лаборатории пробиотиков филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Несчисляев В.А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Горовиц Э.С. кандидат биологических наук, доцент Новоселова Г.Н.

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и иммунобиологических препаратов имени Л.А. Тарасевича, Москва.

Защита состоится ¿¿¿аЛю*. 2004 т.4на заседании

диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс:(3422)44-67-11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

чл.-корр. РАН Ившина И.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вследствие несбалансированного питания, дефицита витаминов, микроэлементов, приема антибактериальных препаратов, а также под действием все увеличивающегося загрязнения окружающей среды потенциально опасными для живых организмов химическими соединениями происходит разрушение эволюционно сложившихся естественных микробиоценозов человека. Поскольку частота распространения дисбактериоза пищеварительного тракта среди россиян по некоторым оценкам достигает 90 %, очевидно, насколько важны исследования, направленные на создание препаратов, восстанавливающих микроэкологический баланс в организме (Грачева и др., 1999; Шендеров, 2002). Важная роль в лечении и профилактике дисбактериозов отводится пробиотикам, содержащим представителей нормальной микрофлоры человека, в том числе лактобактерии (Гуськова, 1996; Горовиц и др., 1999; Каширская, 2000; Шендеров, 2002). Последние широко представлены на слизистых открытых окружающей среде полостей организма и в значительной степени определяют функционалыгую активность микробиоценозов данных биотопов (Воробьев, 1999; Raibaud, 1998). Лактобактерии являются постоянным объектом исследований в микробной экологии человека. Практическое использование их положительных свойств иллюстрируется многолетним опытом изготовления и применения отечественных биопрепаратов (лактобактерин, ацилакт, аципол). Фактором, ограничивающим специфическую активность указанных пробиотиков, является содержание бактерий одного вида. Повышение и расширение спектра биологической активности лактосодержащих пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые штаммы разных видов. Создание препаратов многовидового микробного состава является наиболее перспективным подходом к бактериотерапии (Чупринина и др., 1998; Шендеров, 2001). Указанное направление исследований предполагает реализацию потенциала известных производственных штаммов лактобактерии - Lactobacillus plantarum 8P-A3, L fermentum 90T-C4, L. acidophilns К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L. acidophilusNKi.

Клинические исследования открывают новые стороны позитивного воздействия лактосодержащих препаратов на физическое состояние человека. Это позволяет расширять сферу их применения (акушерство и гинекология, стоматология, дерматология

I вИБЛИОТЕКА |

необходимость создания лекарственных форм, адекватных новым способам аппликации и требованиям к потребительским свойствам препаратов (суппозитории, мази, кремы, порошки, капсулы, таблетки) (Поспелова и др., 1988). Исследования, направленные на разработку и усовершенствование технологий указанных фармакопейных форм препаратов на основе живых лактобактерий, являются актуальными для производства пробиотиков.

Цель настоящего исследования - изучение и реализация биологического и технологического потенциала известных производственных штаммов лактобактерий при конструировании комплексного пробиотического препарата.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительное изучение биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий, используемых для изготовления отечественных лактосодержащих пробиотиков.

2. Сконструировать бактериальную композицию комплексного препарата с учетом совместимости и анализа совокупности биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий.

3. Разработать способ получения комплексного препарата и методы контроля его специфической активности.

4. Исследовать in vitro биологическую активность комплексного препарата в сравнении с аналогами.

5. Изучить возможность и особенности использования различных способов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм лактосодержащих пробиотиков.

Научная новизна. На основе сравнительной оценки биологических и технологических свойств, а также с учетом совместимости производственных штаммов лактобактерий сконструирована бактериальная композиция и разработан способ получения комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой», обладающего высокой биологической активностью. Изучено влияние различных ксеропротекторов на биологические свойства лактобактерий и технологические параметры лиофилизированной биомассы. Разработан способ получения лиофилизированной биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления различных лекарственных форм (порошки, капсулы, мази, суппозитории и т.д.) пробиотиков, с использованием ксеропротектора, содержащего аэросил.

В качестве альтернативы лиофилизации разработан способ стабилизации жидкой бактериальной культуры Ь. р1аШагит 8P-A3, обеспечивающий длительное сохранение жизнеспособности клеток и пригодный для изготовления мягких лекарственных форм лактобактерина.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о биологических и технологических свойствах производственных штаммов лактобактерий, позволяют оптимизировать методические подходы при конструировании бактерийных композиций комплексных пробиотиков. Результаты исследований свидетельствуют о возможности использования различных способов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм пробиотиков. Установлена зависимость технологических свойств сухой лиофилизированной биомассы от состава защитной среды. Разработан и запатентован (Патент № 2200566 на изобретение РФ) состав и технология комплексного пробиотического препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» в виде сухой биомассы во флаконах. В рамках доклинической оценки биологической активности препарата выявлены его преимущества по сравнению с таковой аналогов (лактобактерина, ацилакта). Определены методы контроля специфической активности, предусматривающие раздельный количественный учет колоний-образующих единиц каждого компонента бактериальной композиции. Создан метод получения сухой бактериальной массы с биологическими и технологическими свойствами, удовлетворяющими требованиям крупносерийного производства различных лекарственных форм лактосодержащих пробиотиков. Указанный метод использован, в технологии производства новой лекарственной формы лактобактерина - «Лактобактерин порошок». На основе разработанного способа стабилизации жидкой бактериальной культуры получены препарат «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», соответствующий требованиям Фармакопейной статьи, а также мазь с лактобактериями «Эмулакт» (Патент № 2183963 на изобретение РФ). Разработана нормативно-техническая документация на лактосодержащие препараты: Фармакопейная статья предприятия на препарат «Лактобактерин-БИЛС сухой», Фармакопейная статья предприятия на препарат «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», «Лактобактерин-БИЛС сухой», Фармакопейная статья предприятия на препарат «Лактобактерин порошок», Экспериментально-производственный регламент «Лактобактерин-БИЛС сухой», Изменение №1 к регламенту производства «Лактобактерин в свечах», Регламент производства «Лактобактерин порошок», Инструкция по

применению препарата «Лактобактсрин-БИЛС сухой», Инструкция по применению препарата «Лактобактерин порошок».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биологическая активность разработанного нового комплексного препарата на основе лактобактерий (Ь. plantarum 8P-A3, Ь. acidophilns К3Ш24) существенно превосходит таковую препаратов-аналогов (лактобактерина, ацилакта).

2. Для получения сухой биомассы лактобактерий пригодной для изготовления различных лекарственных форм пробиотических препаратов целесообразно использование ксеропротектора, содержащего сахарозу, обезжиренное молоко и аэросил.

3. При изготовлении мягких лекарственных форм лактобактерина целесообразно применение способа стабилизации бактериальной культуры основанного на использовании стабилизирующей системы, включающей поверхностно-активные вещества и вещества, входящие в состав мазевых или суппозиторных основ.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; Научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы», Пермь, 2000; Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003. Диссертационная работа апробирована на заседании- Научно-технического совета филиала ФГУП «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Полученные результаты исследования защищены 2 Патентами на изобретение РФ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 262 литературных источника, из них 172 отечественных и 90 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе научно-производственной лаборатории пробиотиков в соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер государственной регистрации 01.9.80 007822).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментальных исследованиях использовали производственные штаммы лактобактерий L acidophilus К3Ш24, L. acidophilus NKb L. acidophilus ЮОаш, применяемые при изготовлении препарата «Ацилакт сухой», а также производственные штаммы L fermentum 90T-C4 и L. plantarum 8P-A3, применяемые при изготовлении препарата «Лактобактерин сухой», полученные из коллекции специализированной лаборатории ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также препараты «Лактобактерин сухой», «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», «Ацилакт сухой» и экспериментальные серии нового пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой» производства «Пермского НПО «Биомед».

Изучение активности кислотообразования и определение количества жизнеспособных клеток в бактериальных культурах проводили регламентированными методами (ФС 42-0054-00, ФС 42-3946-00, ФС 42-3950-00) на средах МРС-1, МРС-2, МРС-4 и обезжиренном молоке. Антагонистическую активность производственных штаммов и препаратов проверяли методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде МРС-5 в отношении тест-штаммов, используемых для контроля антагонистической активности пробиотиков (ФС 42-0054-00); препараты дополнительно испытывали со штаммами, применяемыми при определении антимикробного действия лекарственных средств и ростовых свойств питательных сред (ГФ XI), а также с патогенными штаммами, выделенными из клинического материала в лечебных учреждениях г.Перми, предоставленными отделением бактериофагов «Пермского НПО «Биомед». Анализ чувствительности лактобактерий к биологическим жидкостям (желудочный сок «Эквин» производства ГУЛ «Иммунопрепарат», Уфа; желчь медицинская консервированная производства ООО «Самсон-мед», С-Петербург), осуществляли путем определения колоний-образующих единиц (КОЕ) после 2 ч контакта. Антибиотикочувствительность проверяли методом диффузии в агар с использованием стандартного набора дисков с

антибиотиками: оксациллин, доксициклин, цефалексин, гентамицин, левомицстин, рифампицин, тетрациклин, канамицин, олеандомицин, стрептомицин, линкомицин (производства НИЦФ, С.-Петербург). Адгезивность бактериальных культур и препаратов изучали на модели эритроцитов человека О (I) Rh (+) по методике В.И. Брилис с соавт. (1986) и оценивали с помощью среднего показателя адгезии (СПА). Адгезивность считали низкой при СПА меньше 2, средней - от 2 до 4, высокой - свыше 4. Производственное культивирование лактобактерий проводили периодическим способом в реакторе с использованием казеиново-дрожжевой среды. Лиофильнос высушивание предварительно замороженных бактериальных культур осуществляли в сублиматоре ТГ-50 (Германия). При разработке технологии мягких лекарственных форм препаратов на основе лактобактерий использовали вспомогательные поверхностно-активные вещества (ПАВ), входящие в состав мазевых и суппозиторных основ, разрешенные к применению в фармацевтической промышленности. Сыпучесть порошков определяли по массовой скорости истечения (Вальтер, 1983) на приборе ВП-12А (Россия). Определение гигроскопичности образцов порошков проводили весовым методом: навеску порошка выдерживали в эксикаторе (100 % влажность) и вычисляли прирост поглощения влаги.

Математическую обработку данных осуществляли с использованием компьютерных программ Microsoft Excel for Windows 2000, Statistica for Windows, v 5.0. Использовались методы определения средних величин и доверительного интервала. Графическое оформление результатов осуществляли при помощи программы Microsoft Power point for Windows 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С целью создания нового комплексного препарата («Лактобактерин-БИЛС сухой») из известных производственных штаммов проводилось сравнительное изучение биологических и технологических свойств лактобактерий: L. plantarum 8P-A3, L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L acidophilus NKj.

Изучение кислотообразования производственных штаммов позволило выявить особенности динамики этого процесса в зависимости от питательного субстрата и видовой принадлежности бактериальных культур. Установлено, что все штаммы обладают высокой и сопоставимой активностью кислотообразования. По эффекту сквашивания молока (один из субстратов для определения активности кислотообразования) были

выявлены значительные различия в минимальных дозах инокулята у штаммов видов L. fermentum, L plantarum и L. acidophilus, что позволяет использовать указанный культуральный признак в качестве дифференциального (табл. 1).

Таблица 1.

Сквашивание молока лактобактериями

Штамм Разведение дозы инокулята (10s КОЕ)

lO"1 ю-2 Ю-3 Ю-4 ю-3 ю-6 Ю-7 10'8

L. acidophilus ЮОаш + + + + + + + ±

L. acidophilus NKi + + + + + + + ±

L. acidophilus К3Ш24 + + + + + + + ±

L. fermentum 90 T-C4 + + + + + ± - -

L. plantarum 8P-A3 + + + ± - • - -

Примечание.«+» - пробы, где произошло сквашивание молока.

Результаты изучения адгезии на модели человеческих эритроцитов показали низкую степень активности производственных штаммов лактобактерий (табл. 2). При сравнительной оценке не выявлено достоверной разницы между адгезивными свойствами штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4. Достоверных адгезивных отличий у штаммов внутри вида L acidophilus также не установлено, но даже в низком диапазоне адгезивности они уступают по данному признаку L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4 (р<0,05).

Таблица 2.

Адгезия лактобактерий

Штамм Показатель адгезивности, СПА Степень адгезивности

L. plantarum 8Р-АЗ 1,40±0,16 Низкая

L. fermentum 90 Т-С4 1,59±0,10 Низкая

L. acidophilus ЮОаш 0,82±0,13 Низкая

L. acidophilus NK| 0,88±0,10 Низкая

L. acidophilus К3Ш24 1,01±0,10 Низкая

Изучение устойчивости штаммов к биологическим жидкостям выявило высокую резистентность L plantarum 8P-A3 к желудочному соку и желчи (снижение КОЕ/мл не более чем на 1 порядок). Низкой устойчивостью обладали штаммы L. acidophilus ЮОаш и L. acidophilus NKj (снижение КОЕ/мл на 3-6 порядков), штамм L. acidophilus К3Ш24 среди представителей данного вида проявил большую резистентность (снижение КОЕ/мл на 2-5 порядков). Промежуточную устойчивость показал штамм L.fermentum 90T-C4 (снижение КОЕ/мл на 1-2 порядка).

По данным сравнительного исследования антагонистической активности штаммов установлено, что наибольшей активностью обладают штаммы L. fermentum 90T-C4 и L plantarum 8P-A3. Лактобактерии вида L acidophilus слабее подавляли рост тест-штаммов (р<0,01), внутри вида достоверных различий по данному признаку не выявлено.

Штаммы вида L. acidophilus проявили чувствительность к следующим антибиотикам: оксациллин, доксициклин, цефалексин, гентамицин, левомицетин, рифампицин, тетрациклин, олеандомицин, стрептомицин, линкомицин. Устойчивыми штаммы данного вида оказались только к канамицину. Штаммы L. plantarum 8P-A3 и L. fermentum 90 Т-С4 обладали устойчивостью к выбранным антибиотикам, чувствительность проявили только в отношении левомицетина и рифампицина, а в отношении олеандомицина - промежуточную.

Результаты определения количества жизнеспособных клеток в сухой культуре штаммов после лиофилизации свидетельствуют, что по чувствительности к неблагоприятному воздействию данного фактора исследуемые образцы вполне сопоставимы, потеря жизнеспособных клеток составляла около 50 % (табл. 3), достоверных отличий не обнаружено. В процессе хранения сухих культур штаммов при температуре 4-8 °С в течение 12 мес количество живых клеток уменьшалось не более чем на 24%, достоверных отличий между количеством КОЕ у производственных штаммов после хранения также не обнаружено.

По уровню накопления биомассы при глубинном культивировании с использованием казеиново-дрожжевой среды выявлено преимущество штамма L. plantarum 8P-A3 по сравнению с другими штаммами (рис. 1). Накопление биомассы у трех штаммов L. acidophilus не имеет существенных различий, но значительно уступает штаммам L plantarum 8Р-АЗ и L fermentum 90 Т-С4.

Таблица 3.

Сохранение жизнеспособности лактобактерий при лиофилизацни и в процессе хранения сухой культуры

Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/мл

Штаммы До лиофилиза- После лиофилиза- Потери, % После 18 мес Потери, %

цни цни хранения

L. plantarum 8Р-АЗ (16,8011,067) xlO9 (8,2510,276) xlO' 50,212,9 (6,9310,346) хЮ9 16,012,9

L. fermentum 90 Т-С4 (14,8010,860) xlO9 (7,0610,339) xlO9 51,812,7 (5,8710,319) хЮ9 16,812,2

L. acidophilus. NK, (7,14±1,053) xlO8 (4,2911,022) xlO8 40,617,9 (3,5610,693) хЮ8 13,913,9

L. acidophilus. ЮОаш (4,2011,700) xlO8 (2,7911,370) xlO8 39,216,9 (2,1611,031) хЮ8 20,310,9

L. acidophilus. K3UI24 (7,8011,855) xlO8 (4,0910,984) xlO8 47,511,1 (3,4310,735) хЮ8 14,512,8

Время культивирования, ч Рис. 1. Накопление биомассы штаммов

Анализ совокупности биологических и технологических свойств исследованных штаммов лактобактерий, а также исходные требования позволили определить перспективные в производственном отношении двухкомпонентные бактериальные композиции: L plantarum 8P-A3 и L. acidophilus NKj/ L plantarum 8P-A3 и L acidophilus К3Ш24; L. plantarum 8P-A3 и L. acidophilus ЮОаш.

Уровень совместимости штаммов в указанных композициях изучался с помощью гомоантагонизма в тесте отсроченного антагонизма (табл. 4). Наименьшая зона задержки роста тест-штамма L. plantarum 8P-A3 была к L acidophilus К3Ш24, достоверно сопоставимая с ней - к L acidophilus ЮОаш. Штамм L. plantarum 8P-A3 более выражено подавляет рост штаммов L acidophilus NKj и L. acidophilus ЮОаш по сравнению со штаммом L acidophilus К3Ш24 (р<0,001).

Таблица 4.

Гомоантагонизм лактобактерий

Испытуемые штаммы Зона задержки роста тест-штаммов, мм

L. plantarum L. fermentum L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus

8Р-АЗ 90 Т-С4 NK, ЮОаш КзШ24

L. plantarum 8Р-АЗ NB 19,50±0,84 23,8610,65 22,4310,42 16,9110,41

L. fermentum 90 Т-С4 19,33+0,51 ¡¡¡¡И 17,6010,36 21,8210,44 17,5710,56

L. acidophilus NK, 7,0010,26 7,90±0,34 ■■ 20,6010,51 15,41+0,51

L. acidophilus ЮОаш 4,50±0,29 7,0110,32 18,0310,71 ин 8,03Ю,85

L. acidophilus К3Ш24 4,4210,24 8,60+0,24 20,4110,51 19,4010,68 ЯН

С учетом изученных биологических и технологических характеристик производственных штаммов, а также показателей теста отсроченного антагонизма (гомоантагонизма) для создания нового комплексного препарата. «Лактобактерин-БИЛС сухой» была выбрана бактериальная композиция, включающая штаммы лактобактерий L. plantarum 8P-A3 и L acidophilus КзШ24-

Технология и методы контроля препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» на основе выбранной бактериальной композиции базируются

на регламентированных способах получения и контроле лактобактерина и ацилакта. В ходе разработки технологии был унифицирован процесс приготовления маточных культур штаммов лактобактерий. Предложено использовать питательную среду МРС-1 для трех последовательных пассажей каждого штамма. В результате сравнительного анализа качественных показателей маточных культур, изготовленных по регламентированной и предложенной технологии, были получены сопоставимые результаты, достоверные отличия не наблюдались. Разработанный способ получения маточных культур позволяет упростить приемы работы, связанные с использованием различных питательных сред, а также исключить применение среды МРС-4 (L. plantarum 8Р-АЗ) и обезжиренного молока (L. acidophilus К3Ш2Д Также был модифицирован регламентированный способ накопления биомассы, включающий применение казеиново-дрожжевой среды, внесение углеводной добавки и коррекцию рН культуральной среды с помощью раствора аммиака. Модификация заключается в замене раствора глюкозы, стандартно применяемого в качестве углеводной добавки, на сахарозо-желатиновый (СЖ) раствор (среду) - основной компонент протективной среды для лиофилизации пробиотиков (табл. 5). Использование СЖ среды в качестве углеводной добавки позволило унифицировать рабочие растворы (вещества) для культивирования и лиофилизации.

Таблица 5.

Культивирование лактобактерий

Количество жизнеспособных клеток, Ig КОЕ/мл

Углеводная раздельное культивирование совместное культивирование

добавка L. acidophilus L. plantarum L. acidophilus L. plantarum

к3ш24 8Р-АЗ К3Ш24 8Р-АЗ

40 % раствор 9,21 ±0,28 10,17±0,07 8,30±0,6б 10,25±0,015

глюкозы

Среда СЖ 9,32±0,13 10,15+0,06 - -

Как видно из данных материалов, представленных в табл.5, в процессе совместного культивирования выбранных штаммов лактобактерий штамм Ь р1аМагит 8P-A3 достигает уровня накопления биомассы, сопоставимого с монокультурой, при этом показатель выживаемости ацидофильных лактобактерий уступает монокультуре в среднем на один

порядок. Поэтому в технологию препарата был включен метод раздельного культивирования штаммов.

Исходя из содержания жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в производственной культуре каждого штамма, а также из их терапевтически эффективной дозы, было определено количественное соотношение бактериальных взвесей при получении суспензии комплексного препарата, оно составило: две части взвеси L. acidophilns К3Ш24 и одну часть L plantation 8P-A3.

Для стандартизации комплексного препарата был разработан метод раздельного учета бактериальных составляющих композиции. Метод базируется на известных и широко применяемых методиках, их оригинальное сочетание и модернизация позволяют определять количественное содержание каждого штамма в препарате. Количество клеток штамма L. plantarum 8P-A3 достоверно определяется на среде МРС-2, присутствие штамма L acidophilus К3Ш24 не влияет на результат анализа, т.к. скорость роста, количество и морфология колоний имеют существенные различия. Количество жизнеспособных клеток штамма L. acidophilus К3Ш24 также достоверно определяется по эффекту сквашивания молока.

Сравнительное изучение биологических свойств лактобактерина-БИЛС и препаратов-аналогов (лактобактерина, ацилакта) выявило высокую активность нового пробиотика.

Таблица 6.

Адгезия лактосодержащих препаратов

Препараты Показатель адгезивности, С ПА Оценка адгезивности

Лактобактерин Ацилакт Лактобактерин-БИЛС 1,50±0,15 0,56+0,13 2,44±0,16 Низкая Низкая Средняя

Как видно из табл. 6 лактобактерин-БИЛС обладает более выраженной адгезией по сравнению с таковой у моновидовых аналогов (р<0,001). Это объясняется эффектом суммирования адгезивных свойств клеток в условиях бактериальной ассоциации. Ацилакт показал наименьшую адгезивную активность, которая обусловлена свойствами ацидофильных лактобактерий.

В результате сравнительного контроля антибиотикочувствитель-ности препаратов установлено, что лактобактерин-БИЛС и лактобактерин, в

отличие от ацилакта, имеют сопоставимо высокую устойчивость, что объясняется свойствами штаммов, входящих в состав препаратов.

Тест отсроченного антагонизма показал, что разработанный препарат обладает более высокими антагонистическими свойствами по отношению к различным патогенным и условно патогенным микроорганизмам (табл. 7). Его зоны подавления роста тест-штаммов достоверно отличаются от аналогичных зон воздействия препаратов сравнения (р<0,001).

При изучении устойчивости препаратов к биологическим жидкостям (желчи, желудочному соку) было выявлено снижение чувствительности к желудочному соку штамма L acidophilus К3Ш24, входящего в состав комплексного препарата, на один порядок. Вероятно, это связано с протективным действием культуралыюй жидкости штамма L plantarum 8P-A3, который отличается высокой резистентностью к неблагоприятному воздействию биологических жидкостей.

Также было показано, что по активности кислотообразования на различных питательных средах исследуемый препарат не уступает аналогам, превосходит лактобактерин при инкубации в обезжиренном молоке.

Таким образом, лактобактерин-БИЛС по совокупности исследованных параметров специфической активности превосходит моновидовые препараты-аналоги, что обусловлено его бактериальной композицией. Результаты исследований подтверждают эффективность сконструированной бактериальной композиции на основе известных, прошедших клиническое испытание и хорошо зарекомендовавших себя в практике здравоохранения производственных штаммов лактобактерий.

Положительные результаты изучения биологической активности препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» послужили основанием для оформления нормативно-технической документации (Фармакопейная статья предприятия, Экспериментально-производственный регламент, Инструкция по применению).

Экспериментально-производственные серии препарата прошли экспертизу в отделе биологического и технологического контроля филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» на соответствие параметрам качества с положительным результатом. Нормативно-техническая документация на препарат рассмотрена и одобрена на заседании научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».

Антагонистическая активность пробиотических препаратов

Таблица 7.

Зоны задержки роста тест-штаммов, используемых при контроле пробиотиков, мм

Препарат Б-Аехпеп 170 5. лоиие/ 177 6 5. /1ехпег1 337 Е. соИ 157 Р. ш^апя 177 Р. тмЫНя 249 5. аигеш 209

Лактобактерин Ацилакт Лактобактерин-БИЛС 26,81±0,39 15,87±0,41 36,50+0,93 26,92±0,39 16,10+0,42 37,8810,70 25,97±0,44 15,7310,28 33,5010,48 26.7810.43 15.2310.44 35,4110,37 26,2510,49 15,010,37 33,2510,67 2б,97Ю,43 15,1710,27 37,7510,81 24,9410,38 15,6010,42 33,12Ю,24

Зоны задержки роста тест-штаммов, используемых для определения антимикробного действия лекарственных средств и ростовых свойств питательных сред, мм

В. сегеш АТСС 10702 Е. соИ АТСС 25922 Р. aeruginosa АТСС 9027 5. аигеш АТСС 65-38-Р

Лактобактерин Ацилакт Лактобактерин-БИЛС 32,5011,08 15,5010,81 38,3310,92 30,8310,96 15,5011,12 35,5611,06 31,25Ю,75 12,6710,55 40,0510,47 27,6710,66 9,5110,32 35,5611,06

Зоны задержки роста тест-штаммов, выделенных из клинического материала, мм

5. /¡ехпеп За №652 5. НрЫтипит №619 К. рпеитотае № 154 Р. ткаЫНз №257 Е. соН №969 5. аигеш № 1655 ергс1егт1сИз № 159

Лактобактерин Лактобактерин- БИЛС 31,510,92 39,010,77 29,010,88 36,110,68 29,510,78 35,510,62 29,0Ю,82 36,110,93 28,510,74 38,410,65 27,510,98 36,310,77 27,510,76 33,410,61

Способ приготовления разработанного препарата защищен Патентом № 22005666 на изобретение РФ. В настоящее время образцы препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» проходит экспертную оценку в Государственном институте стандартизации и контроля им. Л.Л. Тарасевича (Москва).

Наличие различных лекарственных форм пробиотика повышает его конкурентоспособность среди аналогов, улучшая потребительские свойства. Разработка способов получения лактосодержащих препаратов в виде порошков, мазей, суппозиториев и др. включает необходимость решения ряда биологических и технологических задач, связанных с проблемой стабилизации и улучшения технологических свойств бактериальных культур.

Ввиду того, что лиофилизация для пробиотического производства является основным методом стабилизации, для приготовления различных лекарственных форм используют, как правило, лиофилизированную биомассу. Работа с ней сопряжена с рядом технологических трудностей, связанных с ее высокой влагосорбционной активностью и неудовлетворительной сыпучестью. Установлено, что технологические свойства сухой биомассы во многом зависят от состава ксеропротектора (табл. 8).

Таблица 8.

Влияние ксеропротекторов на сохранение жизнеспособности клеток и сыпучесть сухой биомассы штамма р1ап1агит 8Р-АЗ

№ варианта Компоненты защитной среды Параметры сухой биомассы

Обезжиренное молоко Сахароза Жела -тоза N3-КМЦ пвп Крахмал Количество жизнеспособ ных клеток, КОЕ/О,05г Сыпучесть, г/сек

1 + + + - - 9,38±0,02 зависает

2 + + - + - - 9,34±0,02 1,6±0,21

3 + + - - - + 9,37±0,03 1,5±0,32

4 + + - - + - 9,38+0,02 1,8±0,14

5 + + - - - - 9,37±0,03 2,1±0,16

В результате сравнительного анализа биологических и технологических свойств вариантов сухой биомассы лактобактерий,

полученных с помощью различных ксеропротекторов, было показано, что защитная среда без структурообразующего компонента обеспечивает удовлетворительный протективный эффект, технологические свойства сухой биомассы при этом незначительно улучшаются.

На основе варианта бактериальной суспензии №5 были приготовлены образцы, в состав которых дополнительно вошли вещества, применяемые в фармацевтической технологии для повышения сыпучести порошков. В результате контроля технологических и биологических параметров полученных вариантов определено, что аэросил значительно улучшает технологические свойства сухой биомассы, не снижая биологических (табл. 9). Измерение влагопоглощения в образцах с различным содержанием аэросила позволило определить диапазон оптимальных его концентраций, обеспечивающий необходимые биологические и технологические свойства сухой биомассы - 6 - 9 %.

Таблица 9.

Биологические и технологические свойства сухой биомассы лактобактсрий штамма £. р1апШгит 8Р-АЗ с аэросилом

Содержание аэросила, % Количество жизнеспособных клеток, КОЕ /0,05г Сыпучесть, г/сек

3 2,0x109 3,0±0,12

6 1,8x109 3,8±0,14

9 1,9x109 4,0±0,16

• 12 2,0x109 4,0±0,11

Таким образом, был подобран состав защитной среды для лиофилизации, позволяющий получать сухую биомассу лактобактерий с технологическими и биологическими свойствами, необходимыми для изготовления порошков, капсул и т.д. Разработанный состав ксеропротектора, содержащий молоко, сахар и аэросил, был использован в технологии препарата «Лактобактерин порошок».

В результате поиска альтернативных сублимации методов стабилизации бактериальных культур установлено, что мазевые и суппозиторные основы, а также отдельные вещества, входящие в их состав, оказывают стабилизирующее действие на бактериальные культуры, обеспечивая длительное сохранение жизнеспособных клеток.

Разработаны рецептура и технология перспективной в производственном отношении мази с лактобактерином. Также получены варианты суппозиториев на основе жидкого бактериального компонента,

сохраняющие необходимую биологическую (специфическую) активность в течение всего срока годности препарата (табл. 10). Данный способ стабилизации бактериальной культуры введен в технологию препарата «Лактобактерин, суппозитории вагинальные».

Таблица 10.

Жизнеспособность клеток лактобактерий в суппозиториях на основе жидкой культуры Ь. р1аШагит 8Р-АЗ

Стабилизирующая композиция Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/ суппозиторий

Исходное Через

3 мес 6 мес 9 мес 12 мес

СЖ, этиловый спирт 108 108 10s 107 107

СЖ, глицерин 108 108 108 107 ю7

ПВП, Na КМЦ 108 108 108 107 ю7

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что более полная реализация биологического потенциала известных производственных штаммов лактобактерий связана с разработкой комплексных пробиотических препаратов. Способ получения пробиотика должен включать его выпуск в виде различных лекарственных форм для повышения потребительских свойств препарата. Специфика технологии лекарственной формы пробиотика определяется способом стабилизации бактериальной культуры.

1. На основе сравнительного изучения совокупности биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий, применяемых при изготовлении лактобактерина и ацилакта, сконструирована бактериальная композиция для комплексного пробиотического препарата, включающая штаммы L. plantarum 8P-A3 и L. acidophilus К3Ш24.

2. Разработан оригинальный способ получения комплексного препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой», включающий унифицированный метод приготовления маточных культур и раздельное культивирование производственных штаммов. Предложен способ контроля специфической активности препарата, предусматривающий количественный учет каждого бактериального компонента композиции.

3. При изучении биологической активности комплексного препарата выявлены его преимущества по антагонистическим и адгезивным свойствам в сравнении с препаратами-аналогами: лактобактерином и ацилактом.

4. Впервые разработан состав ксеропротектора для лиофильного высушивания лактобактерий, позволяющий получать сухую биомассу бактерий с биологическими и технологическими свойствами, пригодными для изготовления различных лекарственных форм препаратов.

5. Разработан оригинальный способ получения мягких лекарственных форм (мазь, суппозитории) лактобактерина, включающий применение жидкой бактериальной культуры штамма Ь. р1аШагит 8Р-А3. Применение стабилизирующей системы, включающей вещества, входящие в состав мазевых и суппозиторных основ, обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток лактобактерий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Несчисляев В.А., Петров В.Ф., Молохова Е.И., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. Мазь «Эмулакт» для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных гинекологических заболеваний и дисбактериозов. Патент на изобретение РФ № 2183963. Заявка № 99117476. Приоритет изобретения 10.08.1999. Зарег. в Гос. реестре 27.06.2002.

2. Несчисляев В.А., Молохова Е.И., Фадеева И.В. Получение стабильной биомассы при изготовлении мягких лекарственных форм пробиотиков//В кн.: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: Матер. Юбилейной межвуз. научно-практ. конф. - Пермь, 2000. - С. 168.

3. Несчисляев ВА, Молохова Е.И., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. Мази на основе жидких бактериальных культур и кулътуральных жидкостей лактобацилл//В кн.: Человек и лекарство: Тез. докл. VII Рос. национального конгресса. - Москва, 2000. - С. 616.

4. Несчисляев ВА, Молохова Е.И., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. Стабилизация бактериальной биомассы при изготовлении мягких лекарственных форм лактобактерина//В кн.: Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Труды. Всеросс. конф. - Уфа, 2000. - С. 188-190.

5. Фадеева И.В., Несчисляев В.А. Экспериментальные материалы к разработке комплексного пробиотика на основе лактобактерий//Х1У Коми Республ. молодежная научн. конф/. Тез. докл. - Сыктывкар, 2000. - С. 114.

6. Несчисляев ВА, Фадеева И.В., Чистохина Л.П. К вопросу разработки лекарственных форм пробиотиков//В кн.: Актуальные вопросы разработки,

производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер, научно-практ. конф. - Томск, 2001. - С. 54-55.

7. Фадеева И.В. Разработка технологии комплексного препарата на основе лактобактерий//В кн.: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы: Матер. Межвуз. научно-практ. конф., посвященной 85-летию образования на Урале. - Пермь, 2001. - С. 137-138.

8. Поспелова В.В., Несчисляев В.А., Фадеева И.В., Ворошилина Н.Н., Чистохина Л.П., Канаева Е.Н. Лекарственные формы пробиотиков для местного применения, их разработка и перспективы исследованийУ/В кн.: Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования: Тез. докл. Междунар. научно-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой. - Москва, 2002. -СП.

9. Несчисляев ВА, Фадеева И.В., Арчакова Е.Г. Исследование штаммосовместимости лактобактерий при разработке технологии комплексного пробиотика/ЛГам же. - С. 70.

10. Несчисляев В.А., Фадеева И.В. Способ получения лактобактерина. Патент на изобретение РФ № 22005666. Заявка № 2001121098. Приоритет изобретения 26.06.2001. Зарег. в Гос. реестре 20.03.2003.

11. Несчисляев В.А., Молохова Е.И., Фадеева И.В., Тодер П.В. Влияние ксеропротекторов на технологические свойства сухой биомассы лактобактерий//В кн.: Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер. Всеросс. научн. конф. - Пермь, 2003. - С. 268-270.

12. Фадеева И.В., Несчисляев В.А. Биологические свойства препарата лактобактерин-БИЛС/ЛГам же. - С. 277-280.

13. Несчисляев ВА, Фадеева И.В. Сравнительное изучение биологических свойств нового комплексного пробиотика и препаратов-аналогов/УПермский медицинский журнал. - 2004. - N. . - С.

ФАДЕЕВАИрина Валент иновна

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

АВТОРЕФЕРАТ

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99.

Подписано в печать 16.02.2004. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,5 Формат 60X90/16. Набор компьютерный. Заказ № 105/2004 Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113, т.(3422) 198-033

Содержание диссертации, кандидат биологических наук , Фадеева, Ирина Валентиновна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка комплексного пробиотического препарата на основе лактобактерий"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Фадеева, Ирина Валентиновна

Библиография Диссертация по биологии, кандидат биологических наук , Фадеева, Ирина Валентиновна, Пермь