Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка комплексного пробиотического препарата на основе лактобактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка комплексного пробиотического препарата на основе лактобактерий"

На правахрукописи

ФАДЕЕВА Ирина Валентиновна

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2004

Работа выполнена в лаборатории пробиотиков филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Несчисляев В.А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Горовиц Э.С. кандидат биологических наук, доцент Новоселова Г.Н.

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и иммунобиологических препаратов имени Л.А. Тарасевича, Москва.

Защита состоится ¿¿¿аЛю*. 2004 т.4на заседании

диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс:(3422)44-67-11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

чл.-корр. РАН Ившина И.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вследствие несбалансированного питания, дефицита витаминов, микроэлементов, приема антибактериальных препаратов, а также под действием все увеличивающегося загрязнения окружающей среды потенциально опасными для живых организмов химическими соединениями происходит разрушение эволюционно сложившихся естественных микробиоценозов человека. Поскольку частота распространения дисбактериоза пищеварительного тракта среди россиян по некоторым оценкам достигает 90 %, очевидно, насколько важны исследования, направленные на создание препаратов, восстанавливающих микроэкологический баланс в организме (Грачева и др., 1999; Шендеров, 2002). Важная роль в лечении и профилактике дисбактериозов отводится пробиотикам, содержащим представителей нормальной микрофлоры человека, в том числе лактобактерии (Гуськова, 1996; Горовиц и др., 1999; Каширская, 2000; Шендеров, 2002). Последние широко представлены на слизистых открытых окружающей среде полостей организма и в значительной степени определяют функционалыгую активность микробиоценозов данных биотопов (Воробьев, 1999; Raibaud, 1998). Лактобактерии являются постоянным объектом исследований в микробной экологии человека. Практическое использование их положительных свойств иллюстрируется многолетним опытом изготовления и применения отечественных биопрепаратов (лактобактерин, ацилакт, аципол). Фактором, ограничивающим специфическую активность указанных пробиотиков, является содержание бактерий одного вида. Повышение и расширение спектра биологической активности лактосодержащих пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые штаммы разных видов. Создание препаратов многовидового микробного состава является наиболее перспективным подходом к бактериотерапии (Чупринина и др., 1998; Шендеров, 2001). Указанное направление исследований предполагает реализацию потенциала известных производственных штаммов лактобактерии - Lactobacillus plantarum 8P-A3, L fermentum 90T-C4, L. acidophilns К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L. acidophilusNKi.

Клинические исследования открывают новые стороны позитивного воздействия лактосодержащих препаратов на физическое состояние человека. Это позволяет расширять сферу их применения (акушерство и гинекология, стоматология, дерматология

I вИБЛИОТЕКА |

необходимость создания лекарственных форм, адекватных новым способам аппликации и требованиям к потребительским свойствам препаратов (суппозитории, мази, кремы, порошки, капсулы, таблетки) (Поспелова и др., 1988). Исследования, направленные на разработку и усовершенствование технологий указанных фармакопейных форм препаратов на основе живых лактобактерий, являются актуальными для производства пробиотиков.

Цель настоящего исследования - изучение и реализация биологического и технологического потенциала известных производственных штаммов лактобактерий при конструировании комплексного пробиотического препарата.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительное изучение биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий, используемых для изготовления отечественных лактосодержащих пробиотиков.

2. Сконструировать бактериальную композицию комплексного препарата с учетом совместимости и анализа совокупности биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий.

3. Разработать способ получения комплексного препарата и методы контроля его специфической активности.

4. Исследовать in vitro биологическую активность комплексного препарата в сравнении с аналогами.

5. Изучить возможность и особенности использования различных способов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм лактосодержащих пробиотиков.

Научная новизна. На основе сравнительной оценки биологических и технологических свойств, а также с учетом совместимости производственных штаммов лактобактерий сконструирована бактериальная композиция и разработан способ получения комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой», обладающего высокой биологической активностью. Изучено влияние различных ксеропротекторов на биологические свойства лактобактерий и технологические параметры лиофилизированной биомассы. Разработан способ получения лиофилизированной биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления различных лекарственных форм (порошки, капсулы, мази, суппозитории и т.д.) пробиотиков, с использованием ксеропротектора, содержащего аэросил.

В качестве альтернативы лиофилизации разработан способ стабилизации жидкой бактериальной культуры Ь. р1аШагит 8P-A3, обеспечивающий длительное сохранение жизнеспособности клеток и пригодный для изготовления мягких лекарственных форм лактобактерина.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о биологических и технологических свойствах производственных штаммов лактобактерий, позволяют оптимизировать методические подходы при конструировании бактерийных композиций комплексных пробиотиков. Результаты исследований свидетельствуют о возможности использования различных способов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм пробиотиков. Установлена зависимость технологических свойств сухой лиофилизированной биомассы от состава защитной среды. Разработан и запатентован (Патент № 2200566 на изобретение РФ) состав и технология комплексного пробиотического препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» в виде сухой биомассы во флаконах. В рамках доклинической оценки биологической активности препарата выявлены его преимущества по сравнению с таковой аналогов (лактобактерина, ацилакта). Определены методы контроля специфической активности, предусматривающие раздельный количественный учет колоний-образующих единиц каждого компонента бактериальной композиции. Создан метод получения сухой бактериальной массы с биологическими и технологическими свойствами, удовлетворяющими требованиям крупносерийного производства различных лекарственных форм лактосодержащих пробиотиков. Указанный метод использован, в технологии производства новой лекарственной формы лактобактерина - «Лактобактерин порошок». На основе разработанного способа стабилизации жидкой бактериальной культуры получены препарат «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», соответствующий требованиям Фармакопейной статьи, а также мазь с лактобактериями «Эмулакт» (Патент № 2183963 на изобретение РФ). Разработана нормативно-техническая документация на лактосодержащие препараты: Фармакопейная статья предприятия на препарат «Лактобактерин-БИЛС сухой», Фармакопейная статья предприятия на препарат «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», «Лактобактерин-БИЛС сухой», Фармакопейная статья предприятия на препарат «Лактобактерин порошок», Экспериментально-производственный регламент «Лактобактерин-БИЛС сухой», Изменение №1 к регламенту производства «Лактобактерин в свечах», Регламент производства «Лактобактерин порошок», Инструкция по

применению препарата «Лактобактсрин-БИЛС сухой», Инструкция по применению препарата «Лактобактерин порошок».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биологическая активность разработанного нового комплексного препарата на основе лактобактерий (Ь. plantarum 8P-A3, Ь. acidophilns К3Ш24) существенно превосходит таковую препаратов-аналогов (лактобактерина, ацилакта).

2. Для получения сухой биомассы лактобактерий пригодной для изготовления различных лекарственных форм пробиотических препаратов целесообразно использование ксеропротектора, содержащего сахарозу, обезжиренное молоко и аэросил.

3. При изготовлении мягких лекарственных форм лактобактерина целесообразно применение способа стабилизации бактериальной культуры основанного на использовании стабилизирующей системы, включающей поверхностно-активные вещества и вещества, входящие в состав мазевых или суппозиторных основ.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; Научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы», Пермь, 2000; Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003. Диссертационная работа апробирована на заседании- Научно-технического совета филиала ФГУП «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Полученные результаты исследования защищены 2 Патентами на изобретение РФ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 262 литературных источника, из них 172 отечественных и 90 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе научно-производственной лаборатории пробиотиков в соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер государственной регистрации 01.9.80 007822).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментальных исследованиях использовали производственные штаммы лактобактерий L acidophilus К3Ш24, L. acidophilus NKb L. acidophilus ЮОаш, применяемые при изготовлении препарата «Ацилакт сухой», а также производственные штаммы L fermentum 90T-C4 и L. plantarum 8P-A3, применяемые при изготовлении препарата «Лактобактерин сухой», полученные из коллекции специализированной лаборатории ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также препараты «Лактобактерин сухой», «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», «Ацилакт сухой» и экспериментальные серии нового пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой» производства «Пермского НПО «Биомед».

Изучение активности кислотообразования и определение количества жизнеспособных клеток в бактериальных культурах проводили регламентированными методами (ФС 42-0054-00, ФС 42-3946-00, ФС 42-3950-00) на средах МРС-1, МРС-2, МРС-4 и обезжиренном молоке. Антагонистическую активность производственных штаммов и препаратов проверяли методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде МРС-5 в отношении тест-штаммов, используемых для контроля антагонистической активности пробиотиков (ФС 42-0054-00); препараты дополнительно испытывали со штаммами, применяемыми при определении антимикробного действия лекарственных средств и ростовых свойств питательных сред (ГФ XI), а также с патогенными штаммами, выделенными из клинического материала в лечебных учреждениях г.Перми, предоставленными отделением бактериофагов «Пермского НПО «Биомед». Анализ чувствительности лактобактерий к биологическим жидкостям (желудочный сок «Эквин» производства ГУЛ «Иммунопрепарат», Уфа; желчь медицинская консервированная производства ООО «Самсон-мед», С-Петербург), осуществляли путем определения колоний-образующих единиц (КОЕ) после 2 ч контакта. Антибиотикочувствительность проверяли методом диффузии в агар с использованием стандартного набора дисков с

антибиотиками: оксациллин, доксициклин, цефалексин, гентамицин, левомицстин, рифампицин, тетрациклин, канамицин, олеандомицин, стрептомицин, линкомицин (производства НИЦФ, С.-Петербург). Адгезивность бактериальных культур и препаратов изучали на модели эритроцитов человека О (I) Rh (+) по методике В.И. Брилис с соавт. (1986) и оценивали с помощью среднего показателя адгезии (СПА). Адгезивность считали низкой при СПА меньше 2, средней - от 2 до 4, высокой - свыше 4. Производственное культивирование лактобактерий проводили периодическим способом в реакторе с использованием казеиново-дрожжевой среды. Лиофильнос высушивание предварительно замороженных бактериальных культур осуществляли в сублиматоре ТГ-50 (Германия). При разработке технологии мягких лекарственных форм препаратов на основе лактобактерий использовали вспомогательные поверхностно-активные вещества (ПАВ), входящие в состав мазевых и суппозиторных основ, разрешенные к применению в фармацевтической промышленности. Сыпучесть порошков определяли по массовой скорости истечения (Вальтер, 1983) на приборе ВП-12А (Россия). Определение гигроскопичности образцов порошков проводили весовым методом: навеску порошка выдерживали в эксикаторе (100 % влажность) и вычисляли прирост поглощения влаги.

Математическую обработку данных осуществляли с использованием компьютерных программ Microsoft Excel for Windows 2000, Statistica for Windows, v 5.0. Использовались методы определения средних величин и доверительного интервала. Графическое оформление результатов осуществляли при помощи программы Microsoft Power point for Windows 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С целью создания нового комплексного препарата («Лактобактерин-БИЛС сухой») из известных производственных штаммов проводилось сравнительное изучение биологических и технологических свойств лактобактерий: L. plantarum 8P-A3, L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L acidophilus NKj.

Изучение кислотообразования производственных штаммов позволило выявить особенности динамики этого процесса в зависимости от питательного субстрата и видовой принадлежности бактериальных культур. Установлено, что все штаммы обладают высокой и сопоставимой активностью кислотообразования. По эффекту сквашивания молока (один из субстратов для определения активности кислотообразования) были

выявлены значительные различия в минимальных дозах инокулята у штаммов видов L. fermentum, L plantarum и L. acidophilus, что позволяет использовать указанный культуральный признак в качестве дифференциального (табл. 1).

Таблица 1.

Сквашивание молока лактобактериями

Штамм Разведение дозы инокулята (10s КОЕ)

lO"1 ю-2 Ю-3 Ю-4 ю-3 ю-6 Ю-7 10'8

L. acidophilus ЮОаш + + + + + + + ±

L. acidophilus NKi + + + + + + + ±

L. acidophilus К3Ш24 + + + + + + + ±

L. fermentum 90 T-C4 + + + + + ± - -

L. plantarum 8P-A3 + + + ± - • - -

Примечание.«+» - пробы, где произошло сквашивание молока.

Результаты изучения адгезии на модели человеческих эритроцитов показали низкую степень активности производственных штаммов лактобактерий (табл. 2). При сравнительной оценке не выявлено достоверной разницы между адгезивными свойствами штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4. Достоверных адгезивных отличий у штаммов внутри вида L acidophilus также не установлено, но даже в низком диапазоне адгезивности они уступают по данному признаку L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4 (р<0,05).

Таблица 2.

Адгезия лактобактерий

Штамм Показатель адгезивности, СПА Степень адгезивности

L. plantarum 8Р-АЗ 1,40±0,16 Низкая

L. fermentum 90 Т-С4 1,59±0,10 Низкая

L. acidophilus ЮОаш 0,82±0,13 Низкая

L. acidophilus NK| 0,88±0,10 Низкая

L. acidophilus К3Ш24 1,01±0,10 Низкая

Изучение устойчивости штаммов к биологическим жидкостям выявило высокую резистентность L plantarum 8P-A3 к желудочному соку и желчи (снижение КОЕ/мл не более чем на 1 порядок). Низкой устойчивостью обладали штаммы L. acidophilus ЮОаш и L. acidophilus NKj (снижение КОЕ/мл на 3-6 порядков), штамм L. acidophilus К3Ш24 среди представителей данного вида проявил большую резистентность (снижение КОЕ/мл на 2-5 порядков). Промежуточную устойчивость показал штамм L.fermentum 90T-C4 (снижение КОЕ/мл на 1-2 порядка).

По данным сравнительного исследования антагонистической активности штаммов установлено, что наибольшей активностью обладают штаммы L. fermentum 90T-C4 и L plantarum 8P-A3. Лактобактерии вида L acidophilus слабее подавляли рост тест-штаммов (р<0,01), внутри вида достоверных различий по данному признаку не выявлено.

Штаммы вида L. acidophilus проявили чувствительность к следующим антибиотикам: оксациллин, доксициклин, цефалексин, гентамицин, левомицетин, рифампицин, тетрациклин, олеандомицин, стрептомицин, линкомицин. Устойчивыми штаммы данного вида оказались только к канамицину. Штаммы L. plantarum 8P-A3 и L. fermentum 90 Т-С4 обладали устойчивостью к выбранным антибиотикам, чувствительность проявили только в отношении левомицетина и рифампицина, а в отношении олеандомицина - промежуточную.

Результаты определения количества жизнеспособных клеток в сухой культуре штаммов после лиофилизации свидетельствуют, что по чувствительности к неблагоприятному воздействию данного фактора исследуемые образцы вполне сопоставимы, потеря жизнеспособных клеток составляла около 50 % (табл. 3), достоверных отличий не обнаружено. В процессе хранения сухих культур штаммов при температуре 4-8 °С в течение 12 мес количество живых клеток уменьшалось не более чем на 24%, достоверных отличий между количеством КОЕ у производственных штаммов после хранения также не обнаружено.

По уровню накопления биомассы при глубинном культивировании с использованием казеиново-дрожжевой среды выявлено преимущество штамма L. plantarum 8P-A3 по сравнению с другими штаммами (рис. 1). Накопление биомассы у трех штаммов L. acidophilus не имеет существенных различий, но значительно уступает штаммам L plantarum 8Р-АЗ и L fermentum 90 Т-С4.

Таблица 3.

Сохранение жизнеспособности лактобактерий при лиофилизацни и в процессе хранения сухой культуры

Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/мл

Штаммы До лиофилиза- После лиофилиза- Потери, % После 18 мес Потери, %

цни цни хранения

L. plantarum 8Р-АЗ (16,8011,067) xlO9 (8,2510,276) xlO' 50,212,9 (6,9310,346) хЮ9 16,012,9

L. fermentum 90 Т-С4 (14,8010,860) xlO9 (7,0610,339) xlO9 51,812,7 (5,8710,319) хЮ9 16,812,2

L. acidophilus. NK, (7,14±1,053) xlO8 (4,2911,022) xlO8 40,617,9 (3,5610,693) хЮ8 13,913,9

L. acidophilus. ЮОаш (4,2011,700) xlO8 (2,7911,370) xlO8 39,216,9 (2,1611,031) хЮ8 20,310,9

L. acidophilus. K3UI24 (7,8011,855) xlO8 (4,0910,984) xlO8 47,511,1 (3,4310,735) хЮ8 14,512,8

Время культивирования, ч Рис. 1. Накопление биомассы штаммов

Анализ совокупности биологических и технологических свойств исследованных штаммов лактобактерий, а также исходные требования позволили определить перспективные в производственном отношении двухкомпонентные бактериальные композиции: L plantarum 8P-A3 и L. acidophilus NKj/ L plantarum 8P-A3 и L acidophilus К3Ш24; L. plantarum 8P-A3 и L. acidophilus ЮОаш.

Уровень совместимости штаммов в указанных композициях изучался с помощью гомоантагонизма в тесте отсроченного антагонизма (табл. 4). Наименьшая зона задержки роста тест-штамма L. plantarum 8P-A3 была к L acidophilus К3Ш24, достоверно сопоставимая с ней - к L acidophilus ЮОаш. Штамм L. plantarum 8P-A3 более выражено подавляет рост штаммов L acidophilus NKj и L. acidophilus ЮОаш по сравнению со штаммом L acidophilus К3Ш24 (р<0,001).

Таблица 4.

Гомоантагонизм лактобактерий

Испытуемые штаммы Зона задержки роста тест-штаммов, мм

L. plantarum L. fermentum L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus

8Р-АЗ 90 Т-С4 NK, ЮОаш КзШ24

L. plantarum 8Р-АЗ NB 19,50±0,84 23,8610,65 22,4310,42 16,9110,41

L. fermentum 90 Т-С4 19,33+0,51 ¡¡¡¡И 17,6010,36 21,8210,44 17,5710,56

L. acidophilus NK, 7,0010,26 7,90±0,34 ■■ 20,6010,51 15,41+0,51

L. acidophilus ЮОаш 4,50±0,29 7,0110,32 18,0310,71 ин 8,03Ю,85

L. acidophilus К3Ш24 4,4210,24 8,60+0,24 20,4110,51 19,4010,68 ЯН

С учетом изученных биологических и технологических характеристик производственных штаммов, а также показателей теста отсроченного антагонизма (гомоантагонизма) для создания нового комплексного препарата. «Лактобактерин-БИЛС сухой» была выбрана бактериальная композиция, включающая штаммы лактобактерий L. plantarum 8P-A3 и L acidophilus КзШ24-

Технология и методы контроля препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» на основе выбранной бактериальной композиции базируются

на регламентированных способах получения и контроле лактобактерина и ацилакта. В ходе разработки технологии был унифицирован процесс приготовления маточных культур штаммов лактобактерий. Предложено использовать питательную среду МРС-1 для трех последовательных пассажей каждого штамма. В результате сравнительного анализа качественных показателей маточных культур, изготовленных по регламентированной и предложенной технологии, были получены сопоставимые результаты, достоверные отличия не наблюдались. Разработанный способ получения маточных культур позволяет упростить приемы работы, связанные с использованием различных питательных сред, а также исключить применение среды МРС-4 (L. plantarum 8Р-АЗ) и обезжиренного молока (L. acidophilus К3Ш2Д Также был модифицирован регламентированный способ накопления биомассы, включающий применение казеиново-дрожжевой среды, внесение углеводной добавки и коррекцию рН культуральной среды с помощью раствора аммиака. Модификация заключается в замене раствора глюкозы, стандартно применяемого в качестве углеводной добавки, на сахарозо-желатиновый (СЖ) раствор (среду) - основной компонент протективной среды для лиофилизации пробиотиков (табл. 5). Использование СЖ среды в качестве углеводной добавки позволило унифицировать рабочие растворы (вещества) для культивирования и лиофилизации.

Таблица 5.

Культивирование лактобактерий

Количество жизнеспособных клеток, Ig КОЕ/мл

Углеводная раздельное культивирование совместное культивирование

добавка L. acidophilus L. plantarum L. acidophilus L. plantarum

к3ш24 8Р-АЗ К3Ш24 8Р-АЗ

40 % раствор 9,21 ±0,28 10,17±0,07 8,30±0,6б 10,25±0,015

глюкозы

Среда СЖ 9,32±0,13 10,15+0,06 - -

Как видно из данных материалов, представленных в табл.5, в процессе совместного культивирования выбранных штаммов лактобактерий штамм Ь р1аМагит 8P-A3 достигает уровня накопления биомассы, сопоставимого с монокультурой, при этом показатель выживаемости ацидофильных лактобактерий уступает монокультуре в среднем на один

порядок. Поэтому в технологию препарата был включен метод раздельного культивирования штаммов.

Исходя из содержания жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в производственной культуре каждого штамма, а также из их терапевтически эффективной дозы, было определено количественное соотношение бактериальных взвесей при получении суспензии комплексного препарата, оно составило: две части взвеси L. acidophilns К3Ш24 и одну часть L plantation 8P-A3.

Для стандартизации комплексного препарата был разработан метод раздельного учета бактериальных составляющих композиции. Метод базируется на известных и широко применяемых методиках, их оригинальное сочетание и модернизация позволяют определять количественное содержание каждого штамма в препарате. Количество клеток штамма L. plantarum 8P-A3 достоверно определяется на среде МРС-2, присутствие штамма L acidophilus К3Ш24 не влияет на результат анализа, т.к. скорость роста, количество и морфология колоний имеют существенные различия. Количество жизнеспособных клеток штамма L. acidophilus К3Ш24 также достоверно определяется по эффекту сквашивания молока.

Сравнительное изучение биологических свойств лактобактерина-БИЛС и препаратов-аналогов (лактобактерина, ацилакта) выявило высокую активность нового пробиотика.

Таблица 6.

Адгезия лактосодержащих препаратов

Препараты Показатель адгезивности, С ПА Оценка адгезивности

Лактобактерин Ацилакт Лактобактерин-БИЛС 1,50±0,15 0,56+0,13 2,44±0,16 Низкая Низкая Средняя

Как видно из табл. 6 лактобактерин-БИЛС обладает более выраженной адгезией по сравнению с таковой у моновидовых аналогов (р<0,001). Это объясняется эффектом суммирования адгезивных свойств клеток в условиях бактериальной ассоциации. Ацилакт показал наименьшую адгезивную активность, которая обусловлена свойствами ацидофильных лактобактерий.

В результате сравнительного контроля антибиотикочувствитель-ности препаратов установлено, что лактобактерин-БИЛС и лактобактерин, в

отличие от ацилакта, имеют сопоставимо высокую устойчивость, что объясняется свойствами штаммов, входящих в состав препаратов.

Тест отсроченного антагонизма показал, что разработанный препарат обладает более высокими антагонистическими свойствами по отношению к различным патогенным и условно патогенным микроорганизмам (табл. 7). Его зоны подавления роста тест-штаммов достоверно отличаются от аналогичных зон воздействия препаратов сравнения (р<0,001).

При изучении устойчивости препаратов к биологическим жидкостям (желчи, желудочному соку) было выявлено снижение чувствительности к желудочному соку штамма L acidophilus К3Ш24, входящего в состав комплексного препарата, на один порядок. Вероятно, это связано с протективным действием культуралыюй жидкости штамма L plantarum 8P-A3, который отличается высокой резистентностью к неблагоприятному воздействию биологических жидкостей.

Также было показано, что по активности кислотообразования на различных питательных средах исследуемый препарат не уступает аналогам, превосходит лактобактерин при инкубации в обезжиренном молоке.

Таким образом, лактобактерин-БИЛС по совокупности исследованных параметров специфической активности превосходит моновидовые препараты-аналоги, что обусловлено его бактериальной композицией. Результаты исследований подтверждают эффективность сконструированной бактериальной композиции на основе известных, прошедших клиническое испытание и хорошо зарекомендовавших себя в практике здравоохранения производственных штаммов лактобактерий.

Положительные результаты изучения биологической активности препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» послужили основанием для оформления нормативно-технической документации (Фармакопейная статья предприятия, Экспериментально-производственный регламент, Инструкция по применению).

Экспериментально-производственные серии препарата прошли экспертизу в отделе биологического и технологического контроля филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» на соответствие параметрам качества с положительным результатом. Нормативно-техническая документация на препарат рассмотрена и одобрена на заседании научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».

Антагонистическая активность пробиотических препаратов

Таблица 7.

Зоны задержки роста тест-штаммов, используемых при контроле пробиотиков, мм

Препарат Б-Аехпеп 170 5. лоиие/ 177 6 5. /1ехпег1 337 Е. соИ 157 Р. ш^апя 177 Р. тмЫНя 249 5. аигеш 209

Лактобактерин Ацилакт Лактобактерин-БИЛС 26,81±0,39 15,87±0,41 36,50+0,93 26,92±0,39 16,10+0,42 37,8810,70 25,97±0,44 15,7310,28 33,5010,48 26.7810.43 15.2310.44 35,4110,37 26,2510,49 15,010,37 33,2510,67 2б,97Ю,43 15,1710,27 37,7510,81 24,9410,38 15,6010,42 33,12Ю,24

Зоны задержки роста тест-штаммов, используемых для определения антимикробного действия лекарственных средств и ростовых свойств питательных сред, мм

В. сегеш АТСС 10702 Е. соИ АТСС 25922 Р. aeruginosa АТСС 9027 5. аигеш АТСС 65-38-Р

Лактобактерин Ацилакт Лактобактерин-БИЛС 32,5011,08 15,5010,81 38,3310,92 30,8310,96 15,5011,12 35,5611,06 31,25Ю,75 12,6710,55 40,0510,47 27,6710,66 9,5110,32 35,5611,06

Зоны задержки роста тест-штаммов, выделенных из клинического материала, мм

5. /¡ехпеп За №652 5. НрЫтипит №619 К. рпеитотае № 154 Р. ткаЫНз №257 Е. соН №969 5. аигеш № 1655 ергс1егт1сИз № 159

Лактобактерин Лактобактерин- БИЛС 31,510,92 39,010,77 29,010,88 36,110,68 29,510,78 35,510,62 29,0Ю,82 36,110,93 28,510,74 38,410,65 27,510,98 36,310,77 27,510,76 33,410,61

Способ приготовления разработанного препарата защищен Патентом № 22005666 на изобретение РФ. В настоящее время образцы препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» проходит экспертную оценку в Государственном институте стандартизации и контроля им. Л.Л. Тарасевича (Москва).

Наличие различных лекарственных форм пробиотика повышает его конкурентоспособность среди аналогов, улучшая потребительские свойства. Разработка способов получения лактосодержащих препаратов в виде порошков, мазей, суппозиториев и др. включает необходимость решения ряда биологических и технологических задач, связанных с проблемой стабилизации и улучшения технологических свойств бактериальных культур.

Ввиду того, что лиофилизация для пробиотического производства является основным методом стабилизации, для приготовления различных лекарственных форм используют, как правило, лиофилизированную биомассу. Работа с ней сопряжена с рядом технологических трудностей, связанных с ее высокой влагосорбционной активностью и неудовлетворительной сыпучестью. Установлено, что технологические свойства сухой биомассы во многом зависят от состава ксеропротектора (табл. 8).

Таблица 8.

Влияние ксеропротекторов на сохранение жизнеспособности клеток и сыпучесть сухой биомассы штамма р1ап1агит 8Р-АЗ

№ варианта Компоненты защитной среды Параметры сухой биомассы

Обезжиренное молоко Сахароза Жела -тоза N3-КМЦ пвп Крахмал Количество жизнеспособ ных клеток, КОЕ/О,05г Сыпучесть, г/сек

1 + + + - - 9,38±0,02 зависает

2 + + - + - - 9,34±0,02 1,6±0,21

3 + + - - - + 9,37±0,03 1,5±0,32

4 + + - - + - 9,38+0,02 1,8±0,14

5 + + - - - - 9,37±0,03 2,1±0,16

В результате сравнительного анализа биологических и технологических свойств вариантов сухой биомассы лактобактерий,

полученных с помощью различных ксеропротекторов, было показано, что защитная среда без структурообразующего компонента обеспечивает удовлетворительный протективный эффект, технологические свойства сухой биомассы при этом незначительно улучшаются.

На основе варианта бактериальной суспензии №5 были приготовлены образцы, в состав которых дополнительно вошли вещества, применяемые в фармацевтической технологии для повышения сыпучести порошков. В результате контроля технологических и биологических параметров полученных вариантов определено, что аэросил значительно улучшает технологические свойства сухой биомассы, не снижая биологических (табл. 9). Измерение влагопоглощения в образцах с различным содержанием аэросила позволило определить диапазон оптимальных его концентраций, обеспечивающий необходимые биологические и технологические свойства сухой биомассы - 6 - 9 %.

Таблица 9.

Биологические и технологические свойства сухой биомассы лактобактсрий штамма £. р1апШгит 8Р-АЗ с аэросилом

Содержание аэросила, % Количество жизнеспособных клеток, КОЕ /0,05г Сыпучесть, г/сек

3 2,0x109 3,0±0,12

6 1,8x109 3,8±0,14

9 1,9x109 4,0±0,16

• 12 2,0x109 4,0±0,11

Таким образом, был подобран состав защитной среды для лиофилизации, позволяющий получать сухую биомассу лактобактерий с технологическими и биологическими свойствами, необходимыми для изготовления порошков, капсул и т.д. Разработанный состав ксеропротектора, содержащий молоко, сахар и аэросил, был использован в технологии препарата «Лактобактерин порошок».

В результате поиска альтернативных сублимации методов стабилизации бактериальных культур установлено, что мазевые и суппозиторные основы, а также отдельные вещества, входящие в их состав, оказывают стабилизирующее действие на бактериальные культуры, обеспечивая длительное сохранение жизнеспособных клеток.

Разработаны рецептура и технология перспективной в производственном отношении мази с лактобактерином. Также получены варианты суппозиториев на основе жидкого бактериального компонента,

сохраняющие необходимую биологическую (специфическую) активность в течение всего срока годности препарата (табл. 10). Данный способ стабилизации бактериальной культуры введен в технологию препарата «Лактобактерин, суппозитории вагинальные».

Таблица 10.

Жизнеспособность клеток лактобактерий в суппозиториях на основе жидкой культуры Ь. р1аШагит 8Р-АЗ

Стабилизирующая композиция Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/ суппозиторий

Исходное Через

3 мес 6 мес 9 мес 12 мес

СЖ, этиловый спирт 108 108 10s 107 107

СЖ, глицерин 108 108 108 107 ю7

ПВП, Na КМЦ 108 108 108 107 ю7

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что более полная реализация биологического потенциала известных производственных штаммов лактобактерий связана с разработкой комплексных пробиотических препаратов. Способ получения пробиотика должен включать его выпуск в виде различных лекарственных форм для повышения потребительских свойств препарата. Специфика технологии лекарственной формы пробиотика определяется способом стабилизации бактериальной культуры.

1. На основе сравнительного изучения совокупности биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий, применяемых при изготовлении лактобактерина и ацилакта, сконструирована бактериальная композиция для комплексного пробиотического препарата, включающая штаммы L. plantarum 8P-A3 и L. acidophilus К3Ш24.

2. Разработан оригинальный способ получения комплексного препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой», включающий унифицированный метод приготовления маточных культур и раздельное культивирование производственных штаммов. Предложен способ контроля специфической активности препарата, предусматривающий количественный учет каждого бактериального компонента композиции.

3. При изучении биологической активности комплексного препарата выявлены его преимущества по антагонистическим и адгезивным свойствам в сравнении с препаратами-аналогами: лактобактерином и ацилактом.

4. Впервые разработан состав ксеропротектора для лиофильного высушивания лактобактерий, позволяющий получать сухую биомассу бактерий с биологическими и технологическими свойствами, пригодными для изготовления различных лекарственных форм препаратов.

5. Разработан оригинальный способ получения мягких лекарственных форм (мазь, суппозитории) лактобактерина, включающий применение жидкой бактериальной культуры штамма Ь. р1аШагит 8Р-А3. Применение стабилизирующей системы, включающей вещества, входящие в состав мазевых и суппозиторных основ, обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток лактобактерий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Несчисляев В.А., Петров В.Ф., Молохова Е.И., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. Мазь «Эмулакт» для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных гинекологических заболеваний и дисбактериозов. Патент на изобретение РФ № 2183963. Заявка № 99117476. Приоритет изобретения 10.08.1999. Зарег. в Гос. реестре 27.06.2002.

2. Несчисляев В.А., Молохова Е.И., Фадеева И.В. Получение стабильной биомассы при изготовлении мягких лекарственных форм пробиотиков//В кн.: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: Матер. Юбилейной межвуз. научно-практ. конф. - Пермь, 2000. - С. 168.

3. Несчисляев ВА, Молохова Е.И., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. Мази на основе жидких бактериальных культур и кулътуральных жидкостей лактобацилл//В кн.: Человек и лекарство: Тез. докл. VII Рос. национального конгресса. - Москва, 2000. - С. 616.

4. Несчисляев ВА, Молохова Е.И., Фадеева И.В., Чистохина Л.П. Стабилизация бактериальной биомассы при изготовлении мягких лекарственных форм лактобактерина//В кн.: Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Труды. Всеросс. конф. - Уфа, 2000. - С. 188-190.

5. Фадеева И.В., Несчисляев В.А. Экспериментальные материалы к разработке комплексного пробиотика на основе лактобактерий//Х1У Коми Республ. молодежная научн. конф/. Тез. докл. - Сыктывкар, 2000. - С. 114.

6. Несчисляев ВА, Фадеева И.В., Чистохина Л.П. К вопросу разработки лекарственных форм пробиотиков//В кн.: Актуальные вопросы разработки,

производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер, научно-практ. конф. - Томск, 2001. - С. 54-55.

7. Фадеева И.В. Разработка технологии комплексного препарата на основе лактобактерий//В кн.: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы: Матер. Межвуз. научно-практ. конф., посвященной 85-летию образования на Урале. - Пермь, 2001. - С. 137-138.

8. Поспелова В.В., Несчисляев В.А., Фадеева И.В., Ворошилина Н.Н., Чистохина Л.П., Канаева Е.Н. Лекарственные формы пробиотиков для местного применения, их разработка и перспективы исследованийУ/В кн.: Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования: Тез. докл. Междунар. научно-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой. - Москва, 2002. -СП.

9. Несчисляев ВА, Фадеева И.В., Арчакова Е.Г. Исследование штаммосовместимости лактобактерий при разработке технологии комплексного пробиотика/ЛГам же. - С. 70.

10. Несчисляев В.А., Фадеева И.В. Способ получения лактобактерина. Патент на изобретение РФ № 22005666. Заявка № 2001121098. Приоритет изобретения 26.06.2001. Зарег. в Гос. реестре 20.03.2003.

11. Несчисляев В.А., Молохова Е.И., Фадеева И.В., Тодер П.В. Влияние ксеропротекторов на технологические свойства сухой биомассы лактобактерий//В кн.: Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер. Всеросс. научн. конф. - Пермь, 2003. - С. 268-270.

12. Фадеева И.В., Несчисляев В.А. Биологические свойства препарата лактобактерин-БИЛС/ЛГам же. - С. 277-280.

13. Несчисляев ВА, Фадеева И.В. Сравнительное изучение биологических свойств нового комплексного пробиотика и препаратов-аналогов/УПермский медицинский журнал. - 2004. - N. . - С.

ФАДЕЕВАИрина Валент иновна

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

АВТОРЕФЕРАТ

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99.

Подписано в печать 16.02.2004. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,5 Формат 60X90/16. Набор компьютерный. Заказ № 105/2004 Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113, т.(3422) 198-033

Содержание диссертации, кандидат биологических наук , Фадеева, Ирина Валентиновна

Введение

ГЛАВА 1. ЛАКТОБАКТЕРИИ КАК ПРЕДСТАВИТЕЛИ

НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЧЕЛОВЕКА И ОСНОВА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Значение и функции нормальной микрофлоры человека, 10 роль лактобактерий.

1.2. Пробиотики.

1.3. Лактобактерии как основа пробиотиков.

1.4. Технологические аспекты производства пробиотиков на основе лактобактерий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.:.

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ

И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ.

3.1. Биологические свойства штаммов.

3.1.1. Активность кислотообразования.

3.1.2. Адгезивные свойства штаммов.

3.1.3. Устойчивость лактобактерий к биологическим жидкостям.

3.1.4. Антагонистическая активность штаммов.

3.1.5. Антибиотикочувствительность штаммов лактобактерий.

3.2. Технологические свойства производственных штаммов.

3.2.1. Накопление биомассы лактобактерий при глубинном культивировании.

3.2.2. Устойчивость лактобактерий к лиофильному высушиванию и стабильность в процессе хранения сухой культуры.

3.3. Выбор состава бактериальной композиции.

ГЛАВА 4. ТЕХНОЛОГИЯ И МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ

КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА

ЛАКТОБАКТЕРИН - БИЛС СУХОЙ».

4.1. Разработка технологии комплексного препарата.

4.1.1. Приготовление маточной культуры.

4.1.2. Реакторное культивирование лактобактерий.

4.1.3. Получение бактериальной суспензии.

4.1.4. Лиофильное высушивание.

4.2. Методы контроля специфической активности комплексного препарата.

4.2.1. Определение количества жизнеспособных клеток в дозе препарата.

4.2.2. Определение активности кислотообразования.

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА ЛАКТОБАКТЕРИН

БИЛС И ПРЕПАРАТОВ-АНАЛОГОВ.

5.1. Активность кислотообразования препаратов.

5.2. Адгезивные свойства препаратов.

5.3. Антагонистическая активность препаратов.

5.4. Устойчивость препаратов к воздействию биологических жидкостей.

5.5. Антибиотикочувствительность препаратов.

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ

ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ.

6.1. Особенности получения сухой биомассы лактобактерий для изготовления порошков, капсул, мазей и суппозиториев.

6.2. Особенности получения мягких лекарственных форм пробиотиков.

6.2.1. Изучение влияния мазевых основ на стабильность бактериального компонента.

6.2.2. Стабилизация бактериальной взвеси при изготовлении суппозиториев с лактобактериями.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка комплексного пробиотического препарата на основе лактобактерий"

Актуальность.

Вследствие несбалансированного питания, дефицита витаминов, микроэлементов, приема антибактериальных препаратов, а также под действием все увеличивающегося загрязнения окружающей среды потенциально опасными для живых организмов химическими соединениями происходит разрушение эволюционно сложившихся естественных микробиоценозов человека. Поскольку частота распространения дисбактериоза пищеварительного тракта среди россиян по некоторым оценкам достигает 90 %, очевидно, насколько важны исследования, направленные на создание препаратов, восстанавливающих микроэкологический баланс в организме (51,162).

Важная роль в лечении и профилактике дисбактериозов отводится пробиотикам, содержащим представителей нормальной микрофлоры человека, в том числе лактобактерии (164). Последние широко представлены на слизистых открытых окружающей среде полостей организма и в значительной степени определяют функциональную активность микробиоценозов данных биотопов (163). Лактобактерии являются постоянным объектом исследований в микробной экологии человека. Практическое использование их положительных свойств иллюстрируется многолетним опытом изготовления и применения отечественных биопрепаратов (лактобактерии, ацилакт, аципол). Клинические исследования открывают новые стороны позитивного воздействия этих препаратов на физическое и психологическое состояние человека, что позволяет расширять сферу их применения (117,118).

Основными направлениями прикладных исследований в области лактосодержащих пробиотиков являются: разработка новых препаратов с повышенной биологической активностью, новых лекарственных форм и оптимизация технологического процесса.

Эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в состав препаратов. Повышение и расширение спектра биологической активности лактосодержащих пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые и взаимодополняющие штаммы. Указанное направление исследований предполагает реализацию потенциала известных производственных штаммов лактобактерий: Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L. acidophilus NKj.

Расширение сфер применения пробиотиков (акушерство и гинекология, стоматология, дерматология и др.) определяет необходимость создания лекарственных форм, адекватных новым способам аппликации. Такие фармакопейные формы как суппозитории, мази, кремы, порошки, капсулы и таблетки с лактобактериями, востребованы на фармацевтическом рынке и позволяют улучшить потребительские свойства лактосодержащих пробиотиков, которые, как правило, традиционно выпускаются в виде сухой биомассы во флаконах (ампулах). Исследования, направленные на разработку и усовершенствование технологий указанных фармакопейных форм препаратов на основе живых лактобактерий, являются актуальными для производства пробиотиков.

Цель настоящего исследования — изучение и реализация биологического и технологического потенциала известных производственных штаммов лактобактерий при конструировании комплексного пробиотического препарата.

В соответствии с поставленной целью решались следующие основные задачи:

1. Провести сравнительное изучение биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий, используемых для изготовления отечественных лактосодержащих пробиотиков.

2. Сконструировать бактериальную композицию комплексного препарата с учетом совместимости и анализа совокупности биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий.

3. Разработать способ получения комплексного препарата и методы контроля его специфической активности.

4. Исследовать in vitro биологическую активность комплексного препарата в сравнении с аналогами.

5. Изучить возможность и особенности использования различных способов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм лактосодержащих пробиотиков.

Научная новизна исследований

На основе сравнительной оценки биологических и технологических свойств, а также с учетом совместимости производственных штаммов лактобактерий сконструирована бактериальная композиция и разработан способ получения комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой», обладающего высокой биологической активностью.

Изучено влияние различных ксеропротекторов на биологические свойства лактобактерий и технологические параметры лиофилизированной биомассы. Разработан способ получения лиофилизированной биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления различных лекарственных форм (порошки, капсулы, мази, суппозитории и т.д.) пробиотиков, с использованием ксеропротектора, содержащего аэросил.

В качестве альтернативы лиофилизации разработан способ стабилизации жидкой бактериальной культуры штамма L. plantarum 8Р-АЗ, обеспечивающий длительное сохранение жизнеспособности клеток и пригодный для изготовления мягких лекарственных форм лактобактерина.

Практическая значимость

Разработан состав и технология комплексного пробиотического препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» в виде сухой биомассы во флаконах. В рамках доклинической оценки биологической активности препарата выявлены его преимущества по сравнению с аналогами (лактобактерином, ацилактом). Определены методы контроля специфической активности, предусматривающие раздельный количественный учет колонии-образующих единиц каждого компонента бактериальной композиции.

Предложена технология получения сухой бактериальной массы с биологическими и технологическими свойствами, удовлетворяющими требованиям крупносерийного производства различных лекарственных форм лактосодержащих пробиотиков. Способ получения сухой бактериальной массы включен в технологию препарата «Лактобактерин порошок».

На основе разработанного способа стабилизации жидкой бактериальной культуры получен препарат «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», соответствующий требованиям Фармакопейной статьи. Указанная технология внедрена в производство. Также разработан состав и способ получения мази с лактобактериями - «Эмулакт», технология которой предусматривает использование разработанного способа стабилизации.

По результатам работы получены патенты на изобретения: 1. Патент № 2200566 на изобретение РФ «Способ получения лактобактерина», приоритет от 26.07.01 г.

2. Патент № 2183963 на изобретение РФ «Мазь «Эмулакт» для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных гинекологических заболеваний и дисбактериозов», приоритет от 10.08.99 г.

Результаты научной работы отражены в нормативной документации:

- ФСП «Лактобактерин-БИЛС сухой».

- ФСП «Лактобактерии, суппозитории вагинальные».

- ФСП «Лактобактерии порошок».

- Экспериментально-производственный регламент «Лактобактерин-БИЛС сухой».

- Изменение №1 к регламенту производства «Лактобактерии в свечах».

- Регламент производства «Лактобактерии порошок».

- Инструкция по применению препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой».

- Инструкция по применению препарата «Лактобактерии порошок».

Положения, выносимые на защиту

1. Биологическая активность разработанного нового комплексного препарата на основе лактобактерий (L. plantarum 8Р-АЗ, L. acidophilus К3Ш24) существенно превосходит таковую препаратов-аналогов (лактобактерина, ацилакта).

2. Для получения сухой биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления различных лекарственных форм пробиотических препаратов, целесообразно использование ксеропротектора, содержащего сахарозу, обезжиренное молоко и аэросил.

3. При изготовлении мягких лекарственных форм лактобактерина целесообразно применение способа стабилизации бактериальной культуры, основанного на использовании стабилизирующей системы, включающей поверхностно-активные вещества и вещества, входящие в состав мазевых или суппозиторных основ.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; Научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы», Пермь, 2000; Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003. Диссертационная работа апробирована на заседании Научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».

Публикации

По теме диссертации опубликовано И печатных работ. Полученные результаты исследования защищены 2 Патентами на изобретения РФ.

Объем и структура работы

Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 262 литературных источника, из них 172 отечественных и 90 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Фадеева, Ирина Валентиновна

1. На основе сравнительного изучения совокупности биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий, применяемых при изготовлении лактобактерина и ацилакта, сконструирована бактериальная композиция для комплексного пробиотического препарата, включающая штаммы L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24.

2. Разработан оригинальный способ получения комплексного препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой», включающий унифицированный метод приготовления маточных культур и раздельное культивирование производственных штаммов. Предложен способ контроля специфической активности препарата, предусматривающий количественный учет каждого бактериального компонента композиции.

3. При изучении биологической активности комплексного препарата выявлены его преимущества по антагонистическим и адгезивным свойствам в сравнении с препаратами-аналогами: лактобактерином и ацилактом.

4. Впервые разработан состав ксеропротектора для лиофильного высушивания лактобактерий, позволяющий получать сухую биомассу бактерий с биологическими и технологическими свойствами, пригодными для изготовления различных лекарственных форм препаратов.

5. Разработан оригинальный способ получения мягких лекарственных форм (мазь, суппозитории) лактобактерина, включающий применение жидкой бактериальной культуры штамма L. plantarum 8Р-АЗ. Применение стабилизирующей системы, включающей вещества, входящие в состав мазевых и суппозиторных основ, обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток лактобактерий.

Заключение

В связи с постоянным воздействием и увеличением числа факторов, вызывающих нарушение микробиоценоза человека, одной из актуальных задач остается обеспечение практического здравоохранения высокоэффективными и доступными препаратами - пробиотиками. Проводятся многочисленные исследования по изучению свойств облигатных представителей нормальной микрофлоры и определению возможности их использования в качестве исходных штаммов в производстве пробиотиков, создаются новые поколения пробиотических препаратов (164).

Лактобактерин в течение многих лет успешно применяют в качестве основы для конструирования лечебно-профилактических препаратов, используемых для коррекции дисбиотических состояний человека. Бактерии этого рода являются облигатными представителями нормальной микрофлоры и входят в состав биоценозов почти всех биотопов организма человека. Препараты с лактобактериями действуют на организм человека «мягко», не давая побочных эффектов, и не имеют противопоказаний для использования. Известная устойчивость лактобактерий к антибиотикам позволяет применять лактосодержащие препараты на фоне антибиотикотерапии (164, 169).

С целью повышения эффективности пробиотиков проводится поиск новых производственных штаммов лактобактерий для создания на их основе моно- и комплексных препаратов, включающих разные виды микроорганизмов, что расширяет диапазон их биологических свойств.

Штаммы лактобактерий, которые применяются в производстве пробиотических препаратов, должны отвечать определенному набору требований биологического и технологического характера (159). Выделение, изучение и доклиническая оценка безопасности нового штамма дорогостоящие и трудоемкие процессы. Известные производственные штаммы, входящие в состав отечественных лактосодержащих пробиотиков, таких как лактобактерии, ацилакт, аципол, доказали свою терапевтическую эффективность, что подтверждается многолетним опытом применения и расширением сферы использования указанных препаратов. По нашему мнению, перспектива более полной реализации биологического потенциала производственных штаммов лактобактерий связана с разработкой комплексных пробиотических препаратов, включающих сконструированные на их основе бактериальные композиции. Моновидовые пробиотики обладают ограниченными биологическими свойствами, обусловленными потенциалом одного вида бактерий, и уступают по терапевтической эффективности комплексным препаратам (3).

С целью создания нового комплексного препарата из известных производственных штаммов лактобактерий в нашей работе проводилось сравнительное изучение биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий: L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L. acidophilus NKj.

Исследование биологических свойств штаммов включало оценку активности кислотообразования, адгезивной активности, устойчивости к антибактериальному действию биологических жидкостей (желудочный сок, желчь), антагонистической активности и антибиотикочувствительности.

Изучение кислотообразования производственных штаммов позволило выявить особенности динамики этого процесса в зависимости от питательного субстрата и видовой принадлежности бактериальных культур. По эффекту сквашивания молока (субстрат для определения активности кислотообразования) выявлены значительные различия в дозах инокулята у штаммов видов L. fermentum, L. plantarum и L. acidophilus, что позволяет дифференцировать данные виды.

Результаты изучения адгезии на модели человеческих эритроцитов по методике В.И. Брилис с соавт. показали низкую степень активности производственных штаммов лактобактерий. При сравнительной оценке не выявлено достоверной разницы между адгезивными свойствами штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4. Достоверных адгезивных отличий у штаммов внутри вида L. acidophilus также не установлено. На используемой модели клеток, даже в низком диапазоне адгезивности, они уступают/,.plantarum 8Р-АЗ и L.fermentum 90 Т-С4 (р<0,05).

Изучение устойчивости штаммов к биологическим жидкостям выявило высокую резистентность L.plantarum 8Р-АЗ к желудочному соку и желчи. Штаммы вида L. acidophilus проявили меньшую устойчивость по сравнению с L. plantarum 8Р-А и L. fermentum 90 Т-С4. Отмечена более высокая устойчивость к воздействию биологических жидкостей штамма L. acidophilus К3Ш24 среди вида L. acidophilus.

Антагонистическую активность производственных штаммов лактобактерий определяли in vitro методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде МРС-5 в отношении стандартного набора тест-штаммов, используемых при контроле пробиотиков. Установлено, что наибольшей ингибирующей активностью обладали штаммы L. fermentum 90Т-С4 и

L. plantarum 8P-A3. Лактобактерии вида L. acidophilus слабее подавляли рост тест-штаммов (р<0,01), внутри вида достоверных различий по антагонистической активности не выявлено.

Пробиотик на основе живых бактерий, в состав которого входят штаммы, резистентные в отношении широкого круга антибиотиков, предпочтительнее для бактериотерапии. В связи с этим в нашей работе проводилось изучение антибиотикочувствительности лактобактерий к ряду препаратов, наиболее часто применяемых в лечебной практике, с помощью диско-диффузионного метода. Штаммы вида L. acidophilus проявили чувствительность почти ко всем использованным антибиотикам, кроме канамицина. Штаммы L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4 показали значительную устойчивость к выбранным антибиотикам, чувствительность проявили только в отношении левомицетина и рифампицина, а в отношении олеандомицина - промежуточную. В результате сравнительного изучения чувствительности бактериальных культур к антибиотикам производственные штаммы лактобактерий условно были разделены на две группы: устойчивых (L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4) и чувствительных (L. acidophilus). Внутри групп достоверных различий в чувствительности не обнаружено.

Изучение технологических свойств производственных штаммов включало определение уровня накопления биомассы при глубинном культивировании, устойчивости к лиофильному высушиванию и стабильности в процессе хранения.

По уровню накопления биомассы при глубинном культивировании с использованием казеиново-дрожжевой среды выявлено преимущество штамма L. plantarum 8Р-АЗ по сравнению с другими изучаемыми штаммами. Накопление биомассы у трех штаммов L. acidophilus не имеет существенных различий, но значительно уступает штаммам L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90 Т-С4.

Результаты определения количества жизнеспособных клеток в сухой культуре после лиофилизации свидетельствуют, что по чувствительности к неблагоприятному воздействию данного фактора исследуемые штаммы вполне сопоставимы, потеря жизнеспособных клеток составляла около 50 %. В процессе хранения сухих культур штаммов при температуре (6±2) °С количество живых клеток уменьшалось не более чем на 24 %.

Анализ совокупности биологических и технологических свойств исследованных штаммов лактобактерий, а также исходные требования к комплексному препарату позволили определить перспективные в производственном отношении двухкомпонентные бактериальные композиции:

- L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus NKj;

- L. plantarum 8P-A3 и L. acidophilus К3Ш24;

- L. plantarum 8P-A3 и L. acidophilus ЮОаш.

С помощью теста отсроченного гомоантагонизма на плотной питательной среде был изучен уровень совместимости штаммов в указанных композициях. По результатам анализа выбрана композиция, включающая штаммы L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24. Эти штаммы оказывают наименьшее ингибирующее влияние друг на друга по сравнению с другими вариантами композиций.

Т.о. была выбрана бактериальная композиция, состоящая из штаммов L. acidophilus К3Ш24 и L. plantarum 8Р-АЗ. Однако мы не исключаем возможность использования других композиций изучаемых производственных штаммов и, исходя из близких биологических свойств, можем предполагать сопоставимую терапевтическую эффективность препаратов на их основе.

Следующий этап нашей работы включал разработку способа получения комплексного препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» на основе выбранной бактериальной композиции и методов его контроля. В ходе разработки технологии комплексного препарата, базирующейся на основе регламентированных способов получения лактобактерина и ацилакта, был унифицирован процесс приготовления маточных культур штаммов лактобактерий. Предложено использовать питательную среду МРС-1 для трех последовательных пассажей каждого штамма. В результате сравнительного анализа качественных показателей маточных культур, изготовленных по регламентированной и предложенной технологии, были получены сопоставимые результаты, достоверные отличия не наблюдались. Данный способ получения маточных культур позволяет упростить приемы работы, связанные с использованием различных питательных сред, а также исключить применение среды МРС-4, МРС-2 (L. plantarum 8Р-АЗ) и обезжиренного молока (L. acidophilus К3Ш24).

С целью оптимизации реакторного метода накопления биомассы лактобактерий был модифицирован регламентированный способ, включающий применение казеиново-дрожжевой среды, периодическое внесение углеводной добавки и коррекцию рН культуральной среды с помощью раствора аммиака. Модификация заключается в замене раствора глюкозы, стандартно применяемого в качестве углеводной добавки, на сахарозо-желатиновый раствор -основной компонент протективной среды для лиофилизации.

Использование сахарозо-желатиновой среды в качестве углеводной добавки позволило унифицировать рабочие растворы (вещества) для культивирования и лиофилизации.

Была изучена возможность совместного культивирования выбранных штаммов лактобактерий. Установлено, что, развиваясь в ассоциации, штамм L. plantarum 8Р-АЗ достигает уровня накопления биомассы, достоверно сопоставимого с монокультурой, при этом показатель выживаемости ацидофильных лактобактерий уступает монокультуре в среднем на один порядок. Поэтому в технологию препарата был включен метод раздельного культивирования штаммов.

Исходя из содержания жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в производственной культуре каждого штамма, было определено количественное соотношение бактериальных взвесей при получении суспензии комплексного препарата, оно составило: две части взвеси L. acidophilus К3Ш24 и одну часть L. plantarum 8Р-АЗ.

Для лиофилизации комплексного препарата был успешно апробирован режим замораживания и высушивания, используемый в производстве лактобактерина и ацилакта. При получении препарата в виде сухой биомассы во флаконах в качестве защитной среды для высушивания бактериальной суспензии была использована сахарозо-желатино-молочная среда, применяемая в производстве лактобактерина и ацилакта.

Указанный способ получения комплексного препарата, включающий использование подобранной бактериальной композиции, признан изобретением.

Стандартизация препарата включала скрининг различных применяемых методов контроля пробиотиков и выбор наиболее подходящих. Методы контроля, применяемые при стандартизации лактобактерина сухого (исключая определение количества жизнеспособных клеток в дозе препарата), достоверно оценивали свойства лактобактерина-БИЛС, поэтому и были включены в НТД на новый препарат. Раздельный количественный учет бактериальных составляющих препарата был предусмотрен на этапе конструирования композиции, в его основу были положены существенные видовые отличия штаммов по характеру роста на питательных средах и по ферментативной активности. Штамм L. plantarum 8Р-АЗ достоверно обнаруживается в композиции с помощью стандартных методов контроля на средах МРС-2 и МРС-4, предусмотренными ФС на препараты «Лактобактерин сухой» и «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», присутствие штамма L. acidophilus К3Ш24 в данных условиях не обнаруживается и не влияет на результат анализа. Количество бактерий штамма L. acidophilus К3Ш24 в препарате можно определить методом, описанным в ФС на «Ацилакт сухой», по эффекту сквашивания обезжиренного молока. Присутствие штамма L. plantarum 8Р-АЗ на данной среде на результат анализа не влияет.

Поскольку препарат лактобактерин-БИЛС включает штаммы, применяемые при изготовлении препаратов лактобактерин и ацилакт, технологии данных препаратов также идентичны, поэтому при исследовании биологической активности нового пробиотика данные препараты были использованы для сравнения.

Проведено сравнительное изучение биологических свойств лактосодержащих препаратов: лактобактерина-БИЛС, лактобактерина и ацилакта.

Установлено, что лактобактерин-БИЛС обладает более выраженной адгезией по сравнению с аналогами, что можно объяснить эффектом суммации адгезивных свойств клеток, а также, возможно, конкуренцией за рецепторы для адгезинов микробов.

Исследования показали, что новый комплексный препарат обладает высокими антагонистическими свойствами по отношению к трем группам различных патогенных и условно патогенных микроорганизмов в тесте отсроченного антагонизма на плотной среде МРС-5. Лактобактерин-БИЛС давал более высокие зоны подавления роста тест-штаммов, достоверно отличающиеся от зон подавления препаратов сравнения (р<0,001).

По активности кислотообразования на различных питательных средах исследуемый препарат не уступает своим аналогам, превосходит лактобактерии при инкубации в обезжиренном молоке.

При изучении устойчивости препаратов к биологическим жидкостям (желчи, желудочному соку) было выявлено снижение (на один порядок) чувствительности к желудочному соку штамма L. acidophilus К3Ш24, входящего в состав комплексного препарата, по сравнению с монокультурой штамма. Это можно объяснить, вероятно, протективным действием культуральной жидкости штамма L. plantarum 8Р-АЗ.

Антибиотикочувствительность препаратов находится в аналогичном диапазоне чувствительности со штаммами, из которых они изготовлены. Лактобактерин-БИЛС и лактобактерии, в отличие от ацилакта, имеют сопоставимо высокую устойчивость к антибиотикам.

Таким образом, сравнительный анализ биологических свойств лактобактерина, ацилакта и лактобактерина-БИЛС показал преимущество последнего. Разработанный препарат обладает более широким спектром биологических свойств, обусловленным сочетанием штаммов разных видов. Высокая биологическая активность препарата, установленная с помощью экспериментов in vitro, предполагает высокую терапевтическую эффективность нового пробиотика.

Заключительный этап нашей работы включал разработку технологий различных лекарственных форм препаратов на основе лактобактерий.

Наличие различных лекарственных форм пробиотика повышает его конкурентоспособность среди аналогов, улучшая потребительские свойства. Процесс разработки технологии лактосодержащих препаратов в виде порошков, мазей, суппозиториев, таблеток, капсул и др., включает необходимость решения ряда биологических и технологических задач.

Поскольку лиофилизация для пробиотического производства является основным надежным методом стабилизации бактериальных культур, для приготовления различных лекарственных форм чаще используют именно лиофилизированную биомассу. Работа с ней сопряжена с рядом технологических трудностей, связанных с ее высокой влагосорбционной активностью и неудовлетворительной сыпучестью. Установлено, что технологические свойства сухой биомассы во многом зависят от состава ксеропротектора. В результате сравнительного анализа биологических и технологических свойств вариантов сухой биомассы лактобактерий, полученных с помощью различных ксеропротекторов, было показано, что защитная среда без структурообразующего компонента обеспечивает удовлетворительный протективный эффект, технологические свойства сухой биомассы при этом незначительно улучшаются. Введение в состав бактериальной суспензии аэросила значительно улучшает технологические свойства сухой биомассы. Образцы сухой биомассы с аэросилом обладали удовлетворительной сыпучестью и низкими показателями влагопоглощения. В исследованиях на модели штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24 был подобран состав защитной среды для лиофилизации, позволяющий получать сухую биомассу лактобактерий с технологическими и биологическими свойствами, необходимыми для изготовления порошков, капсул и т. д. Разработанный состав ксеропротектора был использован при разработке технологии препарата «Лактобактерии порошок».

Исключение сублимационной сушки из технологического процесса производства некоторых лекарственных форм пробиотиков предполагает снижение себестоимости и упрощение процесса изготовления препаратов. В работе была изучена возможность использования жидких бактериальных взвесей в производстве мягких лекарственных форм лактосодержащих препаратов, исключая сублимационное высушивание. Показано, что вещества, входящие в состав мазевых и суппозиторных основ, оказывают стабилизирующее действие на бактериальные культуры, обеспечивая длительное сохранение жизнеспособных клеток. Разработаны рецептура и технология перспективной в производственном отношении мази с лактобактерином. Мазевая основа, содержащая Na КМЦ, ПВП, глицерин и этиловый спирт, обеспечивала сохранение живых лактобактерий в течение всего срока хранения (12 мес.) на уровне (107 КОЕ/г), приемлемом для данной лекарственной формы и сопоставимом с вариантом на

7 8 основе сухой биомассы (10"° КОЕ/г).

Также было выявлено стабилизирующее влияние гидрофобных суппозиторных основ на бактериальную взвесь штамма L. plantarum 8Р-АЗ. Введение в суппозиторную массу взвеси лактобактерий, предварительно стабилизированной с помощью различных ПАВ (СЖ, этиловый спирт, глицерин, ПВП и NaKMLQ, позволило получить суппозитории, сохраняющие необходимую биологическую (специфическую) активность в течение всего срока годности препарата. Данный способ стабилизации бактериальной культуры введен в технологию препарата «Лактобактерин, суппозитории вагинальные».

При апробации влияния перспективных стабилизирующих композиций на бактерии штамма L. acidophilus К3Ш24 также выявлен их защитный эффект, но недостаточный для применения в производстве. Подбор стабилизирующей композиции для сохранения жизнеспособности клеток в мягких лекарственных формах необходимо проводить индивидуально для каждого вида и штамма лактобактерий. Выживаемость микроорганизмов в стабилизированных жидких бактериальных взвесях существенно зависит от свойств и концентраций стабилизаторов. Указанные данные свидетельствуют о перспективности и необходимости проведения дальнейших исследований в сфере разработки мягких лекарственных форм пробиотиков на основе жидких бактериальных взвесей.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что более полная реализация биологического потенциала известных производственных штаммов лактобактерий связана с разработкой комплексных пробиотических препаратов. Способ получения пробиотика должен включать его выпуск в виде различных лекарственных форм для повышения потребительских свойств препарата. Специфика технологии лекарственной формы пробиотика определяется способом стабилизации бактериальной культуры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидат биологических наук , Фадеева, Ирина Валентиновна, Пермь

1. Агамалян С.С. Эффективность лиофилизированного препарата «Нарине» при коррекции дисбактериозов / С.С. Агамалян, К.А Саркисян // Рос.ж. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1997. - N 6. - С .68-70.

2. Алмагамбетов К.Х. Транслокация кишечной микрофлоры и ее механизмы / К.Х. Алмагамбетов, Е.М. Горская, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. -1991.-N 10.-С. 74-79.

3. Алюшин М.Т. Аэросил и его применение в фармацевтической практике / М.Т. Алюшин, М.М. Астраханова //Фармация. 1968. - N 6. - С. 73-77.

4. Амерханова A.M. Разработка технологии получения сухой биомассы бифидобактерий распылительным методом обезвоживания / A.M. Амерханова,

5. Е.И. Астафьев, Н.А. Коновалов и др. // Пробиотические микроорганизмы -современное состояние вопроса и перспективы использования: Тез. докл. Междунар. научно-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой. Москва, 2002. - С. 67.

6. Амирова В.Р. Характеристика микрофлоры и антибиотикорезистентность микроорганизмов у новорожденных из групп высокого риска по внутриутробному инфицированию / В.Р. Амирова, Э.Н. Ахмадеева, З.Г. Габидуллин и др. // Педиатрия. 2000. - N 3. — С. 14-17.

7. Андреева Е.Ф. Некоторые особенности организации процесса сублимационного обезвоживания в стерильных условиях / Е.Ф. Андреева, И.И. Тарасова, И.П. Правдин // Оборудование и средства управления микробиологических производств. 1989.-Т. 2. Ч. 1.-С. 148-162.

8. Андрейчин М.А. Антимикробные свойства желчи и желчных кислот / М.А. Андрейчин //Антибиотики. 1980.- N 25 (12). - С. 936-939.

9. Анкирская А.С. Видовой состав и некоторые биологические свойства лактобацилл при различных состояниях микроэкологии влагалища / А.С. Анкирская, В.В. Муравьева // Акушерство и гинекол. 2000. - N 3. - С. 26-28.

10. Антонов С.Ф. Особенности сублимационной сушки лекарственных и диагностических препаратов в ампулах / С.Ф. Антонов, Г.И. Сигаев, Б.А. Никонова и др. // Биотехнология. 1998. - N 5. - С. 48-69.

11. Аркадьева З.А. Методы хранения культур микроорганизмов // Метаболизм микроорганизмов / З.А. Аркадьева; Под ред. Н.С. Егорова М.: Изд-во МГУ, 1986. - С. 57-64.

12. Бабин В.Н. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры / В.Н. Бабин, И.В. Домарадский, А.В. Дубинин // Журн. Рос. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1994. - Т. 38. - N 6. - С. 66-78.

13. Байбеков И.М. Взаимодействие индигенных пристеночных микроорганизмов с клетками слизистой оболочки пищеварительного тракта / И.М. Байбеков, Р.Ш. Мавлян-Ходжаев, Х.И. Ирсалиев // Арх. патол. 1992. — N 5(54).-С. 18-24.

14. Балтрашевич А.К. Способ определения чувствительности, анаэробных микроорганизмов к антибиотикам с использованием стандартных дисков / А.К. Балтрашевич, Т.П. Комаровская // Антибиотики. 1982. - N 8. - С. 32 - 36.

15. Бартенева Н.С. Взаимосвязь химической структуры и биологической активности эндотоксина грамотрицательных бактерий. Молекулярная и клеточная теория инфекционного иммунитета / Н.С. Бартенева. М., 1985. - С. 62-71.

16. Баснакьян И.А. Холодовой шок у бактерий / И.А. Баснакьян //Вестн. РАМН. 2001. - N 3. - С. 18-21.

17. Баснакьян И.А. Голодание бактерий. Стресс, обусловленный лимитом субстрата / И.А. Баснакьян, В.А. Мельникова // Ж. микробиол., эпидемиол., и иммунобиол. 2001. - № 1. - С. 99-103.

18. Беккер М.Е. Анабиоз микроорганизмов. / М.Е. Беккер, Б.Э. Дамберг, А.И. Раппопорт. Рига, 1981. - 253 с.

19. Белокрысенко С.С. Этиологическое значение, экология и генетические механизмы формирования госпитальных штаммов бактерий семейства Enterobacteriaceae: Автореф. дис. . докт. мед. наук / С.С. Белокрысенко. М., 1993.-42 с.

20. Беляев Е.И. Пути усовершенствования препаратов, нормализующих микрофлору кишечника / Е.И. Беляев // Аутофлора человека в норме и патологии и пути ее коррекции: Сб. науч. трудов. Горький, 1988. - С. 74 - 79.

21. Билибин А.Ф. Дисбактериоз, аутофлора и ее значение в патологии и клинике / А.Ф. Билибин // Клин. мед. 1970. - Т. 48. - N 2. - С. 7-12.

22. Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве // Сб. науч. тр. М., 1986. - 207 с.

23. Блохина И.Н. Дисбактериоз и его профилактика / И.Н. Блохина // Педиатрия. 1981. -N 10. - С.6-9.

24. Блохина И.Н. Дисбактериозы / И.Н. Блохина, В.Г. Дорофейчук. JL: Медицина, 1979. - 175с.

25. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно-патогенных бактериях / В.М. Бондаренко //Журн. микробиол. 1997. - N 4. - С. 20-26.

26. Бондаренко В.М. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков / В.М. Бондаренко, Э.И. Рубакова, В.А. Лаврова // Журн. микробиол. 1998. - N 5. - С. 107-112.

27. Бондаренко В.М. Дисбиоз. Современные возможности профилактики и лечения / В.М. Бондаренко, В.Ф. Учайкин, О.А. Мурашова. М., 1995. - 20 с.

28. Борелло С.П. Микрофлора, секреторная и моторная деятельность желудочно-кишечного тракта / С.П. Борелло. М.: Медицина, 1989. - С. 482492.

29. Брилис В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер // Лабораторное дело. 1986. - N 4. - С. 210-212.

30. Быков В.А. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов / В.А. Быков, И.А. Крылов, М.Н. Манаков // Биотехнология. М.,1987. - N 6 - 143 с.

31. Валышев А.В. Роль персистирующей условно патогенной микрофлоры кишечника при дисбиозе в возникновении заболеваний гепатобилиарной системы / А.В. Валышев, Ф.Г. Гильмутдинов // Журн. микробиол. 1997. - N 4. -С. 87-88.

32. Вальтер М.Б. Постадийный контроль в производстве таблеток / М.Б. Вальтер, О.Л. Тюненков, Н.А. Филипин. М.:Медицина, 1982. - 208 с.

33. Виестур У.Э. Культивирование микроорганизмов / У.Э. Виестур, М.Ж. Кристапсонс, Е.С. Былинкина. М., 1980. - 230 с.

34. Воробьев А.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины / А.А. Воробьев, Н.А. Абрамов, В.М. Бондаренко, Б.А. Шендеров // Дисбактериозы и эубиотики: Тез. докл. Всерос. научно-практ. конф. - М., 1996. - С. 42.

35. Воробьев А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова // Журн. микробиол.- 1999.-N6.-С. 102-105.

36. Воронина М.Н. Лактобацилы микрофлоры желудка человека. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Тарту, 1968. - 23 с.

37. ВФС 42-437 ВС -94 «Аципол сухой»

38. Высоцкий В.В. Биологическое значение и структурные основы адгезивных свойств микроорганизмов (обзор) / В.В. Высоцкий // Медицинские аспекты микробной экологии. М - Вып. 7 / 8 - 1993 / 1994. - Ч. I. - С. 42-52.

39. Гарасько Е.В. Микробная экология в норме и при патологии / Е.В. Гарасько // Вести. Иван. мед. акад. 2000. - 5, N 3-4. - С. 31-34.

40. Гольдина О.Д. К оценке направленных изменений среды обитания в понимании антагонизма лактобактерий / О.Д. Гольдина, Н.А. Соколова // Экология и популяционная генетика микроорганизмов. Свердловск, 1975. - С. 47-53.

41. Горовиц Э.С. Неспорообразующие аэробы в норме и патологии / Э.С. Горовиц, Т.И. Карпунина. Пермь, 1999. - 139 с.

42. Горская Е.М. Адгезия микробов к эпителиальным клеткам кишечника / Е.М. Горская // Антибиотики и микроэкология человека и животных. М., 1988.- С. 79 82.

43. Горская Е.М. Теоретические и прикладные аспекты изучения адгезии у слизистой оболочки пищеварительного тракта / Е.М. Горская // Медицинские аспекты микробной экологии. М., 1991. - С. 41 - 47.

44. Горская Е.М. Адгезивные свойства бактерий кишечного происхождения / Е.М. Горская, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер и др. //Ж. микробиол. 1991. - N 10.- С. 5 -8.

45. Горская Е.М. Связывание лактобацилл с некоторыми растворимыми белками и лектинами / Е.М. Горская, А.Ю. Лихачева, А.В. Горелов, В.М. Бондаренко, С.А. Касумова // Ж. Микробиол. 1994.- N 1. - С. 11-13.

46. Горская Е.М. Методические рекомендации по определению адгезии бактерий кишечного происхождения к эпителиальным клеткам тонкого и толстого кишечника / Е.М. Горская, И.М. Манохина, А.В. Горелов, В.В. Поспелова, Н.Г. Рахимова. М., 1989. - 7 с.

47. Грищенко В.А. Сравнительный анализ чувствительности к желчи энтеробактерий / В.А. Грищенко, Ю.А. Брудастов, Е.В. Кудря, Л.И. Васильева // Ж. микробиол., эпидемиологии и иммунобиологии. 2002. - N 3. - С. 65-67.

48. Гуськова Т.А. Дисбактериозы и эубиотики / Т.А. Гуськова, Т.В. Пушкина // Всеросс. научно-практич. конф.: Тез. докл. М., 1996. - С. 58 - 60.

49. Далин М.В. Адгезины микроорганизмов / М.В. Далин, Н.Г. Фиш // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. - Микроэкология. - 1985. - Т. 16. - 107 с.

50. Демина Л.С. Влияние высушивания на содержание нуклеиновых кислот и мутационные изменения у микроорганизмов / Л.С. Демина, С.В. Лысенко // Биол. Науки, 1989. N 5. - С. 87-95.

51. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов / К.Е. Долинов. -М.: Медицина, 1969. 230 с.

52. Дронова О.М. Современные методы определения чувствительности к антибактериальным препаратам анаэробных микроорганизмов / О.М. Дронова, Т.Р. Пономарева // Антибиотики и мед. биотехнология. 1985. - N 11. - С. 847 -849.

53. Евлашкина В.Ф. К вопросу об антагонистической активности штаммов лактобацилл ацидофилюс, входящих в состав аципола и ацилакта / В.Ф. Евлашкина, Р.П. Чупринина, Н.Ю. Абрикосова // Современная вакцинология: Тез. докл. конф. Пермь, 1998. - С. 143-144.

54. Евтухова JI.H. Восстановление жизнеспособности бактерий, поврежденных некоторыми физическими факторами: Автореф. дис. . канд. биол. наук / JI.H Евтухова.- М., 1969. 14 с.

55. Звягин И.В. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания — высушивания биологических препаратов / И.В. Звягин, И.А. Хорьков, Э.Ф. Токарик и др. М., 1981. - 34 с.

56. Звягинцев А.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями / А.Г Звягинцев. М.: МГУ., 1973. - 176 с.

57. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / Под ред. Д.Вудворда. -М., 1988.-215 с.

58. Исакова Д.М. Управление процессом культивирования молочнокислых бактерий в мембранном ферментаторе / Д.М. Исакова, А.Ю. Попов // Контроль и управление биотехнологическими процессами: Тез. Всесоюзной конф. — Горький, 1985.-С. 177-178.

59. Кардашева Е.В. Ингибиторы протеолитических ферментов, продуцируемых лактобациллами / Е.В. Кардашева, Е.М. Горская, С.В. Абрамова // Проблемы медицинской биотехнологии и иммунологии: Сб. мат. конф. МНИИЭМ им. Габричевского. М., 1996. - С. 113 - 118.

60. Карпунина JI.B. Изучение адгезивных свойств клеток Bacillus Polymixa и роль лектинов бацилл в адгезивном процессе / J1.B. Карпунина, У.Ю. Мельникова, Е.Ф. Соболева //Микробиология. 1999. -Т.68, N 4. - С. 445-448.

61. Карпунина Т.И. Повышение эффективности терапевтического действия пробиотиков / Т.И. Карпунина, Э.С. Горовиц, А.Н. Чиненкова, А.Я. Перевалов // Журн. микробиол. -1998. N 2. - С. 104-107.

62. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры / Н.Ю. Каширская // Рус. мед. ж. 2000. -8, 13-14. -С.572-575.

63. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и их использование / Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. М.: Наука. - 1975. - С. 23,290-359.

64. Кигель Н.Ф. Новый бактерийный препарат «АФ» на основе молочнокислых бактерий и его биологические свойства / Н.Ф. Кигель // Микробиол. ж. (Укр.)- 2000. 62, N 3. - С. 49-55.

65. Коваленко Н.К. Адгезия молочнокислых бактерий к эпителию кишечника сельскохозяйственных животных / Н.К. Коваленко, С.А. Касумова, Т.Н. Головач // Журн. микробиол. 1990. - N 3. - С. 76 - 79.

66. Коршунов В.М. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника /

67. B.М. Коршунов, Б.А. Ефимов, А.Р. Пикина // Журн. Микробиол. 2000. - N 31. C.86-91.

68. Коршунов В.М. Качественный состав нормальной микрофлоры кишечника у лиц различных возрастных групп / В.М. Коршунов, JI.B. Поташник, Б.А. Ефимов и др. // Журн. микробиол. 2001. - N 2. - 57 с.

69. Коршунов В.М. Микрофлора кишечника у детей Монголии, России и Швейцарии / В.М. Коршунов, JT.B. Поташник, Б.А. Ефимов и др. // Журн. микробиол. 2001. - N 2. - 57 с.

70. Красик JT.JI. Усовершенствование производства колибактерина и разработка нового экспериментального препарата из молочнокислых бактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ: Дис. . канд. мед. наук / JI.JI. Красик. 1972. - 240 с.

71. Куплетская М.Б., Аркадьева З.А. Методы длительного хранения коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Московского государственного университета / М.Б. Куплетская, З.А. Аркадьева // Микробиология. 1997. - Т. 66. N 2. - С. 283-288.

72. Курепина Н.Е. Микроцины: природа и генетическое детерминирование / Н.Е. Курепина, И.А. Хмель // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1986. - N 4. - С. 3-10.

73. Кушнарева М.В. Влияние нетилмицина, амикацина, цефтазидима и цефатаксима на адгезивные свойства микроорганизмов, выделенных у новорожденных детей / М.В. Кушнарева // Антибиотики и химиотерапия. -2000.-45, N7.-С. 17-21.

74. Куяров А.В. Колонизационная резистентность как показатель функциональных возможностей организма и коррекция ее нарушений: Автореф. дис. докт. мед. наук/ А.В. Куяров. -М.: Моск. мед. акад. 2000. -46 с.

75. Левков Л.А. Цитадгезия лактобацилл в условиях смешанных популяций / Л.А. Левков; Под. ред. И.Н. Блохиной. // Аутофлора человека в норме и патологии. Горький, 1988. - С. 64-70.

76. Ленцер А.А. К вопросу о холестеринлитической активности лактобацилл / А.А. Ленцер, А.А. Трошин // Успехи мед. науки: Тезисы докл. Тарту, 1986. -С. 125-126.

77. Ленцнер А.А. Лактобациллы микрофлоры человека: Автореф. дисс. . докт. мед. наук / А.А. Ленцнер. Тарту: Тартусский гос. ун-т, 1973 . - 69 с.

78. Ленцнер А.А. Биология лактобацилл микрофлоры человека / А.А. Ленцнер, Х.Т. Ленцнер, М.Э. Микельсаар // Актуальные проблемы теоретической медицины: Ученые записки Тартуского государственного университета. Тарту, 1982. - С. 52-63.

79. Ленцнер А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность / А.А. Ленцнер, Х.Т. Ленцнер, М.Э. Микельсаар и др. // Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. - 32. -N 3. - С. 173-179.

80. Ленцнер А.А. О количественном составе микрофлоры кала здоровых взрослых при обычном питании / А.А. Ленцнер, М.Э. Микельсаар, М.Н. Воронина // 16 научная сессия ин-та питания АМН СССР: Тез. докл. М., 1966. -С. 153-154.

81. Лопатина Т.К. Иммуномодулирующее действие препаратов эубиотиков / Т.К. Лопатина, М.С. Бляхер, В.Н. Николаенко, М.Н. Ниловский // Вестн. РАМН. - 1997. - N 3. - С. 30-33.

82. Лыкова Е.А. Антибактериальная резистентность штаммов, входящих в состав препаратов пробиотиков / Е.А. Лыкова // Микробиология. 2000. - N 2. -С. 63-66.

83. Метаболитическая взаимосвязь микрофлоры и эпителия влагалища. Методы лабораторной технологии / Под ред. Карпищенко. Л., 1948. - 398 с.

84. Микельсаар М.Э. Лактобациллы в микрофлоре кала человека при некоторых неинфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта: Автор, дис. канд. мед. наук / М.Э. Микельсаар. Тарту, 1969. - 39 с.

85. Минушкин О.И. Диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза и хронических заболеваний кишечника: метод. Рекомендации / О.И. Минушкин. -М., 1991.-35 с.

86. Минушкин О.И. Дисбактриоз кишечника / О.И. Минушкин, М.Д. Ардацкая, В.Н. Бабин и др. // Росс. мед. журн. 1999. - N 3. - С. 40 - 44.

87. Михайлова Т.Л. Биопрепараты и пищевые факторы в коррекции дисбиоза / Т.Л. Михайлова, Т.Ю. Калинская, В.Г. Румянцева // Росс. ж. гастроэнтерологии, гептологии, колопроктологии. 1999. - т. 8. - N 3. - С. 6770.

88. Молохова Е.И. Биофармацевтические аспекты пробиотиков / Е.И. Молохова // Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования: Тез. докл. Междунар. научно-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой. - М ., 2002. - С. 64.

89. Молохова Е.И. Разработка состава суппозиториев с лактобактерином / Е.И. Молохова, В.Н. Тарасевич, В.А. Несчисляев // Фармация. 1994. - N 2. - С. 28-30.

90. Морев С.И. Влияние яблочных пектинов на адгезивность и развитие микрофлоры кишечника человека / С.И. Морев, Е.В. Гарасько, О.А. Голубев, О.Ю. Кузнецов, Е.М. Зайцева, В.В. Зубков // Вестн. Иван. мед. акад. 2000. - 5, N3-4.-С. 39-43.

91. Мулюкин А.А. Сравнительное изучение элементарного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов / А.А. Мулюкин, В.В. Сорокин // Микробиология. 2002. - Т. 71, N 1. - С. 37-38.

92. Мурашова А.О. Бифидогенные факторы как лекарственные препараты / А.О. Мурашова, О.Б. Лисицин, Н.А. Абрамов // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999.-N 5. - С. 56-61.

93. Несчисляев В.А. Унификация технологии получения и контроля препаратов для бактериотерапии с использованием питательных сред из непищевого сырья: Дисс. .канд. мед. наук / В.А. Несчисляев 1989. -147 с.

94. Несчисляев В.А. Разработка способов стабилизации биомассы при изготовлении лекарственных форм лактобактерина / В.А. Несчисляев, Г.П. Вдовина, B.C. Пучнин и др. // Журн. микробиол. 1998. -N 2. - С. 102-104.

95. Озерецковский Н.А. Бактерийные, сывороточные и вирусные лечебно-профилактические препараты. Справочник практического врача / Н.А. Озерецковский, Г.И. Останина. СПб., 1998. - С. 135-154.

96. Опарин Ю.Г. Повреждение и защита биоматериалов при замораживании и лиофилизации / Ю.Г. Опарин // Биотехнология. 1996. -N 7. - С. 3-13.

97. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибактерина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля: Автореф. дис. .канд. биолог. Наук/ И.Г. Осипова. М., 1997.- 25 с.

98. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека / Л.Г. Перетц. М.: Медицина, 1965. - 280 с.

99. Петровская В.Г. Микрофлора человека в норме и патологии / В.Г. Петровская, О.П. Марко. М., 1976. - 217 с.

100. Пинегин Б.В. Дисбактериозы кишечника / Б.В. Пинегин, В.Н. Мальцев, В.М. Коршунов. М.: Медицина., 1984. - 144 с.

101. Пичхадзе Г.М. Антагонистическая активность эубиотика Максилин к раневой инфекции и его влияние на резистентность микроорганизмов к антибиотикам / Г.М. Пичхадзе, В.П. Русанов, В.Е. Новоселов // Стоматология. — М., 2000. 79, N 4. - С. 22-27.

102. Полищук Е.И., Колтукова Н.В. Выбор стабилизирующей среды для получения лиофилизированных живых культур возбудителей микозов / Е.И. Полищук, Н.В. Колтукова // Лаб. диагност. 1999. - N 4. - С. 29-33.

103. Половой A.M. Коэффициент чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, определяемый методом диффузии в агар с использованием дисков / A.M. Половой // Антибиотики и мед. биотехнологии. — 1985. N 11.-С. 843-845.

104. Поспелова В.В. Новые сферы применения микробных биопрепаратов для коррекции бактериоценоза организма человека / В.В. Поспелова, Н.Г. Рахимова, М.П. Халенева и др. // Иммунобиол. препараты. М., 1989. - С. 142-152.

105. Раппопорт А.И. Влияние сахарозы и лактозы на устойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae к обезвоживанию / А.И. Раппопорт, М.Е. Беккер // Микробиология. -1983. -Т. 52. Вып. 5. С. 719-722.

106. Ратникова И.А. Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий / И.А. Ратникова, Н.Н. Гаврилова, Н.Н. Колокова // Биотехнология. 1995. - N 5-6. - С. 19-20.

107. Рожкова И.Ю. Предпосылки к использованию лактобактерина на основе штамма Lactobacillus fermentum 90-TS-4 в гинекологической практике / И.Ю. Рожкова, Э.Г. Кравцов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1990. Т. 27. - N 2. - С. 234-236.

108. Руководство по вакцинному и сывороточному делу / Под ред. П.Н. Бургасова-М.: Медицина, 1978.-С. 45-153.

109. Серебрякова Е.В. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа / Е.В. Серебрякова, И.В. Дармов, Н.П. Медведев // Микробиология. 2002. - Т. 71, N 2. - С. 237-239.

110. Серов Г.Д. Исследование чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агаровых слоях / Г.Д. Серов, А.А. Сизов // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - N 3. - С. 38-40.

111. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур. Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы / Т.М. Сидякина. Пущино, 1991. - С. 81 -159.

112. Сидякина Т.М. Применение лиофилизации и криоконсервации для длительного хранения культур винных дрожжей / Т.М. Сидякина, З.Н. Кишковский, Е.В. Кузнецова, Т.А. Сахарова // Прикл. биохимия и микробиол. -1986.-22, N6.-С. 840-843.

113. Синицын А.П. Иммобилизованные клетки в биотехнологии / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, Г.П. Бачурина и др. Пущино, 1987. - С. 86-95.

114. Синицын А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. Изд. Московского университета, 1994. - 288 с.

115. Соколова К.Я. Дисбактериозы: теория и практика / К.Я. Соколова, И.В. Соловьева. Изд-во НГТУ, 1999.- 198 с.

116. Соколова Н.А. Некоторые вопросы экологии антагонизма лактобактерий / Н.А. Соколова, О.Д. Гольдина // Экология и популяционная генетика микроорганизмов. Свердловск, 1975. - С. 42-46.

117. Способ оценки чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам в диске: А.с. 2158926 Россия, MnK7G01 N33/48, C12N 1/18./ Е.Н. Мурысева, В.В. Плечев, С.Б. Лапиров, А.А. Евсюков, С.В. Шагарова, А.В Волгарев.

118. Способ получения биомассы бифидобактерий. А.с. 957909, СССР, МКИ А 61 К 35/74, С 12 N Уа/ Н.Г. Рахнимова, В.В. Поспелова, Н.Н. Ворошилина, Г.И. Ханина, А.Д. Беззубов, В.Г. Федосова, Ю.П. Кремлев, Ю.П. Чернецкий, Т.А. Кокорина.

119. Способ получения биомассы лакто-; коли или бифидобактерий. А.С. №2076722, СССР, МКИ 6 А 61К 35/74/ B.C. Пучнин, Н.Н. Чугунова, В.А. Несчисляев.

120. Способ получения пробиотика «Симблер-2» и способ производства с его использованием кисломолочного продукта: А.с. 97108832/13 Украина, МКИ 3 6

121. С 12 N 1/20, А 23 С9/12 / Д.С. Янковский, Г.С. Дымент, Е.П. Потребчук, Л.Д. Товкачевская (Украина).

122. Способ приготовления лечебной пасты из ацидофильного молока А. с. 321236 СССР / М.Р. Гибшман, А.Н. Хлебникова (СССР). 2 с.

123. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. - С. 170-172.

124. Степанчук Ю.Б. Кишечная микрофлора и метаболизм оксалатов: Автореф. дис. канд. мед. наук / Ю.Б. Степанчук. М., 1994. - 21 с.

125. Стоянова Л.Г. Сравнение способов хранения молочнокислых бактерий / Л.Г. Стоянова, З.А. Аркадьева // Микробиология. 2000. - 69, N 1. - С. 98-104.

126. Татаринцев А.В. Молекулярные механизмы межклеточных взаимодействий, опосредованные адгезивными белками и их рецепторами / А.В. Татаринцев, П.В. Вржиц, Д.Э. Ершов, С.Д. Варфоломеев // Вестник академ. мед. наук СССР. -1991. N 2. - С. 29-36.

127. Тюрин М.В. Устойчивость к антибиотикам лактобацилл, выделенных из кишечника здоровых людей / М.В. Тюрин // Антибиотики и химиотерапия. -1989. -Т. 34.-N9.-С. 716-718.

128. Тюрин М.В. К механизму антагонистической активности лактобацилл / М.В. Тюрин, Б.А. Шендеров, Н.Г. Рахимова и др. // Микробиология. 1989. - N 2. - С. 3-8.

129. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских целях / В.Ю. Урбах. М.: Медицина, 1975. - 235 с.

130. Файбич М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения / М.М. Файбич // ЖМЭИ. 1968, N 2. - С. 59-66.

131. Федоров А.Ю. Хранение штаммов промышленных микроорганизмов, включенных в полимерные матрицы / А.Ю. Федоров, Е.В. Волченко, И.Н. Сингирцев и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - том 36, N 1. - с. 59-67.

132. Федоровская Е.А. Взаимосвязь микробных экосистем и иммунитета человека / Е.А. Федоровская, JI.H. Немировская // Мжробюл. ж. 1999. - 61, N 5.-С. 85-96.

133. Физиология человека. М., 1996, Т.З - с. 287.

134. ФС 42 0054 - 00 «Лактобактерин сухой».

135. ФС 42-3946-00 «Ацилакт сухой».

136. ФС 42-3950-00 «Лактобактерин, суппозитории вагинальные».

137. Цагарешвили Г.В. Биофармацевтические, фармацевтические и технологические аспекты создания мягких лекарственных форм / Г.В. Цагарешвили, В.А. Головкин, Г.А. Грошовый. Тбилиси, 1987. - 261 с.

138. Чернякова В.И. Влияние желчи на интестинальные аэробные бактерии / В.И. Чернякова, Т.В. Смирнова // Врач. дело. 1978. - N 10. - С. 87-91.

139. Чупринина Р.П. Перспективы повышения качества препаратов -эубиотиков / Р.П. Чупринина, Н.К. Конькова, В.Ф. Евлашкина, А.В. Рыбачок // Современная вакцинология: Тез. докл. конф. Пермь, 1998. - С. 142

140. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса / С.А. Шевелева // Вопр. питания. 1999. - N 2. -С. 32-40.

141. Шендеров Б.А. Колонизационная резистентность и антимикробные препараты / Б.А. Шендеров // Антибиотики и колонизационная резистентность. 1990.-Т. 19.-С. 5-16.

142. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции / Б.А. Шендеров. М., 1998. - 287 с.

143. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. T.III: Пробиотики и функциональное питание / Б.А. Шендеров. М, 2001.-288 с.

144. Шендеров Б.А. Микроэкологическая токсикология: реальность, проблемы и перспективы / Б.А. Шендеров // Антибиотики и микроэкология человека и животных. М., 1988. - С. 3-7.

145. Шендеров Б.А. Микроэкологические аспекты функционального питания / Б.А. Шендеров, М.А. Манвелова // Медицинские аспекты микробной экологии. Выпуск 7/8. - 1993/1994. - Ч. I. - С. 10-19.

146. Шкарупета М.М. Влияние представителей нормальной микрофлоры и их компонентов на антиинфекционную резистентность: Автореф. дисс. . канд. мед. наук / М.М. Шкарупета. М., 1990. - 26 с.

147. Щербаков П.Л. Микробиоценоз кишечника: его нарушения и коррекция с использованием бактисубтила / П.Л. Щербаков, Л.В. Кудрявцева, С.В. Зайцева и др. // Педиатрия. 1998. - N 5. - С. 99-10.

148. Эйсфельд Д.А. Биологическая характеристика производственных штаммов лактобактерий. Дисс. .канд. биол. наук / Д.А. Эйсфельд. 2002. -129 с.

149. Юринова Г.В. Роль адгезии бактерий в колонизации слизистых оболочек организма (обзор) / Г.В. Юринова, В.И. Злобин, С.М. Попкова, Е.Л. Кичиргина //Бюл. СО РАМН. -2001.-N З.-С. 90-93, 121, 125.

150. Яковлева В.И. Иммобилизованные клетки в биотехнологии / В.И. Яковлева. Пущино, 1987.-С. 15-26.

151. Abrams G.D. Microbiological effects on mucous structure and function / G.D. Abrams // Amer. J. Med. Sci. Biol. 1982. - vol. 35.- N 3.

152. Alvarez-Olmos M.I. Probiotic agents and infectious diseases: A modern perspective on a traditional therapy / M.I. Alvarez-Olmos, R.A. Oberhelman // Clin. Infec. Diseases. 32 N 11. - P. 1567-1576.

153. Anderson R. The Significance and Potential Molecular Mechanisms of Gastrointestinal Barrier Homeostasis / R. Anderson // Scand. J. Gastroenterol.- 1997. -Vol. 32.-N1.- P. 1073-1083.

154. Aquirre M. Lactic acid bacteria and human clinical infection / M. Aquirre, M.D. Col ins // J. Appl. Bacterid.- 1993.- v.75.- P. 95-107.

155. Bengmark S. Econutrition and health maintenance a new concept to prevent G1 inflammation, ulceration and sepsis / S. Bengmark // Clin. Nutrition.- 1996.- Vol. 15.-P. 1-10.

156. Benno Y. Comparison of fecal microflora of elderly persons in rural and urban areas of Japan / Y. Benno, K. Endo, M. Takeo et al. // Apl. Environ. Microbiol.-1989.-N5.-P. 1100-1105.

157. Berg R.D. Bacterial translocation from the gastrointestinal tract immunologic aspects / R.D. Berg, K. Iton // Microecol. and Therapy. - 1986. - Vol. 14. - P. 117120.

158. Bibiloni R. Factors involved in adhesion of bifidobacterial strains to epithelial cells in culture / R. Bibiloni, P.F. Perez, G.L. De Antoni // Pap. Congr. Anaerob. Infec. Apr. 24-26, 1998. Buenos Aires: Anaerobe, 1999. - N 3-4. - P. 483-485.

159. Bos R. , van der Mei Henny C., Busscher Henk J. Physic-chemistry of initial microbial adhesive interactions its mechanisms and methods for study / R. Bos,

160. H.C. Van der Mei, H.J. Busscher // FEMS Microbiol. Rev. 1999. - N 2. - P. 179— 230.

161. Buncic S. Effects of gliconodeltalactone and Lactobacillus plantarum on production of histamine and tyramine in fermented sausaqes / S. Buncic, L. Paunovic, V. Teodorovic et al. // Int. J. Food Microbiol. 1993. - V. 17.

162. Casas I.A. Prebiotics, probiotics, antibiotics and autobiotics / I.A. Casas // Abstr. 13-th Int. Symp. Gnotobiol. June 19-24, 1999. Stockholm: Microb. Ecol. Health and Disease. - 1999. - N 2. - P. 108-109.

163. Chassy B.M. Gene Transfer and Advences in the Molecular Genetics of Lactobacilli / B.M. Chassy // 6th Intern. Symp. Lactic Acid Bacteria and Human Health. 1989, August 30, Seul, Publ. R&D Center, Korea Yakult Co., Ltd, 1998. P. 245-273.

164. Conway P.L. Protein-mediated adhesion of Lactobacilus fermentum trein 737 to mouse stomach squamous epithelium / P.L. Conway, S. Kjielleberg // J. Gen Microbiol. 1989. - 135. - N 5. - P. 1175-1186.

165. Corazza G.R. Non-absorbable antibiotics and small bowel bacterial overgrowth / G.R. Corazza, M. Sorge, A. Strocchi et al. // Ital. J. Gastroenterol. 1992, Nov-Dec. - 24 (9 Suppl. 2). - P. 4-9.

166. Corthier G. Effect of dietary factors on colonization resistance and colonization / G. Corthier, M.C. Bare, V.P. Nguyen // Microb. Ecol. Health and Disease. 2000. -N12, App. N 2. — P. 48-52.

167. C. De Simone. Effect of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus on gut mucosa and peripheral blood В limphocytes / C. De Simone, A. Ciardi, A. Grassi et al. // Immunopharmacol. Immunotoxicol. - 1982. - Vol. 14. - N 1. - P. 1-2.

168. Efiuwewere B.J.O. Mannitol enhanced survival of Lactococcus lactis subjected to drying / B.J.O. Efiuwewere, L.G.M. Gorris, E.J. Smid et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1999.- 51, N 1.- P. 100-104.

169. Faeth K.P. Investigation of the formation of amines by lactic acid bacteria / K.P. Faeth, F. Radler//Wein-Wissenschaft. 1994. - v. 49, N 1 - P. 11-16.

170. Farthing M.J.G. Bugs and guts: It's good to talk? / M.J.G. Farthing // J. Roy. Coll. Physicians London. 1999. - 33 N 3. - P. 267-275.

171. Fatton A. Hydrophobia as an adhesion mechanism of benthic cianobacteria / A. Fatton, M. Shilo // Appl. Environ. Microbiol., 1984. V. 47.N 1. - P. 135-143.

172. Finegold S.M. Normal indigenous intestinal microflora / S.M. Finegold, V.L. Sutter // In.: Human Intestinal Microflora in Health and Disease., D.J. Hentges (ed.), Academic Press, New York (USA). 1983. - P. 3-32.

173. Frank J.F. Mechanisms of pathogen inhibition by Lactic Acid Bacteria / J.F. Frank // 7th Intern. Symp. Lactic Acid Bacteria and Human Health. 1991, September, 12, Seul, Publ. R&D Center, Korea Yakult Co., Ltd, 1998. P. 293-300.

174. Freter R. Interdependence of mechanisms that control bacteria colonization of the large intestinal / R. Freter // Microbial, and Therapy. 1984. - Vol. 14. - P. 89-96.

175. Fuller R. Probiotics in human medicine / R. Fuller // Gut. 1991. 32 N 4. - P. 439-442.

176. Fuller R. Probiotics in man and animals / R. Fuller // J. Appl. Bacter. 1989. -66 N 5. - P. 365-378.

177. Fuller R. Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics / R. Fuller, G.R. Gibson // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - Vol. 32, suppl. 222. - P. 28-32.

178. Gallaher D.D. Probiotics, cecal microflora, and aberrant crypts in the rat colon / D.D. Gallaher, W.H. Stallings et al. // J. Nutr. 1996. - Vol. 126. - N 5. - P. 620-624.

179. Goldin B.R. The effect of milk and lactobacillus feeding on human intestinal bacterial enzyme activity / B.R. Goldin, S.L. Gorbach // Amer. J. din. Nutr. 1984. -Vol. 39.-N5.-P. 756-761.

180. Gorbach S. L. Lastic acid bacteria and Human Health / S. L. Gorbach // Ann. Med. 1990. - Vol. 22. - P. 37-41.

181. Gorbach S.L. Function of the normal human microflora / S.L. Gorbach // Scand. J. Infect. Dis. 1986. - 49 suppl. - P. 17-30.

182. Grunewald K.K. Serum cholesterol levels in rats fed fermented by Lactobacillus acidophillus / K.K. Grunewald // J. Food Sci. 1982 - Vol. 47. -P. 153157.

183. Guerina G.N. Mechanism of bacterial adherence / G.N. Guerina, M.R. Neutra // In.: IX Int. Symp. On Intestinal Microecology. Herborn-Dill. Germany. Sept. 17-18, 1984.-P. 183-185.

184. Guerin-Danan C. Microb. Storage of intestinal bacteria in samples frozen with glycerol / C. Guerin-Danan, C. Andrieux, O. Szylit // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999.- 11, N3.-P. 180-182.

185. Gupta P.K. Antagonic activity of Lactobacillus acidophilus fermented milk against different pathogenic bacteria / P.K. Gupta, B.K. Mital, S.K. Garg // Indian J.Exp. Biol. 1996. - 34, N 12. - P. 1245-1247.

186. Hartemink R. Degradation of xyloglucan by the intestinal microflora / R. Hartemink, A.K.C. Mertens, F.M. Rombouts // Abstr. World Congress Anaer. Bacteria and Infection. San Juan. Puerto Rico. - November 5-8, 1995. - P. 181-184.

187. Hentges D.J. The protective function of the indigenous intestinal flora / D.J. Hentges // Pediatr. Infect. Dis. 1986. -Vol. 5. - Suppl.l. - P. 17-20.

188. Hentges D.J. Intestinal flora in defense against infection / Hentges D.J. // In.: Human Intestinal Microflora in Health and Disease, Academic Press, New York (USA). 1983.-P. 309-319.

189. Holdeman L.V. Recent changes in identification and classification of some anaerobes / L.V. Holdeman, E.P. Cato, W.E.C. Moore // In: Anaerobic bacteria selected topics / Eds: D.W.Lambe et al. New York, 1980. - P. 25-38.

190. Ishikawa N. The effects of intestinal flora on the function of neutrophils / N. Ishikawa, M. Onda, K. Hurukawa et al. // J. Germfree Life Gnotobiol. 1989. - vol. 19.

191. Johnson J.L. Taxonomy of the Lactobacillus acidophilus group / J.L. Johnson, C.F. Phelps, C.S. Cummins et al. // Int. Y. system. Bact. 1980. - Vol. 30. - P. 53-68.

192. Kets E.P.W. Effect of carnitines on Lactobacillus plantarum subjected to osmotic stress / E.P.W. Kets, J.A.M. De Bont // FEMS Microbiology Letters. 146 (1997).-P. 205-209.

193. Klaenhammer T.R. Bacteriocins of lactic acid bacteria / T.R. Klaenhammer // Biochemie. -1988. Vol. 70. - P. 337-349.

194. Klaenhammer T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria / T.R. Klaenhammer// FEMS Microbiology Review. -1993. № 12.- P. 39-86.

195. Kunz R. Investigation into the mechanism of bacterial adhesion to hydrogel -coated surfaces / R. Kunz, C. Anders, L. Heinrich, K. Gersonde // Med. 1999. - 10, N10-11.-P. 649-652.

196. Lilly D.M. Probiotics: Growth promoting factors producend by microorganisms / D.M. Lilly, R.H. Stillwell // Science, 1965. v. 147, P. 747-748.

197. Lindgren S.E. Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and vegetables / S.E. Lindgren, W.J. Dobrogosz// FEMS Microbiol. Rev.-1990, v. 87. P. 149-164.

198. Luckey T.D. Intestinal microecology / T.D. Luckey // In.: Microocologie. des Magen - Darm - Kanals des Menchen. - Leipzig, 1982. - P. 18-36.

199. Lyons T.P. The probiotuc concept: coming of age / T.P. Lyons, R.Y. Fallon // Wold Biotech. Rept., 1986: Prec. Conf., San-Francisco, Nov. 1986. - 2. - P. 69 - 80.

200. Macfarlane G.T. Human Colonic Microbiota: ecology, physiology and metabolic protential of intestinal bacteria / G.T. Macfarlane, S. Macfarlane // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - Vol. 32, suppl. 222. - P. 3-10.

201. Mangell P. Lactobacillus plantarum 299v Inhibits Escherichia co/Mnduced Intestinal Permeability / P. Mangell, P. Nejdfors, M. Wang et al. // Digestive Diseases and Sciences. 2002. - N 47. - P. 511 -516.

202. Maura-Makinen A. The adherence of lactic acid bacteria to the columnar epithelial cells of pigs and calves / A. Maura-Makinen, M. Manninen, H. Gyllenberg // J. Appl. Bacterid. 1983. - 55. - N 2. - P. 241-245.

203. Mc Kay L.L. Applications for biotechnology: present and future improvements in lactic acid bacteria / L.L. Mc Kay, K.A. Baldwin // FEMS Microbiol. Rev., 1990, v. 87, P. 3-14.

204. Midtvedt T. Intestinal microflora associated characteristics / T. Midtvedt // Microecol. and Therapy. 1986. - Vol. 16. - P. 283-288.

205. Mitic S. Uniticai liofilizacije na transformaciju i digebistibinost aminoxiseli na simbiozebacterila Streptococcus thermophilus u Lactobacillus bulgarycus / S. Mitic, M. Cuperlovic // Hrana i iahrana. 1989. - Vol. 30. N 1. - P. 35-36.

206. Multiple bacteriocin producing Lactococcus and composition. Pat. US. 1994. № 5, 348, 881. C1.C12N 1/12,435/252.3; 435/252.4 / E.B. Vademuthu, J.T. Henderson, P.A. Vanderbergh.

207. Orhage K. Bifidobacteria and Lactobacilli in human health / K. Orhage, C.E. Nord // Drugs Exp. And Clin. Res. 2000. - 26, N 3. - P. 95-111.

208. Pathmakanthan S. Probiotics: A review of human studies to date and metodological approaches / S. Pathmakanthan, S. Meance, C.A. Edwards // Microb. Ecol. Health and Disease. 2000. - N 12/2 - P. 10-30.

209. Perdigon G. Systemic augmentation of the immune response in mice by feeding fermentation milks with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus / G. Perdigon, M.E. de Macias, S. Alvares et al. // Immunology. 1988. - Vol. 63. - N I. -P. 46-49.

210. Peterson W.L. The human gastric bactericidal barrier: Mechanisms of action, relative antibacterial activity, and dietary influences / W.L. Peterson, Ph.A. Mackrowiak, C.C. Barnett et al. // J. Biochem. 1987. - 31: 5 - 6. - P. 978 - 983.

211. Raibaud P. Critical Evaluation of the Role of Lactobacilli in Health / P. Raibaud // 3rd Intern. Symp.: Lactic Acid Bacteria and Human Health. 1983, August 26. Seul, Publ. R&D Center, Korea Yakult Co., Ltd, 1998. - P. 116-126.

212. Reid G. Lactobacillus inhibitor production against Escherichia coli and coaggregation ability with uropathogens / G. Reid, J.A. Mc Coarty, R. Andott, R.L. Cook // Can. J. Microb. 1988. - N 34. - P. 344 - 351.

213. Rolfe R.D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health / R.D. Rolfe // J. Nutrition. 2000. - v. 130, (2 S Suppl). - P. 396-402.

214. Rolfe R.D. Interactions among microorganisms of the indigenous intestinal flora and their influence on the host / R.D. Rolfe // Rev. Infect. Dis. 1984. - 6 N 1. -P. 273-279.

215. Samonis G. Prospective evaluation of effects of broad-spectrum antibiotics on gastrointestinal yeast colonization of humans / G. Samonis, A. Gikas, E.J. Anaissie et al. // Antimicrob. Agents chemother. 1993. - N 1. - P. 51-53.

216. Savage D.C. Microorganisms associated with epithelial surfaces and stability of the indigenous gastrointestinal microflora / D.C. Savage // Nahrung. 1987. - 31 N 56. - P. 383-395.

217. Savage D.C. Overview of the association of microbes with epithelial surfaces / D.C. Savage // Microbiol. Therapy. 1984 - Vol. 14. - P. 169-182.

218. Signe K. A study on growth characteristics and nutrient consumption of Lactobacillus plantarum in A-stat culture / K. Signe, L. Tiiu-Maie, P. Tarvo, P. Toomas // Antonie van Leeuwenhoek. 1999. - N 75 - P. 309-320.

219. Smith D.L. Animal antibiotic use has an early but important impact on the emergence of antibiotic resistance in human commensal bacteria / D.L. Smith, A.D. Harris, J.A. Jonson et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2002. - 99, N 9. - P. 64346439.

220. Strus M. In vitro antagoninistic effect of Lactobacillus on organisms associated with bacterial vaginosis / M. Strus, M. Malinowska, P.B. Heczko // J. Reprod. Med. -2002. 47, N 1.-P. 41-46.

221. Tahara T. Mode of action of acidocin 8912, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus TK 8912 / T. Tahara, M. Oshimura, K. Kanatani // Lett. Appl. Microbiol. -1996. V. 23. N 3. - P. 192-194.

222. Tannock G.W. Identification of lactobacilli and bifidobacteria / G.W. Tannock // In: Probiotics: a critical review 9ed. Wymondham (United Kingdom), Horizont Scientific press. 1999. - P. 45-56.

223. Tent W. Verfahren zur Herstellung von aktiver Trockenhefe mit verbessereter Stabillitat / W. Tent, L. Felstle, H. Boschelnen // Заявка 0167643, ЕПВ. МКИ С 12 N1/04, С 12 N1/18.

224. Todorov S. Influence of growth medium on bacteriocin production in Lactobacillus plantarum ST31 / S. Todorov, B. Gotcheva, X. Dousset et al. // Biotechnol. And Biotechnol. Equip. 2000. - 14, N 1. - P. 50-55.

225. Uhlenbruck G. Bacterial Lectins: Mediators of adhesion / G. Uhlenbruck // Zbl. Bact. Hyg. A. -1987. 263/4. - P. 497-508.

226. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract: mechanism and clinical consequences / D. Van der Waaij // Nahrung. 1987. - 31 N 5-6. - P. 507-517.

227. Van der Voorde L. In vitro appraisal of the probiotic value of intestinal lactobacilli / L. Van der Voorde, H. Christiaens, W. Verstraete // World. J. Microbiol. Biotechnol. 1991. -7 N 6. - P. 587-592.

228. Veld J.H. Health aspects of probiotics / J.H. Veld, M.A.R. Bosschaert, C. Shortt //Food Sci.Technol. Today. 1998 v. 12, N 1 - P. 46-50.

229. Venkatsubramanian Ed. K. Immobilized microbial cells / Ed.K. Venkatsubramanian //ACS series. 1979, N 104. - P. 257.

230. Wouters J. A. The role of cold-shock proteins in low- temperature adaptation of food-related bacteria / J.A. Wouters, F.M. Rombouts, O.P. Kuipers et al. // Syst. And Appl. Microbiol. 2000. - 23, N 2. - P. 165-173.