Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов термальных источников Баргузинской долины (Северное Прибайкалье)

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов термальных источников Баргузинской долины (Северное Прибайкалье)"

На правах рукописи

БАЗАРЖАПОВ Бато Баторович

ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ ТЕРМАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ БАРГУЗИНСКОЙ ДОЛИНЫ (СЕВЕРНОЕ ПРИБАЙКАЛЬЕ)

03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ 2005

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН и НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Намсараев Баир Бадмабазарович доктор биологических наук

Дунаевский Яков Ефимович Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Вайнштейн Михаил Борисович кандидат биологических наук

Буянтуева Любовь Батомункуевна

Ведущая организация: Восточно-Сибирский государственный

технологический университет

Защита диссертации состоится «М5>> /^ftPTA 2005 г. в 9 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, биолого-географический факультет, ауд. ЗЮ Факс (3012) 210588 E-mail: bbato@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках БНЦ СО РАН и Бурятского государственного университета.

Автореферат разослан

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

срт-

Н.А. Шорноева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Термофильные бактерии и микроскопические грибы принимают участие в круговороте биогенных элементов в различных экосистемах при высоких температурах. Активная роль микроскопических грибов в процессах трансформации веществ обусловлена присущей им высокой ферментативной активностью и физиологической пластичностью на изменение физико-химических и биологических параметров среды.

Изучению термофильных микроскопических грибов в последнее время удаляется большое внимание, что связано с выяснением их роли в высокотемпературных системах и большим биотехнологическим потенциалом. Распространение микроскопических грибов в термальных источниках Прибайкалья изучалось эпизодически (Рихванов, 1995; Тахтеев, 2000). Работ по физиологии и ферментативной активности данной группы микроорганизмов в этих источниках нет.

Цели и задачи исследования. Целью нашего исследования было изучение видового разнообразия и физиолого-биохимических свойств микромицетов выделенных из термальных источников Прибайкалья. В задачи исследования входило:

1. Определение физико-химических условий среды обитания микроорганизмов.

2. Определение численности физиологических групп микромицетов.

3. Изучение видового разнообразия микромицетов.

4. Выделение накопительных и чистых культур микроскопических грибов.

5. Определение влияния основных абиотических факторов на рост и развитие чистых культур.

6 Определение протеолитической, целлюлазной и каталазной активностей в накопительных и чистых культурах, а также в нативных образцах. Научная новизна. Впервые изучен видовой состав микроскопических грибов, их численность и пространственное распределение в термальных источниках Прибайкалья. Определены температурные и рН параметры роста выделенных кулыур микромицетов. Впервые проведено комплексное исследование ферментативной активности в нативных образцах термальных источников и выделенных накопительных и чистых культурах. Показано, что микроскопические 1рибы секретируют протеолитические ферменты при высоких температурах, проявляют оптимум активности при рН 7,7; 9,7 и 10,4 и относятся к классам сериновых и металлопротеаз.

Практическая ценность. Полученные результат расширяют представление о разнообразии и экологическом значении микроскопических грибов и бактерий в природе. Выделенные культуры представляют интерес для биотехнологии, как продуценты устойчивых к высоким температурам и рН ферментов. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Первом региональном молодежном семинаре «Байкал и мы: от понимания к сотрудничеству» (Чита 2001); научно - практической конференции (ВСГТУ, Улан-Удэ, 2002); Всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии» (Улан-Удэ,

2003), на международном симпозиуме по микробиолбгии "Microorganisms in ecosуstems of lakes, rivers and reservoirs" (Иркутск. 2003). на 7-й и 8-й Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003, 2004). Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, объектов и предмета исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, включая 10 таблиц и 35 рисунков Список литературы содержит отечественные и зарубежные источники.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы исследования.

Объектами исследований были термальные щелочные источники Прибайкалья Алла, Гарга, Кучигер, Умхей, Уро и Сея, в которых в рамках комплексных микробиологических исследований 2001-2004 г.г. производился ежегодный отбор проб Физико-химическая характеристика дана в таблице 1 Методы исследований.

Пробы были отобраны непосредственно на местах выхода термальных вод и ниже по стоку. В местах отбора проб температуру воды измеряли сенсорным электротермометром Prima (Португалия) Кислотность среды (рН) определяли потенциометрическим портативным рН-метром рНер (Португалия) Значение общей минерализации получено при помощи портативного тестер-кондуктометра TDS-4

Таблица 1 Местоположенис и физико-химическая характеристика гидротерм Прибайкалья

Источники Местоположение Ус рН Минерализация г/Л)

Кучигер Баргузинский хребет 43,0-47 2 8 2-9,1 0,60

Гарга Икатгкий хребет 39,6-72,5 • 82-8 5 0.15-0,30

Умхей Долина реки Баргузин 41,7-476. 9,0 9.1 0,42-0,60

Алла Барг\зинский чребег 24,0-762 ' 9,7 0,15-0,40

Сея Долина реки Баргузин 33,4- 50,3 9 3-9,7 0,42

Уро Икатский хребет 47,6-69,9 8,6-9 1 -

«<-» не определяли

Численность микромицегов учитывали с помощью метода разведений путем подсчета колоний, выросших на агаризованной среде, и их перерасчета на число зачатков в 1 г образца. Учет и количество термофильных микроскопических грибов проводили также методом прямого микроскопирования. Количество спор и мицелий подсчитывали на камере Горяева в двух повторах Клетки подсчитывали в капле объемом 0,1 мл, затем производили перерасчет на 1 мл (Виноградский. 1952)

Накопительные и чистые культуры выделяли методом прямых отпечатков и предельных разведений, делая посев на жидкую и агаризованную среду Чапека следующего состава (г/мл): КН2Р04-0,8; MgS04xKXH20; 0.04; FeS04- следы; сахароза- 24; NaNOj - 0.6 или казеин 1%; агар- 15; вода дистиллированная - до 1 лигра. Полученную накопительную культуру разводили в стерильной дистиллированной воде, брали 0,1 мл и растирали на агаризованной среде шпателем Выращенную культуру пересевали на агаризованную среду в чашках Петри и микроск'опировали (Билай, 1982).

Полученные чистые культуры очищали от сопутствующих бактерий путем введения в среду культивирования антибиотика стрептомицина (Cooney, Emerson, 1964). Выращивание полученных чистых термофильных культур проводили в термостате при 42-45°С.

Для определения температурных оптимумов проста стандартные количества клеточных суспензий выращивали в колбах Бюхнера объемом 250 мл в термостате при температурах 25:30; 35; 45; 50° С.

Для изучения влияния рН среды готовили на фосфатном буфере с рН 6,0; 7,0; 8,0; 9.0.

За ростом культур следили микроскопированием и по приросту биомассы мицелия. Биомассу отделяли от культуральной жидкости путем фильтрования через фильтровальную бумагу и сушили при 105°С до постоянной массы (Билай, 1982).

Были использованы стандартные лабораторные методы выделения и идентификации грибов различных систематических групп по их морфо-физиологическим особенностям. (Билай, 1982 г; Литвинов, 1969). Применяли агаризованные среды Чапека, сусло-агар, а также среду с целлюлозой для несовершенных грибов.

Для качественной оценки наличия или отсутствия протеолитических активностей в накопительных культурах использовали желатин, казеин и альбумин, для которых определяли время и степень гидролиза. В желатин добавляли 0.1%-ный индикатор - бромтимоловый синий, который в кислой среде окрашивается в желтый цвет, а в щелочной - в синий (Билай, 1982).

В качестве на очника секретируемых протеолитических ферментов использовали культуральную жидкость, полученную при росте гриба на модифицированной среде Чапека, в которую вместо NaNOj добавляли раствор казеина. Посев осуществляли восьмидневной культурой.

Активность внеклеточных протеолитических ферментов определяли с помощью метода Эрлангера с соавтор. (Erlanger et al., 1961), используя 5 мМ синтетичесие субстраты ^бензоил^-аргинил-п-нитроанилид (БАПА), пироглутамил-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (ГААЛП), карбобензокси-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (КААЛП), фенилаланил-п-нитроанилид (ФПА), глицил-п-нитроанилид (ГПА), а также с помощью тринитрофенилирования, используя 1% -ный белковый субстрат желатину (рН 8). За единицу ферментативной активности принимали такое количество фермента в культуральной жидкости, которое расщепляет 1 нмоль продукта в указанных условиях инкубации за 1 минуту.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм (Кочетов, 1980) и методом Лоури (Lowry et al., 1951). Для определения влияния концентрации казеина в среде на внеклеточную протеолитическую активность готовили

модифицированную среду Чапека с конечной концентрацией казеина от О, I до 2.0 %, далее грибы выращивали в стандартных условиях и кульгуральную жидкость использовали для определения протеолитичсской активности

Влияние различных углеводов в составе модифицированной среды Чапека изучали, добавляя в среду в качестве углеродного компонента сахарозу, мальтозу, рамнозу, маннит или глюкозу.

Для определения оптимума рН секретируемой протсиназы был использован 0.2 М универсальный буфер в диапазоне рН от 6,0 до 11,0. Про политическую активность определяли, как описано выше.

Для выяснения природы функциональных групп активного центра к раствору фермента добавляли раствор соответствующего ингибитора, инкубировали 40 минут при комнатной температуре, затем добавляли раствор субстрата и определяли акгивность, как указано выше. В работе использовались ингибиторы металлопротеаз - этилендиаминтетраацетат № (ЭДТА), цистеииовых протеаз - иодацетамид (ИЛА) и сериновых протеаз - фенилмет илсульфонилфторид (ФМСФ).

Для выяснения биохимического механизма ферментативного гидролиза целлюлозы определяли активности отдельных ферментов целлюлозолитического комплекса - эндо-1,4- (5-глюкозидазную, экзо-1,4- (3-глюкозидазную и целлобиазную (Методы экспериментальной микологии, 1982).

За единицу активности каталазы принимали количество фермента, которое катализирует разложение 1 мкмоля (0,034 мг) за 1 мин (Борисова. 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Физико-химическая характеристика места отбора проб

Для исследования были отобраны пробы воды, донных осадков, циано-бактериальных матов и растительных остатков из гидротерм Алла, Гарга, Кучигср. Уро, Сея, Умхей (табл. 2).

Температура воды в выходах термальных источников изменялась в широких пределах (табл. 1). Наиболее высокотемпературными были источники Алла (76.2° С), Гарга (72,5° С), Уро (69,9°С) В источнике Алла температура воды варьировала от 24°С до 76,2°С. Низкие температуры в выходах, разгружающихся в русле реки, связаны с перемешиванием термальных вод с речными. В источнике Сея пробы были отобраны при температурах от 37°С до 5О.З°С. Умхей - от 39°С до 47.6°С. Кучигср-37-44°С.

Значение рН вод термальных источников варьировало от 8,2 до 9,7. В гидротермах отмечены низкие значения окислительно-восстановительного потенциала, что характерно для вод. содержащих свободный сероводород.

Таблица 2 Типы проб термальных источников гидротерм.

Источник Точки отбора и температура отбора

1 2 3 4 5 6

Алла M M 65 2°С M M 6 oo"c p 0 , M M 50 0"C P о 59 0"C P о 24,0 С P » 23 5 С

Кучигер M M , д 0 47,2"С Л 0 45 9"C Д 0 4I,0"C P 0 43 0"C M M 38,6"C -

Ум\ей Р о 47,6"С M M 4I,7"C P » 45 7"C p о до 39 0°C Д 0 1 4I,6°C 1 -

Сея M м 49,8"С M M ,po 46 5"C P о 46,5"C M M 34 0"C M M 31,4"C Д 0 31 0

Гари M M 66 4"С P о 57 4 С M M 49 8°C M >,p 42 ОТ M M , p 0 39 6T P о 33 5

Уро M M 47,6"C M M 52,1 °C p 0, MM 33 8"C Л0 44 2"C M M 64,0°C M M , p 0 69 1°C

м м - микробный мат, р о - растительные остатки, д о - донные осадки «-»- пробы не отобраны

Количественный и качественный состав микроскопических грибов термальных источников

Из проб термальною источника Алла было выделено 20 штаммов грибов, относящихся к 8-ми родам, из проб источника Уро - 24 штамма, относящихся к 7-ми ролам Из источника Умхей было выделено 19 штаммов 7-ми родов, из источника Сея - 18 штаммов 9-ти родов Из источника Кучигер было получено 19 штаммов, относящихся к 19-ти родам, а из источника Гарга - 13 штаммов, относящихся к 3-м родам Bcera из исследованных образцов были выделены виды, которые относились к 19 родам и 3 подотделам (табл 3)

Подотдел Zygomycotma включает 3 вида родов Mucor, Rhizomucor, Rhizopus подотдел Ascomycotina включает 2 вида родов Candida и Chaetomium Микромицеш рода Candida входят в состав комплексов типичных видов в исследованных гидротермах Преобладающими видами являются несовершенные микроскопические грибы (Deuteromycotina). которые включают класс Deuteromycetes, состоящий из видов 14 родов Преобладающим по частоте встречаемости видов является род Aspergdlus, который занимает одно из доминирующих положении в термальных источниках Баргузинской долины Наиболее часто отмечались микромицеты A fumigatus и A terrus, а также клетки дрожжей рода Candida и виды рода Penicillium. Из всех образцов выделен светлоокрашенный стерильный мицелий, не приводящий к образованию конидий на различных средах Скорее всего, это является характерным признаком комплексов микромицетов, находящихся в экстремальных условиях.

Следует отметить, что в гидротермах Баргузинской долины - Уро, Алла, Сея, Умхей, Гарга содержится незначительное число грибных пропагул (рис 1) Особенно мало их в образцах, выделенных при высоких температурах, где число КОЕ составляло менее 1 тыс/г Так, в первой и второй точках отбора проб

источника Алла число КОЕ составляло от 130 до 225 кл/г. В этих образцах были выделены представители следующих родов Aspergillus, Vertiallium,

Таблица 3 Микроскопические грибы, выявленные в термальных источниках Баргузинской _долины_

Роды и виды микроскопических грибов Источники

Алла Сея Уро Кучпгер Умхей Гарга

Acremomum sp + +

Aspergillus sp + + + + + +

Aspergillus cameus +

Aspergillus fitmtgatusFres + + + + + +

Aspergillus terrus + + + + + +

Candida sp + + + + +

Chaetomium sp +

Citeromyces sp + +

Coelomycetes sp i 1 +

Dendrodochium sp +

Emericella mdullans + •

Paecelomyces variotii Bamer + +

Paecelomyces sp + + + +

Pénicillium sp + + + + +

Ramichoridium sp + +

Rhizopus sp + +

Rhizomucorsp +

Rhizomucir miehei +

Mucor sp + +

Tnchoderma sp + + +

Fusarium sp + + +

Sporothrix sp +

Verticilhum sp + +

nop Myceha sterilia +

Acremomum, Tnchoderma, Mucor и вид Paecelomyces vanotu, а также дрожжеподобные виды рода Candida. При более низких температурам по ручью в третьей и в четвертой точках численность микромицетов несколько увеличивается -до 1120 и 3370 кл/г, соответственно. Качественный состав микромицетов при этом изменялся незначительно Почти во всех образцах встречались представители Myceha stenha. Наиболее высокие показатели численности микромицетов оказались в образцах Уринского источника Наименьшее число микромицетов, менее 1 тыс. кл /г наблюдалось в третьей и в шестой точках - 490 кл. и 560 кл, соответственно. Низкая численность в этих точках связана с тем, что места отбора проб находятся на токе воды и большинство микромицетов смываются вниз по ручью. В образцах

имелись представители родов Aspergillus, Chaetomium. а также представители дрожжеподобиых грибов рода Candida и неидентифицированных видов

О Алла ВГарга ПКучигер ' 0Уро 1Сея ОУмхей

Рис 1 Численность микроскопических грибов в термальных источниках

(ист Умхей 4-ая точка-24750 кл/г) На пятой и седьмой точках отбора проб численность клеток микромицетов достигает 9000 кл и 13920 кл/г. соответственно Качественный состав при этом изменился и представлен в виде дрожжей рода Candida и неиденгифицированных дрожжеподобных микроскопических грибов

На первой и второй точках отбора проб источника Уро численность микромицетов составляла 1500 и 4960 кл/г, соответственно При этом качественный состав представлен В основном видами Aspergillus terrus, А сатеш и дрожжеподобными микроскопическими грибами Кроме этого, встречаются виды представители родов Vusarium, Pemcillium Причем виды рода Aspergillus встречаются па протяжении всего ручья и являются доминирующими Возможно, это объясняется благоприятными экологическими условиями, в частности температурой и наличием субстрата - циано-бактериального мата с растительными остатками

Учет микроскопических грибов в источнике Умхей показал (рис 2), что с места выхода и далее по ручью КОЕ микромицетов возрастает. Так. в первой и второй точках отбора число грибных КОП составляло менее 1 тыс кл/г - 40 и 460 кл/г. соответственно Качественный состав на месте выхода представлен в основном видами рода Penictllium, а также видами родов Sporothix и Citeromyces. Виды рода Pemcillium отмечаются почти во всех образцах В третьей и четвертой точках отбора проб источника Умхей, численность грибов симметрично возрастает и составляет 3040 и 9500 кл/г. соответственно Образцы почвы представлены видами родов Paecelomyces, Tnchoderma, Ramichondntm, Rhizopus и неидетифицированными видами В отличие от первых точек в этих образцах преобладают виды родов Paecelomyces и Tnchoderma. По-видимому, это определяется экологическими условиями во-первых, сравнительно низкими значениями температур, благоприятными для развития этих микромицетов, во-вторых, субстратами, из которых они были выделены, представляющими собой циано-бактериальный мат и

донные отложения богатые органикой. Таким образом, по ходу ручья значительно увеличилось видовое и родовое разнообразие микроскопических грибов.

Наиболее разнообразным в качественном и количественном отношении проявил себя термальный источник Сея. При количественном учете число грибных КОЕ составило более 1 тыс/г. Так, численность, на выходе вод из озера, на циано-бактериалъных матах (первая точка) составляла 6750 кл./г. схожей] картина наблюдается на образцах циано-бактериального мата, взятых по ручьйэ! в 4-5-ти метрах от озера. На этих матах были выявлены представители родов Aspergillus, Trichoderma, lihizomucor и виды Paecelomyces varioti, Emericellaj nidullans, Rhizomucir miehei. Виды рода Aspergillus, такие как термофильный ¡гриб Л fumigatits и термотолерантиьш гриб ¡A. tqrrus, отмечались во всех образцах являются доминирующими! .в этом* источнике (рис. 2). Максимальная численность микромицстов была выявлена в'Четвертой точке отбора проб и доходила |до 24750 КОЕ на г образца. Этому^лагЬприятствуюг такие экологические факторы, как относительно низкое значение температуры (37°С). при которой могут развиваться мезофильные, термотолерантные и термофильные виды микроскопических грибов. К тому же значительную роль играет cy^n^a^ который представлен в виде циано-бактериального мата с растительными остатками. В этих образцах имелись представители родов Rhizomucor, Ramichloridium. а также многочисленные клетки дрожжей рода Candida и неидентифицированных дрожжеподобных микроскопических грибов. Наименьшая численность микромицетов составляла 2000 и 2250 кл./г, в третей и в пятой точках. Это связано с тем. что третья точка находится на протоке ручья, так что большинство микроскопических грибов смывалось вниз по ручью. Пятая точка представляет собой придонный циано-бактериальный мат озера. Здесь детерминирующим фактором является высокое значение температур и р^ Даже в столь экстремальных условиях встречаются споры видов грибов родов Aspergillus, Verticillium и Penicillium.

В термальном источнике Кучигер максимальная численность микромицетов доходила до 6750 кл./г., в первой и третьей точках, вторая точка показала численность около 4000 кл. Относительно высокая численность объясняется высоким содержанием органического вещества в иловых отложениях бани (отк\да были взяты пробы) и невысокой температурой, а также значительной ролью антропогенного фактора. Четвертая и пятая точки, которые были отобраны по ручью между банями с рыхлого придонного мата с растительными остатками, показали низкую численность микромицетов 480 и 540 кл./г, соответственно. Видимо, значительная часть микроскопических грибов смывается с субстрата водой ручья. Однако видовой состав микромицетов по ручью существенно не изменялся. Виды родов Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Colletotrichum, Paecelomyces и клетки дрожжей рода Candida встречаются повсеместно. Для первой точки характерен вид рода Dendrodoch ium.

Термальный источник Гарга характеризуется относительно невысоким количеством и качественным составом микроскопических грибов. На месте выхода (первая точка) источника отмечена низкая численность грибов, которая достигала 10 кл./г и обусловлена видами со стерильным светлоокрашенным мицелием порядка Myceliasterilia. Далее по ручью (вторая точка) проба характеризовалась отсутствием микромицетов по причине отсутствия субстрата (на протоке), на котором они могли

развиваться.'В третьей и четвертой точках численность микромицетов повышается и составляет 90 и 150 кл/г. соответственно. Причем большинство микромицетов развивается предпочтительно на растительных остатках, нежели на матах. Наибольшая численность грибов представлена в пятой точке проставляет 1040 кл./г. Это связано со сравнительно низкой температурой и богатым природным субстратом, представленным растительными остатками и циано-бактериальным магом. Качественный состав представлен видами родов Acremonium, Aspergillus, Mucor, порядка Mycelia sterilia и неидентифицированными микроскопическими грибами." Характерной особенностью источника является отсутствие клеток дрожжей и дрожженодобных микроскопических грибов.

Таким образом, для комплексов микромицетов в щелочных гидротермах Баргузинской долины характерна сравнительно невысокая численность микромицетов и бедность видового состава. Эти показатели снижаются с увеличением температуры и зависят от качества субстрата. Характерной особенностью комплексов микроскопических грибов в термальных источниках является способность мезофильных видов микроскопических трибов сохранять свою жизнеспособность в экстремальных условиях.

Экофизиология микроскопических грибов термальных источников Баргузинской долины

Результаты исследования показали, что амплитуда роста биомассы колеблется в значительных пределах в зависимости от экологических условий. У микроскопического гриба порядка Mycellia sterilia, выделенного из источника Гарга, оптимум роста наблюдался при температуре 45°С, при этом гриб способен расти при температурах от 22 до 55°С при значении оптимума рН 8. Оказалось, что гриб хорошо ассимилирует сахарозу, рамнозу, глюкозу, но наилучший рост проявился на средах с мальтозой. Можно предположить, что данный вид является алкалотолерантно - факультативным термофильным видом, что соответствует экологической нише выделенного гриба. Виды рода Aspergillus характеризуются высоким приростом биомассы. Так, у A. terrus оптимум прироста биомассы проявился при 35°С и рН 7, но гриб также хорошо растет при 25 С и 45°С. Отмечен рост при 55°С, что позволяет его отнести к термотолерантным группам. У видов А. fumigatus и A. carneus оптимум роста наблюдался при 45°С, но хороший прирост биомассы определялся при 35° и 55°С. При изучении роста на различных сахарах наибольшая биомасса была отмечена на средах с сахарозой. По приросту биомассы грибы являются термофилами. В литературе A. carneus относят к мезофильным группам, но некоторые штаммы могут быть термотолерантными, в результате адаптации к окружающей среде. Отмечено, что хороший рост при высоких температурах и обильное спороношение являются основным фактором распространения видов рода Aspergillus в термальных источниках Баргузинской долины. Исследования гриба Paecelomyces variotii при различных концентрациях казеина и на различных белках и углеводах, показало, что прирост биомассы повышался при увеличении концентрации казеина, среди белков наибольший прирост биомассы был отмечен на бычьем альбумине и в присутствии в качестве углеводного субстрата глюкозы. Вид Emericella nidullans показал оптимум роста

при 45°С. также хороший рост был отмечен при 35° и 55°С При росте на различных сахарач наибольший прирост биомассы проявился на сахарозе Rhizomucir тгекег максимум роста проявил при 45°С

Таким образом, микроскопические грибы выделенные из термальных источников Баргузинской долины имеют оптимальную температуру роста 35-45°С При повышении или понижении гемператур у некоторых культур отмечалась потеря способности к образованию спор Отмечены у большинства Микроскопических грибов более высокие температурные границы роста При этом грибы характеризуются широкой областью температур роста в пределах мезо-термофильных границ, т е обладают факультативной термофильностью

Протеазная активность в нативных образцах термальных источников Баргузинской долины

Нами проведены исследования протеазной активности в нативных образцах гидротерм которые характеризовались различными значениями температур (табл 1) Максимальная протеазная активность по cубcтpaтy БАПА проявилась в источнике Гарга Причем наибольшая активность определялась на 5-ой точке - 2,27 ел в образцах циано-бактериалыюго мата с растительными остатками и на 1-ой точке - 1,93 ед в образцах циано-бактериального мата Остальные точки характеризовались низкой активностью (рис 3)

В Аллинском источнике (правый берег р Алла) при повышении температуры повышается протеазная активность по БАПА. Таким образом, максимальная активность проявилась на 1-ой точке - 1,43 ед в образцах циано-бактериального мата (рис 3).

Образцы источника Сея характеризовались низкими значениями активности (до О 03 ед),

Рис 2 Протеазная активность по БАПА Рис 3 Протеазная активность по КАЛЛП

(ист Уро 1-ая точка - 8,03 ед) кроме образцов с точки 2, которые представлены циано-бактериальный матом и растительными остатками и активность которых доходила до 1,31 ед (рис 3) В образцах источников Кучигер, Умхей и Уро протеазная активность по БАПА была практически схожа (рис 3), она варьировала в пределах 0,51 - 0,89 ед Видимо, это

Связано с типом субстрата, специфичностью видового состава. продуцирующего в окружающую среду внеклеточные протеазы, определяемые по характерному для трипсиноподобных ферментов субстрату БАПА.

Таким образом, наибольшая активность по ВАНА проявляется в образцах циано-бактериального мата с растительными остатками, где происходит наибольшее скопление микрофлоры. Относительно протеазной активности по субстрату КААЛП в источниках Уро. Гарга и Сея следует отметить, что с повышением температуры активность возрастаег (рис. 4). Максимальные значения активности проявляются в циано-бактериальных магах. Среди гидротерм выделяется источник Уро с максимальным значением активности - 8,03 ед. Остальные термальные источники - Умхей, Кучигер, Алла, характеризовались низкими значениями активности - до 0,66 ед. Следует отметить, что из-за относителыю слабой растворимости использованного субстрата в буферных растворах эти данные могут быть несколько занижены. Высокая активность по ГААЛП (до 2.35 ед.) обнаружена на 4-ой точке Сеюйского источника (рис 5). Также высокую активность по этому субстрату проявляет Аллинский термальный источник - 2,18 ед. на 1-ой точке. Низкими значениями характеризовались источники Кучигер, Умхей и Уро, активность которых доходила до 0,27 ед.

О Гарга ШСея ОУро О Алла ■ Кучигер □ Умхей

Рис 4 Протеазная активность по ГААЛП Рис 5 Протеазная активность по желатину

(ист. Умхей 3-ая точка - 103,3 ед) Определение общей протеазной активности по белковому субстрату (1%-ной желатине) показало, что наиболее активен источник Умхей (рис.6), максимальная активность которого составила 103,03 ед. и проявилась на 2-ой точке, представленной циано-бактериальным матом.

Таким образом, показана высокая вариабельность в распределении протеазной активности по образцам. Это свидетельствует о важной роли протеазной активности в обеспечении скорости разложения различных видов органических веществ в термальных источниках. Максимальные значения в основном проявляются в тех точках, где в качестве образцов выступал циано-бактериальный мат с растительными остатками или без. Выявлено также, что на протеазную активность микроорганизмов оказывает существенное влияние ряд экологических факторов, в частности, физико-химические условия источников и тип субстрата.

Протеолитические свойства накопительных культур термальных источников Баргузинской долины

Протеолитические свойства изучались у накопительных культур, выделенных из термальных источников Сея, Алла. Гарга и Кучигер.

У накопительных культур источника Сея отмечен широкий спектр протеолитической активности на изученных белковых субстратах. Культуры на ранней стадии культивирования полностью разжижают желатин, казеин, и в 2-3 раза быстрее гидролизуют яичный альбумин (таб. 4). Наибольшая, скорость потребления была отмечена у культуры Се-01-5. Показано, что при низких температурах скорость протеолитических свойств уменьшается в 2-4 раза. Схожая картина наблюдается у накопительных культур выделенных из источников Алла и Гарга Культуры Qu-2 В-2, выделенные из источника Кучигер. характеризовались альбуминазной активностью, они не гидролизовали желатин и казеин. При высоких температурах не имела протсолитических свойств на желатине и казеине культура Га-01-1,

Таблица 4 Протеолитические свойства накопительных культур термальных источников Баргузинской долины (в сутках)

Накопит культуры 22-25"С 42-45"С Измен рН при культив.

Желатин Казеин Альбумин Желатин Казеин Альбумин

Се-01-1 34 30 20 14 14 6 {щелочн

Се-01-6 40 26 20 14 14 6 Щелочи

Се-01-5 38 25 18 12 13 4 Щелочи

С?и Б-2 30 32. 36 14 14 0 Кисл

<}и Ь-3 38 40 37 19 14 12 Щелочи

С?и-2 В 2 0 > 0 20 0 - 0 • 6 'Кисл

Ал хвоя 42 0 18 14 13 6 Щелочи

Ал-01-1 25 27 18 14 13 4 Кисл

Га-01-1 гр 30 26 18 0 . 0 . 4 Щелочи

Га-01-4 23 25 18 18 15 4 Щелочи

При этом она также проявляла альбуминазную активность, в то время как при низких температурах активность наблюдалась на всех су б аратах. Культура же Qu Б-2 проявляла альбуминазиую активность, только при низких значениях температур 23-25°С и была наименьшая по скорости гидролиза (36 суток). Наименьшая альбуминазная активность при разных значениях температур была выявлена у культуры Qu Б-3, и была равна 12 суткам при 42-45°С и 37 суткам при 23-25°С. Наименьшая скорость разжижения желатина была у культуры ГА-01-4 и Qu-Б-З, тогда как при низких температурах скорость разложения была высокой. Видно, что при культивировании культур рH среды у большинства изменяется в щелочную сторону, культуры А1- 01-1, QU-2 В- 2, Qu Б-2 изменяется в кислую сторону.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о наличии видовой специфичности действия протеаз на различные белковые субстраты Представленные комплексы ферментов отличаются по их способности к гидролизу отдельных белковых субстратов и термоустойчивости. Показано, что при высоких

темперагурах культивирования в накопительных культурах повышается активность внеклеточных протеаз, что свидетельствует об их термофилии.

Внеклеточные протеолитические ферменты микроскопических грибов термальных источников Баргузинской долины

Термофильный микромицет Paecelomaces variotii и термотолерантный микроминет Aspergillus carneus, которые выделены из проб термальных источников Алла и Уро, являются активными продуцентами внеклеточных протеолитических ферментов.

Необходимым условием для проявления активности внеклеточных протеаз у исследуемых культур является наличие в среде белкового субстрата, который индуцирует их секрецию. Из полученных результатов видно, что 1%-ный казеин может индуцировать появление в культуральной среде протеолитической активности по белковому субстрату и по синтетическим субстратам различных типов: ГЛЛЛП, ФПА, ГПА. В стандартных условиях (неорганический азот заменен 1%-ным казеином) каждый гриб секретирует свой, характерный только ему, спектр протеаз.

Обнаружено, что P. variotii не проявляет прогеазную активность по отношению к синтетическим субстратам БАПА, ГААЛП, ГПА, ФПА Однако протеазная активность по отношению к белковому субстрату на культуральной среде Чапека с 1%-ным казеином показала (рис. 7) два максим) ма активности на 3 и 6 сутки. Более детальное изучение влияния концентрации казеина на величину протеолитической активности в культутральной среде P. variotii выявило, что при увеличении концентрации казеина активность возрастает. Максимальная секретируемая протеолитическая активность приходилась в присутствии 1%-ного казеина на 3 и 6 сутки, а в присутствии 1,5%-ного казеина на 7 сутки. Дальнейшее увеличение концентрации казеина (до 2%) практически не приводило к увеличению протеолитической активности. При низких концентрациях белка максимальная активность смещалась на 5 и 7 сутки.

Данные ингибиторного анализа показывают, что ЭДТА и ФМСФ ингибируют внеклеточную протеолитическую активность примерно поровну. Эта активность была максимальной при рН 9,7 на 3 сутки роста и 10,4 на 6 сутки при использовании 1 %-НОГО казеина.

Из полученных результатов видно, что исследуемый гриб P. variotii является активным продуцентом внеклеточных щелочных протеолитических ферментов,

Рис. 6. Внеклеточная протеазная активность Peacelomyces variotii

Рис 7 Активность по ФПА А carneus

относящихся к классам сериновых протеаз и металлопротеаз. Эти ферменты активно секретируются при повышенных температурах, что позволяет отнести их алкало-термофильному виду. Способность образования протеаз является результатом адаптации данного микромицета к экстремальным условиям обитания

Проведенные исследования на культуре Aspergillus carneus показали заметное влияние различных углеводов на секрецию протеаз исследуемым грибом Полученные данные выявили, что различные сахара могут вызывать не только количественные изменения в активности внеклеточной протеазы, но и приводить к репрессии или индукции формирования тою или иного фермента. Так, при рост с A carneus на различных углеводах в культуральной жидкости менялось количественное соотношение

внеклеточных протеаз. В присутствии рамнозы и маннита прослеживалась репрессия

активности субтилизин-подобной протеазы, тогда как активность аминопетидазы по ФПА была высокой (рис 8)

Максимальную активность

субтилизин-подобной протеазы по ГААЛП стимулировала сахароза (рис 9) . Начало секреции внеклеточной протеазы

приходилось на " 5 сутки, максимальные значения были обнаружены на 8-9 сутки, тогда как на 1люкозе и мальтозе начало секреции было отмечено на 4 сутки культивирования, причем

максимум активности смещался на 6-7 сутки (рис 9)

Таким образом, произошло смещение секреции внеклеточной протеазы с 5 суток на 4 сутки, при значительном снижении

активности (в 3-4 раза) Наибольшую активность амино-пептидаз по субстрату ФПА стимулировал маннит на 3 сутки роста Пик внеклеточной активности при использовании других Сахаров приходился на 4-5

-сахароза ■ маннит

Рис 9 Активность по желатину A carneus 16

сутки (рис. 8). Активность по субстрату ГПА при росте на различных углеводах была незначительна, обнаружена только в следовых количествах. Изучение действия секретируемых протеаз на желатину выявило, что замена сахарозы на глюкозу или мальтозу вызывает увеличение внеклеточной активности. Максимальная активность отмечена при росте на глюкозе, когда пик приходился на 5 сутки культивирования, и на мальтозе, причем здесь произошло смещение пика на 7 сутки. В присутствии других сахаров активность была ниже на 2-3 порядка (рис. 10).

Данные ингибиторного анализа показали, что при добавлении ФМСФ до 2 мМ наблюдается полное ингибирование внеклеточной протеолитической активности по отношению к белковому субстрату. рН-оптимум этой активности был равен 7,7, что определяет ее принадлежность ферментам класса нейтральных сериновых протеаз.

Проведенные исследования показали, что продукция внеклеточных протеаз у исследуемой культуры А. еатвш главным образом индуцирована и регулируется рядом факторов, среди которых важное значение имеет состав среды, что приводит к регуляции секреции протеолитических ферментов и может использоваться грибами в период адаптации.

Целлюлазная активность микроскопических грибов в термальных источниках

Результаты показали, что наиболее активным продуцентом внеклеточных целлюлаз является микромицет Aspergillus sp., выделенный из источника Кучигер. Этот гриб образует, комплекс целлюлаз, способных гидролизировать нативную целлюлозу и ее растворимые производные. Показано, что секреция ферментов целлюлазного комплекса микроскопических грибов регулируется такими факторами, как температура, наличие и тип субстрата (табл. 5). Этот вид имеет важное значение в процессах разложения целлюлозосодержащих субстратов в природе в условиях повышенной температуры.

Таблица 3. Целлюлазная активность Aspergillus sp (приТ- 45"С1

Глюкоз илазная активность, ед.

Активность эндо-1.4-Р-глюканазы, ед.

Активность экзо-1,4-р-глкжаназы, ед

сутки

субсграт

10

0,528 0,50 0.534 0,552 0,63 0,732 0.73 0.712 0.638

ф/бумага

0,328 0,406 0,432 0,444 0,48 0,5 0,506 0,508 0,526

0,096 0,127 0,192 0,162 0,204 0,139 0,196 0,234 0,151

ф/бумага

0,123 0,132' 0,142 0,148 0,16 0,149 0,166 0,189 0,174

0,16 0,229 0,292 0,26 0,271 0,225 0,312 0,263 0Д6

ф/бумага

0,13 0,134 0,142 0,165 0,183 0,185 0,176 0,172 0,105

Внеклеточная каталаза термофильных и термотолерантных микроскопических

грибов

Микроскопические грибы из накопительных культур различных источников способны продуцировать внеклеточного каталазу При изучении чистых культур установлено, что наибольшим выходом внеклеточной каталазы при различных значениях рН обладает вид поря uca Mvcelia slenlia Наименьший выход кагалазной активности проявили виды poдa Aspergillus и Eтепсеllа nidulans Данные свидетельствуют что на выход каталазы термофильных грибов влияет целый ряд факторов - температура состав среды и рН а также видовая принадлежность изучаемых кутьтур

ВЫВОДЫ

1 В исследованпых термальных источниках выявлено 18 родов микромицетов, которые относятся к 3 подотделам - Zygomycotina Ascomvcotina и Deutei omycotina (представители последнего подотдела наиболее многочисленны)

2 Количественное определение микроскопических грибой показало, что в щеточных гидротермах их численность невысока но с понижением температуры (от 66,4°С до 33 5°С) в ручьях численность возрастает

3 Высокая ферментативная активность в нативных образцах и в культурах свидетельствует об активном участии микробного сообщества в деструкции органического вещества, в том числе и при высоких температурах (до 69 1°С) и рН (до 9,7)

4 Выделенные микроскопические грибы Aspergillus terrus Aspergillus carneus и виды порядка Mycelia sterilia способны к росту при 55 - 60°С

5 Выделена и описана культура Paecelomyces variotu, которая является активным продуцентом внеклеточных щелочных протеолитических ферментов относящихся к классу металлопротеаз Секретируемыс протеазы проявляли максимальную активность при рН 9 7 на 3 с>тки и 10 4 на 6 сутки культивирования Данные ферменты активно секретируются при высоких температурах что позволяет отнести их алкало-термофильному вид)

6 Выделена и описана к)лыура Aspergillus carneus являющаяся при высоких температурах активным продуцентом внеклеточных протеолитических ферментов, относящихся к класс) нейтральных сериновых протеаз с рН-Оптимумом активности 7,7

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Базаржапов Б.Б. Охрана биоты термального источника Гарга (Баргузинская долина) // Материалы семинара «Байкал и мы: от понимания к содружеству». Чита. Поиск. 2001.-С.20-22.

2. Лаврентьева Е.В., Базаржапов Б.Б. Систематический состав и биохимическая активность микроскопических грибов в экстремальных водных экосистемах Прибайкалья // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе. Материалы российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е. В. Талалаева (11-13 марта). Иркутск: изд-во ИГУ, 2002,- С. 63-64.

3. Базаржапов- Б.Б., Лаврентьева Е.В. Биохимическая активность микроскопических !рибов в термальных источниках Прибайкалья // Сборник научных трудов. Серия: Химия и биологически активные вещества. Вытек 8. Изд-во ВСГТУ. Улан-Удэ, 2004. - С. 51 -56.

4. Базаржапов Б.Б., Лаврентьева Е.В. Биоразнообразие микроскопических грибов термальных источников Багузинской долины // Вестник БГУ. Серия 2. Биология. Выпуск 2. • Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2002 . - С. 114-117.

5. Лаврентьева Е.В.. Базаржапов Б.Б., Дунаевский Я.Е. Микроскопические грибы термальною источника Алла // Биология - наука XXI века 6-ая школа -конференция молодых ученых. Сборник тезисов. - Пущино, 2002. С.34.

6. Базаржапов Б.Б., Намсараев Б Б. Разнообразие термофильных микроскопических грибов в гидротермах Баргузинской долины // Эколо! ия южной Сибири. Материалы Южно-Сибирской международной научной конференции студентов и молодых ученых (21-24 ноября 2001 в г. Абакане). - Абакан. 2002. Т. 1. С. 86.

7. Базаржапов Б.Б.. Лаврентьева К.В. Термо-алкалофильные микроскопические грибы в щелочных гидротермах Баргузинской долины // Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии. Материалы Всероссийской конференции: 21-29 июля 2003 г., Улан-Удэ. -Улан-Удэ: Изд. БГСХА, 2003. с. 13-14.

8. Лаврентьева Е.В.. Базаржапов Б.Б.. Намсараев Б.Б. Мицелиальныс грибы в щелочных гидротермах Забайкалья // International Baikal symposium on microbiology (1BSM-2003) "Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs". Irkutsk -Russia. September 8-13, 2003. Abstract of International Baikal Symposium on Microbiology. - Irkutsk. Publishind Hous of Institute of Geography SB RAS. 2003. С 8182.

9. Базаржапов Б.Б. Термофильные микроскопические грибы в гидротермах Баргузинской долины // Биология - наука XXI века. 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. - Пущино, 2003. - С. 264.

10. Шагжина А.П.. Базаржапов Б.Б., Лаврентьева Е.В. Внеклеточная протеазная активность в щелочных гидротермах Баргузинской долины // Биология - наука XXI века. 8-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов.-Пущино, 2004. - С. 164.

11. Шагжина А.П.. Базаржапов Б.Б.. Лаврентьева Е.В. Намсараев Б.Б.' Протеазная активность в источнике Гарга// Международная научно-практическая конференция в НГУ. Сборник тезисов. Новосибирск. -НГУ, 2004. С. 87.

12. Шагжина A.U., Базаржапов Б.Б., Лаврентьева Е.В. Протеазная активность в щелочных гидротермах Прибайкалья // Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование. Ма1ериалы Межрегиональной научно-практической конференции, 2004., Иркутск. - ИГУ, 2004 г. - С. 185.

13. Шагжина А.П., Базаржапов Б.Б., Лаврентьева Е.В.. Намсараев Б.Б. Внеклеточная протазная активность в щелочных гидротермах Баргузинской долины. // Вестник БГУ. Серия. Биология. 2005. (в печаги).

14. Базаржапов Б.Б., Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е., Намсараев Б.Б. Внеклеточные протеолитические ферменты микроскопических грибов термальных источников Баргузинской долины // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. (в печати).

Подписано в печать 08.02.2004. Формат 60x84 1/16. бумага офсетная Объем 1,25 печ. л. Тираж 100. Заказ № 17.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

" I

/|Д'Р

yXT / C* * N

£ №>

5 Í * ;

^ШЦ") 1478

V

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Базаржапов, Бато Баторович

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава 1. Микроорганизмы щелочных гидротерм.

1.1. Термальные источники Баргузинской долины и их физико-химическая характеристика.

1.2. Термальные источники - как среда обитания микроорганизмов.

1.3. Отношение микроорганизмов к температурному градиенту.

1.3.1. Термофильность.

1.4. Причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам.

Глава 2. Систематика, физиология и биохимия термофильных микроскопических грибов

2.1. Таксономия термофильных микроскопических грибов.

2.2. Физиология термофильных микроскопических грибов.

2.3. Классификация ферментов и характеристика некоторых групп.

2.4. Классификация секретируемых протеаз.

2.4.1. Металлопротеазы.

2.4.2. Сериновые протеазы.

2.4.3. Аспартильные протеазы.

2.4.4. Цистеиновые протеиназы.

2.5. Целлюлаза микроскопических грибов.

2.6. Каталазная активность микроорганизмов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объект исследования.

3.2. Методы исследования природной среды и отбора проб.

3.3. Методы определения численности бактерий и микроскопических грибов.

3.4. Методы получения накопительных и чистых культур микроскопических грибов.

3.5. Методы изучения скорости роста микроорганизмов в зависимости от температурного градиента, рН и углеводов.

3.6. Методы идентификации микроскопических грибов.

3.7. Качественный метод определения протеолитических свойств микроорганизмов.

3.8. Методы определения протеолитической активности.

3.8.1. Методы определения протеолитической активности при различных концентрациях казеина.

3.8.2. Методы определения протеолитической активности на различных углеводах

3.8.3. Метод ингибиторов протеаз.

3.9. Метод определения целлюлазной активности.

3.10. Метод определения каталазной активности.

3.11. Метод определения токсичности и антибиотической активности термофильных микроскопических грибов.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Баргузинской долины.

4.2. Количественный и качественный состав термофильных и термотолерантных микроскопических грибов гидротерм.

4.3. Экофизиология микроскопических грибов термальных источников Баргузинской долины.

Глава 5. Ферментативная активность термофильных микрорганизмов

5.1. Протеазная активность в нативных образцах термальных источников Баргузинской долины.

5.2. Протеолитические свойства и активность накопительных культур термальных источников Баргузинской долины.

5.3. Внеклеточные протеолитические ферменты микроскопических грибов термальных источников Баргузинской долины.

5.4. Целлюлазная активность микроскопических грибов в термальных источниках Баргузинской долины.

5.5. Внеклеточная каталаза термофильных и термотолерантных микроскопических грибов.

5.6. Токсичность и антибиотическая активность термофильных микроскопических грибов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов термальных источников Баргузинской долины (Северное Прибайкалье)"

Термофильные микроскопические грибы и бактерии являются экологически обособленной группой организмов, принимающих участие в круговороте биогенных элементов в различных экосистемах. Активная роль микроскопических грибов в процессах трансформации веществ обусловлена присущей им высокой ферментативной активностью и физиологической пластичностью на изменение физико-химических и биологических параметров среды.

Изучению термофильных микроскопических грибов в последнее время уделяется большое внимание, что связано с выяснением их роли в высокотемпературных системах и большим биотехнологическим потенциалом. Анализ этих данных представляет особый интерес для экологии микромицетов, в связи с раскрытием их трофических связей в экологических нишах с высоким температурным градиентом и определением продуцентов устойчивых к высоким температурам и рН ферментов.

Распространение микроскопических грибов в термальных источниках Прибайкалья ранее изучалось эпизодически (Рихванов, 1995; Тахтеев, 2000). Работ по физиологии и ферментативной активности данной группы микроорганизмов в этих источниках нет.

Распространение микромицетов изучалось в термальных источниках Камчатки (Егорова и др., 1997). Имеются работы по изучению ферментов термофильных грибов, выделенных из саморазогревшихся растительных остатков и других высокотемпературных систем (Билай, 1987; Логинова и др., 1967).

В проведенном исследовании впервые изучен видовой состав микроскопических грибов, их численность и пространственное распределение в термальных источниках Прибайкалья. Определены температурные и рН параметры роста выделенных культур микромицетов. Впервые проведено комплексное исследование ферментативной активности в нативных образцах термальных источников и выделенных накопительных и чистых культурах.

Целью настоящей работы было изучение видового разнообразия и физиолого-биохимических свойств микромицетов выделенных из термальных источников Прибайкалья.

В задачи исследования входило:

1. Определение физико-химических условий среды обитания микроскопических грибов.

2. Определение численности физиологических групп микромицетов.

3. Изучение видового разнообразия микромицетов.

4. Выделение накопительных и чистых культур микроскопических грибов.

5. Определение влияния основных абиотических факторов на рост и развитие чистых культур.

6. Определение протеолитической, целлюлазной и каталазной активностей в накопительных и чистых культурах, а также в нативных образцах.

Комплексное исследование микробного сообщества микромицетов термальных источников Баргузинской долины показало, что температура, рН и субстрат источников оказывают существенное дифференцирующее влияние на видовой состав данной группы микроорганизмов. Выявлено, что в термальных источниках именно микроскопические грибы являются основными деструкторами органического вещества. Ферментативная активность их наблюдается в широком диапазоне температур и рН. Показано, что микроскопические грибы секретируют протеолитические ферменты при высоких температурах, проявляют оптимум активности при рН 7,7; 9,7 и 10,4 и относятся к классам сериновых и металлопротеаз.

Полученные результаты расширяют представление о разнообразии микроскопических грибов в термальных источниках Баргузинской долины и их функциональной роли в этих экосистемах. Выявленные закономерности распространения, физиологической и ферментативной активности микроскопических грибов могут использоваться при проведении экологического мониторинга и прогнозировании состояния исследованных источников.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Экология", Базаржапов, Бато Баторович

выводы

1. В исследованных термальных источниках выявлено 19 родов микромицетов, которые относятся к 3 подотделам - Zygomycotina, Ascomycotina и Deuteromycotina (представители последнего подотдела наиболее многочисленны).

2. Количественное определение микроскопических грибов показало, что в щелочных гидротермах их численность невысока, но с понижением температуры (от 69,1°С до 33,5°С) в ручьях численность возрастает.

3. Высокая ферментативная активность в нативных образцах и в культурах свидетельствует об активном участии микробного сообщества в деструкции органического вещества, в том числе и при высоких температурах (до 69,1°С) и рН (до 9,7).

4. Выделенные микроскопические грибы Aspergillus terrus, Aspergillus carneus и виды порядка Mycelia sterilia способны к росту при 55 - 60°С.

5. Выделена и описана культура Paecelomyces variotii, которая является активным продуцентом внеклеточных щелочных протеолитических ферментов, относящихся к классу металлопротеаз. Секретируемые протеазы проявляли максимальную активность при рН 9,7 на 3 сутки и 10,4 на 6 сутки культивирования. Данные ферменты активно секретируются при высоких температурах, что позволяет отнести их алкало-термофильному виду.

6. Выделена и описана культура Aspergillus carneus, являющаяся при высоких температурах активным продуцентом внеклеточных протеолитических ферментов, относящихся к классу нейтральных сериновых протеаз с рН-оптимумом активности 7,7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Комплексные исследования термальных источников Баргузинской долины позволили выявить основные экологические закономерности распространения микроскопических грибов. Кроме того, было также определено влияние физико-химических параметров на их ферментативную активность.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Базаржапов, Бато Баторович, Улан-Удэ

1. Азаренкова Н.М., Ваганова Т.И., Стронгин А.Я., Степанов В.М. Выделение и свойства кислой карбоксидазы из Aspergillus oryzae II Биохимия. 1976. - Т. 41. - С. 20-27.

2. Алекин О.А., Семенов А.Д., Скопинцев Б.А., Руководство по химическому анализу вод суши. Л.: Гидрометеоиздат, 1973. - 269 с.

3. Александров В.Я. Клетка, макромолекула, температура. Д.: Наука, 1975.-324 с.

4. Ананьева М.П., Щекатурин Л.Г. Руководство по химическому анализу воды. Новочеркасск: Редакционно-издательский отдел НПИ, 1960.- 106 с.

5. Андреева Н.С., Гинодман Л.М. Белки и пептиды. М.: Наука, 1995.

6. Барабанов Л.Н., Дислер В.Н. Азотные термы СССР. М.: Геоминвод ЦНИИКиФ, 1986.- 120 с.

7. Бардан С.И., Корнеева Г.А. Экологические факторы формирования и моделирования уровней гидролитических ферментов активных водных масс на приустьевом море Оби и Енисея в зимний период // Известия РАН. Серия биологическая, 2004. № 5. - С. 601-625.

8. Билай В.И., Пидопличко Н.М., Тарадий Г.В. и др. Целлюлозолитические свойства плесневых грибов и принципы отбора активных продуцентов целлюлаз. В кн.: Ферментативное расщепление целлюлозы. М.: Наука, 1967. С. 35-45.

9. Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. -Киев: Наукова думка, 1985. 170 с.

10. Билай Т.И., Захарченко В.А. Определитель термофильных грибов. -Киев: Наукова думка, 1987. 162 с.

11. Билай Т.И., Захарченко В.А., Жернова И.И. Влияние условий культивирования на рост и протеолитическую активность термофильныхгрибов. В кн.: Метаболиты почвенных грибов. Киев, 1971. - С. 177-182.

12. Билай В.И., Билай Т.И., Мусич Е.Г. Трансформация Целлюлозы грибами. Киев: Наук, думка, 1982,- 296 с.

13. Болобова А. В., Клесов А.А. Сравнение эффективности гидролиза микрокристаллической целлюлозы целлюлазами бактериального и грибного происхождения // Прикладная биохимия и микробиология. -1990. Т. 26. - № 3. - С. 321-327.

14. Болобова А.В., Кураков А.В. Поиск микроскопических грибов -продуцентов термостабильных протеаз // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т. 32. - № 2. - С. 402-408.

15. Болобова А.В., Кураков А.В. Поиск грибных продуцентов алкалостабильных и термостабильных целлюлаз // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35, - № 4, - С. 402-408.

16. Борисенко И.М., Замана JI.B. Минеральные воды Бурятской АССР. -Улан-Удэ: Бурят, кн. изд-во, 1997. 162 с.

17. Борисова В.Н. // Методы экспериментальной микологии / Под ред. Билай В.И. Киев: Наук, думка, 1982. С. 178-179.

18. Борисова В.И. Методы экспериментальной микологии. Киев: Изд-во Науково думка, 1973. - С. 95-102.

19. Брянская А.В., Намсараев Б.Б. Цианобактерии гидротерм Бурятии // Сохранение биологического разнообразия геотермальных рефугиев Байкальской Сибири. Матер, науч. конфер. (Иркутск, 21-22 дек. 1999 г.). -Иркутск : СИФИБР СО РАН, 2000. С. 17-18.

20. Бэккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. М.: Изд. МГУ, 1988. -230 с.

21. Васильева Л.И., Руденская Т.Н., Крестьянова И.Н., Ходова О.М., Бартошевич Ю.Э. Протеиназа 1 из Acremonium chrysogrnum сериновая протеиназа нового типа // Биохимия. - 1985. - Т.50. - С. 355-362.

22. Власова Н.А., Ткачук В.Г., Толстихина Н.И. Минеральные водыюжной части Восточной Сибири. М., 1962. - 220 с.

23. Гарибова JI.B. Обзор и анализ современной систематики грибов. Петрозаводск. Изд-во Карельского НУ, 1999. 126 с.

24. Гебрук А.В., Галкин С.В. Гидротермальный биотоп и гидротермальная фауна: общее положение. В кн. Биология гидротермальных систем. КМК Press, 2002. С. 13-24.

25. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.:1. Мир, 1991.-544 с.

26. Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Павлюкова Е.Б. Белозерский М.А.

27. Влияние условий культивирования на образование и секрецию протеазгрибами Alternaria alternate и Fusarium oxysporum И Микробиология. 1995. Т. 64. - № 3. - С. 327-330.

28. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А.

29. Влияние состава среды на количественный и качественный составвнеклеточных протеаз микромицетов // Микробиология. 1999. - Т. 68. 3. С. 324-329.

30. Егорова А.В., Сизова Т.П., Великанов J1.A. Почвенные микромицеты кальдеры вулкан Узон и долины Гейзеров на Камчатке // Микология и фитопатология. 1997. - Т. 31. - Вып. 3. - С. 30-38.

31. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука, 2003.-348 с.

32. Звягинцев Д.В. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: МГУ, 1991.-303 с.

33. Зеров Д.К. Очерк филогении бессосудистых растений. Киев: Наукова думка, 1972.-315 с.

34. Имшенецкий А.А. Микробиологические процессы при высокихтемпературах. М.: Изд-во АН СССР, 1944. 150 с.

35. Исследование водных экосистем Восточной Сибири (Биоразнообразие Байкальского региона: Труды Биолого- почвенного факультета ИГУ. Выпуск 3) / Под. ред. В.В. Тахтеева. Иркутск: Изд-во Иркутского ун-та, 2000. - 126 с.

36. Исследования водных экосистем Восточной Сибири. Биоразнообразие Байкальского региона: труды биолого-почвенного факультета ИГУ. 2000 г. Изд-во ИГУ. Вып. 3. - С. 35-43.

37. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Изд-во Мир, 1981.-520 с.

38. Квасников Е.И., Исакова Д.М. Физиология термотолерантных микроорганизмов. М.: 1978. 67 с.

39. Квеситадзе Э.Г. Эндоглюканазы термофильных и мезофильных мицелиальных грибов. Диссер. докт. биолог, наук, Институт биохимии растений АН Грузии. Тбилиси, 1994.

40. Квеситадзе Г.И., Квачадзе J1.J1., Квеситадзе Э.Г. Селекция термофильных микроскопических грибов продуцентов целлюлаз. // Прикладная биохимия и микробиология. - 1997. - Т. 33. - № 2. - С. 156161.

41. Квеситадзе Э.Г., Нижарадзе Д.Н., Буачидзе Т.Ш, Квеситадже Г.И. Термостабильность и физико-химические свойства эндо- и экзоглюканаз термофильных микроскопических грибов // Биохимия. 1997. - Т. 62. Вып. 2.-С. 208-217.

42. Кирцидели И.Ю. Почвенные микромицеты горных тундр (Полярный Урал и Плато Путорна) // Микология и Фитопатология. 2001. - Т. 35 -Вып. 5.-С. 48-53.

43. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М.: Изд-во МГУ, 1989.- 174 с.

44. Корнеева Г.А., Буданцева Н.А., Чижова Ю.Н. Внеклеточнаяпротеазная активность в компонентах криосферы // Известия РАН. Серия биологическая. 2004. - № 5. - С. 625-633.

45. Корнеева Г.А., Карченко С.В., Романкевич Е.А. Изучение ферментативного гидролиза казеина в морской воде // Известия РАН. Серия биологическая. 1990. - № 6. - С. 821-829.

46. Крайнов С.Р., Швец В.М. Основы геохимии подземных вод. М.: Недра, 1980.-285 с.

47. Кретович B.JI. Введение в энзимологию. М.: Наука, 1974. 351 с.

48. Кузнецов С.И. Микроорганизмы горячих ключей Камчатки // Тр. Инта микробиол. АН СССР. 1977. - вып.4. - С. 130-154.

49. Кураков А.В., Болобова А.В. Микромицеты продуценты термостабильных целлюлаз // Прикладная биохимия и микробиология. -1999. - Т. 35. - № 3. - С. 332-341.

50. Кураков А.В., Куплецкая М.Б., Скринникова Е.В., Сомова Н.Г. Поиск микромицетов продуцентов внеклеточной каталазы и изучение условий ее синтеза // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т. 37. - № 1.-С. 67-72.

51. Курасова В.В., Костин В.В., Малиновская Л.С. Методы исследования в ветеринарной микологии/ Под ред. Н.А. Спесивцевой. М.: Колос, 1971. -312 с.

52. Литвинов М.А. Методы изучения почвенных микроскопических грибов. Л.: Наука, 1969. 121 с.

53. Лобарева Л.С., Степанов В.М. //Успехи биологической химии. 1978. -Т. 19.-С. 83-102

54. Логинова Л.Г. Анаэробные термофильные бактерии. М.: 1982. С. 99-101.

55. Логинова Л.Г., Сергеева В.В., Серегина Л.М. Термофильная аэробнаямикрофлора, образующая слизь в бумажном производстве // Прикл. биохимия и микробиология. 1973. - Т. 9. - № 5. - С. 701-709.

56. Логинова Л.Г., Ташпулатов Ж. Термофильный гриб Aspergillus fumiatus образующий активную целлюлозу // Микробиология. 1965. — Т. 34.-Вып. 2.-С. 258-261.

57. Логинова Л.Г., Ташпулатов Ж. Целлюлозолитические ферменты термотолерантного и мезофильного грибов, близких к Aspergillus fumigatus. В кн.: Тез. докл. IX Международного конгр. По микробиологии. М.: 1966. - 95 с.

58. Логинова Л.Г., Ташпулатов Ж., Калмыкова Т.Н., Сергеева Л.Н. Ферментативное разрушение целлюлозы. М.: 1967 337 с.

59. Ломоносов И.С. Геохимия и формирование современных гидротерм Байкальской рифтовой зоны. Новосибирск: Наука, 1974. 166 с.

60. Ломоносов И.С., Кустов Ю.И., Пиннекер Е.В. Минеральные воды Прибайкалья. Иркутск: Вост.-Сиб. Кн. Изд. 1977. - 269 с.

61. Ломоносов И.С., Пиннекер Е.В. Термальные воды Прибайкалья // Природа. 1980. - № 3. - С. 78-85.

62. Лукомская К.А. Микробиология с основами вирусологии. М.: Просвещение, 1987. 192 с.

63. Максименко А.В. // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113.-№3.-С. 351-365.

64. Методы экспериментальной микологии. Справочник. // Под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1982. 551 с.

65. Минеральные воды южной части Восточной Сибири // Под ред. В.Г. Ткачука, Н.И. Толстихина. М.: Изд. АН СССР, 1961. Т. 1. - 346 с. - Т.2.-181 с.

66. Мирошниченко О.С. // Биополимеры и клетка. 1992. - Т. 8. - № 6. -С.3-25.

67. Мирчик Т.Г. Почвенная микология. М.: изд. МГУ, 1976. С. 45-88.

68. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Шишко Ж.Ф., Ясенко М.И. Образование внеклеточной каталазы видами p. Pennicillium П Микология и фитопатология. 1998. - Т. 32. - №1. - С. 43 - 46.

69. Молосова Т.П., Калюжный С.В., Варфоломеев С.Д., Великодворская Г.А. Характеристика трех ферментов целлюлазного комплекса Clostridium thermocellum: синергизм при гидролизе целлюлозы // Биохимия. 1986. -Т. 40. - Вып. 5. - С. 760-767.

70. Новое в систематике и номенклатуре грибов// под ред. Дьякова и Ю.Т. и Сергеева Ю.В. Национальная академия микологии Медицина для всех. М. 2003.-493 с.

71. Номенклатура ферментов: (Рекомбинации Международного биохимического союза по номенклатуре и классификации ферментов). М.: Наука, 1966. 252 с.

72. Пидопличко Н.М. Грибная флора грубых кормов. Киев: Наук. Думка, 1953.-487 с.

73. Пиннекер Е.В., Писарский С.И., Ломоносов И.С. и др. Гидрогеология Прибайкалья. М.: Наука, 1968. 168 с.

74. Плотникова Г.Н., Сероводородные воды СССР. М.: Недра, 1981. -132 с.

75. Позмогова И.М. Деление микроорганизмов на группы по их отношению к температуре. В кн. Современное представление о термофилии микроорганизмов. М.: Наука, 1973. С. 7-15.

76. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. М.: Мир, 1987.- 117с.

77. Рабинович M.JL, Мельник М.С., Болобова А.В. Целлюлазы микроорганизмов (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология,2002, Т. 38, № 4. с. 355-373.

78. Рихванов Е.Г., Войников В.К. Эффект внеклеточного белка, продуцируемого Bacillus sp., на термотолерантность дрожжей Debaryomyces vanriji II Прикладная биохимия и микробиология. 1995. -Т. 31, № 3. - С. 329-333.

79. Родионова Н.А. Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981.-213с.

80. Рубин Б.А., Ладыгина И.Е. Энзимология и биология дыхания растений. М.: Высшая школа, 1966. 287 с.

81. Руденская Г.Н. Афинные сорбенты на основе хитозана для выделения протеолитического фермента // Вестник МГУ. Серия 2. Химия. 2000. - Т. 41.-№2-С. 475-484.

82. Руденская Г.Н., Остерман А.Л., Степанов В.М. Карбоксильная протеиназа из Trichoderma lignorum // Биохимия. 1980. - Т. 45. № 4. - С. 710-716.

83. Сивере B.C., Мусич Е.Г., Лизак Ю.В. Определение активности целлюлаз. В кн. Методы экспериментальной микологии. Киев: Изд-во Науково думка, 1982. С. 180-187.

84. Сидорова И.И. Макросистема грибов: методология и измененияпоследнего десятилетия // в кн. Новое в систематике и номенклатурегрибов. М.: Национальная академия микологии Медицина для всех,2003.-С. 7-70.

85. Синявская О.И. Каталазная активность грибов рода Penicillium Link. Автореферат диссертации кандидата биологических наук. Киев : Институт микробиологии и вирусологии АН УССР, 1984. 19 с.

86. Степанов В.М. Сериновые протеиназы микроорганизмов // Тез. докл. 2-го Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов, 1979.-С. 33.

87. Степанов В.М., Руденская Г.Н., Васильева Л.И., Крестьянова И.Н., Ходова О.М., Бартошевич Ю.Э. Сериновая протеиназа II из Acremonium chrysogenum // Биохимия. 1986. - Т. 51. - С. 1476-1483.

88. Тулемисова К.А., Мамонова Л.П., Бекмаханова Н.Е. Термофильные микроорганизмы Южного Казахстана. Алма-Ата: Наука, 1984. - 160 с.

89. Феофилова Е.П. Царство грибов: гетерогенногсть физиолого-биохимических свойств и близость к растениям, животным и прокариотам // Прикладная биохимия и микробиология. 2001 г. Т. 37. - № 2. - С. 141155.

90. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А.С., Хохлова Н.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе липидов // Микробиология. 20006. - Т. 69. - № 5. - С. 612-619.

91. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Хохлова Н.С., Меморская А.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе углеводов цитозоля // Микробиология. 2000а. - Т. 69. - № 5. - С. 606-611.

92. Харченко С.Н. Изучение антибиотических свойств грибов. Методы экспериментальной биологии. Киев: Изд-во Науково думка, 1982. - С. 269-285.

93. Adams, М. W. W. 1993. Enzymes and proteins from organisms that grownear and above 100°C. Annu. Rev. Microbiol. 47: p. 627-658.

94. Ainsworth G.C., Sparrow F.K., Sussman A.S. The fungi. Vol. 4. A taxonomic review with keys: Ascomycetes and Fuggi imperfeeti. — New York etc: Acad. Press, 1973. 621 p.

95. Alexandrov, V. Y. Cells, molecules and temperature. Translated from the Russian by vOi. tsernstam. Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. 1977.

96. Allen M.B. The thermophilic aerobic sporoforming bacteria. Bacteriol. Revs., 1953, v.17, p.125-173.

97. Apinis A.E Thermophilous fungi of coastal grasslands. In: Proc. Coll. soil, fauna, soil microflora and their relation-ships/ Eds. J. Doeksen, J. Drift, Amsterdam: N.H. publ. со., 1963, p. 427-438.

98. Apinis A.E. Occurrence of thermophilus microfungi in certain alluvial soils neer Notinghan.- Nowa hedw., 1963, 5, N 1, p. 57-58.

99. Bidochka M.J., St.Leger R., Stuart A., Gowanlock K. Nuclear rDNA phylogeny in the fungal genus Verticillium and its relationship to insect and plant virulence, extracellular proteases and carbohydrases // Microbiology. 1999. V.145. P.955-963.

100. Biely P., Vrsanska M., Claeyssens M. Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases / Eds Suominen P., Reinikainen T. Helsinki: Found. Biotech. And Indust. Fermentation Res. 1993. P. 99-108.

101. Blalock H. G., Georg L.K., Derieux W. T. Encephalites in turkey poults due to Dactylaria (Diplorhinotridium) Gallopava. A case report and its experimental reproduction-Avian Dis, 1973, v. 17, p. 197-204.

102. Brock T.D. Life at high temperatures. Science, 1967, 158 p. 1012-1019.

103. Brock, T. D. 1995. The road to Yellowstone—and beyond. Annu. Rev.1. Microbiol. 49:1-28.

104. Cooney D.A., Emerson R. Thermophilic fungi. An Account of Their Biology, Activites, and Classification. W. H. Freeman. San Francisco; London , 1964.385 р.

105. Davis B.J. Method and applications to human serin protein // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1964 V. 121. № 2. P. 404-427.

106. Davies, G., Tolley, K., Wilson M. 1992. Crystallization and preliminary X-ray analisis of fungal endoglucanase I.J. Mol. Biol. 228: 970-972.

107. Divne C., Stahlberg J., Reinikainen Т., Ruohonen L., Pettersson G., Knowles J.K.C., Teeri T.T., Jones N.F. // Science. 1994. V. 265.№ 5171. P. 524-530.

108. Ellis D. H. Thermophilic fungi isolated from a heated aquatic habitat.-Mycologia, v. 72,1980, N 5, p. 1030-1032.

109. Ellis D. H., Keane P.I. Thermophilous fingi isolated from some Antartic and subantartic soils.- Mycologia, 1980b, v. 72, n. 6, p. 1033-1037.

110. Emerson, R. 1968. Thermophiles, p. 105-128. In G. C. Ainsworth and A.1. S.

111. Enari T.M., Markkanen P. Production of cellulolytic enzymes by fungi. -Adv. Chem. Eng., 1977, 5, N 1, p. 1-24.

112. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophis. 1961. V. 95. P. 271-278.

113. Fergus C. L., Delwiche C. The effects of nutrients and temperature on germination and viability of the ascospores of Chaetomium rectopilium. -Mycoiogia, 1975, v. 47, n. 4, p. 722.

114. Fiedurek J., Gromada A. Selection of biochemical mutants of Aspergillus niger with enhanced catalase production // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 47. №3. p. 313-316.

115. Habeeb T.S. Determination of free amino groups in protein bytrinitrobenzenesulphonic acid // Analyt. Biochem. 1966. V.14. P.328-336.

116. Henssen A. Uber die Bededeutung der thermophile Microorganismen fur due Zersetzung die Stedtmister. Arch. Microbiol., 1957, 27, N 1, S.63-81.1.mail A.-M.S., Saleh S.A., Abdel-Fattah A.F. // Microbios. Lett. 1990. V.43. P.81- 85.

117. Karlsson J., Saloheimo M., Siika- Aho M., Tenkanen M., Pennttila M., Tjerneld F. // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. № 24. P. 6498-6507.

118. Kenneth B.R., Dorothy I.F., Peter K.C. The genus Aspergillus. Baltimore. The Williams & Wilkinscompany. 1965. 686 p.

119. Konstantinidis A.K., Marsden I., Sinnot M.L. Hydrolyses of alpha- and beta-cellobiosyl fluorides by cellobiohydrolases of Trichoderma reesei // Biochem. J. 1993. V. 291. №> 3. P. 883-888.

120. Maheshwari, R. 1997. The ecology of thermophilic fungi, p. 277-289. In К. K. Janardhan, C. Rajendran, K. Natarajan and D. L. Hawksworth (ed.), Tropical mycology. Oxford & 1BH Publishing Co. Pvt. Ltd., New Delhi, India.

121. Meyer G.W. Amino acid utilization by thermophilic fungi. Bull. Torrey Bot. Club, 1970, n. 4, p. 227.

122. Miller, H. M., P. A. Sullivan, and M. G. Shepherd. 1974. Intracellular protein breakdown in thermophilic and mesophilic fungi. Biochem. J. 144: 209214,

123. Monod, M., Paris, S., Sangland, D., Jaton-Ogay, K.,Bille, J., and Latge. Isolation and characterization of a secreted metalloprotease of Aspergillus fumigatus // J.-P. Infection and Immunity, 1993, 61, p. 4099-4104.

124. Mouchacca, J. 1997. Thermophilic fungi: biodiversity and taxonomic status.

125. Crytogamie Mycol. 18: 19-69.

126. Ong, P. S., and G. M. Gaucher. 1973. Protease production by thermophilic fungi. Can. J. Microbiol. 19:129-133.

127. Rajasekaran, A. K., and R. Maheshwari. 1990. Growth kinetics and intracellular protein breakdown in mesophilic and thermophilic fungi. Indian J. Exp. Biol. 28:46-51.

128. Rajasekaran, A. K., and R. Maheshwari. 1993. Thermophilic fungi: an assessment of their potential for growth in soil. J. Biosci. 18:345-354.

129. Rosenberg, S. L. 1975. Temperature and pH optima for 21 species of thermophilic and and thermotolerant fungi. Can. J. Microbiol. 21:1535-1540

130. Rypniewski, W. R. Hastrup, S., Betzer, Ch., Dauter, M., Dauter, Z., Papendorf, G., Branner, S., and Wilson, K.S. Protein Engineering, 1993, V. 6, p. 341-348.

131. Schuleimo M., Tikhomirov D.F., Schou C. // Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases / Eds Suominen P., Reinikainen T. Helsinki: Found. Biotech. And Indust. Fermentation Res. 1993. P. 109-116.

132. Sussman (ed.), The fungi, an advanced treatise. Academic Press, Inc., New York. N.Y. Vol. 3. 2000.

133. Tansey M. R., Broc T.D. Isolation of thermophilic and thermotolerant fungi from spring effluens and thermal soils of Yellowstone National Pare. -BactProc., 1971, v. 36.

134. Tansey M. R., Brock T.D. Dactylaria gallopara, a cause of avain encephalitis, in hot spring effluents, thermal soils and self-heated coal waste piles.- Nature (London), 1973, v. 242, p. 202-203.

135. Tansey M. R., Brock T.D. Experimental studies of thermophilic andthermotolerant fungi with emphasis on their occurrence in wood chip piles, cellulolitic ability, nutrition and physiology. Dissertation abstracts international, 1970, v. 31, v. 12.

136. Tansey M.R. Experimental studies of thermophilic and thermotolerant fungi with emphasis on their occurrence in wood chip piles, cellulolytic ability, nutrition and physiology. Dissertation abstracts international, 1970, v. 31, p. 12.

137. Touche (La) C.J. On a thermophilic species of Chaetomium.- Trans. Brit. Mycol., Soc., 1958, 33, № 1, p. 94-102.

138. Tubaki K., Ito Т., Matsuda Y. Aquatic sediment as a habitat of thermophilic fungi.- Annal. Microbiol., 1974, v. 24, p. 199-207.

139. Ward M., Wu S., Dauberman J., Weiss G., Larenas E., Bower В., Rey M., Oarkson K., Bott R. // Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases / Eds Suominen P., Reinikainen T. Helsinki: Found. Biotech. And Indust. Fermentation Res. 1993. P. 153-158.

140. Zuber H. Thermophilic bacterium. Chem. Unserer. Zeit, 1979, v. 13, n. 6, p. 165-175.